Раскрытие структуры белка: научный обзор

Essays Biochem. 2020 Sep 25;64(4):649–680. doi: 10.1042/EBC20190042
Uncovering protein structure
Elliott J Stollar, David P Smith
Резюме
Структурная биология изучает молекулярное расположение и
динамику биологических макромолекул, особенно белков. Полученные
структуры затем используются, чтобы помочь объяснить, как
функционируют белки. Эта статья дает читателю представление о
структуре белка и лежащих в его основе химии и физике, которые
используются для раскрытия структуры белка. Мы начинаем с химии
аминокислот и того, как они взаимодействуют внутри и между белками,
мы также исследуем четыре уровня структуры белка и то, как белки
складываются в дискретные домены. Мы рассматриваем термодинамику
фолдинга белков и причины неправильного фолдинга белков. Мы
рассматриваем динамику белков и то, как белки могут принимать
различные конформации и состояния. Во второй части этого обзора мы
описываем различные методы, которые биохимики используют для
раскрытия структуры и свойств белков, описанных в первой
части. Белковая структурная биология — относительно новая и
захватывающая область, которая обещает предоставить детали на
атомном уровне для все большего числа молекул, которые являются
фундаментальными для жизненных процессов.
Ключевые слова: связывание белков, химия белков, конформация
белков, структура белков.
Вступление
Белки являются одним из наиболее важных классов молекул для
жизни и лежат в основе области биохимии. Чтобы полностью понять их
роль, важно изучить как их структуру, так и функцию, и этот обзор
посвящен тому, как мы раскрываем структуру белка. Чтобы понять
структуру, мы исследуем химическую природу аминокислот, которые
являются «строительными блоками» белков. Мы рассматриваем, как
взаимодействия между аминокислотами помогают белкам складываться
и колебаться, поскольку они принимают различные структуры. Кроме
того, чтобы понять, как мы экспериментально изучаем структуру белка,
мы изучаем фундаментальные концепции физики и связанные с ними
вычислительные методы. Эта тема действительно междисциплинарна и
помимо биохимии охватывает области биофизики, структурной
биологии и вычислительной биологии.
Мы начнем с описания четырех уровней структуры белка и того, как
существуют различные белковые домены и архитектуры.
Белки — это биологические молекулы, образующиеся в живых
клетках, и мы должны также учитывать, как длинная цепь аминокислот,
образующихся на рибосоме, может переходить в складчатую структуру,
которая играет центральную роль в функции белка. Таким образом, мы
рассматриваем термодинамику сворачивания белков, а также то, что
происходит, когда белки неправильно сворачиваются внутри клетки. Мы
также исследуем другие универсальные свойства белков, в том числе их
способность изменять свою форму, известную как конформационное
изменение. В частности, хотя белки обычно существуют в одной
доминирующей конформации, мы обсудим, как белки на самом деле
существуют в популяции быстро взаимопревращающихся конформаций,
которые позволяют им быть гибкими и адаптировать свою форму,
необходимую для функционирования. Затем мы подробно обсудим
основные методы, использованные для изучения структуры и динамики
белков, которые позволили сделать это понимание. Учитывая
междисциплинарный характер этой темы, мы попутно предоставили
несколько отдельных вставок, чтобы дать более подробную информацию
о фундаментальной науке, лежащей в основе этих концепций.
Часть 1: Структурные свойства белков
Белки
Белки являются одной из четырех основных молекул, управляющих
жизнью, включая нуклеиновые кислоты, липиды и полисахариды. Все
эти большие «макромолекулы» представляют собой ковалентные
соединения на основе углерода, которые используют слабые обратимые
нековалентные взаимодействия для складывания и взаимодействия со
своими мишенями, придавая молекулам и их комплексам различные
формы и динамику. Белки представляют собой полимеры, обычно
состоящие из сотен аминокислот, соединенных вместе пептидными
связями, тогда как более короткие полипептиды (менее 30 аминокислот)
обычно называют пептидами.
Каждая аминокислота имеет общую структуру, содержащую
центральный атом углерода α (C α), соединенный с аминогруппой (–NH 2)
и группу карбоновой кислоты (-COOH), обе из которых используются для
образования пептидных связей. Что наиболее интересно, так это то, что
для 19 из 20 различных аминокислот группа C α также связана с другой
группой R, что дает каждой аминокислоте свою уникальную «боковую
цепь». Боковая цепь придает аминокислоте отличительные структурные
и химические свойства, поскольку боковые цепи различаются по размеру,
форме, полярности, заряду и гидрофобности (рис.1). Аминокислоты
также являются хиральными и могут образовывать два возможных
зеркальных изображения (стереоизомеры), поскольку группа C α связана
с четырьмя уникальными группами, образующими хиральный
центр. Стереоизомеры, как зеркальные отражения, не могут быть
наложены друг на друга, точно так же ваши руки являются зеркальными
отражениями и не могут быть повернуты для совпадения. Два
стереоизомера для каждой из 19 хиральных аминокислот обозначаются
как D и L , однако только L - стереоизомер используется в природе для
построения белков (глицин имеет водород в боковой цепи и не является
хиральным).
Рисунок 1.
(A) Все 20 аминокислот имеют общую структуру с различными химическими и
физическими свойствами, которые определяются их R-группами (боковыми
цепями). У каждого есть свое имя (т.е. аланин), трехбуквенное сокращение (Ала) и
однобуквенный код. Они группируются по размеру, заряду, полярности и, в
некоторых
случаях,
по
особенностям,
придающим
полипептидный
остов. Аминокислоты показаны в виде остатков в коротких полипептидных цепях с
N- и C-концами, указанными на концах. Атомы углерода не обозначены буквой C и
представлены в местах соединения связей, также не показаны атомы водорода,
присоединенные к атомам углерода (это обозначение обычно используется в
органической химии). Полипептидный остов показан черным цветом, а боковые цепи
окрашены. ( Б) Неполярные остатки обычно имеют боковые цепи, в которых
отсутствуют полярные связи и вместо которых имеются неполярные связи (т. е. они
имеют много связей C–H). Неполярные аминокислоты гидрофобны, так как они
имеют тенденцию группироваться вместе, чтобы уйти от воды. (C) Полярные
аминокислоты гидрофильны, что означает, что их боковые цепи сильно
взаимодействуют с водой и друг с другом. (D) Ароматические остатки уникальны тем,
что содержат кольца с чередующимися двойными связями (триптофан и тирозин
нельзя легко разделить на гидрофобные или гидрофильные; каждый из них имеет
большую боковую цепь с полярными и неполярными свойствами). (Э) Заряженные
остатки полностью ионизируются при pH 7 и существуют преимущественно в
депротонированной, отрицательно заряженной форме или в протонированной,
положительно заряженной форме. В дополнение к боковым цепям N- и C-концы
полипептидной цепи ионизируются при физиологических значениях рН. (F) Глицин
и пролин показаны как аминокислоты и классифицируются как особые
случаи. Глицин имеет водород в боковой цепи и позволяет полипептидам быть
гибкими. Пролин может существовать только в двух конформациях, потому что его
боковая цепь напрямую связана с его аминогруппой, которая ограничивает остов в
более узком диапазоне форм.
