Биохимия: Учебно-методическое пособие Часть 1

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФГБОУ ВО «МАРИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ »
ИНСТИТУТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК И ФАРМАЦИИ
БИОХИМИЯ
Часть I
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ
Йошкар-Ола
2025
ТЕМА 1.
УДК 577.1(075.8)
ББК Е072я73
Б 638
Рецензенты:
М. Е. Неганова, доктор биологических наук, ведущий
научный сотрудник лаборатории биологических испытаний института физиологически активных веществ ФИЦ
ПХФ и МХ РАН;
М. В. Дубинин, доктор биологических наук, доцент, профессор кафедры биохимии, клеточной биологии и микробиологии ФГБОУ ВО «Марийский государственный университет»
Утверждено ученым советом
Марийского государственного университета
Б 638
Биохимия : учебно-методическое пособие. – 2-е издание,
перераб. и доп. / Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, ФГБОУ ВО «Марийский государственный университет» ; составители: О. В. Попова, А. А. Семенова, А. И. Рыбакова, О. Э. Краснощёкова. – Йошкар-Ола : Марийский гос. ун-т, 2025.
ISBN 978-5-907799-44-8.
Часть I: Биохимия. – 194 с.
ISBN 978-5-907799-45-5.
В учебно-методическом пособии рассмотрены основные темы,
предусмотренные программой дисциплины «Биохимия». Приведен теоретический материал, лабораторные работы и контрольные
вопросы к ним. Даны контрольные вопросы к каждому занятию
для самоподготовки студентов, к итоговым занятиям по темам,
тестовые задания для самоконтроля.
Для студентов 2 и 3 курсов следующих специальностей и направлений подготовки: 33.05.01 Фармация, 31.05.01 Лечебное дело,
31.05.02 Педиатрия, 06.03.01 Биология (профиль Биомедицина).
УДК 577.1(075.8)
ББК Е072я73
ISBN 978-5-907799-44-8
SBN 978-5-907799-45-5
© ФГБОУ ВО «Марийский
государственный университет», 2025
© Попова О. В., Семенова А. А.,
Рыбакова А. И., Краснощёкова О. Э.,
составление, 2025
2
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
AA – арахидоновая кислота
ALA – альфа-линоленовая кислота
DHA – докозагексаеновая кислота
EPA – эйкозапентаеновая кислота
GLA – гамма-линоленовая кислота
LA – линолевая кислота
ОА – олеиновая кислота
АДГ – антидиуретический гормон
АДФ – аденозиндифосфат
АКТГ – адренокортикотропный гормон
АМФ – аденозинмонофосфат
АСТ – аспартатаминотрансфераза
АТФ – аденозинтрифосфат
АФК – активные формы кислорода
ГАМК – гамма-аминомасляная кислота
ГМФ – гуанозинмонофосфат
ГТФ – гуанозинтрифосфат
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНП – дезоксирибонуклеопротеины
2,4-ДНФ – 2,4-динитрофенол
КК – креатинкиназа
КЧ – каталазное число
ЛДГ – лактатдегидрогеназа
ЛП – липопротеины
ЛПВП – липопротеины высокой плотности
ЛПНП – липопротеины низкой плотности
ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности
МДА – малоновый диальдегид
МНЖК – мононенасыщенные жирные кислоты
НАД+ – никотинамидадениндинуклеотид
НАДН-ДГ – НАДН-дегидрогеназа
НАДФ – никотинамидадениндинуклеотид фосфат
НЭЖК – неэстерифицированные жирные кислоты
ПВК – пировиноградная кислота
ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты
ПОЛ – перекисное окисление липидов
РНК – рибонуклеиновая кислота
3
ТЕМА 1.
РНП – рибонуклеопротеины
РОП – редокс-потенциал
СОД – супероксиддисмутаза
СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита
СР – свободный радикал
СТГ – соматотропный гормон
ТТГ – тиреотропный гормон
ФАД – флавинадениндинуклеотид
ФМН – флавинмононуклеотид
ХМ – хиломикроны
цАМФ – циклический аденозинмонофосфат
цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат
ЦНС – центральная нервная система
ЦТК – цикл трикарбоновых кислот
ЦТФ – цитидинтрифосфат
УТФ – уридинтрифосфат
4
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ПРЕДИСЛОВИЕ
Биохимия – это теоретическая основа медицины.
Подготовка врача, изучение других профессиональных дисциплин и
вся дальнейшая профессиональная врачебная деятельность стоит на трех
«китах» – морфологии (гистология и анатомия), физиологии и биохимии.
Биохимия – это химия живых существ. Живая система от неживой
отличается обменом веществ и энергии (метаболизмом). В результате обмена веществ (метаболизма) в биологические внутренние среды нашего
организма поступает большое количество продуктов обмена веществ
(метаболитов), содержание которых у здорового человека варьирует незначительно и составляет гомеостаз внутренних сред организма (кровь, сыворотка, спинномозговая жидкость, моча, пищеварительные соки и др.).
Практически любое заболевание начинается с повреждения (нарушения) одной реакции в метаболизме клетки, а затем оно распространяется
на ткань, орган и целый организм. Нарушение метаболизма ведет к нарушению гомеостаза в биологических жидкостях организма человека, что
сопровождается изменением биохимических показателей.
Значение клинико-биохимических методов исследования биологических сред организма велико в медицине. Только в крови человека можно
определить современными методами биохимических исследований
около 1000 показателей метаболизма.
Биохимические показатели биологических сред организма человека
широко используются при:
– постановке диагноза заболевания, особенно дифференциального
диагноза;
– выборе метода лечения;
– контроле за правильностью назначенного лечения;
– скрининге (выявлении болезни на доклинической стадии);
– мониторинге (контроле за течением заболевания и результатом лечения);
– прогнозе (информации о возможном исходе заболевания).
Задачи биохимии заключаются в изучении строения и функций биомолекул, входящих в состав тканей организма, а также механизмов:
– поступления пластических и биологически активных веществ во
внутреннюю среду организма;
– превращения поступивших мономеров в биополимеры, специфичные для данного организма;
– высвобождения, накопления и использования энергии в клетке;
5
ТЕМА 1.
– образования и выведения конечных продуктов распада веществ в
организме;
– воспроизведения и передачи наследственных признаков организма;
– регуляции всех перечисленных процессов.
Цель курса биохимии – научить будущих врачей применять при изучении последующих дисциплин и в профессиональной врачебной деятельности сведения о химическом составе и молекулярных процессах в
организме как о характеристиках нормы и признаках патологии.
Студентам для успешного овладения компетенциями по дисциплине
необходимо регулярно посещать лекции и лабораторно-практические занятия; выполнять план самостоятельной работы; активно участвовать в
работе коллоквиумов и студенческих конференций, широко используя
электронное оборудование для демонстрации наглядных материалов и
электронных презентаций; использовать рекомендованные электронные
ресурсы для подготовки к занятиям и промежуточной аттестации по дисциплине.
В данном пособии, состоящем из двух частей, собраны лабораторные
работы, краткий теоретический материал, примеры тестов и контрольные
вопросы, выполнение и освоение которых позволит обучающимся
успешно изучить дисциплину.
6
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ТЕМА 1.
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Лабораторно-практическое занятие
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
При работе в лаборатории на занятиях по биохимии студенты
должны соблюдать все правила техники безопасности при работе в химической лаборатории.
В помещения лаборатории биохимии студенты допускаются только
в халатах и сменной обуви. Длинные волосы должны быть заколоты. На
голове медицинская шапочка.
Техника безопасности при работе в химической лаборатории и
оказание первой помощи
1. Во время работы в химической лаборатории необходимо придерживаться чистоты, тишины, порядка и правил техники безопасности.
2. Каждый работающий должен знать, где находятся в лаборатории
средства противопожарной защиты и аптечка.
3. Категорически запрещается курить, есть, пить воду в лаборатории.
4. Нельзя приступать к работе, пока студент не освоит принцип и ход
ее выполнения.
5. Опыты необходимо проводить только в чистой посуде. Нельзя
пользоваться реактивами из неподписанной посуды. После окончания работы студент должен сразу вымыть посуду.
6. В процессе работы необходимо следить, чтобы реактивы не попали на кожу лица и рук, особенно в глаза.
7. Никаких реактивов в лаборатории не пробовать на вкус, нюхать
вещества можно очень осторожно, направляя на себя пары или газы легкими движениями руки.
8. На всей посуде, где сохраняются реактивы, должны быть названия
реактивов.
9. Во время нагревания жидких и твердых веществ в пробирках и
колбах запрещается направлять их отверстие на себя или на соседа.
10. После окончания работы необходимо отключить газ, воду, электричество.
11. Запрещается выливать в раковину концентрированные растворы
кислот и щелочей.
7
ТЕМА 1.
Тема 1.
Введение в биохимию. Методы биохимических исследований
12. При работе с ядовитыми веществами – кислотами, щелочами, фенолом и другими – необходимо пользоваться защитными очками, противогазами и респираторами.
13. Опыты с легковоспламеняющимися веществами проводить как
можно дальше от пламени и электроприборов.
14. При возникновении пожара немедленно отключить газ и электроприборы во всей комнате. Пламя затушить огнетушителем, песком или
использовать противопожарное одеяло.
15. Если на ком-то загорается одежда, необходимо уложить потерпевшего на пол и накрыть одеялом.
16. При термических ожогах пораженную часть тела подержать
10–20 минут под струей холодной проточной воды (можно опустить в
емкость с прохладной чистой водой). Сделать примочку слабым раствором КМnО4. Наложить чистую (по возможности стерильную повязку).
Можно смачивать повязку холодной водой.
17. При ожогах едкими щелочами следует провести нейтрализацию
слабым раствором уксусной кислоты, затем хорошо промыть поврежденное место проточной водой.
18. При попадании кислоты на кожу или слизистые необходимо
сразу же обработать их для нейтрализации раствором гидрокарбоната
натрия, затем тщательно промыть проточной водой.
19. При попадании в глаза реактивов, необходимо быстро промыть
глаза большим количеством воды и доставить потерпевшего в медпункт.
20. С целью предотвращения инфицирования студентов СПИДом, гепатитом или венерическими болезнями, забор крови у студентов для определения тех или иных биохимических показателей не проводится.
Все биохимические показатели определяются на практическом занятии только в искусственной сыворотке крови или в донорской крови, взятой на станции переливания крови.
ТЕОРИЯ
Значение биохимических анализов в практической медицине
На современном этапе развития медицины резко повысилось значение биохимических анализов. Применение новых лекарственных средств
и новых методов лечения, проведение сложнейших хирургических вмешательств и реанимационных мероприятий требует постоянного биохимического контроля. За последние годы число биохимических исследований на одного стационарного больного в среднем увеличилось в несколько раз. Биохимические анализы применяются для диагностики, контроля за состоянием пациентов (мониторинг), скрининга различных заболеваний и прогнозирования.
8
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Таким образом, главная задача биохимической лаборатории состоит
в том, чтобы обеспечить врача биохимической информацией, необходимой для лечения больного. Такая информация представляет ценность,
только если она точна, соответствует клинической ситуации и правильно
используется врачом в процессе принятия решений.
Объект биохимических исследований
Для клинико-биохимических анализов используют:
1) биологические жидкости внутренних сред организма – плазму или
сыворотку крови, спинномозговую жидкость, лимфу, амниотическую,
внутрисуставную или внутриглазную жидкости;
2) биологические выделения (экстракты) – мочу, желчь, слюну, желудочный и кишечный соки, кал, пот, слезную жидкость, женское молоко
и молозиво, семенную жидкость, слизистые выделения.
Пробу биологической жидкости берут утром натощак. Чаще всего
исследуется утренняя моча, но для некоторых анализов (например, гормонов) используется суточная моча.
Капиллярную кровь у взрослых получают из пальца, у детей – можно
из мочки уха, большого пальца ноги или пятки.
Большое количество крови берут из локтевой вены (у маленьких детей – из подкожных вен головы).
Из цельной крови с добавлением антикоагулянта (гепарина или цитрата натрия) центрифугированием можно получить плазму и форменные
элементы крови. Сыворотка крови отличается от плазмы тем, что в ней
отсутствует фибриноген и другие белки крови, участвующие в ее свертывании и вошедшие в сгусток.
Для получения сыворотки кровь собирают в сухую пробирку без антикоагулянта и оставляют в холодильнике для образования и отделения
сгустка.
В сыворотке, плазме, эритроцитах определяют вещества, неравномерно распределенные между эритроцитами и жидкой средой крови,
например натрий, калий, фосфаты, билирубин и т. д.
Если анализ невозможно провести сразу, то объекты биохимических
исследований можно хранить в холодильнике. Срок хранения, в зависимости от вида определяемого вещества, может быть от нескольких часов
до нескольких суток.
Выражение результатов биохимических исследований
Выбранная для исследования методика должна отличаться точностью, специфичностью и воспроизводимостью результатов.
Удобнее применять методики, использующие готовые наборы реактивов заводского изготовления. Если это невозможно, следует обращать
9
ТЕМА 1.
внимание на чистоту используемых реактивов, так как использование реактивов неизвестной степени очистки может внести ошибку в проводимые исследования.
Воспроизводимость метода зависит от случайных погрешностей при
проведении осаждения, центрифугирования, пипетирования, а также от
стабильности полученного продукта.
Для поддержания на высоком уровне воспроизводимости исследований удобно использовать контрольные сыворотки промышленного производства.
В биохимии и клинической химии используются основные и производные единицы СИ. Концентрацию веществ, молекулярная масса которых известна (например, концентрацию глюкозы, мочевины, мочевой
кислоты в биологических жидкостях), выражают в единицах молярной
концентрации моль/литр или в дольных единицах – миллимоль/литр,
микромоль/литр.
Концентрацию веществ, у которых не установлена или точно не известна молекулярная масса, выражают в единицах массовой концентрации (или в массовых долях) – кг/л, г/л, мг/л, мкг/л и т. д. В этих же единицах выражаются результаты определения содержания белков (альбумин, фибриноген, общий белок, гаптоглобин, общие липиды).
Физико-химические методы в биохимии
1. Центрифугирование – метод разделения неоднородных систем, в
том числе суспензий, в поле центробежных сил. В основе метода лежит
следующий принцип: более крупные и более плотные частицы осаждаются быстрее и собираются на дне пробирки (рис. 1). Рабочая часть центрифуги – ротор, в который помещают пробирки с исследуемой жидкостью. Центрифужные пробирки перед центрифугированием уравновешивают и в роторе ставят друг против друга.
В лабораторной практике центрифугирование чаще всего применяют
для:
1) отделения форменных элементов от плазмы крови;
2) разделения субклеточных частиц;
3) осаждения денатурированных белков.
В клинической биохимии наиболее часто используют центрифуги
общего назначения, которые способны давать максимальную скорость до
6000 об/мин.
Для получения субклеточных частиц используют скоростные и ультрацентрифуги. Ультрацентрифуги дают предельную скорость до 80 000 об/мин
и центробежное ускорение до 500 000 g. Они снабжены холодильником
и вакуумной установкой.
10
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Рис. 1. Осаждение частиц под действием сил центробежного ускорения в ходе
центрифугирования. На рисунке показан угловой ротор (с фиксированным углом)
и бакет-ротор с подвижно-расположенными центрифужными стаканами (пробирками)
2. Хроматография – это метод разделения и определения веществ,
основанный на распределении компонентов между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Неподвижной (стационарной) фазой служит
твердое пористое вещество (часто его называют сорбентом) или пленка
жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу,
иногда под давлением. Компоненты анализируемой смеси (сорбаты) вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Ее
обычно помещают в стеклянную или металлическую трубку, называемую колонкой. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью
сорбента (за счет адсорбции или по какому-либо другому механизму)
компоненты будут перемещаться вдоль колонки с разной скоростью.
Одни компоненты останутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей
степени взаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторые и вовсе покинут колонку вместе с подвижной фазой
(такие компоненты называются неудерживаемыми). Таким образом, происходит быстрое разделение сложных смесей компонентов (рис. 2).
Хроматографические методы применяются для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот, белков (а также углеводов, липидов и их метаболитов).
Различают несколько видов хроматографии:
1) адсорбционная – основана на различной способности отдельных
компонентов смеси адсорбироваться на поверхности твердой фазы сорбента (М. С. Цвет, 1903 г.);
11
ТЕМА 1.
2) распределительная – основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях;
3) ионообменная – основана на различной способности разделяемых
веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы сорбента;
4) осадочная – основана на образовании труднорастворимых осадков
в определенной последовательности;
5) диффузионная – основана на разделении веществ по скорости
диффузии внутри сорбента в зависимости от размера молекул;
6) аффинная – основана на биологическом сродстве и биологической
активности молекул.
Рис. 2. Принцип хроматографического разделения компонентов смеси
А) Показано разделение смеси А+В. На самописце выходящие из колонки вещества
отображаются в виде пиков, по площади которых можно судить и о количестве вещества.
Б) Стеклянная хроматографическая колонка: 1 – смесь (А+Б+В+Г); 2 – наименее подвижный компонент смеси; 3 – сорбент, которым заполнена колонка; 4 – коллектор фракций
Различают хроматографические методы и по технике выполнения:
колоночная и плоскостная. В зависимости от агрегатного состояния фаз –
газовая, жидкостная и газожидкостная хроматография. По направлению
движения растворителя – восходящая, нисходящая, одномерная, двумерная и радиальная.
3. Электрофорез – это процесс направленного движения частиц,
диспергированных в жидкости в постоянном электрическом поле. Частицы одного и того же вещества несут одинаковые по знаку заряды.
В электрическом поле положительно заряженные частицы перемещаются к отрицательному электроду – катоду (-), отрицательно заряженные
частицы – к положительному электроду – аноду (+). Движение частиц к
12
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
катоду иногда называют катафорезом, к аноду – анафорезом. Скорость
движения зависит от массы частиц и их заряда в данных условиях, благодаря чему электрофорез позволяет разделять смеси веществ на составляющие их компоненты.
В клинической практике применяется зональный электрофорез для
исследования белкового состава жидкостей организма. Чаще используют
электрофорез на бумаге как наиболее простой по технике выполнения
(рис. 3). Электрофорез в агаровом и крахмальном гелях используется в
медицинской практике преимущественно в научных исследованиях. При
помощи электрофореза на бумаге разделяют в крови фракции белков, липопротеидов, гликопротеидов, а также белковые фракции мочи, желудочного сока, экссудатов и т. п. По технике проведения электрофорез может быть горизонтальным, вертикальным и радиальным.
Рис. 3. Прибор для горизонтильного электрофореза: 1 – носитель; 2 – крышка;
3 – электроды (катод и анод); 4 – буферный раствор; 5 – изолятор; 6 – фитиль
4. Фотометрия – метод количественного анализа, основанный на
измерении интенсивности поглощения или рассеяния веществом светового потока.
Светопоглощение, или экстинкция, прямо пропорционально концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и коэффициенту
молярной экстинкции.
Коэффициент молярной экстинкции – величина поглощения, которую дает 1 моль вещества в 1 мл раствора при толщине слоя измеряемого
раствора равной 1 см.
13
ТЕМА 1.
Экстинкция прямо пропорциональна интенсивности окраски раствора, которая может быть изначальной (то есть определяемое вещество
обусловливает цвет раствора), либо приобретенной в процессе химической реакции.
Концентрацию определяемого вещества можно рассчитать двумя
способами:
1) используя экстинкцию стандартного раствора с известной концентрацией определяемого вещества. Для этого составляют пропорцию:
Е ст.
соответствует С ст.
Е оп.
соответствует С оп.,
С оп. =
С ст. ∙ Е оп.
Е ст.
Е ст. – экстинкция стандартной пробы;
Е оп. – экстинкция опытной пробы (исследуемого раствора);
С ст. – концентрация стандартного раствора;
С оп. – концентрация определяемого вещества.
2) Концентрация исследуемого вещества определяется с помощью
калибровочного графика. Для построения калибровочного графика измеряют экстинкции нескольких растворов с известной концентрацией
определяемого вещества (рис. 4). Зависимость между концентрацией вещества в стандартных (калибровочных) пробах и оптической плотностью, соответствующей этим пробам, отражают линией, построенной по
точкам. Строить калибровочный график следует не менее чем по пяти
точкам.
Калибровочная кривая прокладывается таким образом, чтобы по
возможности большее число точек (например, 3 из 5) лежало на линии,
а остальные располагались близ нее, равномерно отклоняясь в ту и другую стороны. Отдельные точки, значительно смещающиеся от калибровочной кривой и обычно являющиеся результатом грубой ошибки в определении, исключаются из учета.
Примечание: на представленном графике все 5 точек лежат на одной
линии, но так получается крайне редко. Поэтому выбирается наибольшее
количество точек, лежащих на одной прямой, по ним строится график –
прямая линия. Остальные точки примерно поровну оказываются расположены по обе стороны от этой линии.
С1–С5 – концентрации стандартного раствора вещества в стандартных пробах.
Е1–Е2 – экстинкция (оптическая плотность) соответствующих стандартных
проб.
Ех – экстинкция (оптическая плотность) опытной пробы.
Сх – концентрация белка в опытной пробе (определяемая из графика).
14
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Рис. 4. Схема построения калибровочного графика
Фотометрические приборы делятся на две большие группы: фотоэлектроколориметры и спектрофотометры.
В фотоэлектроколориметрах нужные спектральные диапазоны выделяют при помощи светофильтров (красного, зеленого, синего, фиолетового и т. д.). В спектрофотометрах участки спектра выделяют при помощи призм или дифракционных решеток (рис. 5), поэтому можно установить любую длину волны в заданном диапазоне. Обычно спектрофотометры – это приборы более высокого класса, чем фотометры – в них
можно выделить более узкий участок (более монохроматический) спектра, следовательно, точность измерения будет выше. Однако все зависит
от конкретной конструкции прибора.
Рис. 5. Схема устройства спектрофотометра
Чаще всего в клинической биохимии фотометрия проводится в области 400–700 нм – это так называемая видимая область спектра. Свет с
15
ТЕМА 1.
большей длиной волны относится к ближней инфракрасной области, измерения в которой приходится делать чрезвычайно редко. Свет с длиной
волны короче 400 нм относится к ультрафиолетовому диапазону, причем
различают ближнюю область с длиной волны 300–400 нм и коротковолновый диапазон 220–300 нм.
Для фотометрических измерений в видимой и ближней инфракрасной областях применяются кюветы из обычного стекла. Для ближней
ультрафиолетовой области нужны кюветы из специальных сортов стекла –
увиолевые; в коротковолновой ультрафиолетовой области пригодны
только кюветы из кварца или сапфира (высокой стоимости).
Последовательность операций при работе на спектрофотометрах
или фотометрах различных конструкций несколько различается, но имеется общий принцип.
1. Сначала устанавливают нужную длину волны, выбирая светофильтр на фотометре или вращая соответствующую рукоятку на спектрофотометре.
2. Следующий этап – выведение нуля. Для этого в кюветодержатель
устанавливают кювету с контрольным раствором (растворитель или раствор, полученный в результате холостого опыта, то есть без проведения
химической реакции). Изменяя интенсивность светового потока, выводят
показания прибора на величину шкалы, предусмотренную инструкцией
(чаще всего – нуль).
3. После этого устанавливают опытную или стандартную пробу и по
шкале прибора проводят отсчет оптической плотности.
В биохимических лабораториях наиболее широко применяются современные модификации фотоэлектроколориметров и спектрофотометров.
5. Флюорометрия. Эффект флюоресценции проявляется в свечении
исследуемого объекта под влиянием облучения светом с более короткой
длиной волны.
Физический эффект флюоресценции заключается в том, что молекула исследуемого вещества поглощает квант света возбуждения (тот
свет, которым облучается объект) и при этом переходит в новое, с большей энергией, состояние. Через некоторый микропромежуток времени
(он настолько мал, что им можно пренебречь) молекула исследуемого вещества излучает избыточную энергию в виде кванта света флюоресценции, что улавливается соответствующим прибором флюориметром.