Как только аминокислоты соединяются вместе, образуя
полипептидную
цепь,
боковые
цепи
и
основные
группы
взаимодействуют друг с другом через множество слабых
взаимодействий, включая ван-дер-ваальсовы, водородные связи,
электростатические взаимодействия, а также гидрофобный эффект,
которые определяют форму белка и его взаимодействие с мишенью
(рисунок 2). Например, боковая цепь лизина имеет длинную
углеводородную цепь, которая неполярна, но конец цепи заряжен
положительно, что позволяет ему взаимодействовать с другими
молекулами, используя любое из слабых взаимодействий, описанных
выше. С другой стороны, глутаминовая кислота имеет такой же размер,
но несет отрицательный заряд и имеет меньше потенциальных способов
взаимодействия. В дополнение к взаимодействиям боковых цепей
пептидная связь несет диполь из-за электроотрицательных свойств
связанного кислорода, что позволяет ему образовывать водородные
связи с группами основной и основной цепи. Поскольку существует 20
различных аминокислот, и они могут быть расположены в любом
порядке, существует огромное количество возможных линейных
комбинаций, и организмы выработали десятки тысяч различных белков
и пептидов. Белки обычно не существуют в виде протяженных цепей, и
благодаря взаимодействию боковой цепи и основной цепи они
складываются сами по себе, что приводит к уникальной форме. Каждая
форма имеет свой способ перемещения и взаимодействия с другими
молекулами, что обеспечивает выполнение её функции. Разнообразие
форм означает, что белки чрезвычайно универсальны: иногда они
действуют как ферменты, катализируя химические реакции, иногда —
как мессенджеры, связывающиеся с определённым партнёром для
передачи сообщения, а иногда — как структурные каркасы внутри
клетки (рисунок 3). Напротив, ДНК обычно принимает классическую
двойную спиральную структуру независимо от ее последовательности,
что соответствует ее функции - хранения генетической информации.
рисунок 2.
Межмолекулярные взаимодействия
Взаимодействия между боковыми цепями аминокислот помогают стабилизировать
свернутые структуры белков и позволяют белкам взаимодействовать друг с
другом. Эти взаимодействия могут включать (А) взаимодействия Ван-дер-Ваальса,
когда молекулы комплементарных форм приближаются друг к другу. Эти молекулы
могут быть незаряженными и содержать только неполярные связи, но при тесном
контакте в этих неполярных связях может индуцироваться мгновенный диполь,
допускающий слабые электростатические взаимодействия между противоположно
(частично) заряженными группами. Хотя индивидуальная сила Ван-дер-Ваальса
слаба, многие такие взаимодействия через неполярные поверхности могут позволить
двум белкам взаимодействовать друг с другом. Неполярные группы также могут
притягиваться друг к другу за счет гидрофобного эффекта, который будет
рассмотрен при обсуждении фолдинга белков. (B) Водородная связь возникает, когда
каждая из двух взаимодействующих молекул содержит диполи (т. е. они содержат
полярные ковалентные связи), когда электростатическое притяжение возникает
между частично отрицательным атомом N или O (с неподеленной парой электронов)
и частично положительным атомом водорода, который ковалентно связан. связан с
другим атомом азота или кислорода. В отличие от взаимодействий Ван-дер-Ваальса,
эти связи зависят не только от величины парциальных зарядов и расстояния между
ними, но и от ориентации вовлеченных групп. Когда водород является линейным с
ковалентно присоединенными N или O и взаимодействующими N или O (т. е. все три
атома и неподеленная пара электронов появляются на линии), сила максимальна. В
качестве таких, белки должны складываться и взаимодействовать с другими
белками, используя очень точную геометрию, которая удовлетворяет этой
направленной зависимости, чтобы образовывать прочные и значимые водородные
связи. (C) Ионные взаимодействия (солевые мостики) - это взаимодействия
притяжения между противоположно заряженными ионами, поскольку ионы
содержат больше заряда, чем другие диполи, обсуждавшиеся выше, они
представляют собой самое сильное межмолекулярное взаимодействие, включающее
заряд, а (D) дисульфидные связи представляют собой образующиеся ковалентные
связи сера-сера. путем окисления двух остатков цистеина, которые могут
образовываться внутри одной белковой цепи или между двумя отдельными
цепями. Учитывая, что эти связи являются ковалентными, они являются самой
прочной межмолекулярной связью в целом, однако эти связи могут быть разорваны,
если
белок
подвергается
воздействию
восстанавливающей
среды
и
восстанавливается.
рисунок 3.
Белки имеют разнообразную структуру и функции
Белки являются рабочими лошадками для всех живых организмов и, как таковые,
обладают огромным набором функций, которым способствует ряд различных
структур и связанная с ними динамика. Обратите внимание, что белки, показанные
здесь, представлены не в масштабе и окрашены полипептидной цепью. Некоторые
белки обеспечивают структурную основу, например, 180 копий белков оболочки,
составляющих внешнюю оболочку вируса Зика , содержащую РНК, необходимую для
заражения (код PDB: 5ire) .). Три конформации белка оболочки окрашены по-разному,
чтобы показать невероятную симметрию, которая создает оболочку икосаэдра (20
граней). Также показаны множественные копии моносахарида N-ацетилглюкозамина
(голубой). Внешняя оболочка вируса показана путем представления атомов в белках
в виде сфер, образующих поверхность или заполняющее пространство
представление. Некоторые белки функционируют как ферменты, которые
катализируют химические реакции, снижая активационный барьер, который
необходимо преодолеть, когда субстраты превращаются в продукты, такие
как гексокиназа , которая катализирует первую стадию гликолиза (код PDB: 2yhx)
.). Этот белок имеет большой верхний (суб)домен и меньший нижний (суб)домен,
который создает между ними активный центр, где происходит катализ. Когда
глюкоза связывается с активным центром, домены зажимаются, и устье активного
центра закрывается, что облегчает превращение в глюкозо-6-фосфат с
использованием АТФ. Белок показан с прозрачной поверхностью, а внутри показан
только полипептидный остов в виде мультяшного изображения с тонкими петлями,
соединяющими α-спирали в виде спиральных трубок и β-цепи в виде толстых
стрелок, где конец стрелки указывает на С-конец. Многие белки функционируют
путем связывания с другим белком, мембраной или малой молекулой, что позволяет
транспортировать молекулы и передавать сигналы внутри и между клетками в ответ
на внешние стимулы. Например, антителав крови связываются с чужеродными
антигенами (обычно белками чужеродного микроорганизма или вируса) и вызывают
иммунный ответ, который требует точного взаимодействия белков, чтобы избежать
взаимодействия с собственными белками (код PDB: 1igt ). Как правило, эти богатые
β-слоем антитела состоят из четырех полипептидных цепей (две длинных тяжелых
цепи желтого и голубого цвета и две более коротких легких цепи розового и зеленого
цветов), которые вместе образуют стебель с двумя гибкими ответвлениями, которые
соединяются с двумя сайтами связывания, где происходит связывание
антигена. Сайты связывания уникальны для каждого антитела, а гибкость и
динамика этих сайтов позволяют каждому антителу распознавать уникальную
чужеродную молекулу и атаковать ее с разных сторон. Другие примеры белковых
взаимодействий включают ДНК-связывающий домен изфактор транскрипции
Oct1, связывающийся с ДНК (код PDB: 1oct ). Это взаимодействие должно быть очень
специфичным, чтобы связываться только с правильной последовательностью
промотора ДНК, чтобы включались только определенные гены. Сахаро-фосфатный
остов ДНК представлен в виде рисунка, а четыре основания ДНК окрашены поразному, чтобы выделить уникальную последовательность, распознаваемую
Oct1. Гормоны представляют собой важный класс молекул, которые также зависят от
точных
межбелковых
взаимодействий. Например,
альфа-спиральный
белок инсулин представляет собой небольшой гормон, состоящий из двух цепей
(зеленой и голубой), соединенных дисульфидными связями (код PDB: 4ins)
.). Инсулин необходим для поддержания уровня глюкозы в крови, связываясь с
рецептором инсулина, который находится снаружи многих тканей, таких как клетки
печени, мышц и сердца. Связывание инсулина способствует поглощению глюкозы
кровью после еды и контролирует множество различных метаболических процессов,
изменяя активность ферментов и белков-транспортеров. Наконец, белки
специфически
взаимодействуют
с
небольшими
молекулами,
чтобы
транспортировать их через мембраны или в другие места нашего тела. Например,
дезоксигемоглобин представляет собой гетеротетрамерный белок, состоящий из
двух цепей α-субъединиц (зеленый) и двух цепей β-субъединиц (синий), который
переносит кислород (код PDB: 2hhb) .). Каждая цепь сворачивается в α-спиральный
домен, который включает кольцеобразную группу гема (розового цвета),
содержащую атом железа. Кислород обратимо связывается с этими атомами железа и
позволяет этому важнейшему газу транспортироваться кровью из легких в другие
ткани организма. Сокращения: АТФ, аденозинтрифосфат; PDB, банк данных о
белках; РНК, рибонуклеиновая кислота.