Аналитические методы, использующие флюоресценцию, основаны на
предположении, что при освещении светом одинаковой интенсивности
сила света флюоресценции пропорциональна содержанию исследуемого
вещества. Однако такая пропорциональность соблюдается только в относительно узком диапазоне концентраций, поэтому при исследовании
16
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
нужно всегда с особой тщательностью проверять линейность калибровочного графика.
Работа с автоматической пипеткой (дозатором)
Автоматическая пипетка – основной инструмент при работе в современной биохимической лаборатории. Автоматическая пипетка предназначена для дозирования водных растворов низкой вязкости при комнатной температуре – только в этом случае объем, выставленный на пипетке, равен объему жидкости в типе.
Устройство и принцип действия автоматической пипетки представлены на рисунке 6.
Рис. 6. Схема устройства автоматической пипетки:
А – устройство автоматической пипетки, Б – принцип действия
Автоматическая пипетка состоит из корпуса 3, зажимаемого в руке,
с упором для указательного пальца 2. Набор и выдавливание жидкости из
пипетки происходит путем нажимания большим пальцем на поршень 1.
При надавливании поршень смещается, пока не достигнет первого упора,
при большем усилии поршень смещается еще немного и достигает второго (окончательного) упора. Смещение поршня, а следовательно, и
набираемый в пипетку объем жидкости регулируется вращением колеса 6,
17
ТЕМА 1.
а установленный объем показывается в окне индикатора 4. Набор жидкости происходит непосредственно в сменный наконечник 5, называемый
типом. Удаление использованного типа производится нажатием большим пальцем на кнопку 7, которая приводит в действие рычаг 8, непосредственно сталкивающий тип с носика пипетки.
Автоматическая пипетка работает аналогично медицинскому
шприцу: внутри корпуса пипетки 9 находится стальной поршень 11, который с помощью уплотнительного резинового кольца 10 и силиконовой
смазки герметично с ним соединен. При смещении поршня 11 вверх, в
тип, надетый на пипетку, втягивается жидкость, при смещении поршня
вниз – жидкость выдавливается. Регулируя колесом 6 ход поршня, регулируют объем всасываемой жидкости.
Автоматическая пипетка плохо подходит для дозирования:
1) вязких жидкостей (глицерина, агара, концентрированной серной
кислоты, триэтаноламина, концентрированных растворов детергентов и
белков);
2) жидкостей с низким поверхностным натяжением, особенно при
повторных заборах (детергенты, растворы белков);
3) холодных и горячих растворов, так как воздух в типе меняет температуру, и, следовательно, объем (охлажденные растворы ферментов,
горячие буферы для гибридизации, верхний агар);
4) органических растворителей (особенно легколетучих, например,
хлороформа, ацетона, диэтилового эфира). Во всех этих случаях точность
дозирования резко падает, для точного дозирования всех указанных растворов приходится применять специальные приемы.
Автоматическая пипетка не подходит для дозирования:
1) агрессивных жидкостей (концентрированная серная и хлорная
кислоты, пергидроль);
2) жидкостей и растворов, выделяющих агрессивные пары (концентрированная соляная, плавиковая и азотная кислоты, жидкий бром). В этих
случаях возможна порча пипетки.
Правила работы с пипеткой:
1. Отжать поршень пипетки до первого упора – при прямом дозировании (рис. 7, 1 STOP) и до второго упора – при обратном дозировании
(рис. 7, 2 STOP). Техника «прямого дозирования» применяется для забора
прозрачных и невязких жидкостей (забор – нажимаем до 1-го упора; слив –
жмем до 2-го упора несколько раз). Техника «обратного дозирования» применяется для забора непрозрачных и / или вязких жидкостей, например
цельная кровь (забор – нажимаем до 2-го упора; слив – жмем до 1-го упора,
останавливаемся, излишек жидкости сливаем в другое место).
18
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Рис. 7. Техника 1-го упора и 2-го упора (при прямом дозировании и обратном
дозировании соответственно): 1 – поршень пипетки в позиции 1-го упора;
2 – поршень пипетки в исходной позиции; 3 – поршень пипетки в позиции 2-го упора
2. При отборе жидкости боковыми стенками типа нельзя касаться боковых стенок сосуда (часто тип укрепляют на пипетке руками, поэтому
его внешняя поверхность загрязнена, также на внешнюю поверхность может налипнуть жидкость со стенок сосуда, что приведет к неточному дозированию).
3. Жидкость отбирать прямо с поверхности, тип глубоко не опускать.
4. Отпускать поршень пипетки вверх необходимо плавно (иначе раствор попадет внутрь пипетки, что приведет к ее порче).
5. Выдавить жидкость, отжав пипетку до второго упора.
6. Жидкость выдавливать по возможности на стенку пробирки или
на поверхность жидкости – не капать и не погружать тип глубоко.
7. Не класть пипетку с надетым типом на стол – тип может загрязниться или кого-нибудь испачкать; если в типе осталось больше 50 мкл
жидкости, то она может затечь внутрь пипетки.
Растворы с низким поверхностным натяжением (растворы белков,
детергентов, фенол, хлороформ, спирт) способны затечь в горизонтально
лежащую пипетку, даже если их в типе гораздо меньше, чем 50 мкл.
8. Не сбрасывать тип, в котором есть жидкость, – эта жидкость также
может попасть внутрь пипетки.
9. Следите, чтобы выставленный на пипетке объем не сбился в ходе
работы.
10. Не выставляйте на пипетке объем выше или ниже ее номинала.
11. Следует контролировать работу пипетки «на глаз», особенно при
повторных дозированиях (часто случается, что отбирается неправильный
объем – некачественный тип, тип неплотно надет, тип не сразу коснулся
жидкости, тип закупорился).
19
ТЕМА 1.
Тест для самоконтроля
1. На различии зарядов белковых молекул основан метод:
а) диализа;
б) гель-фильтрации;
в) аффинной хроматографии;
г) ионообменной хроматографии;
д) седиментации.
2. Аффинная хроматография позволяет:
а) денатурировать белок;
б) избирательно выделить белок из смеси белков;
в) определить N-концевую аминокислоту в белке;
г) определить C-концевую аминокислоту в белке;
д) установить изоэлектрическую точку белка.
3. На разделении неоднородных систем, в том числе суспензий, в
поле центробежных сил основан метод:
а) центрифугирование;
б) электрофорез;
в) фотометрия;
г) хроматография.
4. Метод разделения, основанный на распределении компонентов
между двумя фазами (подвижной и неподвижной):
а) центрифугирование;
б) электрофорез;
в) фотометрия;
г) хроматография.
5. На измерении интенсивности поглощения или рассеяния веществом светового потока основан метод:
а) центрифугирование;
б) электрофорез;
в) фотометрия;
г) хроматография.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Охарактеризуйте принцип метода центрифугирования.
2. С какой целью данный метод применяется в биохимических исследованиях в медицинской практике?
3. Охарактеризуйте принцип метода хроматографии. Назовите виды
хроматографии. Какой вид хроматографического разделения молекул основан на их биологической активности?
4. Охарактеризуйте принцип метода электрофореза.
5. С какой целью данный метод применяется в биохимических исследованиях в медицинской практике?
20
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
6. Охарактеризуйте принцип фотометрии. В какой области спектра
чаще всего проводят измерения в биохимических исследованиях в медицине?
7. Как можно рассчитать концентрацию вещества с помощью калибровочного графика?
8. Опишите принцип и последовательность работы с автоматической пипеткой. Какие жидкости можно набирать такой пипеткой, для
каких она не очень подходит, какие нельзя?
21
ТЕМА 2.
Тема 2.
Аминокислоты и белки (строение, свойства, функции)
ТЕМА 2.
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Лабораторно-практическое занятие
АМИНОКИСЛОТЫ. ОБРАЗОВАНИЕ ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ. ПЕПТИДЫ.
КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ
ТЕОРИЯ
Белок – высокомолекулярное азотистое природное соединение, распадающееся в ходе гидролиза на аминокислоты.
Белки содержат углерода – 50–55 %, водорода – 6,5–7,3 %, азота –
15–18 %, кислорода – 21–24 %, серы – до 2,4 % и золы – до 0,5 %.
Построение всех белков происходит из набора 20 различных аминокислот (стандартных; синоним – белковых, протеиногенных), ковалентно
связанных друг с другом в определенной, характерной только для данного белка последовательности.
Общей структурной особенностью аминокислот является наличие
карбоксильной и аминогруппы, связанных с одним и тем же атомом углерода (альфа-атом углерода). Различаются аминокислоты боковыми цепями (R-группами), которые у разных аминокислот неодинаковы по
структуре, электрическому заряду и растворимости в воде. Карбоксильные и аминогруппы аминокислот участвуют в образовании пептидных
связей.
Стандартные аминокислоты имеют трехбуквенные и однобуквенные
условные обозначения (табл. 1).
Таблица 1
Полные названия и сокращенные обозначения аминокислот
№
Аминокислота
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Аланин
Аргинин
Аспарагин
Аспарагиновая кислота
Валин
Гистидин
Глицин
Глутамин
Глутаминовая кислота
Трехбуквенное
сокращенное обозначение
ала
Ala
арг
Arg
асн
Asn
асп
Asp
вал
Val
гис
His
гли
Gly
глн
Gln
глу
Glu
22
Однобуквенное
обозначение
A
R
N
D
V
H
G
Q
E
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Окончание табл. 1
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Изолейцин
Лейцин
Лизин
Метионин
Пролин
Серин
Тирозин
Треонин
Триптофан
Фенилаланин
Цистеин
иле
лей
лиз
мет
про
сер
тир
тре
три
фен
цис
Ile
Leu
Lys
Met
Pro
Ser
Tyr
Thr
Trp
Phe
Cys
I
L
K
M
P
S
Y
T
W
F
C
Помимо 20 стандартных аминокислот, входящих в состав белков, существуют другие аминокислоты, присутствующие в живых организмах.
Классификация аминокислот по свойствам боковой цепи (радикала)
Протеиногенные аминокислоты делят на 4 группы по полярности радикалов:
1) неполярные (гидрофобные) (рис. 8);
2) полярные (гидрофильные) незаряженные (рис. 9);
3) отрицательно заряженные (рис. 10);
4) положительно заряженные (рис. 11).
Рис. 8. Неполярные (гидрофобные) аминокислоты: а) аланин (Ala) – Ала;
б) валин (Val) – Вал; в) пролин (Pro) – Про; г) лейцин (Leu) – Лей; д) изолейцин (Ile) – Иле;
е) фенилаланин (Phe) – Фен; ж) метионин (Met) – Мет; з) триптофан (Trp) – Три
23
ТЕМА 2.
Рис. 9. Незаряженные полярные аминокислоты:
а) глицин (Gly) – Гли; б) серин (Ser) – Сер; в) треонин (Thr) – Тре; г) тирозин (Tyr) – Тир;
д) аспарагин (Asn) – Асн; е) глутамин (Gln) – Глн; ж) цистеин (Cys) – Цис
Рис. 10. Отрицательно заряженные аминокислоты:
а) аспарагиновая кислота (Asp) – Асп; б) глутаминовая кислота (Glu) – Глу
Рис. 11. Положительно заряженные аминокислоты:
а) лизин (Lys) – Лиз; б) аргинин (Arg) – Арг; г) гистидин (His) – Гис
24
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Радикалы аминокислот участвуют в образовании связей: 1) гидрофобные радикалы участвуют в гидрофобных взаимодействиях; 2) гидрофильные радикалы формируют водородные связи; 3) полярные (заряженные) радикалы образуют ионные связи; 4) сближение двух радикалов цистеина цис-SH + цис-SH ведет к образованию дисульфидной связи цис-SS-цис.
При нейтральных значениях рН все кислотные (способные отдавать Н+) и все основные (способные присоединять Н+) функциональные
группы находятся в диссоциированном состоянии. Поэтому в нейтральной среде аминокислоты, содержащие недиссоциирующий радикал,
имеют суммарный нулевой заряд. Аминокислоты, содержащие кислотные функциональные группы, имеют суммарный отрицательный заряд,
а аминокислоты, содержащие основные функциональные группы, –
положительный заряд.
Изменение рН в кислую сторону (т. е. повышение в среде концентрации
Н+) приводит к подавлению диссоциации кислотных групп. В сильнокислой
среде все аминокислоты приобретают положительный заряд.
Напротив, увеличение концентрации ионов ОН– (гидроксильных
ионов, подщелачивание среды) вызывает отщепление Н+ (ионов водорода) от основных функциональных групп, что приводит к уменьшению
положительного заряда (сдвигу его в отрицательную сторону). В сильнощелочной среде все аминокислоты имеют суммарный отрицательный
заряд.
Таблица 2
Константы (полу)-диссоциации кислотных и основных групп аминокислот
и значения изоэлектрических точек для отдельных аминокислот
Аминокислота
Gly (Гли)
Ala (Ала)
Val (Вал)
Leu (Лей)
Ser (Сер)
Cys (Цис)
Met (Мет)
Asp (Асп)
Glu (Глу)
Arg (Арг)
Lys (Лиз)
Phe (Фен)
Tyr (Тир)
Trp (Три)
Константы (полу)-диссоциации
рКа (α-СООН)
рКа (α-NH3+)
рКа (R)
COOH ↔ COO- + H+
NH3+ ↔ NH2 + H+
2,34
9,60
–
2,34
9,60
–
2,29
9,72
–
2,36
9,60
–
2,21
9,15
–
1,71
8,33
10,30
2,28
9,21
–
2,09
9,82
3,86
2,19
9,76
4,25
2,17
9,04
12,48
2,18
8,95
10,50
2,58
9,24
–
2,20
9,11
10,10
1,22
9,39
–
25
pI
6,20
6,11
6,00
6,04
5,68
5,08
5,74
2,98
3,09
10,76
9,74
5,91
5,63
3,88
ТЕМА 2.
Окончание табл. 2
Аминокислота
His (Гис)
Ile (Иле)
Thr (Тре)
Pro (Про)
Asn (Асн)
Gln (Глн)
Константы (полу)-диссоциации
рКа (α-СООН)
рКа (α-NH3+)
рКа (R)
+
COOH ↔ COO + H
NH3+ ↔ NH2 + H+
1,82
9,17
6,00
2,32
9,76
–
2,63
10,43
–
2,00
10,60
–
2,02
8,80
–
2,17
9,13
–
pI
7,64
5,68
5,16
7,64
3,09
3,09
Значение рН, при котором заряды аминокислоты скомпенсированы,
т. е. аминокислота имеет вид биполярного иона и суммарный заряд молекулы равен 0, называется изоэлектрической точкой. Если аминокислота имеет дополнительные ионогенные группы в боковой цепи, то при
расчете изоэлектрической точки следует учитывать их вклад (табл. 2).
Состояние изоэлектрической точки характерно также и для пептидов и белков. В этом состоянии аминокислота, пептид или белок не
будет перемещаться в электрическом поле ни к катоду, ни к аноду. При
положительном суммарном заряде (при рН <7), молекула в электрическом поле будет перемещаться к катоду. При отрицательном суммарном
заряде (при рН >7) – к аноду.
Аминокислотный состав белков
Частота, с какой разные аминокислоты встречаются в белках и пептидах, неодинакова (табл. 3).
Таблица 3
Аминокислотный состав некоторых белков
(указано число аминокислотных остатков на молекулу белка)
Аминокислота
Глицин
Аланин
Валин
Лейцин
Серин
Глутаминовая
кислота
Глутамин
Лизин
Аргинин
Пролин
Аспарагиновая
кислота
3
3
3
1
3
13
6
3
6
2
15
12
7
17
7
24
12
19
20
15
Фосфорилаза
гликогена
48
63
62
79
29
4
8
14
12
64
1
4
3
4
3
18
2
4
7
20
2
5
8
19
18
13
31
48
63
36
2
3
3
20
51
Кортикотропин Цитохром с Миоглобин Тромбин
26
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Окончание табл. 3
Аспарагин
Изолейцин
Треонин
Фенилаланин
Тирозин
Цистеин
Метионин
Гистидин
Триптофан
0
0
0
3
2
0
1
1
1
4
8
7
3
5
2
3
3
1
8
8
4
7
2
0
3
9
2
14
15
11
9
11
6
7
5
7
45
49
35
38
36
9
21
22
12
Всего
39
104
152
259
841
Например, глицин в белках обнаруживается в 10 раз чаще, чем триптофан. Из каждой тысячи аминокислотных остатков в белках на долю
глицина приходится около 70, а на долю триптофана – около 7.
Остальные аминокислоты по частоте нахождения в белках занимают
промежуточное положение, образуя такой ряд: (Ала≈Вал≈Лей≈Сер) >
(Глу≈Глн≈Лиз≈Арг≈Про) > (Асп≈Асн≈Иле≈Тре≈Фен) > (Три≈Цис≈Мет≈Гис).
Большинство белков по аминокислотному составу различаются не
очень резко. Но есть некоторые специализированные белки со специфическим аминокислотным составом. Например, коллаген на 1/3 построен
из остатков глицина, около 1/5 приходится на остатки пролина и оксипролина. Гистоновые белки, обеспечивающие компактизацию ДНК на
1/3 построены из остатков лизина и аргинина.
Поскольку химическая структура радикалов аминокислотных остатков разнообразна, то белок может приобретать определенные свойства и
пространственную конформацию.
Набор аминокислот в белках различен, так же как и отличается набор
свободных аминокислот в клетках живых организмов. Такой набор имеет
тканевую, органную и эволюционную специфичность.
Так, аминокислотный состав тканей мозга значительно отличается от
состава других тканей тем, что в мозге присутствует избыточное количество дикарбоновых аминокислот и их амидов (они составляют 2/3 от общего количества аминокислот в мозге). Причем следует сказать, что молодые клетки характеризуются большей степенью амидированности аминокислот, чем старые клетки.
Некоторые аминокислоты выполняют важные функции благодаря
наличию особых по химическому строению боковых групп (радикалов).
Тирозин, фенилаланин и триптофан являются ароматическими аминокислотами и в связи с этим проявляют высокую химическую активность. Ароматические аминокислоты входят в состав таких биологически
27
ТЕМА 2.
активных соединений, как гормоны, медиаторы, коферменты. Например,
происходит последовательное превращение:
Триптофан → серотонин → мелатонин → мексамин.
Фенилаланин → тирозин → дофамин → норадреналин → адреналин.
Заменимые и незаменимые аминокислоты
Протеиногенные аминокислоты по тому, синтезируются они в организме человека или нет, подразделяются на заменимые и незаменимые
(табл. 4).
Таблица 4
Биологическая роль и возможность синтеза аминокислот в организме человека
Аминокислота
Синтезируется ли в
организме человека
Стандартные (протеиногенные) аминокислоты
Стимулирует умственную деятельность, мышечную
актвиность и координацию движения, участвует в обНезаменимая
Валин
менных процессах в мышцах, способствует восстановаминокислота
лению поврежденных тканей, укрепляет мускулатуру
Участвует в синтезе коллагена, антител, гормонов,
ферментов, способствует восстановлению тканей,
Незаменимая
Лизин
усвоению кальция. Недостаток ведет к раздражиаминокислота
тельности и усталости
Участвует в синтезе гемоглобина, регулирует уроНезаменимая
Изолейцин вень сахара в крови, определяет физическую и псиаминокислота
хическую выносливость
Участвует в синтезе гормона роста, способствует реНезаменимая
Лейцин
генерации костей, кожи, мышц, снижению уровня сааминокислота
хара в крови
Антиоксидант, обеспечивает детоксикацию оргаНезаменимая
Метионин низма, участвует в синтезе коллагена и других беламинокислота
ков, защищает суставы
Участвует в синтезе коллагена и эластина, в жировом
Незаменимая
Треонин и белковом обмене, нормализует работу печени, споаминокислота
собствует повышению иммунитета
Преобразуется в серотонин (нейромедиатор, вызывающий умственное расслабление и ощущение эмоциНезаменимая
Триптофан
онального благополучия). Важнейший элемент при
аминокислота
лечении депрессии
Участвует в синтезе нейромедиатора дофамина
(предшественника норадреналина и адреналина).
Незаменимая
Фенилаланин
Уменьшает боль, способствует улучшению настроеаминокислота
ния, памяти и обучаемости
Условно заменимая
аминокислота
Антиоксидант, преобразуется в глутатион (главный
(незаменима для
Цистеин антиоксидант), участвует в формировании коллагена
детей первых
и улучшает эластичность и упругость кожи
месяцев жизни и
недоношенных)
Основная биологическая роль
28
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Окончание табл. 4
Способствует росту и восстановлению тканей, вхо- Частично заменимая
дит в состав миелиновых оболочек, преобразуется
аминокислота
в гистамин (медиатор воспалительной реакции, ре(незаменима для
гулирует иммунный ответ)
детей до года)
Способствует восстановлению тканей, синтезу
Частично заменимая
Аргинин
гормона роста, увеличению мышечной и уменьшеаминокислота
нию жировой массы
Нейромедиатор; предшественник дофамина, нора- Условно заменимая
дреналина, адреналина; меланинов; йодтиронинов
аминокислота
Тирозин
(гормонов щитовидной железы); обеспечивает (для ее синтеза необулучшение памяти, интеллекта
ходим фенилаланин)
Участвует в белковом обмене, детоксикации, обмене
фолиевой кислоты; выполняет нейромедиаторную
Заменимая
Глутамин
функцию (предшественник мозговых нейротрансмитаминокислота
теров), ускоряет восстановление после тренировок
Стабилизатор нервных процессов; способствует
Заменимая
Аспарагин
увеличению выносливости
аминокислота
Источник энергии для центральной нервной сиЗаменимая
Аланин
стемы и головного мозга
аминокислота
Глутаминовая
Заменимая
Нейромедиатор, ноотроп
кислота
аминокислота
Участвует в процессах детоксикации и выведения
Аспарагиновая
Заменимая
аммиака, в реакциях трансаминирования, синтезе
кислота
аминокислота
углеводов; предшественник аспарагина
Предшественник этаноламина и холина для синЗаменимая
Серин
теза сложных жиров и ацетилхолина (нейромедиааминокислота
тора); образуется из глицина
Стабилизатор психических процессов; нейромедиЗаменимая
Глицин
атор; повышает умственную работоспособность.
аминокислота
Используется для лечения депрессии
Вспомогательные ГАМК функции торможения
Заменимая
Пролин
ЦНС
аминокислота
Некоторые нестандартные аминокислоты
Заменимая
Таурин
Антиоксидант
аминокислота
Необходим для детоксикации и обезвреживания
Заменимая
Орнитин
аммиака
аминокислота
Заменимая
ГАМК
Главный тормозной нейромедиатор ЦНС
аминокислота
Гистидин
Заменимые аминокислоты – синтезируются в организме из других
аминокислот.
Незаменимые аминокислоты – не синтезируются в организме; должны
поступать с пищей.
При отсутствии одной или нескольких незаменимых аминокислот
нарушается процесс образования белка в организме, может развиваться
белковая недостаточность.
29
ТЕМА 2.
Оптическая изомерия аминокислот
Во всех аминокислотах (кроме глицина) альфа-углеродный атом
имеет четыре различных заместителя (хиральный атом углерода)
(рис. 12). Благодаря этой структурной особенности аминокислоты могут
существовать в различных стереоизомерных формах, отличающихся
друг от друга различной пространственной ориентацией групп, присоединенных к α-углеродному атому:
Рис. 12. Структура аминокислот аланина и глицина
с указанием альфа-углеродного атома и его хиральности
Для каждого хирального атома углерода, входящего в состав молекулы, реализуется две различные конфигурации (из 20 стандартных аминокислот только треонин и изолейцин имеют больше одного хирального
атома углерода), соответствующие L- и D-стереоизомерам. Эти две
структуры можно рассматривать как два несовместимых при наложении
зеркальных отображения. Они называются энантиомерами. Обозначения L и D связывают конфигурации при альфа-углеродном атоме с известными конфигурациями двух энантиомеров глицеральдегида (рис. 13).
Рис. 13. Пример структур L- и D-стереоизомеров аминокислоты и глицеральдегида (эталон)
30
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Подобная классификация аминокислот имеет биологическое значение. Первоначально в процессе биосинтеза в составе белков обнаруживают только L-аминокислоты. Обнаруженные в белках D-аминокислоты
возникают после завершения синтеза белка в результате реакции рацемизации.
Превращение L-формы аминокислот в D-форму и обратно является
одним из метаболических процессов в живых организмах, причем равновесие этого метаболического процесса сильно смещено в сторону образования L-формы.
Пептиды. Пептидная связь
Аминокислоты могут вступать в реакции конденсации с образованием пептидов (рис. 14).
Вещества пептидной природы принято делить на:
1) олигопептиды (2–10 аминокислотных остатка);
2) пептиды (10–20 аминокислотных остатка);
3) полипептиды (более 20 аминокислотных остатков, но не более 100);
4) белки (более 100 аминокислотных остатков – условная граница).
Различие между полипептидами и белками (макропептидами) чрезвычайно проблематично. Исторически сложилось так, что границей
между полипептидами и белками считают соединения, состоящие примерно из 100 остатков аминокислот и имеющие молекулярную массу ~
10 000 Да. Такой принцип классификации основан на способности к диализу через природные мембраны.
Рис. 14. Схема реакции соединения двух аминокислот в дипептид
В пептидах послдовательно соединенные аминокислотные остатки
ковалентно присоединены друг к другу путем образования связи между
альфа-карбоксильной группой одной аминокислоты и альфа-аминогруппой другой аминокислоты (рис. 15).
Число и последовательность связанных в пептид аминокислот называют первичной структурой. Для пептида с известной последовательностью формулу записывают, соединяя символы аминокислотных остатков
черточками (обозначающими пептидные связи между аминокислотами).
Различают собственно пептид, например Ala-Ser-Asp-Phe-Gly, и фрагмент
31
ТЕМА 2.
-Ala-Ser-Asp-Phe-Gly- (с черточками при концевых аминокислотах). Если
часть последовательности пептида еще не известна, то аббревиатуры соответствующих аминокислот, разделенные запятыми, указывают в скобках:
Gly-Gly-Ala-Ser-Phe-(Tyr, Phe, Pro, Arg, Lys)-Val-Pro-Gly-Ala.
Рис. 15. Пентапептид серил-глицил-тирозил-аланил-лейцин (Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu).
Названия пептидов образуются из названий аминокислот, начиная с N-концевого остатка,
который принято располагать слева. Пептидные связи обозначены серым
Протеиногенная аминокислота цистеин имеет дополнительные возможности соединения аминокислотных остатков, так как при окислении
тиольной группы могут образовываться дисульфидные связи (рис. 16А).
Различают внутримолекулярное дисульфидное связывание в пределах
одной пептидной цепи и межмолекулярное дисульфидное связывание
между различными пептидными цепями (рис. 16Б).
Рис. 16. Дисульфидные связи между радикалами цистеина:
А – схема образования дисульфидной связи; Б – дисульфидные связи в пределах
одной пептидной цепи (выше) и между разными пептидными цепями (ниже)
32
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Поскольку пептиды содержат свободные амино- и карбоксильные
группы, то они так же, как и аминокислоты, являются биполярными
ионами, имеют изоэлектрическую точку и проявляют амфотерные свойства (альфа-аминогруппа в пептидах становится менее основной, а
альфа-карбоксильная группа – менее кислотной). Растворимость пептидов зависит от размера молекулы и от химической природы входящих
в нее аминокислотных остатков.
По основному физиологическому действию пептиды можно разделить на группы:
– обладающие гормональной активностью (окситоцин, вазопрессин,
рилизинг-гормоны гипоталамуса, меланоцитстимулирующий гормон,
глюкагон и др.);
– регулирующие процессы пищеварения (гастрин, холецистокинин,
вазоинтестинальный пептид, желудочный ингибирующий пептид и др.);
– регулирующие тонус сосудов и артериальное давление (брадикинин, калидин, ангиотензин II);
– регулирующие аппетит (лептин, нейропептид Y, меланоцитстимулирующий гормон);
– обладающие обезболивающим действием (энкефалины и эндорфины);
– мультифункциональные пептиды.
Один из примеров физиологически активного пептида – глутатион
(рис. 17). Это трипептид (гамма-глутамил-цистеинил-глицин), который
действует как антиоксидант, защищая сульфгидрильные группы ферментов и других белков от окисления.
Рис. 17. Структура трипептида глутатиона
Глутатион участвует также в переносе аминокислот через клеточную
мембрану (гамма-глутамильный цикл) и активно задействован по второй
фазе биотрансформации веществ в печени (конъюгация с глутатионом).
33
ТЕМА 2.
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 1.
Качественные реакции на аминокислоты и белки
Цветные реакции дают возможность обнаружить присутствие белка
в биологических жидкостях и получить представление о его аминокислотном составе. Есть реакции универсальные для всех белков и частные –
реакции на отдельные аминокислоты.
1) Биуретовая реакция (универсальная)
Принцип: биуретовая реакция открывает пептидную связь в белке.
Ее способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. При добавлении сернокислой меди к сильнощелочному раствору белка или полипептида образуются соединения меди с пептидной
группировкой (рис. 18), окрашенные в красно- или сине-фиолетовый цвет
в зависимости от длины полипептидной цепи. Раствор белка дает синефиолетовое окрашивание, а продукты неполного его гидролиза (пептоны) – розовое или красное.
Рис. 18. Биуретовая реакция на пептидную связь
Интенсивность окрашивания раствора зависит от количества в нем
белка, поэтому биуретовая реакция может использоваться для количественного анализа белка в растворе (или в биологических жидкостях организма).
2) Нингидриновая реакция (универсальная)
Принцип: нингидриновая реакция характерна для альфа-аминогрупп. Растворы белка, альфа-аминокислот и пептидов при нагревании с
нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание. В этой реакции
альфа-аминокислоты и пептиды окисляются нингидрином и подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию с образованием аммиака, альдегида и СО2. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации (рис. 19), окрашенные в синий цвет
34
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
(комплекс Руэмана). Интенсивность окраски пропорциональна количеству аминогрупп, поэтому реакция может быть использована для количественного определения альфа-аминокислот в аминокислотных анализаторах. Также нингидриновая реакция используется для обнаружения
аминокислот в хроматографии; в криминалистике используется для выявления отпечатков пальцев на бумаге.
Рис. 19. Нингидриновая реакция на альфа-аминогруппу
3) Ксантопротеиновая реакция (частная)
Принцип: ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках
циклических аминокислот – триптофана, фенилаланина, тирозина, содержащих бензольное ядро (рис. 20). Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой дает желтое окрашивание,
переходящее в оранжевое при подщелачивании вследствие образования
натриевой соли динитротирозина. Реакция обусловлена нитрованием
бензольного кольца этих аминокислот с образованием нитросоединений
желтого цвета.
Рис. 20. Ксантопротеиновая реакция на бензольный цикл
35
ТЕМА 2.
4) Реакция Фоля (частная)
Принцип: реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. Метионин, хотя и является содержащей серу аминокислотой, этой реакции не
дает, поскольку сера в нем связана прочно. Реакция состоит в том, что
при кипячении белка под действием щелочи от цистеина или цистина
легко отщепляется сера в виде сернистого натрия, который с плюмбитом
дает черный или бурый осадок сернистого свинца (рис. 21).
Рис. 21. Реакция Фоля на слабосвязанную серу (цистеин и цистин)
Реактивы и оборудование:
1) раствор яичного белка; раствор желатина; 2) NaOH, 10%-ный раствор; 3) CuSO4, 1%-ный раствор; 4) нингидрин, 0,1%-ный водный раствор; 5) HNO3, конц.; 6) NaOH, 30%-ный раствор; 7) (CH3COO)2Pb, 5%ный раствор; 8) дистиллированная вода; 9) пипетки капельные; 10) чистые сухие пробирки; 11) спиртовка, держатели.
Ход работы:
Нингидриновая
Биуретовая
Реакция
№ пробы
Добавленные реагенты
Р-р яичного белка – 5 капель;
10 % NaOH – 5 капель;
1 % CuSO4 – 2 капли
Дист. вода – 5 капель;
2
10 % NaOH – 5 капель;
контрольная
1 % CuSO4 – 2 капли
Р-р яичного белка – 5 капель;
1
0,1 % нингидрин – 5 капель;
опытная
нагревают
Дист. вода – 5 капель;
2
0,1 % нингидрин – 5 капель;
контрольная
нагревают
Окраска
Чем
обусловлена
реакция?
1
опытная
36
–
–
Фоля
Ксантопротеиновая
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Р-р яичного белка – 5 капель;
конц. HNO3 – 5 капель;
осторожно (!) нагревают
Дист. вода – 5 капель;
2
конц. HNO3 – 5 капель;
контрольная
осторожно (!) нагревают
Р-р яичного белка – 5 капель;
1
30 % NaOH – 5 капель;
опытная 5 % (CH3COO)2Pb – 5 капель;
нагревают до кипения
Р-р желатина – 5 капель;
2
30 % NaOH – 5 капель;
опытная 5 % (CH3COO)2Pb – 5 капель;
нагревают до кипения
Волос;
3
30 % NaOH – 5 капель;
опытная 5 % (CH3COO)2Pb – 5 капель;
нагревают до кипения
Дист. вода – 5 капель;
4
30 % NaOH – 5 капель;
контрольная 5 % (CH3COO)2Pb – 5 капель;
нагревают до кипения
1
опытная
–
–
Задание: выполните лабораторную работу, заполните пустые ячейки
в таблице.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Что открывает биуретовая реакция? Напишите уравнение реакции.
2. Что открывает нингидриновая реакция? Напишите уравнение реакции.
3. Что открывает ксантопротеиновая реакция? Напишите уравнение
реакции.
4. Что открывает реакция Фоля? Напишите уранение реакции.
5. Напишите аминокислоты, содержащие серу.
6. Напишите ароматические аминокислоты.
7. Как изученные белки (альбумин, желатин и кератин волос) различаются по аминокислотному составу?
8. Покажите образование пептидной связи на примере любого трипептида. Охарактеризуйте особенности и свойства пептидной связи.
Тест для самоконтроля:
1. Оптической активностью обладают все перечисленные аминокислоты, кроме:
а) лейцина;
б) серина;
в) аланина;
г) глицина;
д) триптофана.
37
ТЕМА 2.
2. Гуанидиновую группу содержит аминокислота:
а) пролин;
б) лизин;
в) аргинин;
г) аспартат;
д) лейцин.
3. Иминокислотой является:
а) глицин;
б) серин;
в) пролин;
г) глутамин;
д) треонин.
4. Ионную связь с лизином способна образовывать аминокислота:
а) аргинин;
б) серин;
в) аспартат;
г) аспарагин;
д) лейцин.
5. Дисульфидную связь образует аминокислота:
а) серин;
б) метионин;
в) треонин;
г) цистеин;
д) валин.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Назовите функции аминокислот.
2. Охарактеризуйте структуру и общие свойства функциональных
групп аминокислот. Что такое стандартные и нестандартные аминокислоты?
3. Кислотно-основные свойства аминокислот. Какие химические реакции характерны для аминокислот?
4. Классификация аминокислот по свойствам боковой цепи.
5. Заменимые, незаменимые и полузаменимые аминокислоты. Значение и биологическая роль отдельных аминокислот.
6. Особенности оптической изомерии аминокислот. Сколько стереоизомеров имеют аминокислоты?
7. Что такое пептид и белок? Как связаны между собой аминокислоты в молекуле белка?
8. Покажите образование пептидной связи на примере любого трипептида. Охарактеризуйте особенности и свойства пептидной связи.
9. Какие молекулы относятся к пептидам? Какие функции выполняют пептиды в организме?
38
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
10. Приведите примеры физиологически активных пептидов. Какие
функции они выполняют в организме?
11. Как аминокислотный состав и структура пептидов связаны с их
биологической функцией?
12. Что такое суммарный заряд молекулы пептида / белка? Как его
рассчитать? Что происходит со структурой белка при изменении суммарного заряда молекулы?
13. От чего зависит рН среды, содержащей пептиды? Как можно ее
измерить?
14. Что такое изоэлектрическая точка? Как ее можно рассчитать?
Способы достижения изоэлектрических точек для положительно и отрицательно заряженных пептидов.
15. Какой заряд будут иметь водные растворы белка с избыточным
количеством свободных карбоксильных групп? В какой среде будет ИЭТ
такого белка?
16. Какой заряд будут иметь водные растворы белка с избыточным
количеством аминогрупп? В какой среде будет ИЭТ такого белка?
17. Охарактеризуйте принципы проведения биуретовой, нингидриновой, ксантопротеиновой реакций и реакции Фоля, их практическое значение.
39
ТЕМА 2.
Лабораторно-практическое занятие
УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА БЕЛКОВ. ДИАЛИЗ БЕЛКА. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ
ТЕОРИЯ
К белкам относятся полипептиды, способные самопроизвольно формировать и удерживать определенную пространственную структуру, которая стабилизируется системой нековалентных взаимодействий, что может быть достигнуто лишь начиная с некоторой длины полипептидной
цепи (50–100 аминокислотных остатков, но все зависит от аминокислотного состава и расположения аминокислот в цепи).
Датский биохимик Кай Ульрик Линнерстрём-Ланг предложил рассматривать четыре уровня организации белковой молекулы: первичную,
вторичную, третичную и четвертичную структуры. В 1951 году он ввел
термин «первичная структура». На сегодняшний день в молекулах белков
выделяют следующие уровни организации: тонкая и первичная структуры, вторичная, супервторичная, третичная и четвертичная. Причем
каждая последующая включает в себя предыдущие.
Тонкая структура – пространственное расположение атомов и
атомных группировок, формирующих пептидные цепи (рис. 22).
Первичная структура – последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи (рис. 22). Стабилизируется
пептидными связями между аминокислотными остатками цепи.
Тонкая и первичная структура составляют по сути единое целое.
Аминокислотный состав и последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи детерминирована генетически (зашифрована
в полинуклеотидной последовательности ДНК).
Рис. 22. Тонкая и первичная структуры белка неотделимы друг от друга
40
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Вторичная структура – локальная пространственная укладка атомов, составляющих основу полипептидной цепи, без учета конформации
боковых радикалов аминокислот или взаимодействия с другими фрагментами. Вторичная струтра белков может быть регулярной (фрагменты
полипептидной цепи организованы определенным образом) и нерегулярной (не имеют определенной пространственной укладки) (рис. 23). К регулярным типам организации относятся такие виды вторичной струткуры, как альфа-спираль, бета-слои, бета-изгиб.
Вторичная структура предопределена тонкой и первичной структурой и зависит от углов вращения вокруг связи N-C (ψ) и связи С-С (φ) –
связей, соседних с пептидной связью (вокруг пептидной связи свободное
вращение атомов отсутствует). Если углы вращения находятся в пределах 40–60 º, формируется альфа-спираль – правозакрученная «пружина»
с шагом спирали 0,54 нм, стабилизируется водородными связями между
группировками пептидного остова (на один виток спирали – 3 водородные связи). Есть некоторые взаимодействия и между радикалами аминокислот в спирали.
Другой вид вторичной структуры (тип регулярной организации полипептидной цепи) – бета-складчатый слой, когда один фрагмент полипептидной цепи укладывается в складку относительно другого фрагмента, которые могут быть как параллельными, так и антипараллельными. Стабилизация бета-слоя осуществляется также водородными связями между -СО и -NH группами пептидных связей соседних цепей. Для
образования таких слоев боковые цепи аминокислот должны быть небольшого размера. Например, бета-кератины, богатые бета-складчатыми
слоями, содержат очень высокую долю остатков глицина и аланина.
Рис. 23. Вторичная структура белка предопределена тонкой и первичной структурой
41
ТЕМА 2.
Есть еще бета-изгибы (или бета-повороты) – поворот полипептидной цепи на 180 º, обычно такой фрагмент соединяет в структуре белка
альфа-спирали и бета-слои и образуется там, где в цепи находятся пролин
и глицин. Локализованы очень часто такие структуры на поверхности молекулы белка и образуют водородные связи с молекулами воды.
Супервторичная структура – специфический порядок чередования
и сочетания вторичных структур. В ней выделяют 2 подуровня организации: «ансамбли» и домены. «Ансамбли» – сочетания нескольких видов
вторичной структуры (рис. 24). Некоторые белки содержат специфически
организованные структурные мотивы – сочетания элементов вторичной
структуры или отдельных участков полипептидных цепей (например,
«структура бета-бочонка», «лейциновая застежка-молния», «цинковый палец» и др., образующиеся за счет межрадикальных взаимодействий).
Рис. 24. Сверхвторичная структура белка. Подуровень – «ансамбли»
Несколько «ансамблей» могут организовываться в белковый домен.
Каждый домен связан с другим через так называемый шарнирный участок. Домен – участок полипептидной цепи, который в процессе формирования пространственной структуры приобрел глобулярную конформацию и часто обладает функциональной активностью (рис. 25). Доменная
организация характерна для полифункциональных белков.
Основная роль в стабилизации супервторичной структуры принадлежит взаимодействиям между аминокислотными радикалами.
Третичная структура – общее пространственное расположение
белковой молекулы (рис. 26). Как минимум, белки по третичной струткуре подразделяются на глобулярные и фибриллярные. Но с учетом особенностей состава и организации супервторичной стурктуры различают
α-белки, α/β-белки, α+β-белки, β-белки и аморфные. Третичная структура
стабилизируется дисульфидными, ионными, водородными и гидрофобными связями.
42
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Рис. 25. Супервторичная структура белка. Подуровень – домены
Рис. 26. Третичная и четвертичная структуры белка
43
ТЕМА 2.
Четвертичная структура – общее пространственное расположение белковых субъединиц относительно друг друга (рис. 26), характерна
только для тех белков, которые имеют в своем составе несколько субъединиц или протомеров (полипептидных цепей). Субъединицы могут
быть как одинаковыми, так и разными. Обычно белки содержат четное
число субъединиц. Связи, которые удерживают субъединицы, малопрочные (водородные, ионные, реже гидрофобные взаимодействия). Способность протомеров объединяться в олигомерный белок обеспечивается
комплементарностью их поверхностных участков (пространственное и
химическое соответствие взаимодействующих поверхностей).
Гипотеза «расплавленной глобулы»
В укладке полипептидной цепи в трехмерную структуру ведущую
роль играет самоорганизация белковой молекулы, описываемая гипотезой «расплавленной глобулы» (рис. 27).
Рис. 27. Гипотеза «расплавленной глобулы» описывает укладку полипептидной цепи
белка в нативную пространственную структуру
Согласно этой гипотезе полипептидная цепь проходит несколько этапов укладки в пространстве. Сначала образуются отдельные участки вторичной структуры, при определенном их количестве наблюдается переориентация радикалов аминокислот и переход всей цепи в более компактную
44
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
форму. Затем образуется нативная пространственная конформация белковой молекулы, решающим моментом при этом является замыкание дисульфидных связей. Частично свернутая полипептидная цепь называется «расплавленной глобулой».
Свойства белковых растворов
Свойства белковых растворов определяются большими размерами
молекул, т. е. белки являются коллоидными частицами и образуют коллоидные растворы (размеры частиц – 0,1–0,001 мкм) – размеры частиц
дисперсной среды и дисперсной фазы различаются в десятки и сотни раз.
Коллоидный раствор состоит из жидкой фазы (золь) и студенистой (гель).
К свойствам белковых растворов относятся:
1. Рассеивание света вследствие дифракции на коллоидных частицах –
опалесценция. Особенно это заметно при прохождении луча света через
белковый раствор, когда виден светящийся конус (эффект Тиндаля).
2. Белковые растворы, в отличие от истинных, обладают малой скоростью диффузии.
3. Неспособность белковых частиц проникать через мембраны,
поры которых меньше диаметра белков (полунепроницаемые мембраны). Это используется в диализе. Очистка белковых препаратов от посторонних примесей лежит в основе работы «искусственной почки» при
лечении острой почечной недостаточности.
4. Создание онкотического давления, то есть перемещение воды в сторону более высокой концентрации белка, что проявляется, например, как
формирование отеков при повышении проницаемости сосудистой стенки.
5. Высокая вязкость в результате сил сцепления между крупными молекулами, что проявляется, например, при образовании гелей и студней.
Гидратация белков и факторы, влияющие на их растворимость
Белки – гидрофильные вещества. Если растворять сухой белок в
воде, то сначала он, как всякое гидрофильное высокомолекулярное соединение, набухает, а затем молекулы белка начинают постепенно переходить в раствор. При набухании молекулы воды проникают в белок и
связываются с его полярными группами. Плотная упаковка полипептидных цепей разрыхляется. Набухший белок можно считать как бы обратным раствором, т. е. раствором молекул воды в высокомолекулярном веществе – белке. Дальнейшее поглощение воды приводит к отрыву молекул белка от общей массы и растворению. Но набухание не всегда ведет
к растворению; некоторые белки, например коллаген, так и остаются в
набухшем виде, поглотив большое количество воды.
Растворение связано с гидратацией белков, т. е. связыванием молекул
воды с белками. Гидратная вода так прочно связана с макромолекулой
45
ТЕМА 2.
белка, что отделить ее удается с большим трудом. Это говорит не о простой
адсорбции, а об электростатическом связывании молекул воды с полярными группами боковых радикалов кислых аминокислот, несущих отрицательный заряд, и основных аминокислот, несущих положительный заряд.
Однако часть гидратной воды связывается пептидными группами,
которые образуют с молекулами воды водородные связи. Например, полипептиды с неполярными боковыми группами тоже набухают, т. е. связывают воду. Так, большое количество воды связывает коллаген, хотя этот
белок содержит преимущественно неполярные аминокислоты. Вода, связываясь с пептидными группами, раздвигает вытянутые полипептидные
цепи. Однако межцепочечные связи (мостики) не дают молекулам белка
отрываться друг от друга и переходить в раствор. При нагревании массы,
содержащей коллаген, межцепочечные мостики в коллагеновых волокнах
разрываются, и освобожденные полипептидные цепи переходят в раствор.
Эта фракция частично гидролизованного растворимого коллагена называется желатиной. Желатина по химическому составу близка к коллагену,
легко набухает и растворяется в воде, образуя вязкие жидкости. Характерным свойством желатины является способность к гелеобразованию.
Водные растворы желатины широко используются в лечебной практике как плазмозамещающее и кровоостанавливающее средство, а способность к гелеобразованию – при изготовлении капсул в фармацевтической практике.
Растворы белков способны к осаждению (коагуляции).
Различают 2 вида реакций осаждения:
1) обратимое осаждение. Белковая молекула в растворе удерживается двумя факторами: зарядом и гидратной оболочкой. При высаливании нарушается гидратная, или водная, оболочка белка. Суммарный заряд белковой молекулы, его структура и свойства при этом не изменяются. Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей
аммония, щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание),
спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей.
Осажденные таким образом белки могут быть вновь растворены, например, если соли удалить методом диализа.
2) необратимое осаждение – денатурация. При этом нарушается
гидратная оболочка белковой молекулы и изменяется ее суммарный заряд. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (рН около 5,0). Снятие заряда осуществляется путем подведения рН к изоэлектрической точке. Удаление гидратной оболочки
производится водоотнимающими средствами (органические растворители, соли щелочноземельных металлов в высокой концентрации), изменением температуры и др.
46
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Высаливание
Растворы нейтральных солей широко используются не только для повышения растворимости белка, например при выделении его из биологического материала, но и для избирательного осаждения разных белков, т. е. их
фракционирования. Процесс осаждения белков нейтральными солевыми
растворами называется высаливанием. Характерной особенностью белков, полученных высаливанием, является сохранение ими нативных биологических свойств после удаления соли.