Поскольку почти все жизненно важные функции обеспечиваются
белками, любые изменения в их структуре, вызванные повреждением,
мутацией или модификацией, объясняют причину заболевания на
молекулярном уровне. Классический пример — гемоглобин. Когда
человек наследует вариант гена гемоглобина, в котором глутаминовая
кислота (R-группа заряжена) в положении шестого остатка заменена на
валин (R-группа гидрофобна), это приводит к серповидно-клеточной
анемии. Это различие в одной аминокислоте изменяет поверхность
гемоглобина, удаляя отрицательный заряд и образуя гидрофобное
«липкое» пятно (в отсутствие кислорода), заставляя дезоксигемоглобин
слипаться. Поскольку этот белок находится в высоких концентрациях в
эритроцитах, он превращает клетки из стандартного диска в
серповидную форму, что сокращает время жизни клеток, что приводит к
анемии.
Чтобы более подробно понять структуру белков, мы далее
исследуем четыре уровня, определяющие их форму.
Структура белка
Структура
белка
описывается
на
четырех
различных
уровнях. Расположение аминокислот в полипептидной цепи называют ее
первичной структурой. Каждая аминокислота в полипептидной цепи
называется остатком, а связанный ряд атомов углерода, азота и
кислорода известен как основная цепь или белковый остов. Первая
аминогруппа в начале пептидной цепи известна как N-конец, а конец с
карбоксильной группой — С-конец. Когда мы подсчитываем или
записываем остатки в полипептидной цепи, мы начинаем с Nконца. Расположение дисульфидных связей, ковалентно связывающих
разные части полипептидной цепи, также считается частью первичной
структуры.
Вторичная структура белка — это способ организации первичной
структуры белка в результате образования регулярных водородных
связей между основными группами C = O и NH каждой пептидной связи.
Однако сама пептидная связь вращаться не может, так как имеет двойной
характер за счет резонансной стабилизации (рисунок 4), при которой
азот отдает свою неподеленную пару электронов карбонильному
углероду, смещая электроны к кислороду. В результате электроны
делокализуются между несколькими атомами, что увеличивает
стабильность связи и уменьшает вращение (рисунок 5А). Таким образом,
вращение может происходить только вокруг связи между C α и группой C
= O (угол phi (φ)) и C α и группой NH (угол psi (ψ)). По сути, полипептидная
основная цепь состоит из повторяющегося ряда из двух вращающихся
связей, за которыми следует одна невращающаяся (пептидная)
связь. Однако не все 360o углов psi и phi возможны, поскольку соседние
боковые
цепи
могут
столкнуться
из-за
стерических
затруднений. Фактически, для определенных углов и комбинаций
аминокислот атомы не могут находиться в одном и том же физическом
месте, и это частично объясняет, почему некоторые аминокислоты
имеют более высокую склонность (вероятность) к образованию
различных типов вторичной структуры. В рамках этих ограничений
двумя основными локальными конформациями, которые избегают
стерических затруднений и максимизируют водородные связи между
остовами, являются α-спираль и вторичные структуры β-листа (рисунок
5).
рисунок 4.
Резонансная стабилизация приводит к тому, что пептидная связь имеет
двойной характер и несет диполь.
Скобки: Двунаправленная стрелка означает, что пептидная связь представляет собой
гибрид
двух
состояний. При
резонансе
азот
может
отдавать
свою
негибридизованную неподеленную пару электронов карбонильному углероду и
отталкивать электроны от карбонильной двойной связи к кислороду, образуя анион
кислорода. Изображение справа: резонансная структура пептидной связи показана
фиолетовым цветом. Азот имеет тенденцию делиться своей неподеленной парой
электронов с карбонильным углеродом, делокализуя электроны среди атомов азота,
углерода и кислорода. Также показан индивидуальный дипольный момент (стрелка),
связанный со связью. Пунктирная линия указывает на резонанс пептидной связи, а
дополнительная стабильность приводит к невращающейся пептидной связи.
рисунок 5
Белковые вторичные структурные элементы
(A) Схема общей полипептидной цепи. Боковые цепи аминокислот обозначены как R.
Цветные прямоугольники обозначают наборы из шести атомов, копланарных из-за
характера двойной связи пептидной связи. Стрелки указывают на связи, которые
могут свободно вращаться с углом вращения вокруг N-C α , известного как phi, и
вокруг C α -C, известного как psi. Обратите внимание, что помечены только связи
пептидного остова, в большинстве случаев связь R-группы может свободно
вращаться. (B) Линейное изображение химической структуры полипептидного
остова из трех β-цепей внутри β-листа. Водородные связи между группами –CO и –NH
основной цепи показаны пунктирными линиями. Параллельные листы содержат βтяжи, идущие в одном направлении, тогда как антипараллельные листы содержат βтяжи, идущие в направлении, противоположном соседнему. (C) Мультяшное
представление (также известное как ленточная диаграмма) антипараллельной
области β-листа из более крупного белка. В этом примере три β-нити соединены
короткими петлями. Стрелки, представляющие β-цепи, условно указывают на Сконец. Водородные связи, удерживающие листы вместе, показаны пунктирными
линиями. (D) Вид сбоку того же β-листа, показывающий отдельные остатки боковых
цепей. Атомы окрашены углеродом в розовый цвет, серой в желтый, кислородом в
красный и азотом в синий. Обратите внимание, что остатки на неполярной стороне в
основном состоят из неполярных углеродсодержащих остатков, тогда как остатки на
полярной стороне содержат атомы кислорода и азота и представляют собой смесь
ионных и полярных боковых цепей. Каждая прядь имеет небольшой изгиб, который
можно увидеть на изображении. (E) Схематичное изображение α-спирали с
последовательностью NH 2–SGEFARICRDLSHIG–COOH. Водородные связи между
атомами основной цепи показаны пунктирными линиями. Атомы окрашены
углеродом в светло-голубой цвет, серой в желтый цвет, кислородом в красный цвет и
азотом в синий цвет. Обратите внимание, что все пептидные связи в α-спирали
направлены в одном направлении и связаны с остатком в четырех местах цепи. (F)
Мультяшное изображение той же α-спирали, что и в более крупных белковых
структурах. (G) Вид α-спирали в разрезе: боковые цепи расходятся наружу, от центра
спирали.
α-спираль представляет собой правозакрученный клубок, в
котором основная группа NH связана водородными связями с основной
группой C = O аминокислоты, расположенной четырьмя остатками ранее
по последовательности белка. В результате полипептидная цепь
скручивается в виде правильной спирали, а R-группы направлены
наружу, в сторону от пептидной цепи. Для полного оборота спирали
требуется примерно 3,6 остатка.
β-листы состоят из двух или более вытянутых полипептидных
цепей, называемых β-нитями, которые идут рядом друг с другом. Они
могут располагаться как параллельно, так и антипараллельно. Остатки
аминокислот располагаются в виде правильного зигзага, при этом
соседние пептидные связи направлены в противоположные стороны.
При таком расположении NH-группа и C = O-группа каждой
аминокислоты образуют водородную связь с C = O-группой и NH-группой
соответственно на соседних тяжах. Цепи могут располагаться в
противоположных направлениях, образуя антипараллельный β-лист,
или в одном направлении, образуя параллельный β-лист. Боковые цепи
каждого из остатков направлены в противоположные стороны от листов
и чередуются между собой. В первичной структуре часто наблюдается
чередование гидрофильных и гидрофобных остатков, что придаёт βлистам гидрофильную и гидрофобную поверхности.
Общий трехмерный (3D) вид белка называется его третичной
структурой. Она формируется за счёт взаимодействия между боковыми
цепями (R-группами) и за счёт того, как вторичная структура
складывается в белок. Четвертичная структура — это то, как несколько
свернутых
белковых
цепей
(называемые
субъединицами)
взаимодействуют
и
организуются,
образуя
более
крупный
многосубъединичный белковый комплекс. Примеры третичной и
четвертичной структур можно увидеть в некоторых из первых белков,
структура которых была определена с помощью рентгеновской
кристаллографии, как показано на рисунке 3. Структуру белка часто
представляют в виде модели, в которых β-цепи представлены в виде
стрелок, а α-спирали в виде ленты или трубки. Например, гемоглобин
представляет собой α-спиральный белок с четвертичной структурой,
состоящий из четырех субъединиц, известный как тетрамер. Структуру
можно увидеть на рисунке 3 в виде мультяшного изображения,
покрытого прозрачной молекулярной поверхностью белка. По мере того,
как было расшифровано все больше белков, стало ясно, что существует
много разных форм и структур белков, которые, по-видимому,
организованы в отдельные единицы, называемые белковыми
доменами. В настоящее время существует около 165 000 белковых
структур, а их третичные и четвертичные структуры классифицируются
по группам в соответствии с двумя основными классификационными
системами, называемыми CATH и SCOP. Мы сосредоточимся на
концепции белковых доменов в следующем разделе.
Белковые домены
Форма белка определяется расположением элементов вторичной
структуры, таких как α-спирали и β-слои, в узнаваемые конформации,
называемые мотивами (или сверхвторичной структурой). Мотивы
представляют собой короткие сегменты структуры белка, и такое же
расположение можно найти во многих различных белках. Например, βповорот связывает β-цепи вместе и состоит из четырех
последовательных остатков, которые позволяют полипептидной цепи
свернуться почти на 180 градусов. Мотив β-α-β состоит из параллельных
β-цепей, соединенных α-спиралью, пересекающей две нити. Элементы
вторичной структуры и мотивы организованы в отдельных белках в
компактные независимые трехмерные структуры, называемые
доменами. В отличие от мотивов, домены складываются независимо
от остальной части полноразмерной полипептидной цепи (рисунок
6). Расположение элементов вторичной структуры, описывающих форму
белкового домена, называется его складкой. Например, складка Россмана
имеет 2 мотива β-α-β с общей средней β-цепью, образующей домен. Этот
конкретный домен обнаружен во многих более крупных белках, что дает
ему возможность связывать нуклеотиды. Примечательно, что
существует всего около 2200 узнаваемых белковых складок, несмотря на
огромное количество возможных комбинаций аминокислот.
рисунок 6.
Мотивы, домены и полноразмерные белки
(A) Вторичная структура часто упаковывается в мотивы. Эти мотивы представляют
собой устойчивые легко складывающиеся композиции, но не могут существовать
самостоятельно. (B) Белковый домен представляет собой консервативную часть
заданной полноразмерной белковой последовательности с определенной третичной
структурой, которая может развиваться, функционировать и существовать
независимо от остальной части белковой цепи. Каждый домен образует компактную
трехмерную структуру и часто может быть независимо стабильным и складчатым,
как правило, с определенной функцией. (С) Большие белки обычно состоят из
нескольких независимо свернутых доменов. Белок представлен прямой линией от Nконца к С-концу, а любые белковые домены, которые он содержит, представлены в
прямоугольниках. Аминокислотная последовательность выделена на С-конце, и из-за
ее низкой сложности, состоящей только из пролина (P) и аланина (A), предполагается,
что она неупорядочена.
Другой способ классификации белков - по четырем основным
«типам» белков, каждый из которых имеет характерные
последовательности и структурные особенности:
1. Глобулярные (примерно сферические) и растворимые белки
(например, ферменты, обнаруженные в цитоплазме)
2. Мембранные белки в мембране клетки или органеллы (например,
рецепторы)
3. Волокнистые
белки (характеризующиеся
наличием
повторяющихся мотивов последовательности, например, коллаген)
4. Неструктурированные белки (описаны далее в тексте)
Существует много других способов классификации белковых
доменов, и две из наиболее часто используемых систем — это CATH и
системы структурной классификации белков (SCOP)(таблица 1). Обе
представляют собой иерархические системы классификации доменов, в
которых белки организованы на разные уровни в зависимости от
структурного сходства и сходства последовательностей, и у каждой есть
веб-сайты, которые вы можете изучить.
Таблица 1
Две основные системы классификации белковых доменов
CATH https://www.cathdb.info/
SCOP http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk
• Класс : Структуры классифицируются в
соответствии с составом их вторичной
структуры (в основном α, в основном β,
смешанные α/β или несколько вторичных
структур).
• Класс : Структуры
классифицируются в соответствии с
составом их вторичной структуры (в
основном α, в основном β,
смешанные α/β или несколько
вторичных структур).
• Архитектура: структуры классифицируются в
соответствии с их общей формой, которая
• Fold: группы на основе глобальных
определяется ориентацией вторичных структур в структурных особенностей, общих
трехмерном пространстве, но игнорирует связь
для большинства их членов.
между ними.
• Топология (складчатое семейство):
структуры группируются в группы складок на
этом уровне в зависимости как от общей формы,
так и от связности вторичных структур.
• Суперсемейство: Домены в складке
сгруппированы в суперсемейства,
которые имеют по крайней мере
отдаленного общего предка.
• Гомологичное суперсемейство: на этом
уровне группируются белковые домены,
которые, как считается, имеют общего предка.
• Семья: Домены в суперсемействе
сгруппированы в семьи, которые
имеют более позднего общего
предка.
В ходе эволюции многоклеточные организмы создали новые
большие белки, смешивая и сопоставляя существующие домены в новые
комбинации. Поскольку у каждого домена есть определенная функция
(например, связывание, катализ или активация генов), эти новые белки
будут обладать уникальной комбинацией свойств в зависимости от
содержащихся в них доменов. Белки, имеющие более чем несколько
общих доменов, обычно кодируются членами эволюционно родственных
генов. Таким образом, они составляют семейства генов, которые имеют
общего предка, а эквивалентные домены внутри семейства имеют
высокую
консервативность
последовательностей. Эти
домены
называются ортологами, и белки, в которых они находятся, обычно
играют одинаковую роль у всех видов. Гены белков, которые имеют
только один или несколько общих доменов, могут принадлежать к
надсемейству генов. Члены надсемейства могут иметь одну общую
функцию, но их последовательности в остальном не связаны. Сходные
домены, обнаруженные в разных полноразмерных белках одного и того
же организма, называются паралогами. Часто они давным-давно
отделились от общего предка, и эти домены обычно сохраняют только
самые важные структурные и функциональные свойства. Каждый
большой белок с различными доменами должен свернуться из исходной
линейной полипептидной цепи, и этот процесс рассматривается далее.