Механизм высаливания состоит в том, что добавляемые анионы и катионы солевого раствора снимают гидратную оболочку белков, являющуюся одним из факторов его устойчивости. Возможно, одновременно
происходит и нейтрализация зарядов белка ионами соли, что также способствует осаждению белков.
Способность к высаливанию наиболее выражена у анионов солей. По
силе высаливающего действия анионы и катионы располагаются в следующие ряды:
SO42- > С6Н5О73- > СН3СОО- > Сl- > NO3- > Вr- > I- > CNSLi+ > Na+ > К+ > Pb+ > Сs+
Эти ряды называются лиотропными.
Сильным высаливающим эффектом в этом ряду обладают сульфаты. На практике для высаливания белков чаще всего применяют сульфат натрия и аммония.
Кроме солей белки осаждают органическими водоотнимающими
средствами (этанол, ацетон, метанол и др.).
Высаливание широко используют для разделения и очистки белков,
поскольку многие белки различаются по размеру гидратной оболочки и
величине зарядов. Для каждого из них имеется своя зона высаливания,
т. е. концентрация соли, позволяющая дегидратировать и осадить белок.
После удаления высаливающего агента белок сохраняет все свои природные свойства и функции.
Денатурация (денативация) и ренатурация (ренативация)
При действии различных веществ, нарушающих высшие уровни организации белковой молекулы (вторичную, третичную, четвертичную) с
сохранением первичной структуры, белок теряет свои нативные физикохимические и, главное, биологические свойства. Это явление называется
денатурацией (денативацией). Оно характерно только для молекул, имеющих сложную пространственную организацию (например, белков).
Пептиды не способны к денатурации.
При денатурации разрываются связи, стабилизирующие четвертичную, третичную и даже вторичную структуры. Полипептидная цепь разворачивается и находится в растворе или в развернутом виде, или в виде
47
ТЕМА 2.
беспорядочного клубка. При этом теряется гидратная оболочка и белок
выпадает в осадок. Однако осажденный денатурированный белок отличается от того же белка, осажденного путем высаливания, тем, что он
утрачивает свои нативные свойства. Это указывает на то, что механизм
действия веществ, вызывающих денатурацию и высаливание, разный.
При высаливании сохраняется нативная структура белка, а при денатурации разрушается.
Денатурирующие факторы делятся на физические и химические.
Свойства денатурированных белков
Наиболее типичными для денатурированных белков являются следующие признаки:
1) увеличение числа реактивных или функциональных групп по сравнению с нативной молекулой белка (функциональными группами называются группы боковых радикалов аминокислот: -СООН, -NН2, -SН, -ОН).
Часть этих групп обычно находится внутри молекулы белка и не выявляется специальными реагентами. Развертывание полипептидной цепи при
денатурации позволяет обнаружить эти дополнительные, или скрытые,
группы;
2) уменьшение растворимости и осаждение белка (связано с потерей
гидратной оболочки, развертыванием молекулы белка с «обнажением»
гидрофобных радикалов и нейтрализацией зарядов полярных групп);
3) изменение конфигурации молекулы белка;
4) потеря биологической активности, вызванная нарушением нативной структурной организации молекулы;
5) более легкое расщепление протеолитическими ферментами по
сравнению с нативным белком; переход компактной нативной структуры
в развернутую рыхлую форму облегчает доступ ферментов к пептидным
связям белка, которые они разрушают.
Последнее качество денатурированного белка широко известно. Термическая или иная обработка продуктов, содержащих белки (главным образом мясные), способствует лучшему перевариванию их с помощью
протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта. В желудке
человека и животных вырабатывается природный денатурирующий
агент – соляная кислота, которая, денатурируя белки, помогает их расщеплению ферментами. Однако наличие соляной кислоты и протеолитических ферментов не позволяет применять белковые лекарственные препараты через рот, так как они денатурируются и тут же расщепляются,
теряя свою биологическую активность.
Денатурирующие вещества, осаждающие белки, используются в
биохимической практике с иными целями, чем высаливающие. Высаливание как прием применяется для выделения какого-то белка или группы
48
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
белков, а денатурация – для освобождения от белка смеси каких-либо
веществ. Удаляя белок, можно получить безбелковый раствор или устранить действие этого белка.
Долго считалось, что денатурация необратима. Однако в некоторых
случаях удаление денатурирующего агента (такие опыты были сделаны
при использовании мочевины) восстанавливает биологическую активность белка. Процесс восстановления физико-химических и биологических свойств денатурированного белка называется ренатурацией или ренативацией (рис. 28). Если денатурированный белок (после удаления денатурирующих веществ) вновь самоорганизуется в исходную структуру,
то восстанавливается и его биологическая активность.
Рис. 28. Денатурация и ренатурация молекулы белка
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 2.
Проведение диализа белоксодержащего раствора
Принцип: неспособность белка проникать через полупроницаемые
мембраны широко используется для очистки белков от низкомолекулярных примесей, которые свободно проходят через мембрану. Процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных частиц с помощью
полупроницаемых мембран называется диализом. С помощью диализа
очищают высокомолекулярные растворы белковых веществ от примеси
низкомолекулярных соединений (солей, сахаров и др.). В качестве полупроницаемой мембраны используется целлофан, коллоид, пергамент
и др. Из этого материала делают мешочек, в который вносят раствор
белка с примесью низкомолекулярных веществ. Мешочек помещают в
49
ТЕМА 2.
стакан с водой, в которую будут диффундировать низкомолекулярные
частицы, а белок остается внутри мешочка (рис. 29).
Рис. 29. Простейший диализатор
Задача отделения белков от низкомолекулярных примесей возникает
при проведении многоступенчатых процедур выделения и очистки белков,
исследовании их физических и химических свойств, биологических функций. Также диализ приходится проводить при анализе белков. Велико значение диализа в медицине, когда с помощью данного метода поддерживают жизнь больных хронической почечной недостаточностью.
Реактивы и оборудование:
1) раствор яичного белка с хлористым натрием; 2) AgNO 3, 0,5%-ный
раствор (в бутылочке из темного стекла); 3) HNO3, 10%-ный раствор;
4) NaOH, 10%-ный раствор; 5) CuSO4, 1%-ный раствор; 6) кусочки целлофана размером 12,5 × 12,5 см; нитки; 7) дистиллированная вода; 8) стакан; 9) стеклянные палочки; 10) пипетки капельные; 11) градуированные
пипетки на 1–2 мл или дозаторы.
Ход работы:
1 этап (готовит лаборант): в мешочек из целлофана наливают до
половины объема раствор яичного белка (с хлористым натрием). Мешочек перевязывают ниткой и подвешивают на стеклянной палочке, погружая в стакан с дистиллированной водой. Диализ проводят при комнатной
температуре. Через 60–120 минут из стакана (диализатора) берут по 2 мл
воды в две пробирки.
50
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
2 этап: в одной пробирке (№ 1) проводят реакцию на ионы хлора –
должен выпасть осадок хлористого серебра; в другой пробирке (№ 2)
проводят биуретовую реакцию. Если диализ проводится правильно, биуретовая реакция будет отрицательной.
№
пробирки
1
2
Добавленные реагенты
Наблюдаемые
изменения
Чем обусловлена реакция?
Вывод
2 мл воды из диализатора;
10 % HNO3 – 3 капли;
0,5 % AgNO3 – 3 капли
2 мл воды из диализатора;
10 % NaOH – 5 капель;
1 % CuSO4 – 2 капли
Задание: 1) зарисуйте в тетрадь устройство простейшего диализатора (рис. 29); 2) выполните лабораторную работу; 3) заполните пустые
ячейки в таблице; 4) сформулируйте итоговый вывод о правильности
протекания диализа.
Клинико-диагностическое значение:
Принцип диализа взят за основу работы аппарата «искусственная
почка» – т. н. гемодиализ. Гемодиализ применяется при необходимости
очищения крови от находящихся в ней вредных для организма веществ
при следующих патологических состояниях: острая почечная недостаточность; хроническая почечная недостаточность в терминальной стадии; отравления ядами и лекарствами (способными пройти через диализную мембрану).
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Охарактеризуйте коллоидные свойства растворов белковых молекул.
2. Что такое диализ?
3. Какое применение в практической медицине получил диализ?
Лабораторная работа № 3.
Проведение и изучение денатурации белков
3.1. Осаждение белков при кипячении
Принцип: воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой происходят необратимые изменения физико-химических и биологических свойств макромолекул.
На скорость и интенсивность процесса будут влиять рН и добавление
электролитов. Быстро и наиболее полно белки денатурируют в изоэлектрической точке. Сдвиги рН в кислую и щелочную стороны затормаживают процесс осаждения белков. В сильнокислых и сильнощелочных растворах осаждения белков при кипячении практически не происходит.
51
ТЕМА 2.
При добавлении кислот молекулы белка заряжаются положительно, в щелочных растворах они приобретают отрицательные заряды. Прибавление
электролитов (например, хлористого натрия) ускоряет процесс осаждения даже в кислой среде.
Так, если нагреть нейтральный раствор белка до кипения (как в пробирке № 1), жидкость должна помутнеть, так как разрушаются водные
оболочки вокруг молекулы белка и происходит укрупнение его частиц.
Если раствор белка подкислить слабым раствором кислоты и нагреть (как
в пробирке № 2), то хлопьевидный осадок белка выпадет скорее и полнее,
так как при подкислении рН раствора приблизится к изоэлектрической
точке белка. Если раствор белка подкислить более концентрированной
кислотой и нагреть (как в пробирке № 3), то даже при кипячении осадка
не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость. Если раствор белка
подкислить и добавить электролит – хлористый натрий, а затем нагреть
(как в пробирке № 4), то выпадет белый хлопьевидный осадок, так как
частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами хлористого натрия, а также теряют гидратную оболочку. Если раствор белка подщелочить и нагреть до кипения, то
осадка не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд
на частицах белка увеличивается.
Реактивы и оборудование:
1) раствор яичного белка; 2) CH3COOH, 1%-ный; 10%-ный раствор;
3) NaOH, 10%-ный раствор; 4) NaCl, насыщенный раствор; 5) пробирки;
6) спиртовки; 7) держатели; 8) пипетки капельные; 9) градуированные пипетки на 0,5–1 мл или дозаторы.
Ход работы:
№
пробирки
1
2
3
4
5
Добавленные реагенты,
условия
Р-р яичного белка – 5 капель;
нагревают до кипения
Р-р яичного белка – 5 капель;
1 % CH3COOH – 1 капля;
нагревают
Р-р яичного белка – 5 капель;
10 % CH3COOH – 5 капель;
нагревают
Р-р яичного белка – 5 капель;
10 % CH3COOH – 5 капель;
насыщ. р-р NaCl – 2 капли;
нагревают
Р-р яичного белка – 5 капель;
10 % NaOH – 2 капли;
нагревают
Наблюдаемые
изменения
52
Объяснение наблюдаемых
изменений. Вывод
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Задание: выполните лабораторную работу, заполните пустые ячейки
в таблице.
3.2. Осаждение белков солями тяжелых металлов, концентрированными минеральными кислотами и органическими веществами
Принцип: А) осаждение белков солями тяжелых металлов (в отличие от высаливания) происходит при небольших концентрациях солей.
Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO3, HgCl2), но нерастворимые в воде. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т. е. денатурацию.
Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного положительного заряда на частицах белка.
Б) Концентрированные минеральные кислоты вызывают резкую дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом происходит образование комплексных соединений. В результате происходит
денатурация белка. Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке
всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший в осадок
белок растворяется.
В) Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков.
Чаще используют растворы трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот. Сульфосалициловая кислота кроме белков осаждает также продукты
их распада – высокомолекулярные пептоны и полипептиды. Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки и не осаждает продукты
распада белков.
В органических растворителях (спирт, ацетон и др.) белки не растворяются и выпадают в осадок. В зависимости от природы белка для его
осаждения требуются различные концентрации спирта. Спирт связывает
воду, вызывая дегидратацию мицелл белка и неустойчивость их в растворе. При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным
или слабокислым, но не щелочным. Реакция может облегчаться присутствием электролита хлористого натрия вследствие снятия заряда с частиц
белка. Реакция осаждения белка спиртом или кратковременным действием спирта обратима при охлаждении. Если осадок быстро отделить
от спирта, то белок может сохранить нативное состояние.
Реактивы и оборудование:
1) раствор яичного белка; 2) CuSO4, 5%-ный раствор; 3) (CH3COO)2Pb,
5%-ный раствор; 4) HNO3, конц.; 5) сульфосалициловая кислота, 20%-ный
раствор; 6) пробирки; 7) пипетки капельные.
53
ТЕМА 2.
Ход работы:
№
пробирки
1
2
3
4
Добавленные реагенты,
условия
Р-р яичного белка – 10 капель;
5 % CuSO4 – по каплям
до выпадения осадка
Р-р яичного белка – 10 капель;
5 % (CH3COO)2Pb – по каплям
до выпадения осадка
Р-р яичного белка – 10 капель;
конц. HNO3 – наслаивают осторожно
(!) по стенке пробирки до появления
белого кольца или осадка
Р-р яичного белка – 10 капель;
20 % сульфосалициловая кислота –
по каплям до появления осадка
Наблюдаемые Объяснение наблюдаемых
изменения
изменений. Вывод
Задание: выполните лабораторную работу, заполните пустые ячейки
в таблице.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Назовите факторы устойчивости белка в водном растворе.
2. Назовите виды осаждения белка.
3. Что такое денатурация?
4. Как можно осадить белок из раствора?
5. Обратим ли процесс денатурации?
6. Какие уровни организации белковой молекулы нарушаются, а какие сохраняются при денатурации?
7. С помощью чего можно осадить белок из раствора? Назовите факторы денатурации.
Тест для самоконтроля:
1. Белки лучше осаждаются в изоэлектрической точке, потому что:
а) подвергаются гидролизу;
б) имеют высокий суммарный заряд;
в) имеют нулевой суммарный заряд;
г) изменяется молекулярная масса;
д) изменяется аминокислотный состав.
2. Для очистки крови в аппарате «искусственная почка» используется метод:
а) электрофореза;
б) диализа;
в) аффинной хроматографии;
г) высаливания;
д) распределительной хроматографии.
54
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
3. Все перечисленные факторы вызывают необратимую денатурацию белка, кроме:
а) нагревания до 100 °С;
б) действия кислот и щелочей;
в) действия солей тяжелых металлов;
г) нагревания до 40 °С;
д) ионизирующей радиации.
4. Растворимость белков не зависит от:
а) размера белковой молекулы;
б) сродства к лигандам;
в) наличия заряда и гидратной оболочки;
г) рН раствора;
д) аминокислотного состава.
5. Какая из структур белка обладает максимальной прочностью:
а) первичная;
б) вторичная;
в) третичная;
г) четвертичная;
д) прочность всех структур примерно одинакова.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Объясните факторы устойчивости коллоидного раствора белка.
2. От чего зависит заряд белка в водном растворе?
3. Чем обусловлены реакции осаждения белков? При каких температурных условиях возможно осаждение белков?
4. Что такое обратимое и необратимое осаждение белков?
5. Что такое денатурация белка? Дайте характеристику денатурирующим агентам.
6. Что происходит с белковой молекулой при высаливании?
7. В чем суть процесса диализа?
8. Каково практическое значение диализа?
9. Что такое нативная структура белка?
10. Охарактеризуйте первичную и вторичную структуры белковых
молекул.
11. Охарактеризуйте супервторичную структуру белков.
12. Охарактеризуйте третичную и четвертичную структуры белковых молекул.
13. Что такое «расплавленная глобула»?
14. Что такое фолдинг белка? Назовите и охарактеризуете молекулыпомощники фолдинга (шапероны, шаперонины, фолдазы). Нарушения
фолдинга. Прионы.
55
ТЕМА 2.
Лабораторно-практическое занятие
ПРОСТЫЕ И СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ.
ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ
ТЕОРИЯ
Функции белков
1. Структурная. Входят в состав мембран клеток и отличаются высокой гидрофобностью. Составляют остов многих тканей и органов,
определяют их механические свойства: коллаген соединительных тканей, костей, суставов; эластин связок, альфа-кератин кожи, волос, ногтей,
рогов, перьев, склеротин наружного скелета насекомых, фиброин шелка.
К этой группе можно отнести белковые вещества клеточных стенок бактерий, оболочек вирусов, мембранные и рибосомальные белки.
2. Двигательная. Наиболее известны белки сократительного аппарата мышц – актин и миозин. К этой же группе относится тубулин, входящий в состав микротрубочек, обеспечивающих перемещение ресничек
и жгутиков клетки.
3. Каталитическая (ферменты, или энзимы). Ежесекундно в клетке
протекает множество ферментативных реакций. Ферменты могут быть
построены из одной полипептидной цепи, нескольких цепей или даже образовывать комплексы. Ферменты увеличивают скорость реакции в миллионы и миллиарды раз.
4. Транспортная (например, гемоглобин, миоглобин и др.). Ряд белков выполняет функции переноса веществ из одного компартмента
клетки в другой или между органами целого организма. Например, гемоглобин переносит кислород от легких к тканям, а углекислый газ – от тканей к легким. В крови локализованы специальные транспортные белки –
альбумины, переносящие различные экзогенные и эндогенные вещества.
Имеются также специальные белки – пермеазы, переносящие различные
вещества через биологические мембраны.
5. Регуляторная (гормоны, гистоны, репрессоры). В организме существует специальный класс белков, выполняющих регуляторные функции.
В первую очередь к ним относятся гормоны белково-пептидной природы.
Эти белки играют основную роль в регуляции клеточной и физиологической активности. Например, гормон инсулин регулируют потребление
клетками глюкозы, кальцитонин – содержание кальция в крови и костной
ткани и т. п.
6. Защитная (антитела и иммуноглобулины). Защитные белки помогают организму преодолевать патологические состояния или бороться с
возбудителями заболеваний. Антитела и иммуноглобулины синтезируются в костном мозге и предохраняют организм от чужеродных бактерий.
56
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Они обладают уникальным свойством распознавать чужеродные бактерии, вирусы и белки, связываться с ними и нейтрализовать. Сюда относятся антигены тканевой совместимости, антивирусные реагенты – интерферон, факторы некроза опухолей, а также фибриноген, тромбин и
фибрин, предохраняющие организм от потери крови (обеспечивают свертываемость).
7. Рецепторная (родопсин, холинорецептор и т. п.). Играют важную
роль при передаче нервного или гормонального сигнала в клетку или ее
некоторые компартменты. Рецепторы локализованы в мембранах, и механизмы передачи информации связаны в основном с изменениями конформации белка, поглощением или выделением энергии и т. п.
8. Запасная и питательная (казеин молока, яичный альбумин и т. п.).
Ряд белков используется клетками в качестве резервного, питательного материала. К ним относятся проламины и глютелины – белки растений, преимущественно зерновых, овальбумин – питательный белок птичьих яиц.
9. Токсическая (токсины ботулинический, дифтерийный). Представлены ядами змей, скорпионов, пчел. Они характеризуются относительно
низкой молекулярной массой. Токсины растений и микроорганизмов –
дифтерийный и холерный токсины, рицин, абрин и т. п.
10. Антибиотики (актиноксантин, неокарциностатин и т. п.) обладают противобактериальным действием.
Строение простых и сложных белков
По своему строению белки подразделяются на простые и сложные.
Простые белки состоят только из аминокислот (рис. 30).
Рис. 30. Классификация простых белков
57
ТЕМА 2.
Сложные белки состоят из апобелка и простетической группы (лиганда) (рис. 31).
Рис. 31. Классификация сложных белков
Функции простетической группы в составе сложного белка разнообразны:
1) изменяет свойства белков (заряд, растворимость, термолабильность);
2) фосфорная кислота в фосфопротеинах или остатки моносахаридов
в гликопротеинах защищают белок от протеолиза вне и внутри клетки;
3) углеводная часть в гликопротеинах в виде лиганда обеспечивает
транспорт нерастворимых в воде соединений;
4) перенос жиров и холестерина липопротеинами – придает биологическую активность и определяет функцию белка;
5) нуклеиновая кислота в нуклеопротеинах, гем в гемоглобине, углевод в рецепторных белках влияют на проникновение через мембраны,
внутриклеточную миграцию, сортировку и секрецию белков. Это выполняет, как правило, углеводный остаток.
I. Хромопротеины
Хромопротеины придают тканям цвет. Хромопротеины содержат
окрашенные простетические группы:
– гемопротеины (содержат гем);
– ретинальпротеины (содержат витамин А);
– флавопротеины (содержат витамин В2);
– кобамидпротеины (содержат витамин В12).
58
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Гемопротеины:
– неферментативные (гемоглобин, миоглобин),
– ферменты (цитохромы, каталаза, пероксидаза).
Гем – структура, включающая в себя порфириновое кольцо (состоящее из 4 пиррольных колец) и иона Fe2+ (рис. 32). Железо связывается с
порфириновым кольцом двумя координационными и двумя ковалентными связями. Это – небелковая часть гемопротеинов. Цитохромы различаются аминокислотным составом пептидных цепей, числом цепей и
разделяются на типы а, b, с, d. Цитохромы находятся в составе дыхательной цепи и цепи микросомального окисления.
Рис. 32. Один из вариантов гема
Флавопротеины – это ферменты окислительно-восстановительных
реакций. Содержат производные витамина В2 флавинмононуклеотид
(ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД) (рис. 33).
Рис. 33. Флавинадениндинуклеотид (ФАД)
59
ТЕМА 2.
II. Гликопротеины
Гликопротеины, или гликоконъюгаты, – это белки, содержащие
углеводный компонент, ковалентно присоединенный к полипептидной
основе. Содержание углеводов в них варьирует от 1 до 85 % по массе.
Два подкласса белков, содержащих углеводы, – протеогликаны и
гликопротеины. Между этими подклассами имеются существенные отличия (табл. 5).
Таблица 5
Сравнительная характеристика истинных гликопротеинов и протеогликанов
Гликопротеины
– доля углеводов 15–20 %
– не содержат уроновых кислот
– углеводные цепи содержат не более 15 звеньев
– углевод имеет нерегулярное строение
Протеогликаны
– доля углеводов 80–85 %
– имеются уроновые кислоты
– углеводные цепи крайне велики
– углевод имеет регулярное строение
Уроновые кислоты – это производные гексоз, имеющие в 6-м положении карбоксильные группы (рис. 34): глюкуроновую, галактуроновую,
идуроновую, аскорбиновую кислоты. Они часто входят в состав протеогликанов.
Рис. 34. Уроновые кислоты
Строение производных моносахаридов
Аминосахара – производные моносахаров (рис. 35), содержащие
аминогруппы – глюкозамин или галактозамин.
Рис. 35. Аминосахара
60
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Эти производные обязательно входят в состав дисахаридных компонентов гетерополисахаридов. Ряд антибиотиков (эритромицин, карбомицин) содержат в своем составе аминосахара. Сиаловые кислоты являются N- или O-ацилпроизводными нейраминовой кислоты, которую
можно рассматривать как производное глюкозы. Они, наряду с аминосахарами, входят в состав гликопротеинов и гликолипидов (ганглиозидов).
Гликозиды – соединения, образующиеся путем конденсации моносахарида (свободного или в составе полисахарида) с гидроксильной группой другого соединения, которым может быть любой моносахарид или
вещество неуглеводной природы (агликон), например метанол, глицерол,
стерол, фенол.
Широкое применение в кардиологии нашли входящие в состав
наперстянки сердечные гликозиды. В качестве агликона они содержат
стероиды. Известный антибиотик стрептомицин также является гликозидом.
Функции гликопротеинов:
1. Структурная – клеточная стенка бактерий, костный матрикс,
например коллаген, эластин.
2. Защитная – например, антитела, интерферон, факторы свертывания крови (протромбин, фибриноген).
3. Рецепторная – присоединение эффектора приводит к изменению
конформации белка-рецептора, что вызывает внутриклеточный ответ.
4. Гормональная – гонадотропный, адренокортикотропный и тиреотропный гормоны.
5. Ферментативная – холинэстераза, нуклеаза.
6. Транспортная – перенос веществ в крови и через мембраны,
например, трансферрин, транскортин, альбумин, Na+, К+-АТФаза.
Протеогликаны – характеризуется наличием крупных полисахаридов, состоящих из повторяющихся дисахаридных остатков. Дисахариды
включают в себя какую-либо уроновую кислоту и аминосахар. Многократно дублируясь, дисахариды образуют олиго- и полисахаридные цепи –
гликаны. Для углеводной части встречаются другие названия – кислые гетерополисахариды (т. к. имеют много кислотных групп), гликозаминогликаны (содержат аминогруппы).
Основные представители гликозаминогликанов: гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, кератансульфаты и дерматансульфаты,
гепарин. Эти молекулы входят в состав протеогликанов, функцией которых является заполнение межклеточного пространства и удержание здесь
воды, также они выступают как смазочный и структурный компонент суставов и других тканевых структур.
61
ТЕМА 2.
Углеводная часть, аналогично гликопротеинам, связывается с белком через остатки серина и аспарагина. По функции протеогликаны особенно значимы для межклеточного пространства, особенно соединительной ткани, в которое погружены коллагеновые волокна. При помощи
электронной микроскопии выяснено, что они имеют древовидную структуру (рис. 36). Молекулы гликанов весьма гидрофильны, создают сетчатый желеподобный матрикс и заполняют пространство между клетками, являясь преградой для крупных молекул и микроорганизмов.
Рис. 36. Схема строения протеогликана
III. Липопротеины
Липопротеины имеют огромное клиническое значение. Структура
транспортных липопротеинов очень похожа на орех, у которого имеется
скорлупа и ядро (рис. 37). «Скорлупа» липопротеина является гидрофильной, «ядро» – гидрофобное.
Рис. 37. Схема строения липопротеина
62
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Внутреннюю часть формируют неполярные эфиры холестерола и
триацилглицеролы. В поверхностном слое находятся фосфолипиды, холестерол и белки. Белки в липопротеинах называются апопротеинами
(или апобелками). Их выделяют несколько видов: А, В, С, D. В каждом
типе липопротеинов преобладают соответствующие ему аполипобелки.
Выделяют четыре основных класса липопротеинов:
– липопротеины высокой плотности (ЛПВП, альфа-липопротеины,
α-ЛП);
– липопротеины низкой плотности (ЛПНП, бета-липопротеины, β-ЛП);
– липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП, пре-бета-липопротеины, пре-β-ЛП);
– хиломикроны (ХМ).
Концентрация и соотношение в крови тех или иных липопротеинов
играют ведущую роль в возникновении такой распространенной сосудистой патологии, как атеросклероз.
Свойства и функции липопротеинов разных классов зависят от состава, т. е. от соотношения триацилглицеролов, холестерола и его эфиров, фосфолипидов, белков. Главной функцией липопротеинов является
перенос в крови триацилглицеролов, холестерола и его эфиров.
Кроме того, типичной липопротеиновой структурой является биологическая мембрана.
IV. Металлопротеины
Если в белке содержатся ионы одного или нескольких металлов, то
такие белки называются металлопротеины. Ионы металлов соединены
координационными связями с функциональными группами белка. Металлопротеины могут быть ферментами.
Ионы металлов в этом случае:
– участвуют в ориентации субстрата в активном центре фермента;
– входят в состав активного центра фермента и участвуют в катализе,
являясь, например, акцепторами электронов на определенной стадии
ферментативной реакции.
К ферментативным металлопротеинам относятся белки, содержащие, например:
– медь: цитохромоксидаза, в комплексе с другими ферментами дыхательной цепи митохондрий участвует в синтезе АТФ;
– железо: ферритин, депонирующий железо в клетке; трансферрин,
переносящий железо в крови; каталаза, обезвреживающая перекись водорода;
– цинк: алкогольдегидрогеназа, обеспечивающая метаболизм
этанола и других спиртов; лактатдегидрогеназа, участвующая в метаболизме молочной кислоты; карбоангидраза, образующая угольную
63
ТЕМА 2.
кислоту из CO2 и H2O; щелочная фосфатаза, гидролизующая фосфорные
эфиры различных соединений; альфа2-макроглобулин, антипротеазный
белок крови;
– селен: тиреопероксидаза, участвующая в синтезе гормонов щитовидной железы; глутатионпероксидаза – антиоксидантный фермент;
– кальций: альфа-амилаза слюны и панкреатического сока, гидролизующая крахмал.
V. Фосфопротеины
Фосфопротеины – это белки, в которых присутствует фосфатная
группа. Она связывается с пептидной цепью через остатки тирозина, серина и треонина, т. е. тех аминокислот, которые содержат ОН-группу.
Фосфорная кислота может выполнять:
– структурную роль, придавая заряд, растворимость и изменяя свойства белка, например, в казеине молока, яичном альбумине;
– функциональную роль. В клетке присутствует много белков, которые связаны с фосфатом не постоянно, а в зависимости от активности
метаболизма. Белок может многократно переходить в фосфорилированную или в дефосфорилированную форму, что играет регулирующую роль
в его работе (рис. 38).
Рис. 38. Схема, отражающая изменение конформации белка
в фосфорилированном и дефосфорилированном состоянии
Фосфопротеины – это, как правило, ферменты, например такие ферменты, как гликогенсинтаза и гликогенфосфорилаза.
Фосфорилирование простых белков также влияет на их конформацию
и физико-химические свойства. Так, гистоны в фосфорилированном состоянии менее прочно связываются с ДНК, и активность генома возрастает.
VI. Нуклеопротеины
Нуклеопротеины отвечают за продолжение жизни клетки. Нуклеопротеины – это белки, связанные с нуклеиновыми кислотами (рис. 39).
Они составляют существенную часть рибосом, хроматина, вирусов.
64
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Рис. 39. Пример нуклеопротеина
В рибосомах рибонуклеиновая кислота (РНК) связывается со специфическими рибосомальными белками. Вирусы являются практически чистыми рибо- и дезоксирибонуклеопротеинами.
ПРАКТИКА
Лабораторная работа №4.
Определение химического состава казеиногена молока
Принцип: важнейший белок молока казеиноген содержится в молоке в виде растворимой кальциевой соли. Казеиноген обладает свойствами кислоты и в молоке находится в виде анионов, растворимых в
воде (кальцинат казеиногена). При подкислении молоко свертывается
благодаря выпадению в осадок казеиногена. Не следует добавлять избыток кислоты, поскольку молекулы белка перезаряжаются и вновь переходят в раствор, что мешает осаждению. Свертывание молока возможно
также и в присутствии молочной кислоты, образовавшейся из лактозы
под влиянием молочнокислых бактерий. При ферментативном свертывании молока (действие пепсина) казеиноген подвергается химическим изменениям с образованием из него казеина.
Реактивы и оборудование:
1) молоко; 2) уксусная кислота, конц.; 3) NaOH, 10%-ный раствор;
4) CuSO4, 1%-ный раствор; 5) HNO3, 10%-ный раствор; 6) фенолфталеин;
7) молибденовый реактив; 8) круглые фильтры, воронки; 9) пробирки химические и мерные; 10) спиртовки, держатели; 11) пипетки капельные и
градуированные.
Ход работы:
1. Осаждение казеиногена. К 4 мл молока приливают равный объем
дистиллированной воды. Осаждают казеиноген добавлением 1 капли
65
ТЕМА 2.
концентрированной уксусной кислоты. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают на фильтре дистиллированной водой 2 раза. Часть
осадка снимают с фильтра стеклянной палочкой в чистую пробирку.
2. Щелочной гидролиз казеиногена. В пробирку с казеиногеном
приливают 2 мл 10%-ного раствора NaOH. Кипятят 1–3 минуты над спиртовкой, затем охлаждают и проводят реакции на продукты гидролиза.
3. Проведение качественных реакций на продукты гидролиза:
А) Определение белка. Белок обнаруживают биуретовой реакцией.
В пробирку к 3 каплям гидролизата добавляют 1–2 капли 1%-ного раствора. Развивается розово-фиолетовое окрашивание.
Б) Обнаружение фосфата. Оставшийся гидролизат подкисляют
25–30 каплями 10%-ного раствора HNO3 в присутствии 1–2 капель фенолфталеина до обесцвечивания и отфильтровывают в сухую пробирку.
С фильтратом проделывают реакцию на фосфат: к 5 каплям фильтрата
приливают 20 капель молибденового реактива и кипятят несколько минут. Жидкость окрашивается в желтый цвет.
Задание: результаты запишите в протокол лабораторной работы.
Сделайте вывод о составе казеина молока.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Охарактеризуйте структуру и свойства казеиногена. Как казеиноген превращается в казеин? В чем между ними различия?
2. Охарактеризуйте биологическую роль казеина.
3. Как можно осадить казеин? Что будет происходить, если добавить
избыток кислоты?
4. С помощью какой реакции можно обнаружить фосфорную кислоту в составе сложного белка?
Лабораторная работа № 5.
Выделение муцина из слюны и обнаружение углеводного компонента
Принцип: при подкислении слюны муцин выпадает в осадок. Для
доказательства наличия в муцине глюкозы выполняют нафтоловую
пробу. При действии концентрированной серной кислоты из глюкозы образуется оксиметилфурфурол, который конденсируется с альфа-нафтолом и образует соединение фиолетового цвета.
Реактивы и оборудование:
1) пробирки химические и пробирки мерные, стеклянные палочки;
2) спиртовой раствор альфа-нафтола, 1%-ный раствор; 3) уксусная кислота, конц.; 4) серная кислота, конц.; 5) градуированные пипетки на 2 мл;
6) пипетки капельные.
66
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
ВНИМАНИЕ!
С концентрированной серной кислотой работать осторожно!
Ход работы:
В пробирку собирают 2 мл слюны и по каплям прибавляют концентрированную уксусную кислоту (4–5 капель) до образования осадка муцина.
Жидкость осторожно сливают, задерживая сгусток муцина стеклянной палочкой. Затем с ним проводят нафтоловую пробу на его углеводный компонент.
Для этого к сгустку прибавляют 1–2 капли 1%-ного спиртового раствора альфа-нафтола, смешивают и осторожно по стенке наслаивают концентрированную серную кислоту (в объеме, равном содержимому пробирки). На границе раздела двух слоев жидкости постепенно появляется
фиолетово-красное кольцо, хорошо видимое на белом фоне.
Задание: результат запишите в протокол лабораторной работы. Сделайте вывод о составе муцина.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Охарактеризуйте структуру муцина.
2. Охарактеризуйте значение и функции муцина.
3. Какой качественной реакцией можно обнаружить углеводный
компонент муцина? Какое при этом развивается окрашивание?
Тест для самоконтроля:
1. Гликопротеины – это сложные белки, в состав которых входит
простетическая группа, представляющая собой:
а) гем;
б) производные липидов;
в) производные углеводов;
г) нуклеотиды;
д) производные витамина А.
2. Липопротеины – это сложные белки, в состав которых входит
простетическая группа, представляющая собой:
а) гем;
б) производные липидов;
в) производные углеводов;
г) нуклеотиды;
д) витамины группы В.
3. Цитохромы относятся к классу:
а) нуклеопротеидов;
б) хромопротеидов;
в) гликопротеидов;
г) липопротеидов;
д) фосфопротеидов.
67
ТЕМА 2.
4. Хромопротеинами называются белки, имеющие в качестве простетической группы:
а) ДНК;
б) липиды;
в) углеводы;
г) пигменты;
д) фосфорную кислоту.
5. Гемопротеинами называются белки, имеющие в качестве простетической группы:
а) протопорфирин;
б) флавинмононуклеотид;
в) гем;
г) магнийпорфирин;
д) флавинадениндинуклеотид.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Охарактеризуйте основные функции белков. Приведите примеры.
2. Каков принцип разделения белков на простые и сложные?
3. Охарактеризуйте особенности строения, аминокислотного состава, химической и функциональной активности гистонов, протаминов,
альбуминов, глобулинов, проламинов, глютелинов, склеропротеинов.
Как особенности аминокислотного состава белков каждой группы влияют на их функции?
4. Охарактеризуйте особенности строения, аминокислотного состава, химической и функциональной активности хромопротеинов, липопротеинов, нуклеопротеинов, металлопротеинов, гликопротеинов, фосфопротеинов. Приведите примеры белков.
5. Какие связи стабилизируют апобелок и простетическую группу?
Объясните это на примере разных классов сложных белков.
6. Задание 1: в тетради для практических работ заполните таблицу
по характеристике простых белков:
Класс простых
белков
Выполняемые
Особенности структуры и
Физикофункции
аминокислотного
химические
(биологическая
состава
свойства
роль)
Альбумины
Глобулины
Гистоны
Протамины
Проламины
Глютеллины
Склеропротеины
68
Примеры
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Задание 2: в тетради для практических работ заполните таблицу по
характеристике сложных белков:
Класс сложных
белков
Выполняемые
Особенности структуры
Физикофункции
и состава белкового и
химические
(биологическая
небелкового компонента
свойства
роль)
Хромопротеиды
Гликопротеиды
Липопротеиды
Металлопротеиды
Фосфопротеиды
Нуклеопротеиды
69
Примеры
ТЕМА 2.
Лабораторно-практическое занятие
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
ТЕОРИЯ
Все известные способы определения концентрации общего белка в сыворотке (плазме) крови подразделяют на следующие основные группы:
1) азотметрические, основывающиеся на установлении количества
белкового азота;
2) способы, состоящие в определении плотности сыворотки
(плазмы);
3) весовые (гравиметрические), в этих случаях белки сыворотки
крови осаждают, высушивают до постоянного веса и взвешивают на аналитических весах;
4) рефрактометрические, основывающиеся на определении показателя (коэффициента) преломления (рефракции) света при прохождении
через раствор, содержащий белок;
5) колориметрические, основывающиеся на цветовых реакциях белков с определенными реактивами;
6) нефелометрические, количество белка устанавливают по степени
помутнения, производимого реактивами;
7) поляриметрические, основывающиеся на измерении степени поляризации света и угла поворота плоскости поляризации света при прохождении его через раствор, содержащий белок;
8) спектрофотометрические, заключающиеся в измерении степени
светопоглощения в ультрафиолетовой области.
Из колориметрических способов определения уровня общего белка особого внимания заслуживают методы, основанные на биуретовой реакции.
Так как на биуретовую реакцию не влияет присутствие в крови ароматических аминокислот (тирозина, триптофана), фенолов, мочевой кислоты, указанный метод считается самым специфичным, весьма точным и практически
доступным.
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 6.
Количественное определение белка в моче по помутнению,
образующемуся при добавлении сульфосалициловой кислоты
Принцип: интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислоты пропорциональна его концентрации.
Реактивы и оборудование:
1) раствор сульфосалициловой кислоты 3%-ный; 2) физиологический раствор; 3) стандартный раствор альбумина (0,1 г лиофизированного
70
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
альбумина из человеческой или бычьей сыворотки растворить в небольшом количестве физиологического растворав колбе вместимостью 100
мл, а затем довести до метки тем же раствором. Получаем 0,1%-ный раствор или раствор с концентрацией 1 г/л); 4) пробирки; 5) градуированные
пипетки на 5 мл; 6) спектрофотометр, кюветы на 5 мм; 7) марля или марлевый бинт для фильтрования мочи; 8) воронки.
Ход работы:
Мочу (если есть взвесь или осадок) профильтровать в сухую чистую
пробирку через 6–7 слоев марли, сложенной в воронку.
Приготовление контрольной пробы:
Контролем служит пробирка, в которой к 1,5 мл профильтрованной
мочи добавляют 3,5 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия (физиологическим раствором).
Приготовление и измерение опытной пробы:
В пробирку вносят 1,5 мл профильтрованной мочи, добавляют 3,5 мл
3%-ного раствора сульфосалициловой кислоты, перемешивают.
Через 10 минут измеряют на спектрофотометре при длине волны
590–650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контрольной
пробы в кювете длиной оптического пути 5 мм (измеряют Еоп).
Приготовление и измерение стандартной пробы:
В отдельную чистую пробирку переносят 1,5 мл стандартного раствора (С ст. = 1 г/л), добавляют 3,5 мл 3%-ного раствора сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 10 минут измеряют на спектрофотометре при длине волны 590–650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против дистиллированной воды в кювете длиной оптического
пути 5 мм (измеряют Е ст.).
Расчет:
Составляют пропорцию:
Е ст.
соответствует С ст.
Е оп.
соответствует С оп.
С оп. =
С ст. ∙ Е оп.
Е ст.
, где
Е ст. – экстинкция стандартной пробы;
Е оп. – экстинкция опытной пробы;
С ст. – концентрация белка в стандартном растворе;
С оп. – концентрация белка в опытной пробе.
ВНИМАНИЕ! Корректное количественное определение белка в
моче в ряде случаев затруднено.
71
ТЕМА 2.
Это обусловлено рядом факторов:
– низким содержанием белка в моче здорового человека, часто находящимся на пороге чувствительности большинства известных методов;
– присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций;
– значительными колебаниями содержания и состава белков мочи
при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.
Ложноположительные результаты могут быть при наличии в моче
контрастных веществ, содержащих органический йод. Поэтому тест
нельзя использовать для лиц, принимающих препараты йода. Ложноположительный результат может быть также обусловлен приемом сульфаниламидных препаратов, больших доз пенициллина и при высоких концентрациях в моче мочевой кислоты.
Задание: выполните лабораторную работу; результаты содержания
белка в исследуемой моче запишите в протокол лабораторной работы;
сделайте вывод по полученному результату на основании клинико-диагностического значения.
Клинико-диагностическое значение
У большинства здоровых людей белок в моче НЕ обнаруживается
вообще, или же его меньше, чем 0,033 г/л.
При исследовании суточной мочи в норме обнаруживается не более
0,03–0,05 г белка в сутки. Показатели у мужчин и женщин не отличаются.
Перед исследованием рекомендуется НЕ употреблять острую, копченую пищу, большое количество белковой пищи, алкоголь, применять
аспирин, пенициллин, сульфаниламидные препараты.
Для того чтобы определить суточную экскрецию белка, необходимо
отдать на исследование всю мочу, выделенную за сутки. В день сбора
мочи также следует ограничить употребление вышеперечисленных продуктов и медицинских препаратов.
Нормальное количество белка в моче у ребенка немного отличается от такового у взрослых. Так, у детей до 1 месяца оно составляет
0,24 г/л/сутки, а в возрасте старше 1 месяца – 0,06 г/л/сутки.
Повышенное содержание белка в моче называют протеинурией.
Ее делят на несколько уровней:
– следовая протеинурия – количество белка в моче не превышает
0,033 г;
– микроальбуминурия – 0,03 – 0,3 г/сутки;
– умеренная протеинурия – 0,3–1,0 г/сутки;
– средняя протеинурия – 1,0–3,0 г/сутки;
– выраженная протеинурия – больше 3 г/сутки.
72
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Появление следовой протеинурии может быть связано с нарушением
питания; стрессом; чрезмерными физическими нагрузками; повышением
температуры тела; применением некоторых лекарственных препаратов.
Различают следующие формы протеинурии в зависимости от места
возникновения:
– преренальную, связанную с усиленным распадом белка тканей, выраженным гемолизом;
– ренальную, обусловленную патологией почек, которая может быть
разделена на клубочковую и канальцевую;
– постренальную, связанную с патологией мочевыводящих путей и
чаще всего обусловленную воспалительной экссудацией.
В зависимости от длительности существования выделяют постоянную
протеинурию, существующую в течение многих недель и даже лет, и переходящую, появляющуюся периодически, иногда даже при отсутствии
патологии почек, например при лихорадке и выраженной интоксикации.
Обнаружение в моче белков с относительно большой молекулярной
массой свидетельствует об отсутствии избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Объясните принцип определения количества белка с сульфосалициловой кислотой.
2. Охарактеризуйте формы протеинурии в зависимости от места возникновения.
3. Охарактеризуйте формы протеинурии в зависимости от длительности существования.
4. Какова классификация протеинурий?
5. Какие факторы затрудняют определение количество белка в моче?
6. В каких случаях возможны ложноположительные результаты?
Лабораторная работа № 7.
Количественное определение белка в сыворотке крови
биуретовым методом
Принцип: в основе лежит цветная реакция с биуретовым реактивом.
Белки в щелочной среде реагируют с CuSO4, при этом образуется комплекс, окрашенный в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски прямопропорциональна количеству белка в исследуемой пробе.
Реактивы и оборудование:
1) сыворотка крови неразведенная; 2) биуретовый реактив; 3) стандартный раствор белка с концентрацией 50 г/л; 4) пробирки; 5) градуированные пипетки на 1, 2 и 5 мл; 6) спектрофотометр, кюветы на 10 мм.
73
ТЕМА 2.
Ход работы:
1. Метод расчета по стандартному раствору
В первую пробирку вносят 0,1 мл физиологического раствора –
0,9%-ного раствора NaCl (контрольная проба), во вторую пробирку – 0,1
мл стандартного раствора белка (50 г/л) (стандартная проба), в третью
пробирку – 0,1 мл исследуемой сыворотки крови (опытная проба).
Во все пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива, перемешивают содержимое пробирок, через 30 минут определяют экстинкцию
стандартной и опытной проб на спектрофотометре (кювета 10 мм, 540 нм)
против контрольной пробы.
Расчет:
Составляют пропорцию:
Е ст.
соответствует С ст.
Е оп.
соответствует С оп.
С оп. =
С ст. ∙ Е оп.
Е ст.
, где
Е ст. – экстинкция стандартной пробы;
Е оп. – экстинкция опытной пробы;
С ст. – концентрация белка в стандартном растворе;
С оп. – концентрация белка в опытной пробе.
2. Метод построения калибровочного графика
Ниже приведены данные для построения калибровочного графика.
На миллиметровой бумаге постройте калибровочный график (см. лабораторно-практическое занятие по физико-химическим методам в биохимии). Воспользовавшись графиком, определите концентрацию белка в
сыворотке (возьмите значение экстинкции опытной пробы (Еоп), измеренное на спектрофотометре в п. 1 данной работы).
Данные для построения калибровочного графика
№ пробы
1
2
3
4
5
Концентрация белка в
стандартных пробах, С (г/л)
20
40
60
80
100
Экстинкция
стандартных проб, Е
0,11
0,20
0,32
0,41
0,50
Задание: выполните лабораторную работу; результаты запишите в
протокол лабораторной работы; сделайте вывод о содержании белка в исследуемой сыворотке крови и на основании этого – заключение.
74
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Клинико-диагностическое значение
У здорового человека содержание общего белка составляет 65–85 г/л.
Уменьшение содержания белков ниже 65 г/л – гипопротеинемия, а увеличение количества белков больше, чем 85 г/л – гиперпротеинемия.
Гипопротеинемия наблюдается при нефротическом синдроме, энтерите, хроническом панкреатите, ожогах, экземе, массивных кровопотерях,
хронических болезнях почек, при голодании, при сердечной декомпенсации.
Гиперпротеинемия может быть при магроглобулинемии Вальденстрема, ревматоидном артрите, коллагенозах, циррозе печени, сгущении
крови (при диарее, рвоте, сахарном диабете, тяжелых травмах), острых
инфекционных заболеваниях.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Какая цветная реакция лежит в основе количественного определения белка сыворотки крови? Какое окрашивание развивается?
2. Какой прибор используется в работе?
3. Какой физико-химический метод лежит в основе определения?
4. Охарактеризуйте устройство и принцип работы спектрофотометра.
5. Каково содержание белка в сыворотке крови в норме?