Сворачивание белков
Белковый домен в его функциональной и/или собранной форме
называется нативным. Это состояние является результатом того, что
боковые цепи аминокислот, присутствующие в полипептидной цепи,
благоприятно взаимодействуют друг с другом и стабилизируют
белок. Однако, когда белковый домен впервые транслируется рибосомой
с мРНК, он существует в виде линейной цепи аминокислот, не имеющей
структуры, и называется развернутым или «денатурированным». В этом
состоянии эти взаимодействия еще не сформировались. Если бы
развернутый белковый домен случайным образом перебирал все
возможные конформации, которые он мог создать, проверяя все
возможные комбинации взаимодействий, процесс нахождения
нативного состояния занял бы больше времени, чем возраст
Вселенной! Однако большинство белковых доменов могут спонтанно
укладываться в свое «нативное состояние» за время от 10−6 до
10−1 с. Процесс, посредством которого развернутый белковый домен
приобретает свое компактное трехмерное нативное состояние, известен
как сворачивание белка и изучается с точки зрения термодинамики и
кинетики. [Блок 1 - термодинамика].
Блок 1 Термодинамика
•
Чтобы понять, почему происходит сворачивание белка, мы должны
рассмотреть область термодинамики, целью которой является понять,
произойдет ли какая-либо химическая реакция. Другими словами,
благоприятно ли для реакции превращение реагентов в продукты? Для
этого нам придётся вспомнить некоторые основы, рассмотренные в
обзоре «Основы химии для биохимиков» из этой серии. Для начала важно
определить систему как интересующую нас реакцию (например, реакцию
сворачивания белка, включающую развернутые и свернутые белки и
любые молекулы растворителя или растворенного вещества, которые
взаимодействуют с этими белками), а окружающую среду — как все
остальное в Вселенной, которая находится вне системы. Как биохимики,
чтобы сделать прогноз о системной реакции, нас интересуют три
системные величины, называемые энтальпией, H; энтропия, S и
свободная энергия Гиббса G. Первый и второй законы термодинамики
помогут нам понять, откуда берутся эти величины.
•
•
Первый закон термодинамики гласит, что общее количество энергии во
Вселенной постоянно и что энергия не может быть ни создана, ни
уничтожена, но может быть преобразована из одной формы в
другую. Исходя из этого закона, мы можем начать отслеживать энергию,
например, если тепловая энергия теряется в результате реакции при
производстве продуктов, тогда энергия системы будет снижаться,
однако энергия окружающей среды будет увеличиваться по мере того,
как эта тепловая энергия просто переведут. Изменение теплосодержания
реакции определяется как ΔH и зависит от разорванных связей и новых
связей, образовавшихся во время реакции. В ходе реакции всякий раз,
когда образуется связь, тепловая энергия выделяется в окружающую
среду, а всякий раз, когда связь разрывается, тепловая энергия
поглощается системой из окружающей среды. Следовательно, чтобы
рассчитать ΔH, необходимо учитывать сумму энергий разорванных
связей и сумму энергий образовавшихся связей. Если при образовании
связи высвобождается больше энергии, чем энергия, затраченная при
разрыве связи, то энергия будет высвобождаться, и ΔH будет
отрицательным или экзотермическим. И наоборот, если при
образовании связи высвобождается меньше энергии, чем энергия,
затрачиваемая при разрыве связи, тогда энергия будет поглощаться, и ΔH
будет положительным или эндотермическим. При сворачивании белка
вовлеченными
взаимодействиями
обычно
являются
слабые
нековалентные связи, которые мы обсуждали ранее, включая
гидрофобный эффект, водородные связи, ван-дер-ваальсовы и другие
электростатические взаимодействия. Когда белок сворачивается, чаще
всего при образовании этих связей высвобождается больше энергии, чем
энергия, потребляемая при разрыве любых ранее существовавших
связей, присутствующих в развернутом состоянии (т. е. ΔH
отрицательно). Однако иногда белки могут сворачиваться даже при
положительном значении ΔH. Чтобы понять, почему это так, мы должны
также принять во внимание второй закон термодинамики.
Второй закон термодинамики гласит, что энтропия Вселенной всегда
увеличивается, другими словами, для того, чтобы сворачивание белка
происходило благоприятно, энтропия Вселенной должна увеличиваться
в результате этого процесса. Энтропия часто описывается как
беспорядок, что является знакомым большинству из нас термином в
физическом смысле, например, как мы видели в основном тексте,
молекулы воды, которые окружают развернутый белок и
взаимодействуют с ним, достаточно упорядочены и ограничены, и это
только когда белки сворачиваются и вытесняют эти молекулы воды, они
могут покинуть поверхность белка и больше двигаться, что существенно
увеличивает их беспорядок. Лучше думать об энтропии, как о количестве
способов распределения энергии в системе. Например, если объект
горячий, то у него много тепловой энергии сосредоточено в одном месте
(в объекте). Однако, если вы поместите этот объект в холодную воду,
тепло всегда передается воде и нагревает ее, поскольку тепловая энергия
рассеивается и распространяется от объекта в воду. Это происходит по
мере того, как рассеивание энергии увеличивает количество способов ее
распределения. На самом деле, чем больше движение связей или атомов
в молекулах, тем больше способов распределения энергии. В
экзотермической реакции энергия высвобождается в окружающую среду
и увеличивает энтропию Вселенной, поскольку теперь энергия
рассеяна. Следовательно, энтропия Вселенной может увеличиваться
двумя способами: либо за счет увеличения энтропии системы (ΔS > 0),
либо за счет рассеивания энергии от системы к окружающей среде (ΔH <
0). Количество свободной энергии Гиббса используется для
отслеживания изменения энтропии Вселенной ( если вы поместите этот
объект в холодную воду, тепло всегда передается воде и нагревает ее,
поскольку тепловая энергия рассеивается и распространяется от объекта
в воду. Это происходит по мере того, как рассеивание энергии
увеличивает количество способов ее распределения. На самом деле, чем
больше движение связей или атомов в молекулах, тем больше способов
распределения
энергии. В
экзотермической
реакции
энергия
высвобождается в окружающую среду и увеличивает энтропию
Вселенной, поскольку теперь энергия рассеяна. Следовательно, энтропия
Вселенной может увеличиваться двумя способами: либо за счет
увеличения энтропии системы (ΔS > 0), либо за счет рассеивания энергии
от системы к окружающей среде (ΔH < 0). Количество свободной энергии
Гиббса используется для отслеживания изменения энтропии Вселенной
(если вы поместите этот объект в холодную воду, тепло всегда
передается воде и нагревает ее, поскольку тепловая энергия
рассеивается и распространяется от объекта в воду. Это происходит по
мере того, как рассеивание энергии увеличивает количество способов ее
распределения. На самом деле, чем больше движение связей или атомов
в молекулах, тем больше способов распределения энергии. В
экзотермической реакции энергия высвобождается в окружающую среду
и увеличивает энтропию Вселенной, поскольку теперь энергия
рассеяна. Следовательно, энтропия Вселенной может увеличиваться
двумя способами: либо за счет увеличения энтропии системы (ΔS > 0),
либо за счет рассеивания энергии от системы к окружающей среде (ΔH <
0). Количество свободной энергии Гиббса используется для
отслеживания изменения энтропии Вселенной (уравнение 1 ).