6. С чем может быть связано его повышение или понижение?
Тест для самоконтроля:
1. Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови:
а) 20–30 г/л;
б) 40–50 г/л;
в) 60–85 г/л;
г) 90–100 г/л.
2. Какие вещества могут оказать влияние на точность определения
белка в моче?
а) аспирин;
б) активированный уголь;
в) витамин А;
г) мезим.
3. Гипопротеинемия наблюдается при:
а) хронических нефритах;
б) подагре;
в) сахарном диабете;
г) миеломной болезни.
4. Уменьшение содержания белка в крови называется:
а) гипопротеинемия;
б) гипоурикурия;
в) гиперпротеинемия;
г) гипопротеинурия.
75
ТЕМА 2.
5. Объединение мелких диспергированных частиц в бо́льшие по размеру агрегаты называется:
а) коагуляция;
б) флотация;
в) экстракция;
г) флокуляция.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Назовите и охарактеризуйте основные методы определения содержания общего белка в сыворотке крови.
2. Особенности оценки содержания белка в моче. Клинико-биоагностическое значение. Причины ложноположительных результатов.
3. Протеинурия, ее виды, признаки и причины.
4. Устройство и принцип работы спектрофотометра.
5. Порядок работы на приборе.
6. Принцип количественного определения белка в сыворотке крови.
7. Гипопротеинемия, ее признаки и причины.
8. Гиперпротеинемия, ее признаки и причины.
76
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ К ИТОГОВОМУ ЗАНЯТИЮ
1. Функциональные группы биологических молекул. Функциональные группы аминокислот.
2. Аминокислоты. Их структура и общие свойства функциональных
групп. Растворимость аминокислот. Влияние рН. Функции и значение
аминокислот. Формулы стандартных аминокислот. Классификация аминокислот по свойствам радикалов.
3. Кислотно-основные свойства аминокислот. Оптическая изомерия
аминокислот.
4. Незаменимые и заменимые аминокислоты. Их значение для организма. Полузаменимые аминокислоты. Последствия дефицита незаменимых аминокислот. Примеры патологий, связанных с дефицитом незаменимых аминокислот.
5. Пептидная связь. Характеристики, образование. Пептиды. Изоэлектрическая точка. Суммарный заряд молекулы. Физико-химические
свойства. Классификация по физиологическому действию.
6. Олигопептиды и полипептиды. Пептидные антибиотики. Общая
характеристика. Грамицидин S, циклоспорин. Структура, аминокислотный состав, особенности. Свойства и функции.
7. Пептидные гормоны. Общая характеристика строения. Окситоцин
и вазопрессин, связь аминокислотного состава и выполняемых функций.
8. Синтез пептидов в виде предшественников на примере энкефалинов – природных антибиотиков, их созревание, изменения в первичной
структуре.
9. Ансерин, карнозин, глутатион. Структура и значение для клеток и
организма.
10. Методы разделения и идентификации аминокислот и пептидов:
хроматография и электрофорез. Методы определения аминокислотной
последовательности белковых молекул.
11. Белки. Свойства белковых молекул. Биологические функции белков. Примеры белков. Растворимость белков, изоэлектрические точки.
Качественные реакции на белки и аминокислоты.
12. Коллоидные свойства белков. Факторы устойчивости коллоидного раствора белка. Обратимое осаждение и денатурация, ренатурация.
Денатурирующие агенты. Диализ как метод очистки белковых растворов.
Применение в практической медицине.
13. Тонкая и первичная структура белковых молекул. Взаимосвязь
между структурой и функцией. Связи, участвующие в образовании.
14. Вторичная структура. Зависимость биологической активности от
структуры молекул. Связи, участвующие в образовании.
77
ТЕМА 2.
15. Супервторичная структура. Ансамбли и домены. Структурные
мотивы: «бета-бочонок», «альфа-спираль – поворот – альфа-спираль»,
«цинковый палец», «лейциновая застежка-молния». Значение аминокислотного состава. Особенности.
16. Третичная структура. Связи, стабилизирующие третичную
структуру белка. Глобулярные и фибриллярные белки.
17. Гипотеза расплавленной глобулы. Фолдинг белка. Самопроизвольный – роль функциональных групп аминокислот. Участие шаперонов и шаперонинов в регуляции фолдинга. Ферменты фолдинга – фолдазы, характеристика действия.
18. Патологии, связанные с нарушением фолдинга белков. Системные амилоидозы. Амилоидозы, поражающие определенные органы и
ткани (сахарный диабет II типа, болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Хоттингера). Прионные белки, вызывающие заболевания.
19. Четвертичная структура белков. Зависимость их функций и активности от количества протомеров. Свойство комплементарности.
Строение гемоглобина.
20. Общая характеристика простых и сложных белков. Особенности
строения, характеристика связей, участвующих в стабилизации и формировании конечной конформации молекул сложных белков.
21. Альбумины. Характеристика аминокислотного состава, структуры и функций.
22. Глобулины. Характеристика аминокислотного состава, структуры и функций.
23. Гистоны. Характеристика аминокислотного состава, структуры и
функций. Участие в компактизации ДНК – формирование нуклеосомного
кора.
24. Протамины. Характеристика аминокислотного состава, структуры и функций.
25. Глютелины, проламины, склеропротеины. Характеристика аминокислотного состава, структуры и функций.
26. Строение альфа-кератина, коллагена и фиброина шелка. Химический состав. Связь структуры и свойств, выполняемых функций.
27. Хромопротеины. Характеристика строения и аминокислотного
состава апобелков, разнообразие простетических групп, связи между
апобелком и простетической группой, функции, примеры.
28. Липопротеины. Характеристика строения и аминокислотного состава апобелков, структурные и транспортные липопротеины, функции.
Фракции липопротеинов сыворотки крови, соотношение белков и липидов. Роль в патогенезе атеросклероза.
29. Гликопротеины. Характеристика строения и аминокислотного
состава апобелков, разнообразие простетических групп, связи между
78
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
апобелком и простетической группой, функции, примеры. Основные отличия гликопротеинов от протеогликанов. Роль углеводного компонента
гликопротеинов. Муцины.
30. Нуклеопротеины. Характеристика строения, связи между белком
и простетической группой, функции.
31. Металлопротеины. Характеристика строения и аминокислотного
состава белков, связи между белком и простетической группой, функции,
примеры.
32. Фосфопротеины. Характеристика строения и аминокислотного
состава белков, связи между белком и простетической группой, функции,
примеры.
79
ТЕМА 3.
Тема 3.
Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты
(строение, свойства, функции).
Нуклеопротеины
ТЕМА 3.
НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
(СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ). НУКЛЕОПРОТЕИНЫ
Лабораторно-практическое занятие
НУКЛЕОТИДЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И НУКЛЕОПРОТЕИНЫ
ТЕОРИЯ
Нуклеиновые кислоты – биологические полимеры, отвечающие за
хранение и реализацию генетической информации, состоящие из мономеров – нуклеотидов. Два вида нуклеиновых кислот: ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота и РНК – рибонуклеиновая кислота.
Программированный синтез белков – это главная функция нуклеиновых кислот, но есть и другие. Каталитическая функция: так, рибозимы
проявляют РНК-азную активность – это малые молекулы РНК с каталитической активностью (гидролизуют фосфодиэфирные связи в нуклеиновых кислотах, катализируют самосплайсинг – отщепление интронных,
нетранслируемых последовательностей в гетероядерной РНК (первичный транскрипт)).
Нуклеотиды
Нуклеотиды, в свою очередь, состоят из трех частей: азотистого основания, сахара пентозы и остатка фосфорной кислоты.
Азотистые основания – производные ароматических гетероциклических соединений – пурина и пиримидина. В состав нуклеиновых кислот входят два производных пурина – аденин (A) и гуанин (G) – и три
производных пиримидина – цитозин (C), урацил (U) и тимин (T) (рис. 40).
Все пять азотистых оснований называются главными (основными, мажорными). В составе нуклеотидов РНК также часто встречаются минорные азотистые основания (редко встречающиеся), такие как дигидроурацил, псевдоурацил, гипоксантин и др.
Взаимодействие азотистых оснований с пентозой приводит к образованию нуклеозида (рис. 41). Нуклеозиды, содержащие рибозу, называются рибонуклеозидами, а нуклеозиды, содержащие дезоксирибозу – дезоксирибонуклеозидами.
Пентоза углеродным атомом в первом положении связывается N-гликозидной связью с атомом азота в 9 положении пурина или атомом азота
в 1 положении пиримидина. Так, аденин, соединяясь с пентозой, образует
аденозин, гуанин дает гуанозин, из цитозина образуется цитидин, из урацила – уридин, из тимина – тимидин.
80
НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ).
НУКЛЕОПРОТЕИНЫ
Рис. 40. Основные азотистые основания
Рис. 41. Строение нуклеотида (с одним, двумя и тремя остатками фосфорной кислоты)
Приставка «дезокси-» указывает на наличие дезоксирибозы в составе
нуклеозида, например дезоксиаденозин, дезоксигуанозин и т. д. (табл. 6).
81
ТЕМА 3.
Нуклеотидами называют фосфорные эфиры нуклеозидов. К одному
атому пентозы может присоединяться от одного до трех остатков фосфорной кислоты.
Название мононуклеотида состоит из названия нуклеозида, указания
места присоединения и числа остатков фосфорной кислоты (табл. 6).
Таблица 6
Номенклатура азотистых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов
Нуклеозид
Азотистое
Однобук(азотистое основание +
основание
венный код
пентоза)
ДНК:
Аденин
Дезоксиаденозин
дА (dA)
дГ (dG)
Гуанин
Дезоксигуанозин
дЦ (dC)
Цитозин
Дезоксицитидин
Т (T)
Тимин
Тимидин
д-Аденозинмонофосфат дАМФ (dAMP)
д-Гуанозинмонофосфат дГМФ (dGMP)
д-Цитидинмонофосфат дЦМФ (dCMP)
Тимидинмонофосфат
ТМФ (TMP)
РНК:
Аденин
Гуанин
Цитозин
Урацил
Аденозинмонофосфат
Гуанозинмонофосфат
Цитидинмонофосфат
Уридинмонофосфат
Аденозин
Гуанозин
Цитидин
Уридин
А (A)
Г (G)
Ц (C)
У (U)
Мононуклеотид
(нуклеозид + фосфат)
Обозначения
нуклеотидов
АМФ (AMP)
ГМФ (GMP)
ЦМФ (CMP)
УМФ (UMP)
Циклические нуклеотиды
Циклические нуклеотиды образуются в клетке при участии ферментов – циклаз и осуществляют регуляцию внутриклеточного метаболизма.
Так, циклические нуклеотиды ц-3’,5’-аденозинмонофосфат (цАМФ) и
ц-3’,5’-гуанозинмонофосфат (цГМФ) являются внутриклеточными посредниками гормонов, нейромедиаторов. Другие циклические соединения – 2’,3’-АМФ и 2’,3’-ГМФ являются промежуточными продуктами
распада нуклеиновых кислот (рис. 42).
Рис. 42. Циклические нуклеотиды:
А – циклический-2’,3’-АМФ, Б – циклический-3’,5’-АМФ
82
НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ).
НУКЛЕОПРОТЕИНЫ
Помимо того, что нуклеотиды являются мономерами нуклеиновых
кислот, они выполняют ряд других функций (табл. 7).
Таблица 7
Распределение и роль нуклеотидов в организме
I. Построение
нуклеиновых кислот
ДНК
РНК
НУКЛЕОТИДЫ
II. Синтез макроэргов
(АДФ) АТФ – энергетическая валюта клетки; являются субстратами и продуктами реакций окислительного, субстратного и
фотосинтетического фосфорилирования.
ГТФ – энергетически обеспечивает процессы трансляции белков.
УТФ – обеспечивает энергией синтез гликогена.
ЦТФ – участвует в синтезе
глицерофосфолипидов
III. Синтез коферментов
Например, АМФ:
1) никотинамидаденин-нуклеотид (НАД+);
2) никотинамидаденин-нуклеотид фосфат (НАДФ+);
3) флавинадениндинуклео-тид
(ФАД);
4) S-аденозилметионин;
5) КоА и др.
Строение нуклеиновых кислот
Нуклеотиды в ДНК и РНК ковалентно связаны между собой фосфодиэфирными мостиками, в которых 5’-фосфатная группа одного нуклеотида соединена с 3’-гидроксильной группой следующего нуклеотида
с образованием фосфодиэфирной связи (рис. 43).
Таким образом, ковалентный остов нуклеиновых кислот состоит из
чередующихся остатков фосфата и пентозы, а азотистые основания – боковые группы, присоединенные к остову регулярно через одинаковые интервалы. Остовы ДНК и РНК гидрофильны. Гидроксильные группы сахарных остатков образуют водородные связи с водой. Фосфатные группы
полностью диссоциированы при рН 7, их отрицательные заряды нейтрализуются в основном благодаря ионным взаимодействиям с белковыми
молекулами, несущими положительные заряды, а также с ионами металлов и полиаминов.
Последовательность одной цепи нуклеиновой кислоты всегда начинают с 5’-конца и заканчивают 3’-концом слева направо в направлении
5’→3’.
Свободные пиримидины и пурины обладают слабовыраженными основными свойствами и поэтому называют основаниями. Наиболее важные функциональные группы пиримидинов и пуринов – это атомы азота
кольца, карбонильные группы и аминогруппы, не входящие в цикл. Водородные связи между амино- и карбонильными группами служат вторым важнейшим типом взаимодействия между основанями в нуклеиновых кислотах.
83
ТЕМА 3.
Водородные связи между основаниями обеспечивают комплементарную ассоциацию между двумя (реже тремя или четырьмя) спиралями
нуклеиновых кислот: аденин (А) специфически связывается с тимином
(Т) или урацилом (U), а гуанин (G) – с цитозином (С) (рис. 44). Эти пары
оснований преобладают в структуре двойных спиралей ДНК и РНК и
называются – комплементарными.
Рис. 43. Фосфодиэфирные связи в ковалентном остове ДНК и РНК
Нуклеопротеиды – сложные белки, состоящие из простого белка и
небелковой части – нуклеиновых кислот. Нуклеопротеиды содержатся в
84
НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ).
НУКЛЕОПРОТЕИНЫ
большом количестве в ядерном веществе клеток. Кроме того, они выделены из цитоплазмы. Нуклеопротеиды обладают свойствами кислот, нерастворимы в воде и растворимы в щелочах.
Рис. 44. Водородные связи между парами оснований
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 8.
Изучение состава нуклеопротеидов
Принцип: для изучения состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей в присутствии серной кислоты. При непродолжительном, частичном гидролизе нуклеопротеиды распадаются на белок и
нуклеиновые кислоты. При продолжительном гидролизе наступает полный распад нуклеопротеидов. При гидролизе мононуклеотидов выделяются пуриновые или пиримидиновые основания, углевод (рибоза или дезоксирибоза) и фосфорная кислота. Составные части нуклеопротеидов в
гидролизате можно открыть с помощью цветных (качественных) реакций.
85
ТЕМА 3.
Реактивы и оборудование:
1) дрожжи (пекарские); 2) H2SO4, 10%-ный раствор; 3) NaOH, 10%ный раствор; 4) CuSO4, 1%-ный раствор; 5) аммиак концентрированный;
6) AgNO3, 2%-ный раствор (аммиачный раствор); 7) молибденовый реактив – раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте; 8) концентрированная H2SO4; 9) тимол, 1%-ный спиртовой раствор, или альфанафтол, 1%-ный раствор; 10) дистиллированная вода; 11) круглодонная
колба с воздушным холодильником; 12) воронка с фильтром; 13) мерный
цилиндр на 50 или 100 мл; 14) пипетки капельные.
Ход работы:
1. Кислотный гидролиз нуклеопротеидов (выполняют лаборанты)
Помещают 1 г пекарских дрожжей в круглодонную колбу на 100 мл,
добавляют 20 мл 10%-ного раствора H2SO4 и 20 мл дистиллированной
Н2О. Колбу закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой (воздушным холодильником) и кипятят под тягой в течение 1 часа на асбестовой
сетке при слабом нагревании. Через час после начала кипения нагревание
жидкости прекращают, дают ей остыть, переносят в цилиндр, доводят водой до первоначального объема и фильтруют.
С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов. При гидролизе нуклеиновых кислот обнаруживаются фосфорная кислота, рибоза или дезоксирибоза и азотистые основания – пуриновые и пиримидиновые.
2. Качественные реакции на составные части нуклеопротеидов:
А) Биуретовая проба на полипептиды
К 5 каплям гидролизата прибавляют 10 капель 10%-ного раствора
NaOH и 1 каплю 1%-ного раствора CuSO4. Жидкость окрашивается в розовый (или фиолетовый) цвет.
Б) Серебряная проба на пуриновые основания
Нейтрализуют 10 капель гидролизата 1 каплей концентрированного
аммиака и добавляют 5 капель 2%-ного раствора AgNO3. При стоянии через 3–5 мин выпадает небольшой бурый осадок серебряных производных
пуриновых оснований.
В) Качественная реакция Молиша на пентозу
При взаимодействии концентрированной серной кислоты с гексозами или пентозами происходит дегидратация их: из пентоз образуется
фурфурол, а из гексоз – оксиметилфурфурол. Они дают с тимолом (метилизопропилфенол) или альфа-нафтолом в присутствии концентрированной серной кислоты продукты конденсации красного цвета.
86
НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ).
НУКЛЕОПРОТЕИНЫ
К 10 каплям профильтрованного гидролизата дрожжей добавляют
2–3 капли 1%-ного спиртового раствора тимола (или альфа-нафтола), перемешивают и по стенке пробирки осторожно приливают 20 капель концентрированной H2SO4.
При встряхивании на дне пробирки образуется красное окрашивание
вследствие образования продукта конденсации фурфурола с тимолом
(или альфа-нафтолом).
Г) Молибденовая проба на фосфорную кислоту
К 3–5 каплям гидролизата приливают 20 капель молибденового реактива (раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте) и кипятят несколько минут. Жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет.
При охлаждении образуется желтый кристаллический осадок комплексного соединения фосфорно-молибденовокислого аммония.
Молибденовая проба на фосфорную кислоту:
H3PO4 + 12(NH4)2MoO4 + 21HNO3 → (NH4)3PO4 + 12MoO3 + 21NH4NO3 + 12H2O.
Задание: выполните п. 2 лабораторной работы; результаты запишите в
протокол лабораторной работы; сделайте вывод о составе нуклеопротеидов.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Охарактеризуйте структуру нуклеопротеинов.
2. Изобразите в тетради для лабораторных работ схему полного гидролиза нуклеопротеидов.
3. Какие функции выполняют нуклеопротеины?
4. Каков тип связи между белковым компонентом и простетической
группой в нуклеопротеинах?
5. Какой реакцией можно обнаружить фосфорную кислоту в составе
нуклеопротеинов?
6. Какой реакцией можно обнаружить пуриновые азотистые основания?
7. Какой реакцией можно обнаружить пентозы?
Тест для самоконтроля:
1. Мономерами нуклеиновых кислот являются:
а) нуклеозиды;
б) нуклеотиды;
в) азотистые основания;
г) нуклеопротеиды.
2. При полном гидролизе РНК образуются все перечисленные вещества, кроме:
а) фосфорной кислоты;
б) тимина;
в) аденина;
г) гуанина;
д) рибозы.
87
ТЕМА 3.
3. В составе нуклеиновых кислот встречаются все указанные
соединения, кроме:
а) цитозина;
б) тимина;
в) урацила;
г) имидазола.
4. Аденозин – это:
а) нуклеозид;
б) нуклеотид;
в) азотистое основание;
г) нуклеиновая кислота.
5. Первичная структура нуклеиновых кислот стабилизируется:
а) гидрофобными связями;
б) 3’,5’-фосфодиэфирными связями;
в) водородными связями;
г) ионными связями.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Пуриновые и пиримидиновые азотистые основания. Формулы,
строение. Главные и минорные азотистые основания.
2. Нуклеозиды. Образование гликозидной связи. Формулы.
3. Нуклеотиды. Образование фосфоэфирной связи. Моно-, ди- и трифосфаты. Функции нуклеотидов. Циклические нуклеотиды.
4. Понятие о первичной структуре нуклеиновых кислот. Образование 3’,5’-фосфодиэфирной связи между нуклеотидами. Характеристика
первичной структуры ДНК и РНК. Различия.
5. Вторичная структура ДНК. Модель ДНК, разработанная Д. Уотсоном и Ф. Криком. Правила Э. Чаргаффа и выводы из них. Принцип комплементарности, образование водородных связей между азотистыми основаниями.
6. Особенности и виды конформационных форм ДНК, связь с клеточным циклом.
7. Отличия вторичной структуры ДНК от вторичной структуры
РНК.
8. Типы и распределение рибонуклеиновых кислот в клетке. Особенности строения, связь с функциями. Малые РНК.
9. Понятие о третичной структуре нуклеиновых кислот. Связь с белками. Нуклеопротеины.
10. Сверхспирализация ДНК. Топоизомеразы.
11. Компактизация ДНК. Механизмы формирования нуклеомеров,
нуклеосом и хромосом.
88
НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ).
НУКЛЕОПРОТЕИНЫ
12. Биологическая роль нуклеиновых кислот в живых организмах.
Экспериментальные исследования Герши, как доказательство роли ДНК
в хранении и реализации наследственной информации.
13. Физико-химические свойства ДНК и РНК. Отношение к растворителям, вязкость, механическая прочность, взаимодействие с УФ. Гиперхромный и гипохромный эффект.
14. Структура, свойства и функции митохондриальной ДНК. Почему
митохондрии имеют собственную ДНК?
89
ТЕМА 4.
Тема 4.
Углеводы и липиды (строение, свойства, функции)
ТЕМА 4.
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Лабораторно-практическое занятие
СТРОЕНИЕ, ФУНКЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ
ТЕОРИЯ
Углеводы – это оксопроизводные многоатомных спиртов и продукты
их конденсации (полигидроксиальдегиды, полигидроксикетоны и их
производные).
В организме человека и животных они выполняют энергетическую,
защитную, структурную, механическую и другие функции. Так, глюкоза
является ценнейшим питательным веществом для большинства клеток и
особенно для мозга.
Все углеводы условно делят на две группы:
1. Углеводы с преимущественно энергетической функцией. Глюкоза
при полном окислении одной молекулы дает 38 молекул АТФ. Гомополисахариды (крахмал – в растениях; гликоген – в животных клетках) состоят из остатков альфа-D-глюкозы. Откладываются в цитозоле в виде
гранул и несут резервную функцию.
2. Углеводы с преимущественно структурной функцией. Гликопротеины и гликолипиды входят в состав мембран клеток и участвуют в специфических взаимодействиях (например, рецепторы). Гликозаминогликаны входят в состав соединительной ткани. Некоторые из них (гепарин)
выполняют регуляторную функцию.
Классификация углеводов основана на их структуре и физико-химических свойствах. По структуре углеводы принято разделять на моносахариды (от 1 до 10 атомов углерода, наиболее распространенные в природе – гексозы), олигосахариды (состоят из остатков моносахаридов от 1
до 10, самые распространенные – дисахариды), полисахариды (состоят из
большого количества остатков моносахаридов и подразделяются на гомополисахариды и гетерополисахариды).
Моносахариды
В зависимости от количества атомов углерода: триозы (3), тетрозы (4), пентозы (5), гексозы (6), гептозы (7), октозы (8), нонозы (9),
декозы (10).
В зависимости от функциональной группы: альдозы и кетозы. Альдозой является, например, глюкоза, а кетозой – фруктоза.
Моносахариды, начиная с пентоз в водном растворе образуют циклические формы. В зависимости от структуры цикла различают: пиранозы (шестичленный цикл) и фуранозы (пятичленный цикл).
90
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Для моносахаридов характерна оптическая изомерия (L- и D-), пространственная изомерия относительно аномерного атома углерода (α- и β-).
Структура глюкозы и ее возможных изомерных форм представлена
на рисунке 45.
Рис. 45. Структура глюкозы и ее возможных изомерных форм
Примечание: * – аномерный атом углерода (принадлежал карбонильной группе)
Олигосахариды
Олигосахариды и полисахариды построены из циклических форм
моносахаридов, соединенных между собой гликозидными связями.
Олигосахариды в зависимости от количества моносахаридных
остатков: дисахариды (рис. 46), трисахариды и т. д.
Рис. 46. Структура дисахарида мальтозы
(остатки α-D-глюкопиранозы связаны между собой α-1,4-гликозидной связью)
Полисахариды
В зависимости от структуры цепей: линейные (например, амилоза)
и разветвленные (например, амилопектин, гликоген (рис. 47)).
91
ТЕМА 4.
В зависимости от моносахаридных остатков: гомополисахариды
(одинаковые моносахариды входят в состав; например, сюда относятся
крахмал, гликоген, целлюлоза) и гетерополисахариды (разные моносахариды входят в состав; например, сюда относится гиалуроновая кислота,
молекула которой построена из D-глюкуроновой кислоты и Nацетилглюкозамина).
В связи с биологической функцией: резервные (крахмал у растений,
гликоген у животных) и структурные (целлюлоза).
Восстанавливающая способность углеводов
В растворах сахаров можно обнаружить карбонильную группу, спиртовой и полуацетальный гидроксилы. Каждая из этих групп вступает в
реакции окисления-восстановления. Восстанавливающая способность
моносахаридов характеризуется тем, что при действии слабых окислителей или ферментативно альдегидная группа в положении С1 переходит в
карбоксильную.
У дисахаридов, обладающих восстанавливающей способностью,
связь между мономерами осуществляется за счет спиртового и полуацетального гидроксилов. Одно из мономерных звеньев сохраняет свободный полуацетальный гидроксил, который определяет восстанавливающие свойства и все реакции, свойственные моносахаридам.
У невосстанавливающих дисахаридов гликозидная связь образована
за счет полуацетальных гидроксилов обоих моносахаридов. Поэтому они
не проявляют характерных реакций альдегидной группы.
Рис. 47. Фрагмент структура гликогена или амилопектина
92
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Конъюгаты углеводов
Гетерополисахариды входят в состав углевод-белковых комплексов,
которые подразделяют на протеогликаны и гликопротеины.
Протеогликаны – высокомолекулярные соединения, состоящие из
белка (5–10 %) и углеводной части (до 95 %). Белки в протеогликанах
представлены одной полипептидной цепью. Углеводная часть (гликозаминогликаны) представляет собой длинные неразветвленные цепи гетерополисахаридов. Они построены из повторяющихся дисахаридных единиц, одним мономером этого дисахарида является Д – глюкуроновая или
L – идуроновая кислоты, вторым мономером – производное аминосахара
глюкоз- и галактозамин.
Это, например, шесть классов гликозаминогликанов с хорошо известной структурой: гиалуроновая кислота, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератансульфат, гепарансульфат.
Гликопротеины – это белки, содержащие олигосахаридные цепи
разной длины, нерегулярного строения, ковалентно присоединенные к
полипептидной основе. Углеводный компонент гликопротеинов составляет не более 40 % от общей массы. Гликопротеины содержатся в
мембранах, в цитозоле клеток и в жидкостях организма. Они выполняют в организме человека разные функции и присутствуют во всех
классах белков.
Реакции для обнаружения углеводов
Реакция с реактивом Фелинга
Все моносахариды и некоторые дисахариды (лактоза, мальтоза) обладают редуцирующим действием, т. е. легко окисляются ионами Сu2+ в
щелочной среде, а ионы меди восстанавливаются, образуя при этом гидрат закиси меди СuОН – желтого цвета, который при длительном нагревании переходит в закись меди Сu2О – красного цвета.
Подобно реакции Фелинга протекает реакция Троммера (к раствору
сахара прибавляют NaOH и CuSO4).
Реакция Барфеда
Имеет тот же принцип, что и реакция Фелинга, но окисление сахара
происходит не в щелочной, а в среде, близкой к нейтральной. В этих
условиях редуцирующие дисахариды, в противоположность моносахаридам, практически не окисляются, а следовательно, не восстанавливают
реактив Барфеда, что позволяет отличить их от моносахаридов.
Реакция на пентозы по Биалю
При нагревании с концентрированными кислотами от пентоз отщепляется вода и образуется фурфурол, который с орцином дает голубоватозеленое окрашивание.
93
ТЕМА 4.
Получение озазона глюкозы
При обработке глюкозы избытком фенилгидразина образуется фенилгидразон глюкозы. При добавлении щелочи образуется озазон глюкозы. При этом 2-й атом углерода в глюкозе окисляется молекулой фенилгидразина, которая восстанавливается в анилин и аммиак.
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 9.
Качественные реакции на углеводы
9.1. Обнаружение глюкозы реакцией «серебряного зеркала»
Принцип: глюкоза – важнейшая в физиологическом отношении гексоза, является основным энергетическим субстратом организма. Главные
источники глюкозы – сахароза, крахмал, запасы гликогена в печени, а
также реакции синтеза из аминокислот, лактата.
Качественно глюкозу можно обнаружить с помощью реакции «серебряного зеркала». Благодаря восстанавливающей способности глюкозы бесцветный раствор гидрата окиси серебра восстанавливается до
металлического серебра, которое выделяется в виде черного осадка либо
в виде блестящего зеркального налета.
Реактивы и оборудование:
1) AgNO3, 0,2 н. раствор; 2) NaOH, 2 н. раствор; 3) NH 4OH, 2 н. раствор; 4) глюкоза, 0,5%-ный раствор; 5) дистиллированная вода; 6) пробирки; 7) пипетки капельные; 8) спиртовки, держатели.
Ход работы:
В пробирку наливают 3–4 капли 0,2 н. раствора AgNO3; 5 капель 2 н.
раствора NaOH и некоторое количество 2 н. раствора NH4OH (по каплям
до полного растворения образующегося осадка). Затем в пробирку добавляют 3–4 капли раствора глюкозы. Слегка подогревают на спиртовке.
Наблюдают изменения.
В другой пробирке проделывают ту же реакцию с дистиллированной
водой или раствором сравнения.
Задание: проведите реакцию «серебрянного зеркала», запишите результат в тетрадь для лабораторных работ, сделайте вывод.
9.2. Обнаружение фруктозы с реактивом Селиванова
(проба на кетозы)
Принцип: из фруктозы под действием кислоты при нагревании образуется оксиметилфурфурол, который затем, конденсируясь с резорцином, дает красное окрашивание.
94
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Реактивы и оборудование:
1) фруктоза, 0,5 %; 2) глюкоза, 0,5%-ный раствор; 3) реактив Селиванова (0,5%-ный раствор резорцина в 20%-ной соляной кислоте); 4) пробирки; 5) пипетки капельные; 6) спиртовки, держатели.
Ход работы:
Номер
пробирки
Добавленный
углевод
Пробирка
№1
Р-р фруктозы,
10 капель
Пробирка
№2
Р-р глюкозы,
10 капель
Пробирка
№3
(контрольная)
Дист. вода,
10 капель
Добавленные
реактивы, условия
Наблюдаемое Чем обусловлено
окрашивание окрашивание или
(результат)
его отсутствие?
+ Реактив Селиванова, 10 капель;
осторожно нагреть
на спиртовке
+ Реактив Селиванова, 10 капель;
осторожно нагреть
на спиртовке
+ Реактив Селиванова, 10 капель;
осторожно нагреть
на спиртовке
Задание: проведите реакции; наблюдаемый результат занесите в таблицу и оформите протокол лабораторной работы.
9.3. Реакция Молиша на углеводы с альфа-нафтолом
Принцип: углеводы и их производные в присутствии концентрированной сульфатной кислоты образуют фурфорол, который с альфанафтолом дает фиолетовое окрашивание (развивается на границе раздела
фаз при наслаивании кислоты). Положительную реакцию с альфа-нафтолом дают моно-, олиго- и полисахариды, поэтому ее используют для их
обнаружения в биологических жидкостях.
Реактивы и оборудование:
1) крахмал, 1%-ный раствор; 2) сахароза, 1%-ный раствор; 3) глюкоза,
1%-ный раствор; 4) альфа-нафтол; 5) пробирки; 6) градуированные пипетки на 1 мл; 7) пипетки капельные.
Ход работы:
Номер
пробирки
Добавленный
углевод
Добавленные
реактивы, условия
Пробирка
№1
Р-р крахмала,
1 мл
+ 2–3 капли α-нафтола
+ осторожно по стенке
пробирки наслаивают
по 1 мл конц. H2SO4
95
Наблюдаемое
окрашивание
(результат)
Чем обусловлено
окрашивание или
его отсутствие?
ТЕМА 4.
Пробирка
№2
Р-р сахарозы,
1 мл
Пробирка
№3
Р-р глюкозы,
1 мл
+ 2–3 капли α-нафтола
+ осторожно по стенке
пробирки наслаивают
по 1 мл конц. H2SO4
+ 2–3 капли α-нафтола
+ осторожно по стенке
пробирки наслаивают
по 1 мл конц. H2SO4
Задание: проведите реакции; наблюдаемый результат занесите в таблицу и оформите протокол лабораторной работы.
9.4. Реакция на пентозы с бензидином
Принцип: все пентозы при кипячении в кислой среде в присутствии
бензидина образуют красное окрашивание. Реакция обусловлена дегидрированием пентоз с образованием фурфурола, который дает красное
окрашивание с бензидином.
Реактивы и оборудование:
1) арабиноза, 1%-ный раствор; 2) раствор бензидина в уксусной кислоте; 3) пробирки; 4) градуированные пипетки или автоматические дозаторы, пипетки капельные; 5) спиртовки и держатели.
Ход работы:
В пробирку наливают 0,5 мл раствора бензидина в уксусной кислоте
и прибавляют 1–2 капли раствора арабинозы. Пробирку кипятят 5 минут
до появления красного окрашивания.
Задание: проведите реакцию; наблюдаемый результат занесите в
протокол лабораторной работы.
Клинико-диагностическое значение
Реакцию используют в клинической практике для дифференцирования пентозурии, обусловленной повышенным употреблением фруктов в
пищу, от глюкозурии.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Принцип обнаружения глюкозы реакцией «серебряного зеркала».
Будут ли давать эту реакцию другие моносахариды?
2. Будет ли фруктоза давать положительную реакцию Фелинга?
3. Какой реакцией можно отличить глюкозу от фруктозы?
4. Какой реакцией можно отличить рибозу от глюкозы и мальтозу от
сахарозы, а также лактозу от галактозы?
5. Принцип реакции Молиша.
6. Какими реакциями можно обнаружить продукты гидролиза крахмала и гликогена?
96
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Лабораторная работа № 10.
Определение восстанавливающей способности углеводов
Принцип: углеводы, обладающие восстанавливающей способностью, способны восстанавливать нерастворимый в воде осадок гидрата
окиси меди в желтый, а затем в красный осадок закиси меди.
Реактивы и оборудование:
1) глюкоза, 0,5%-ный раствор; 2) NaOH, 2 н. раствор; 3) CuSO4, 0,2 н.
раствор; 4) фруктоза, 0,5%-ный раствор; 5) сахароза, 0,5%-ный раствор;
6) лактоза, 1%-ный раствор; 7) крахмал, 1%-ный раствор; 8) пробирки; 9) пипетки капельные и градуированные на 0,5 и 1 мл; 9) спиртовки, держатели.
Ход работы:
Номер Добавленный
пробирки
углевод
Добавленные реактивы, условия
Наблюдаемое Чем обусловлено
окрашивание окрашивание или
(результат) его отсутствие?
+ 6–8 капель 2 н р-ра NaOH;
Пробирка Р-р глюкозы, + по каплям 0,2 н р-р CuSO4 (пока
№1
0,5 мл
не прекратится его растворение).
Осторожно нагревают на спиртовке
+ 6–8 капель 2 н р-ра NaOH;
Пробирка Р-р фруктозы, + по каплям 0,2 н р-р CuSO4 (пока не
№2
0,5 мл
прекратится его растворение).
Осторожно нагревают на спиртовке
+ 6–8 капель 2 н р-ра NaOH;
Пробирка Р-р сахарозы, + по каплям 0,2 н р-р CuSO4 (пока не
№3
0,5 мл
прекратится его растворение).
Осторожно нагревают на спиртовке
+ 6–8 капель 2 н р-ра NaOH;
Пробирка Р-р лактозы, + по каплям 0,2 н р-р CuSO4 (пока не
№4
0,5 мл
прекратится его растворение).
Осторожно нагревают на спиртовке
+ 6–8 капель 2 н р-ра NaOH;
Пробирка Р-р крахмала, + по каплям 0,2 н р-р CuSO4 (пока не
№5
0,5 мл
прекратится его растворение).
Осторожно нагревают на спиртовке
Задание: проведите реакции; результат запишите в таблицу и оформите протокол лабораторной работы. Сделайте вывод о восстанавливающей способности исследуемых углеводов.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Какие углеводы обладают восстанавливающей способностью?
2. Чем обусловлена восстанавливающая способность углеводов?
Напишите уравнение реакции с глюкозой и используемыми в работе реактивами, доказывающее ее восстанавливающую способность.
97
ТЕМА 4.
3. Какими реакциями можно подтвердить наличие восстанавливающей способности?
4. С помощью какой реакции можно отличить восстанавливающие
моносахариды от восстанавливающих дисахаридов?
Тест для самоконтроля:
1. К моносахаридам относится:
а) мальтоза;
б) фруктоза;
в) лактоза;
г) гепарин;
д) гликоген.
2. Гликоген является:
а) гетерополисахаридом;
б) гомополисахаридом;
в) олигосахаридом;
г) дисахаридом;
д) пептидом.
3. Глюкоза является:
а) кетогексозой;
б) кетопентозой;
в) альдогексозой;
г) альдопентозой;
д) дисахаридом.
4. В состав сахарозы входят остатки:
а) двух молекул глюкозы;
б) двух молекул фруктозы;
в) глюкозы и фруктозы;
г) галактозы и глюкозы.
5. Фруктоза является:
а) кетогексозой;
б) кетопентозой;
в) альдогексозой;
г) альдопентозой;
д) дисахаридом.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Что такое углеводы? Дайте определение.
2. На какие группы по структуре молекул классифицируются углеводы?
3. Охарактеризуйте функции углеводов, приведите примеры.
4. Физико-химические свойства углеводов.
98
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
5. Какова химическая структура, классификация, номенклатура и
конформация моносахаридов?
6. Виды изомерии моносахаридов. Кетозы и альдозы. Оптическая
изомерия. Напишите структурные формулы D- и L-изомеров глюкозы.
7. Проекционные формулы Фишера и проекционные циклические
формулы Хеуорса. Пиранозы и фуранозы. α- и β-изомеры.
8. Изобразить структурные проекционные циклические формулы
α-,D-глюкопиранозы, β-,D-глюкопиранозы, α-,D-рибофуранозы; α-,D-фруктофуранозы.
9. Напишите формулы рибозы и дезоксирибозы в кольчатой и цепной формах. Какое значение имеют данные моносахариды для жизнедеятельности организма?
10. Важнейшие дисахариды. Приведите примеры, опишите значение
и функции, изобразите структурные формулы.
11. Объясните восстанавливающую способность углеводов. Как ее
можно обнаружить в лабораторных условиях? Объясните отсутствие восстанавливающей способности у сахарозы.
12. Структура, свойства и биологическое значение гомополисахаридов и гетерополисахаридов.
13. Гетерополисахариды: гликозаминогликаны (гепарин, гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты), протеогликаны и гликопротеины.
Строение, функции.
14. Назовите основные группы гликопротеинов крови. В чем диагностическая ценность определения гликопротеинов?
15. Задание: заполните таблицу.
Класс углевода
Особенности строения
99
Основные представители.
Формулы
ТЕМА 4.
Лабораторно-практическое занятие
СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ЛИПИДОВ
ТЕОРИЯ
Липиды – разнообразные по химическому строению вещества, проявляющие ряд общих физических, физико-химических и биологических
свойств. Они характеризуются способностью растворяться в эфире, хлороформе, других жировых растворителях, однако не растворяются в
воде. Они способны формировать вместе с белками и углеводами основной структурный компонент живых клеток.
Обязательными компонентами липидов являются спирты и жирные
кислоты, соединенные друг с другом сложноэфирной или амидной связью.
Спирты в составе липидов
В качестве спиртового компонента в большинстве липидов присутствует трехатомный спирт глицерин или высокомолекулярный аминоспирт сфингозин; в меньших количествах в липидах присутствуют диольные спирты и производные сфингозина, например дигидросфингозин
(рис. 48).
Рис. 48. Структура спиртов,
входящих в состав триглицеридов, глицерофосфолипидов и сфинголипидов
Жирные кислоты
Жирные кислоты в организме человека имеют четное число атомов
углерода, что связано с особенностями их биосинтеза.
В свободном, неэтерифицированном состоянии жирные кислоты
(НЭЖК) в организме содержатся в небольшом количестве. Большая часть
жирных кислот – связанные (этерифицированные), входят в состав молекул липидов, где связаны с гидроксильными группами спиртов сложноэфирной связью.
Жирные кислоты липидов человека представляют собой углеводородную неразветвленную цепь, на одном конце которой находится карбоксильная группа, а на другом – метильная группа (ω-углеродный атом).
100
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Жирные кислоты, не содержащие двойных связей, называют насыщенными. Основной насыщенной жирной кислотой в липидах человека
является пальмитиновая (до 30–35 %). Жирные кислоты, содержащие
двойные связи, называют ненасыщенными. Ненасыщенные жирные кислоты представлены моноеновыми (с одной двойной связью, МНЖК) и полиеновыми (с двумя и большим числом двойных связей, ПНЖК). Важнейшие жирные кислоты представлены в таблице 8.
Таблица 8
Важнейшие природные жирные кислоты
Название кислоты, шифр
Строение
Лауриновая кислота (12:0)
СН3(СН2)10СООН
Миристиновая кислота (14:0)
СН3(СН2)12СООН
Пальмитиновая кислота (16:0)
СН3(СН2)14СООН
Стеариновая кислота (18:0)
СН3(СН2)16СООН
Арахиновая кислота (20:0)
СН3(СН2)18СООН
Лигноцериновая кислота (24:0)
СН3(СН2)22СООН
Пальмитоолеиновая кислота (16:1Δ9)
СН3(СН2)5СН=СН(СН2)7СООН
Олеиновая кислота (18:1Δ9)
СН3(СН2)7СН=СН(СН2)7СООН
Линолевая кислота (18:2Δ9,12)
СН3(СН2)4СН=СНСН2СН=СН(СН2)7СООН
Линоленовая кислота (18:3Δ9,12,15)
СН3СН2(СН=СНСН2)2СН=СН(СН2)7СООН
Арахидоновая кислота (20:4Δ5,8,11,14)
СН3(СН2)4(СН=СНСН2)3СН=СН(СН2)3СООН
Омега-3 и омега-6 семейства жирных кислот
Важнейшими классами полиеновых жирных кислот являются омега-3
(ω-3) и омега-6 (ω-6) семейства жирных кислот (рис. 49). (ω-(6,3) – номер
углеродного атома, у которого находится первая двойная связь, считая
от ω-(метильного) атома углерода).
Рис. 49. Схема, отображающая классификацию жирных кислот
101
ТЕМА 4.
Омега-3 кислоты (альфа-линоленовая – ALA, эйкозапентаеновая –
EPA, докозагексаеновая – DHA) содержатся в таких пищевых продуктах,
как семена льна (ALA), и в некоторых видах рыб (сельдь, скумбрия,
осетр) (EPA, DHA).
Они играют основную роль в поддержании здоровья клеточных
структур нашего организма и помогают в профилактике ряда неинфекционных заболеваний, в первую очередь сердечно-сосудистых (инфаркты,
инсульты, гипертоническая болезнь), а также депрессивного синдрома и
синдрома гиперактивности, заболеваний суставов и некоторых кожных
заболеваний; омега-3 активизируют работу иммунной системы, профилактируют болезнь Альцгеймера.
Вероятным механизмом их действия является то, что они влияют на
выработку организмом химических веществ, помогающих контролировать воспалительные процессы, происходящие в кровеносной системе,
суставах и тканях. Омега-3 жирные кислоты обладают противовоспалительным действием.
Но более значимой является способность омега-3 жирных кислот к
уменьшению отрицательного воздействия употребления избыточных количеств омега-6 жирных кислот (линолевая – LA, гамма-линоленовая –
GLA, арахидоновая – AA), которые присутствуют в куриных яйцах, мясе
домашней птицы, подсолнечном масле, маргарине и хлебобулочных изделиях. Важность Омега-6 для организма заключается в поддержании
здоровья кожи, снижении уровня холестерина, функции свертываемости
крови.
Однако, когда омега-6 жирные кислоты превосходят по поступлению в организм и не уравновешены необходимым для организма количеством омега-3 кислот, могут возникнуть различные нарушения здоровья.
Омега-6 жирные кислоты обладают провоспалительным действием.
Повышенная свертываемость крови является фактором риска появления
тромбоза и способствует развитию таких серьезных заболеваний, как инфаркт и инсульт, но, как только соотношение омега-3 и омега-6 достигает
нормативного уровня, риск сердечных заболеваний снижается.
В норме соотношение между омега-3 и омега-6 жирными кислотами
должно составлять приблизительно 1 : 4. Идеальное соотношение 1 : 1.
Снизить риск сердечно-сосудистых заболеваний поможет замена
омега-6 кислот в рационе жирными кислотами класса омега-9 (ω-6) – это
моноеновые ненасыщенные жирные кислоты (например, олеиновая кислота – ОА). Олеиновая кислота в большом количестве содержится в
оливковом масле, а также в рапсовом и миндальном масле, в авокадо. Она
поддерживает баланс холестерина, полезна при расстройствах пищеварения, болезнях печени и желчного пузыря.
102
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Классификация липидов
Липиды делят на две группы: неомыляемые (не содержат жирных
кислот) и омыляемые (содержат жирные кислоты).
К неомыляемым относятся стероиды, каротиноиды и терпеноиды
(построены из изопреновых остатков).
Омыляемые липиды делят на простые и сложные. К простым относятся триацилглицериды (резерв энергии) и воски. Сложные липиды –
фосфолипиды и гликолипиды (рис. 50).
Жирные кислоты, входящие в состав липидов (в частности, триацилглицеридов), определяют их физико-химические свойства. Чем
больше в липидах остатков короткоцепочечных и ненасыщенных кислот, тем ниже температура плавления и выше растворимость. Жиры,
в состав которых входит много ненасыщенных кислот, при комнатной
температуре будут жидкими; их называют маслами. Животные жиры, содержащие значительное количество насыщенных жирных кислот, при
этих условиях остаются твердыми.
Рис. 50. Структура простого липида – триацилглицерола (триглицерина, ТГ)
и сложного липида – фосфолипида (в данном случае – сфингомиелина)
Жировые числа
Для характеристики свойств жира используют константы, или жировые числа, – кислотное число, число омыления, йодное число.
Кислотное число – это масса гидроксида калия или натрия (мг), необходимая для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся
в 1 г жира.
Число омыления – это масса гидроксида калия или натрия (мг), необходимая для гидролиза нейтральных липидов (омыления) и нейтрализации
всех жирных кислот (в том числе свободных), содержащихся в 1 г жира.
Йодное число – это масса йода (г), связываемая 100 г жира. Поскольку
связывание йода происходит по месту двойных связей ненасыщенных кислот, йодное число характеризует степень ненасыщенности жира.
103
ТЕМА 4.
Стероиды
Стероиды – вещества, основу структуры которых составляет стерановый каркас (производные циклопентанпергидрофенантрена), обнаруживаются у животных и человека, в растениях.