ΔСвселенная= - Δ G / T
(1)
ΔS Universe , Изменение энтропии Вселенной; ΔG, изменение свободной
энергии Гиббса по мере изготовления изделий (т. е. из развернутого в
сложенное); T, температура (в Кельвинах).
•
Когда ΔG отрицателен, ΔS Вселенной положителен, и реакция будет
происходить, и наоборот . Трудно отслеживать изменения энтропии и
энтальпии во всей Вселенной, и, к счастью, мы можем просто
сосредоточиться на изменении энтропии и энтальпии реакции
сворачивания белка (только в системе) и игнорировать изменения в
окружающей среде, потому что ΔG также является функцией энтальпия и
энтропия системной реакции (уравнение 2).
ΔG=ΔH−TΔS
(2)
ΔH, изменение энтальпии при производстве продуктов из реагентов (т.е. из
развернутого в свернутое); ΔS, изменение энтропии по мере того, как
продукты производятся из реагентов (т.е. из развернутого в свернутое).
•
Следует отметить, что биохимики не могут предсказать ΔH и ΔS и должны
полагаться на экспериментальные калориметрические измерения для
определения этих значений. Как видно из (уравнение 2), для
самопроизвольного складывания белка (и окружающих его
взаимодействующих молекул воды) у него будет больше свободной
энергии в развернутом состоянии и меньше свободной энергии в
свернутом состоянии. Чтобы представить изменение свободной энергии
ансамбля белков, полезно показать ход реакции, который измеряется
экспериментально с использованием классической энергетической
диаграммы, как описано в основном тексте.
Любая самопроизвольная (благоприятная) реакция в природе
приводит к уменьшению ее свободной энергии, что диктуется законами
термодинамики. Например, сворачивание белковых доменов является
спонтанной реакцией, когда происходит отрицательное изменение
свободной энергии Гиббса (G), и белковый домен переходит в состояние
с меньшей энергией. Изменение свободной энергии Гиббса (ΔG) имеет
две составляющие, на которые влияет температура; изменение
энтальпии (H, мера энергий образовавшихся и разорванных связей в
системе) и изменение энтропии (S, мера изменения «беспорядка» в
системе), как видно из (уравнение 2). Движущая сила сворачивания белка
является результатом гидрофобного коллапса, образования водородных
связей, электростатических взаимодействий и ван-дер-ваальсовых
взаимодействий, которые снижают свободную энергию. Согласно
(уравнение 2), для того чтобы отрицательное значение ΔG и
сворачивание белка стало термодинамически благоприятным,
изменение этих взаимодействий должно привести либо к
благоприятному изменению энтальпии системы (ΔH) и/или энтропии
(ΔS).
Когда аминокислоты образуют новые водородные связи, ван-дерваальсовы и другие электростатические взаимодействия, это приводит к
выделению тепла, а разрыв этих связей с водой приводит к поглощению
тепла. Следовательно, отношение образования связи к разрыву связи в
развернутом и свернутом состояниях будет определять ΔH. Однако в
основе гидрофобного эффекта (сворачивания) лежит увеличение
энтропии связанной с белком воды и является важнейшей движущей
силой фолдинга белка. Когда белковый домен находится в развернутом
состоянии, молекулы воды должны упорядочиваться в виде
льдоподобных структур вокруг гидрофобных групп полипептидной
цепи, что создает порядок в системе и поэтому имеет меньшую энтропию,
чем свободные молекулы воды (Рисунок 7А). В результате гидратные
оболочки вокруг боковых цепей больше не требуются, и эти молекулы
воды становятся неупорядоченными (свободными для выборки
нескольких состояний и взаимодействий), вызывая положительное
изменение энтропии системы (ΔS). Следует отметить, что по мере
сворачивания белкового домена полипептидная цепь теряет энтропию,
поскольку принимает единственную доминирующую свернутую
конформацию (форму), однако это уменьшение энтропии часто
компенсируется гидрофобным эффектом, описанным выше.
Рисунок 7. Два состояния сворачивания небольшого белка
(А) Гидрофобный коллапс. В компактной складке (справа) гидрофобные
аминокислоты (показаны черными сферами) схлопываются по направлению к
центру, защищаясь от водной среды. (B) Классический взгляд на сворачивание
белка. На
диаграмме
представлена
свободная
энергия
нативного
и
денатурированного ансамблей белка в условиях, когда нативное состояние
предпочтительнее, поскольку нативное состояние имеет более низкую свободную
энергию, чем развернутое состояние. Разница свободной энергии между этими
состояниями (ΔG) является мерой стабильности белка. Ансамбль переходного
состояния представляет собой популяцию короткоживущих и частично свернутых
конформаций, которые нельзя непосредственно наблюдать в экспериментах, но
которые необходимо пройти, чтобы свернуться, и определяет активационный барьер
для свертываний (ΔG #складывание) и разворачивание (ΔG # разворачивание).
Для любого данного белка существует несколько различных путей
фолдинга, которые позволяют одному и тому же белку достигать своего
нативного состояния разными путями. Экспериментально мы не можем
различить эти отдельные «микроскопические» пути и можем только
отслеживать «макроскопические» изменения вдоль координаты реакции
с помощью спектроскопических методов (например, измеряя изменения
сигнала флуоресценции или КД при сворачивании белка в реальном
времени). Если мы представим связанную свободную энергию
«макроскопического» ансамбля путей, мы создадим классическую
энергетическую диаграмму (рисунок 7B), который показывает
свободную энергию белка при переходе от развернутого ансамбля
(слева) к свернутому ансамблю (справа). Часто небольшие белковые
домены из нескольких сотен аминокислот могут складываться за один
шаг, проходя через ансамбль переходных состояний с высокой
энергией. Однако более крупные белковые домены часто проходят через
ряд промежуточных состояний, которые являются стабильными, но не
полностью свернутыми, прежде чем процесс завершится. Классический
взгляд полезен для интерпретации экспериментальных измерений,
однако теоретические и вычислительные исследования в настоящее
время работают над новым взглядом на складчатость, который пытается
понять и представить микроскопические пути. Здесь белки
представляют собой объекты с несколькими состояниями, которые
складываются по множеству непредсказуемых путей и промежуточных
конформаций.
Белковые домены сворачиваются, потому что нативное состояние
высвобождает воду в более неупорядоченное состояние (увеличивая
энтропию), а новые связи (по сравнению со старыми связями) обычно
приводят к выделению тепла, уменьшая энтальпию. В совокупности это
приводит
к
уменьшению
свободной
энергии
Гиббса
и
самопроизвольному складыванию. Однако только потому, что свернутый
белок имеет меньшую энергию, чем развернутый, это указывает только
на то, что процесс благоприятен для протекания. Скорость, с которой это
происходит (скорость реакции), не зависит от ΔG и вместо этого
определяется размером барьера между энергией ансамбля развернутых
белков и энергией ансамбля переходного состояния (также известного
как активационный барьер). или ΔG #для складывания). Чем ниже
энергия ансамбля переходных состояний, тем быстрее сворачивается
белок, что может достигать микросекунд. Мы до сих пор не до конца
понимаем, как предсказать, как будет складываться белковый домен,
насколько это будет благоприятно и как быстро это будет
происходить. Один из подходов к изучению правил состоит в том, чтобы
изучить, как люди участвуют в игре по складыванию белков. Если вы
хотите принять участие и весело провести время, пытаясь сложить свой
собственный белок с помощью компьютера, посетите сайт fold.it.
Каждый домен в полноразмерном белке обычно укладывается
независимо; однако иногда один или несколько доменов могут
неправильно складываться, и белок иногда запутывается, образуя
белковый агрегат, который описан далее.
Неправильный фолдинг белка
Большую часть времени свернутые белки остаются свернутыми,
однако при определенных условиях обычно стабильные нативно
свернутые белки могут частично разворачиваться и собираться в
мультисубъединичную агрегированную форму, известную как
амилоид. Образование амилоида связано с целым рядом все более
распространенных заболеваний человека, включая болезни Альцгеймера
и Паркинсона, а также диабет II типа, при котором он накапливается в
органах и тканях по всему телу. Различные белки могут образовывать
амилоид, и каждый из них связан со своим заболеванием. Что интригует
в амилоиде, так это то, что для ряда белковых структур конечный
амилоидный материал, который они принимают, имеет удивительно
похожую структуру.
Под электронным микроскопом амилоид выглядит как длинные
неразветвленные волокна, состоящие из нитей, которые обвиваются
друг вокруг друга, как нити в веревке. На структурном уровне белка
филаменты состоят из параллельных вытянутых структур β-листов,
известных как перекрестные β. Отдельные β-тяжи уложены в регистр,
один поверх другого, идущие перпендикулярно оси фибриллы. Боковые
цепи выступают из листов, а водородные связи, удерживающие листы
вместе, проходят по длине перекрестной β-фибриллы. Поскольку βлисты удерживаются вместе за счет взаимодействий пептидного остова,
которые могут образовывать все белки, это помогает объяснить, почему
так много белков могут принять эту структуру (рисунок 8). Помимо
похожей структуры, амилоидные фибриллы из разных белков обладают
способностью связывать гистологические красители.
Рисунок 8. Кросс-β-структура амилоидного материала
Структура амилоидного триплета фибриллы с атомарным разрешением ЯМР
(справа),
соответствующая
крио-ЭМ-реконструкции
(в
центре). Фоновое
изображение фибриллы (слева) было получено с помощью просвечивающей
электронной микроскопии (масштабная линейка, 50 нм). Составляющие β-листы
показаны в виде ленты синим цветом; атомы кислорода, углерода и азота показаны
красным, серым и синим цветом соответственно. Обратите внимание, что в кросс-βструктуре β-тяжи уложены друг на друга. Изображение адаптировано с разрешения
Фитцпатрика, Дебелухиной, Байро, Клэр, Капорини, Баджаджа, Яронца, Ванга,
Ладижанского и Мюллера (2013) Атомная структура и иерархическая сборка кросс-βамилоидной фибриллы. проц. Натл. акад. науч. США 110 , 5468–5473. Сокращения:
крио-ЭМ, криогенная электронная микроскопия; ЯМР, ядерно-магнитный резонанс.
Сборка амилоида начинается с того, что белок принимает частично
развернутую конформацию. Это состояние не является ни полностью
свернутым, ни развернутым, и сохраняет вторичные структурные
элементы, такие как β-листы и α-спирали. Однако он теряет
определенную третичную структуру и плотную упаковку свернутого
белка. Экспериментально известно, что низкий pH, высокая температура
и низкие концентрации денатурирующих веществ способствуют
принятию частично развернутых конформаций. Мутации, при которых
одна аминокислота заменяется другой, также могут способствовать
более легкому принятию частично развернутой конформации. С
возрастом у людей также происходит постепенное ослабление
способности клеток удалять неправильно свернутые белки, что
объясняет, почему некоторые амилоидные заболевания, такие как
болезнь Альцгеймера с ранним началом, являются наследственными и
возрастными. Первоначально считалось, что амилоидные фибриллы
ответственны за возникновение болезни, но сейчас принято считать, что
наиболее токсичной структурой является олигомер, который
накапливается на ранних стадиях образования амилоида. Олигомеры –
это гибкие и растворимые вещества, существующие в нескольких
формах. Они вызывают токсическое усиление функции, и определение их
структуры остается одной из серьезных задач структурной биологии. На
самом деле все свёрнутые и неправильно свёрнутые белки, независимо
от их структуры, обладают определённой гибкостью и динамикой,
которые играют ключевую роль в их функционировании. Об этом мы
поговорим далее.
Белковая динамика
Белки не являются статичными и часто изменяют свою исходную
нативную структуру, чтобы обеспечить возможность связывания или
катализа. Например, фермент гексокиназа (рисунок 3), который
участвует в первой стадии гликолиза (расщепление глюкозы), меняет
конформацию. Этот фермент содержит два (суб)домена, между которыми
находится активный центр. Границы между белковыми доменами
являются идеальным местом для создания активных сайтов, поскольку
две части могут смещаться относительно друг друга в ответ на то, что
происходит между ними. Когда глюкоза связывается с активным
центром в открытой конформации, два домена меняют своё положение и
«захватывают» субстрат, образуя закрытую конформацию. Это
конформационное изменение позволяет гексокиназе располагать свои
каталитические остатки вокруг глюкозы. Попав в активный центр,
субстрат фосфорилируется с помощью молекулы связанного
аденозинтрифосфата (АТФ), что приводит к образованию глюкозо-6фосфата.
Гексокиназа и другие белки в целом не ограничиваются
несколькими
конформационными
состояниями.
Белки
лучше
рассматривать как динамические молекулы, которые переходят из
одного состояния в другое. Они постоянно находятся в движении: атомы
вибрируют, связи колеблются, а иногда происходят более значительные
колебания, когда белок принимает другие возможные конформации. Эти
структурные изменения и динамические движения необходимы для
связывания субстрата и многих других функций. Благодаря
компьютерному моделированию мы начинаем визуализировать весь
процесс в режиме реального времени в виде молекулярных фильмов,
созданных с помощью молекулярно-динамического моделирования. Эти
видеоролики показывают, почему сворачивание, структура, динамика и
взаимодействие имеют центральное значение для понимания биологии
белка.
Интересным последствием конформационных изменений является
то, что после того, как один лиганд связался с белком, он может изменить
форму отдельного сайта связывания, так что аффинность связывания
другого лиганда в этом удаленном сайте также изменится. Другими
словами, второй лиганд может иметь различную аффинность к своему
белку-мишени в зависимости от того, связан ли первый лиганд. Эта
концепция известна как аллостерия и занимает центральное место в
регуляции белков и ферментов. Например, в гемоглобине есть четыре
субъединицы, каждая из которых содержит группу гема, которая
связывает кислород (рисунок 3). Связывание кислорода в четырех
участках гема не обязательно происходит одновременно. Как только
первый атом гема связывается с кислородом, в структуре
соответствующей белковой цепи (субъединицы) происходят небольшие
изменения. Эти изменения приводят к смещению соседней цепи, в
результате чего она слегка поворачивается и принимает другую форму,
что облегчает связывание последующих молекул кислорода (рисунок
9). Этот эффект называется положительной аллостерией, поскольку он
повышает вероятность следующего события. Аллостерия играет
ключевую роль в регуляции метаболических путей, так как ферменты в
начале пути могут подавляться при слишком высоком уровне продукта
за счёт ингибирования по принципу обратной связи. Конечный продукт
обычно вызывает конформационные изменения в ферменте на первой
(обязательной) стадии, так что его субстрат больше не может
связываться с его активным центром. Этот процесс называется
отрицательной аллостерией (рисунок 10).
Рисунок 9. Положительная аллостерия гемоглобина
Эта диаграмма иллюстрирует «последовательную» модель кооперативности, которая
предполагает, что связывание кислорода с одной субъединицей гемоглобина
запускает последовательность конформационных изменений в других субъединицах
гемоглобина, которые увеличивают их сродство к кислороду, и что это происходит
последовательно. Связывание кислорода (синий кружок) в одной субъединице
вызывает структурное изменение в соседней субъединице (фиолетовый), что делает
их более способными связывать другую молекулу кислорода.
Рисунок 10. Ингибирование обратной связи в метаболических путях
Производство метаболита E в этом четырехэтапном метаболическом пути позволяет
ему связываться с первым ферментом пути, чтобы отключить его, тем самым
регулируя количество E в клетке. Когда уровень Е падает, путь снова включается,
поскольку первый фермент больше не ингибируется. Часто это ингибирование по
принципу обратной связи вызывается отрицательной аллостерией, которая
включает изменение конформации активного центра за счет связывания другой
молекулы в другом месте фермента.
Белки совершают множество других типов движений, таких как
внутренние колебания и вращения метильных групп, а также
коллективные движения групп атомов, например, колебательные
движения длинных боковых цепей или переворот коротких пептидных
петель. Каждое из этих движений чрезвычайно важно, а также часто
играет центральную роль в функции белка. По мере увеличения числа
обменивающихся конформаций просто невозможно представить белок с
единой структурой. Вместо этого его нужно описывать как совокупность
множества взаимопреобразующихся конформаций, известную как
структурный ансамбль. Структурные ансамбли особенно важны, когда
белок имеет большую внутренне неупорядоченную область (IDR),
которая имеет небольшое количество объемных гидрофобных
аминокислот, так что изолированно она остается развернутой, несмотря
на то, что другие части белка свернуты. Некоторые белки настолько
гибкие и динамичные, что их относят к внутренне неупорядоченным
белкам, у которых вообще нет определённой вторичной структуры. Это
открытие было сделано относительно недавно, так как считалось, что
развёрнутые белки образуются только в экстремальных условиях,
например при высокой температуре, кислотности или в результате
серьёзных мутаций. На самом деле существует целый ряд белков, у одних
из которых преобладает одна структура, а другие полностью
неупорядочены и их лучше описывать как динамический ансамбль
неструктурированных конформаций.
За последние 20 лет возрос интерес к неупорядоченным белкам,
поскольку примерно треть белков в организме человека содержит
неупорядоченные участки длиной 30 и более аминокислотных остатков.
Благодаря своей нестабильной структуре неупорядоченные белки
обладают множеством преимуществ для функционирования клеток.
Гибкость неупорядоченного белка означает, что к нему могут легко
получить доступ такие ферменты, как киназы, которые могут
посттрансляционно модифицировать его (в случае с киназой это будет
добавление
фосфатной
группы). Во
многих
случаях,
когда
неупорядоченный белок или участок связывается с мишенью, он
претерпевает конформационные изменения, приобретая более
определенную структуру (рисунок 11). Один и тот же белок может
действовать как молекулярный узел и связывать ряд молекул, включая
малые лиганды, поверхности мембран или другие белки. Сворачивание
при связывании не всегда должно происходить, и несколько событий
связывания могут одновременно работать вместе с неупорядоченным
белком, изменяя его структуру и динамику. Неупорядоченному белку
может потребоваться связать несколько молекул, прежде чем он
приобретет трехмерную форму. При правильном сочетании стимулов
создаётся новый специфический ансамбль, формирующий подходящий
сайт связывания для следующей мишени в сигнальном каскаде, что
приводит к правильной реакции. Поэтому неудивительно, что
неупорядоченные белки регулируют передачу сигналов в клетках. В ходе
этого процесса сигналы, поступающие извне, преобразуются в реакции
внутри клетки. Один и тот же неупорядоченный белок может
обрабатывать множество стимулов, обеспечивая быструю и гибкую
реакцию на меняющиеся условия, с которыми сталкиваются клетки.
Неупорядоченные белки также участвуют в клеточном цикле,
транскрипции и трансляции, транспорте и апоптозе. Другой интересной
особенностью неупорядоченных белков является их способность
самособираться в многобелковые комплексы и при этом сохранять
довольно вытянутую неглобулярную форму, как и следовало ожидать от
белков, которые сворачиваются независимо друг от друга. Эти
расширенные конформации позволяют неупорядоченным белкам
превращаться в молекулярный клей, который имеет гораздо большую
площадь поверхности для контактов между белками и скрепляет
комплекс вместе, как это можно увидеть при сборке дрожжевой
рибосомы. Неупорядоченные белки также участвуют в активности
клеточного цикла, транскрипции и трансляции, транспорте грузов и
апоптозе. Другой интересной областью неупорядоченных белков
является их способность самособираться в многобелковые комплексы и
при этом сохранять довольно вытянутую неглобулярную форму, как и
следовало ожидать от независимо свернутых белков. Такие вытянутые
конформации позволяют неупорядоченным белкам выступать в роли
молекулярного клея, который имеет гораздо большую площадь
поверхности для контактов между белками и скрепляет комплекс, как
это видно на примере сборки рибосомы дрожжей.
Рисунок 11. Мультфильм о парном складывании и переплете
PUMA представляет собой внутренне неупорядоченный белок (зеленый), который
складывается при связывании со свернутым белком MCL-1 (белый). Перед
связыванием PUMA моделируется как ансамбль быстро взаимопревращающихся
развернутых состояний.
Наконец, было показано, что неупорядоченные белки с
«мультивалентными» или «множественными взаимодействующими»
сайтами быстро и динамично взаимодействуют друг с другом, что может
привести к разделению на жидкую и твёрдую фазы. В этих случаях
вместо образования амилоида или определенного крупного комплекса
некоторые неупорядоченные белки объединяются, образуя отдельную
жидкую фазу внутри клетки, обогащенную этими поливалентными
молекулами. Образующаяся
новая
жидкая
фаза
называется
биомолекулярным конденсатом и позволяет клетке организовывать и
концентрировать
молекулы,
участвующие
в
определенной
биохимической реакции, подобно классическим мембраносвязанным
органеллам, таким как митохондрии. По этой причине их часто называют
безмембранными органеллами. Некоторые из этих жидких фаз можно
увидеть непосредственно под микроскопом, например ядрышки и тельца
Кахаля. Молекулы внутри них выполняют в клетке определенные
функции. Следовательно, неупорядоченные белки чрезвычайно важны
для клетки, и в будущем они займут центральное место в понимании
того, как структура белка влияет на его функцию.
Доступность данных
Данные CD для иммуноглобулина были смоделированы из кода pdb: 1igt
с использованием PDB2CD [Mavridis and Janes (2017) PDB2CD: вебприложение для создания спектров кругового дихроизма из координат
атомов белка. Биоинформатика 33 , 56–63]. Данные CD для
растворимого домена белка микроэкзонного гена 14 (CD0004062000) и
инсулина (CD0000040000) были извлечены из PCDDBID [Whitmore, Miles,
Mavridis, Janes and Wallace (2017) PCDDB: новые разработки в банке
данных белкового кругового дихроизма. Нуклеиновые Кислоты
Res. 45 (D1), D303–D307] [Lopes, Orcia, Araujo, DeMarco and Wallace
(2013) Biophys. Дж. 104, 2512–2520]. Компакт-диски были созданы с
использованием Szilágyi (2019): EMANIM: интерактивная визуализация
электромагнитных волн. Веб-приложение доступно по
адресу https://emanim.szialab.org . Все остальные коды PDB для рисунков
указаны в их легендах.