Главный животный стероид – холестерин (холестерол) – представляет
собой вторичный циклический спирт (рис. 51). В организм человека холестерин поступает с продуктами животного происхождения либо может синтезироваться в организме (главным образом в печени). Он входит в структуру мембран, а также служит предшественником различных биологически
важных веществ (стероидных гормонов, желчных кислот, витамина D).
Рис. 51. Структура холестерина
Функции липидов
Разнообразие веществ этого класса определяет разнообразие их
функций. Так, основной функцией жиров является их способность служить источником энергии. Такие вещества, как фосфолипиды, гликолипиды, холестерин, входят в состав мембран.
Главные функции липидов:
1) пластическая: липиды входят в состав мембран и определяют их
свойства (избирательная проницаемость, участие в активном транспорте;
жидкостность, передача нервного импульса; биопотенциалы (не только
на нейронах, но и на мембранах митохондрий); упорядочение ферментативных цепей; входят в состав рецепторов для гормонов и обеспечивают
механизм усиления эффектов);
2) энергетическая: липиды служат энергетическим материалом для
организма (это основная функция жиров – простых липидов, ацилглицеролов); при окислении 1 г жира выделяется около 9,3 ккал (39 кДж/моль)
энергии, что в 2 раза больше, чем при окислении 1 г белков или углеводов. В сутки человек в среднем потребляет 60–80 г жира, что составляет
35–40 % суточного калоригенеза;
104
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
3) защитная: липиды предохраняют тело и органы от механического
повреждения и сохраняют тепло (подкожный жир, жировая капсула почек, сальник в брюшной полости);
4) регуляторная (эйкозаноиды, стероидные гормоны);
5) эмульгирование жиров (пищеварение), стабилизация липидсодержащих жидкостей (желчь) и транспорт гидрофобных молекул (мицеллы,
липопротеины);
6) резерв эндогенной воды: 1 г жира при окислении дает 1,07 г воды;
7) усвоение жирорастворимых соединений: жир необходим для растворения и всасывания жирорастворимых витаминов;
8) специфические функции: обеспечивают устойчивость эритроцитов; ганглиозиды связывают токсины и яды.
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 11.
Обнаружение липидов в сыворотке крови и растительном масле
В крови содержатся триглицериды, фосфолипиды, эфиры холестерина, свободный холестерин и неэстерифицированные жирные кислоты.
Жиры, всасывающиеся слизистой оболочкой тонкого кишечника,
в лимфе и в крови находятся в виде хиломикронов – мельчайших капелек,
содержащих до 1 % белка. Большинство липидов содержится в комплексе с белками.
Повышенное содержание триглицеридов в сыворотке крови может
свидетельствовать о снижении их превращений в тканях.
Принцип: липиды можно открыть по реакции с красителями суданового ряда (например, с суданом черным образуется розовое окрашивание).
Реактивы и оборудование:
1) судан, 1%-ный спиртовой раствор; 2) этанол (разбавляют водой в
2 раза непосредственно перед работой); 3) сыворотка крови; 4) растительное масло; 5) дистиллированная вода; 6) бумага для хроматографии
(нарезается полосками шириной 5 см); 7) чашки Петри.
Ход работы:
Каплю сыворотки наносят на полоску хроматографической бумаги,
высушивают при температуре не выше 90 ºС. Для сравнения на 2-ую полоску бумаги наносят каплю растительного масла, на 3-ю – каплю дистиллированной воды. Полоски высушивают.
Помещают полоски бумаги в чашки Петри, заливают суданом и
оставляют на 30 минут. После этого бумагу достают, дают стечь судану.
Раствором этилового спирта в чистой чашке Петри промывают бумагу.
105
ТЕМА 4.
На месте нанесения сыворотки крови заметно розовое пятно окрашенных
липопротеидов и хиломикронов.
Задание: выполните лабораторную работу; результат (описание
окраски пятен) запишите в протокол лабораторной работы. Сделайте вывод о содержании липидных компонентов в сыворотке по сравнению с
маслом и в сравнении с водой.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Объясните принцип работы.
2. Какой краситель используют для выявления липидов?
3. В какой форме жиры находятся в лимфе и в крови?
4. Какие функции выполняют липиды в организме человека?
Лабораторная работа № 12.
Сравнение ненасыщенности жиров
Принцип: о ненасыщенности жиров можно судить по йодному числу
(или количеству раствора йода, пошедшему на титрование раствора
жира).
Реактивы и оборудование:
1) свиное сало; сливочное масло; маргарин; растительное масло;
2) хлороформ; 3) 0,001 н. раствор йода в хлороформе; 4) стеклянные стаканчики; 5) бюретка или мерная пипетка для титрования.
Ход работы:
В четыре плоскодонных стаканчика отвесить по 0,5 г:
– в стаканчик № 1 – свиного сала;
– в стаканчик № 2 – сливочного масла;
– в стаканчик № 3 – маргарина;
– в стаканчик № 4 – 15 капель растительного масла.
Затем добавляют в каждый стаканчик по 3 мл хлороформа для растворения жира (твердые жиры следует предварительно расплавить). Титруют содержимое всех стаканчиков 0,001 н. раствором йода в хлороформе до появления отчетливой розовой окраски. Записывают объем раствора йода, пошедшего на титрование каждого вида жира.
Задание: выполните лабораторную работу; результаты занесите в
таблицу.
№
Исследуемый
жир
Объем реактива,
Вывод о степени ненасыщенности
пошедшего на титрование, мл
исследуемого жира
1
2
3
4
106
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Какие жиры называются ненасыщенными?
2. Что такое йодное число? Как его можно определить?
3. Приведите примеры ненасыщенных жирных кислот, относящихся
в моноеновым, полиеновым.
4. Назовите незаменимые жирные кислоты.
5. Как наличие и количество ненасыщенных связей влияет на структуру молекул липидов и их физические свойства?
Лабораторная работа № 13.
Определение кислотного числа жира
Принцип: кислотное число – масса КОН (NaOH) (г), связанная свободными жирными кислотами, содержащимися в 1 г жира. Таким образом, кислотное число жира говорит о наличии в исследуемом жире свободных (не связанных эфирными связями) жирных кислот.
Реактивы и оборудование:
1) жир (сливочное масло, маргарин, кулинарный жир, свиное сало);
2) весы (технические с разновесами, или аналитические, электронные);
3) стеклянные бюксы или стаканчики; 4) скальпель или нож; 5) пипетки;
6) бюретка для титрования; 7) хлороформ; 8) фенолфталеин; 9) 0,01 н.
раствор щелочи КОН (или NaOH).
Ход работы:
В четыре плоскодонных стаканчика отвесить по 0,5 г:
– в стаканчик № 1 – свиного сала;
– в стаканчик № 2 – сливочного масла;
– в стаканчик № 3 – маргарина;
– в стаканчик № 4 – 15 капель растительного масла.
Затем добавляют в каждый стаканчик по 3 мл хлороформа для растворения жира (твердые жиры следует предварительно расплавить).
Добавляют 1 каплю индикатора фенолфталеина.
Титруют 0,01 н. раствором щелочи по фенолфталеину. Окончание
титрования – появление слабо-розовой окраски в избытке щелочи, щелочь больше не связывается с жирными кислотами. Замеряют объем щелочи, пошедшей на титрование.
Вычисляют кислотное число жира по формуле:
Х =
V∙Т
а
, где
V – объем щелочи, пошедшей на титрование;
Т – титр щелочи;
а – масса жира.
107
ТЕМА 4.
Задание: выполните работу с разными жирами, сравните их кислотные числа; сделайте вывод о количестве свободных жирных кислот в разных жирах.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Что такое кислотное число? Как его можно определить?
2. Для чего в работе используется фенолфталеин?
3. Изобразите в тетради формулы пальмитиновой и стеариновой кислот; трипальмитата.
Тест для самоконтроля:
1. В структурном отношении все липиды являются:
а) простыми эфирами;
б) высшими спиртами;
в) сложными эфирами;
г) полициклическими спиртами.
2. В состав липидов входят высшие жирные кислоты:
а) с четным числом атомов углерода;
б) с нечетным числом атомов углерода;
в) монокарбоновые;
г) дикарбоновые.
3. К резервным липидам относятся:
а) фосфолипиды;
б) гликолипиды;
в) триглицериды;
г) стериды.
4. Сложные эфиры высших жирных кислот с глицерином и полициклическими спиртами составляют группу:
а) сложных липидов;
б) простых липидов;
в) фосфатидов;
г) диольных липидов.
5. Наиболее распространенные ненасыщенные жирные кислоты,
входящие в состав липидов:
а) акриловая;
б) олеиновая;
в) пальмитиновая;
г) линолевая.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Липиды: химическая структура, физико-химические свойства,
значение.
108
УГЛЕВОДЫ И ЛИПИДЫ (СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ)
2. Жирные кислоты, классификация, свойства и биологическое значение. Насыщенные и ненасыщенные. Семейства омега-3 и омега-6.
3. Классификация фосфолипидов. Химическая структура. Физикохимические свойства.
4. Классификация гликолипидов. Химическая структура. Физикохимические свойства.
5. Липопротеиды. Классификация. Свойства. Значение.
6. Холестерол. Химическая структура, биологическое значение. Другие стероиды.
7. Какие вещества образуются из холестерина в организме человека?
8. Задание: заполните таблицу.
Группа
Класс липидов
Основные
представители
Простые липиды
Сложные липиды
Стероиды
109
Особенности
строения
Формула
ТЕМА 4.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ К ИТОГОВОМУ ЗАНЯТИЮ
1. Структура и классификация углеводов. Функции углеводов, приведите примеры. Физико-химические свойства углеводов.
2. Химическая структура, классификация, номенклатура и конформация моносахаридов. Виды изомерии моносахаридов. Кетозы и альдозы.
Оптическая изомерия. Напишите структурные формулы D- и L-изомеров
глюкозы.
3. Проекционные формулы Фишера и проекционные циклические
формулы Хеуорса. Пиранозы и фуранозы. α- и β-изомеры. Изобразить
структурные проекционные циклические формулы α-,D-глюкопиранозы,
β-,D-глюкопиранозы, α-,D-рибофуранозы; α-,D-фруктофуранозы.
4. Важнейшие дисахариды. Приведите примеры, опишите значение
и функции, изобразите структурные формулы.
5. Восстанавливающая способность углеводов. Как ее можно обнаружить в лабораторных условиях? Объясните отсутствие восстанавливающей способности у сахарозы.
6. Структура, свойства и биологическое значение гомополисахаридов и гетерополисахаридов.
7. Гетерополисахариды: гликозаминогликаны (гепарин, гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты), протеогликаны и гликопротеины.
Строение, функции.
8. Структура и свойства жирных кислот. Классификация жирных
кислот. Незаменимые жирные кислоты.
9. Структура, классификация и свойства основных липидов организма человека. Структура и свойства ацилглицеролов. Состав природных триацилглицеролов.
10. Воски. Структура и свойства. Примеры восков, их практическое
применение.
11. Структура и классификация фосфолипидов. Глицерофосфолипиды. Сфингофосфолипиды – сфингомиелины. Выполняемые функции.
12. Гликолипиды: цереброзиды, ганглиозиды, сульфатиды. Номенклатура ганглиозидов. Выполняемые функции, примеры.
13. Стероиды: струкутра и свойства. Основные представители. Холестерол – животный стероид. Производные холестерола в организме человека, их роль.
110
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Тема 5.
Ферменты. Витамины. Коферментная роль витаминов
ТЕМА 5.
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Лабораторно-практическое занятие
СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
ТЕОРИЯ
Ферменты – биологические катализаторы белковой природы. Синтезируются в клетках организма. Ферменты относятся к простым или
сложным белкам.
Простые ферменты состоят только из аминокислот, а сложные – из
двух частей: белковой (апофермент) и небелковой (кофактор).
Если кофактор прочно связан с апоферментом, он называется простетической группой, если органической природы – коферментом.
В отличие от неорганических катализаторов, ферменты:
– действуют в мягких условиях (tо = 37 оС, рН 7,4, давление 1 атм);
– специфичны, т. е. катализируют определенные реакции.
При абсолютной специфичности действуют на один субстрат (S),
или группу родственных субстратов, а при относительной специфичности действуют на определенный тип связи. Специфичность фермента
обусловлена его конформацией.
– обладают высокой эффективностью;
– регулируются, то есть при определенных условиях работают с соответствующими данной ситуации скоростями; регулируются малыми
молекулами.
Участок фермента, в котором происходит специфическое связывание
субстрата и его превращение в продукт, называется активным центром.
У простых ферментов активный центр состоит из аминокислот. У
сложных ферментов, кроме аминокислот, в состав активного центра входит кофактор.
По теории Фишера субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку,
то есть между конформацией активного центра и конформацией субстрата существует абсолютное пространственное соответствие.
Согласно теории Кошланда, активный центр фермента формируется
окончательно при взаимодействии его с субстратом, то есть субстрат меняет активный центр в соответствии со своей формой в момент контакта
с ферментом.
Благодаря своей белковой природе ферменты сохраняют все свойства
белков. Денатурированные ферменты теряют свои специфические свойства биокатализаторов. С белковой природой связаны основные свойства
111
ТЕМА 5.
ферментов – специфичность, термолабильность, зависимость их действия
от значения рН, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.
Аллостерические ферменты
Аллостерическими называют ферменты, активность которых регулируется не их субстратами, а другими веществами, присоединяющимися к
ферментам в особых участках, удаленных от их активного центра (рис. 52).
Эти вещества влияют на активность фермента, вызывая обратимое изменение в структуре его активного центра. Называются такие вещества
аллостерическими эффекторами. Участвующие в аллостерической регуляции эффекторы – клеточные метаболиты часто именно того пути,
регуляцию которого они осуществляют.
Рис. 52. Схема организации молекулы фермента
В зависимости от характера влияния, которое они оказывают, увеличивая или уменьшая сродство фермента к субстрату, эффекторы подразделяются на аллостерические активаторы (ускоряющие реакцию) и аллостерические ингибиторы (тормозящие реакцию).
112
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Механизм действия ферментов
Скорость химической реакции определяется энергией активации (Еакт):
чем меньше энергия активации, тем легче (скорее) протекает реакция.
В присутствии фермента (Е) реакция (S→Р) делится на несколько
стадий.
Вначале фермент (Е) взаимодействует с субстратом (S) с образованием фермент-субстратного комплекса (ЕS). Энергия этой стадии невелика, и комплекс образуется быстро.
На второй стадии происходит образование продукта (Р). Поскольку
энергия ES-комплекса уже достаточно высока, то Еакт2 второй стадии будет опять невелика и переходное состояние ES достигается быстро.
Белковая природа ферментов определяет уникальные свойства этих
катализаторов:
1. Активность ферментов зависит от температуры.
2. Активность ферментов зависит от рН среды.
3. Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата.
4. Зависимость скорости реакции от концентрации фермента.
Определение активности фермента
Активность ферментов определяют:
– по скорости убывания субстрата;
– по скорости образования продукта.
Регуляция активности ферментов является главным отличительным свойством от небиологических катализаторов. Это достигается
действием аллостерических эффекторов (о них говорилось выше) и истинных эффекторов – активаторов и ингибиторов. Все эффекторы вызывают изменение конформации фермента, в результате изменяется
сродство фермента к субстрату.
Механизмы изменения активности ферментов:
1. Аллостерический. Регулятор действует на аллостерический центр.
Аллостерический центр – это участок фермента, пространственно не
совпадающий с активным центром. Присоединение регулятора к аллостерическому центру приводит к изменению конформации фермента, а
следовательно, и активного центра. Сродство фермента к субстрату при
этом изменяется.
2. Химическая модификация. Заключается в изменении химической
структуры фермента путем присоединения или отщепления каких-либо
химических групп в любом месте фермента. Химическое изменение фермента вызывает изменение конформации и, следовательно, активности.
Химическая модификация может осуществляться путем:
– фосфорилирования – дефосфорилирования;
113
ТЕМА 5.
– метилирования – деметилирования;
– аденилирования – деаденилирования.
3. Частным случаем химической модификации является ограниченный протеолиз. Ограниченный протеолиз – это процесс отщепления какой-либо части фермента в виде олиго- или полипептида. В результате
формируется активный центр. Активность фермента при этом возрастает.
4. Взаимодействие «белок-белок». Этот механизм регуляции не является самостоятельным и характерен только для ферментов с четвертичной структурой, то есть состоящих из субъединиц. Диссоциация или ассоциация этих субъединиц приводит к изменению конформации активного центра. Для одних ферментов ассоциация приводит в активации
фермента, а диссоциация – к ингибированию, для других – наоборот.
Действие истинных активаторов и ингибиторов на ферменты
Ингибирование ферментов бывает обратимым и необратимым.
Необратимые ингибиторы прочно связываются с ферментами, при
этом связываются или разрушаются функциональные группы, необходимые для проявления каталитической активности.
Необратимые ингибиторы не имеют физиологического значения и
являются ферментными ядами.
Обратимые ингибиторы действуют недолго. Комплекс фермент-ингибитор непрочен и быстро диссоциирует, активность фермента при этом
восстанавливается.
Обратимые ингибиторы делятся на конкурентные и неконкурентные.
Конкурентный ингибитор похож на субстрат по структуре и форме,
поэтому может конкурировать с ним за место в активном центре. Степень
ингибирования зависит от концентрации субстрата и ингибитора. Чем
больше концентрация ингибитора, тем сильнее ингибирование.
Неконкурентные ингибиторы структурно не похожи на субстрат, поэтому действуют вне активного центра путем аллостерического механизма или путем химической модификации.
Регуляция метаболических путей
Регуляция в метаболических путях (цепочках ферментативных реакций) направлена на ключевые ферменты, которые катализируют, как
правило, необратимые реакции. К ключевым ферментам относятся:
а) фермент, стоящий в начале цепи;
б) лимитирующий фермент (имеет наименьшую скорость в цепи);
в) ферменты, стоящие на развилке цепи.
Классификация ферментов
Катализируемая химическая реакция является тем признаком, по которому можно отличить один фермент от другого. Этот принцип был положен
114
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
в основу классификации ферментов, согласно которой все известные на
сегодняшний день ферменты подразделяют на семь классов.
Класс 1. Оксидоредуктазы (ЕС 1 или КФ 1) – катализируют окислительно-восстановительные реакции.
Класс 2. Трансферазы (ЕС 2 или КФ 2) – катализируют реакции переноса химических групп.
Класс 3. Гидролазы (ЕС 3 или КФ 3) – катализируют расщепление
связей с присоединением воды по месту разрыва.
Класс 4. Лиазы (ЕС 4 или КФ 4) – катализируют расщепление связей
без помощи воды, а таже реакции отщепления атомов от молекул с образованием двойной связи, или присоединение атомов по двойной
связи.
Класс 5. Изомеразы (ЕС 5 или КФ 5) – катализируют изомерные превращения.
Класс 6. Лигазы (синтетазы) (ЕС 6 или КФ 6) – катализируют реакции синтеза молекул с затратой АТФ.
Класс 7. Транслоказы (ЕС 7 или КФ 7) – катализируют реакции перемещения ионов или молекул через мембраны или их разделение внутри
мембран. Введен IUPAC в классификацию в 2018 году.
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 14.
Определение специфичности действия ферментов
Принцип: ферменты специфичны в отношение как типа катализируемых реакций, так и субстратов, на которые они воздействуют. Некоторые ферменты обладают абсолютной специфичностью, действуют на
один какой-либо субстрат.
Высокая специфичность ферментов определяется тем, что только некоторые, строго определенные функциональные группы, входящие в состав ферментов, могут участвовать в образовании фермент-субстратных
комплексов. Аминокислоты, составляющие активный центр фермента,
имеют определенное пространственное расположение, способствующее
соединению с субстратом.
Амилаза (КФ 3.2.1.1.) слюны ускоряет гидролиз только полисахарида
крахмала, не действует на дисахариды. Продуктами гидролиза полисахарида являются дисахарид мальтоза и моносахарид глюкоза, которую
можно открыть реакцией Троммера.
Положительная реакция Троммера свидетельствует о полном гидролизе крахмала под действием фермента. Положительная реакция с йодом
указывает на отсутствие гидролиза крахмала.
115
ТЕМА 5.
Реактивы и оборудование:
1) слюна в разведении 1 : 5; 2) сахароза, 1%-ный раствор; 3) крахмал,
1%-ный раствор; 4) NaOH, 10%-ный раствор; 5) CuSO4, 5%-ный раствор;
6) термостат или водяная баня (температура 38 оС); 7) химический цилиндр
на 10 мл; 8) пробирки химические; 9) градуированные пипетки на 2 и 5 мл;
10) пипетки капельные; 11) мерные пробирки; 12) спиртовки; держатели.
Ход работы:
Готовят разведение слюны 1 : 5.
Пробирка 1
Пробирка 2
+3 мл 1 % раствора крахмала
+3 мл 1 % раствора сахарозы
+0,5 мл слюны, разведенной 1 : 5
+0,5 мл слюны, разведенной 1 : 5
Содержимое пробирок тщательно перемешивают и ставят в термостат
на 10 минут при температуре 38–40 °С.
По истечении этого времени с содержимым каждой пробирки
проделывают реакцию Троммера
Реакция Троммера
+10 капель 10 % раствора NaOH
+5 капель 5 % раствора CuSO4, нагревают
до кипения, кипятят 1–2 минуты
Результат:
Реакция Троммера
+10 капель 10 % раствора NaOH
+5 капель 5 % раствора CuSO4, нагревают
до кипения, кипятят 1–2 минуты
Результат:
Задание: выполните лабораторную работу; запишите результат в
таблицу, сделайте вывод о специфичности действия амилазы.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Какую реакцию катализирует амилаза слюны?
2. Назовите субстраты амилазы. Какое они имеют строение?
3. Назовите продукты амилазной реакции.
4. Объясните результаты опыта со слюной.
5. С помощью какой качественной реакции можно обнаружить крахмал?
6. Какой специфичностью обладает амилаза слюны?
7. Обладают ли специфичностью неорганические катализаторы?
8. Что такое денатурация?
9. Для чего необходима инкубация фермента с субстратом?
10. Как можно измерить активность амилазы?
11. Какова зависимость скорости амилазной реакции от концентрации крахмала?
12. К какому классу ферментов относится амилаза слюны?
13. Подвергаются ли ферменты денатурации?
116
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Лабораторная работа № 15.
Влияние температуры на активность ферментов
Принцип: ферменты при нагревании до 60–80 оС утрачивают свои
свойства биологических катализаторов. Степень инактивирования зависит и от длительности теплового воздействия. При низких температурах
ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа
резко снижается. В термолабильности ферментов можно убедиться на
примере действия ферментов слюны – амилазы и мальтазы.
Амилаза катализирует гидролиз крахмала и гликогена до дисахарида
мальтозы. Мальтаза расщепляет мальтозу до глюкозы. Крахмал дает с йодом синее окрашивание, амилодекстрины (наиболее сложные) – фиолетовое, эритродекстрины – краснобурое, ахродекстрины – желтое (цвет
йода в воде). Мальтоза и глюкоза имеют свободные альдегидные группы
и дают реакцию Троммера, которая основана на способности углеводов
при нагревании восстанавливать гидрат окиси меди (голубого цвета) в
гидрат закиси желтого цвета. При дальнейшем нагревании гидрат закиси
переходит в красную закись меди.
Реактивы и оборудование:
1) слюна в разведении 1 : 5; 2) крахмал, 1%-ный раствор; 3) NaOH,
10%-ный раствор; 4) CuSO4, 5%-ный раствор; 5) 0,1%-ный раствор йода в
0,2%-ном йодистом калии; 6) мерные цилиндры (или стаканчики) на 10 или
25 мл, мерные пробирки; 7) градуированные пипетки на 1 и 5 мл; 8) термостат или водяная баня (температура 38 оС); 9) пипетки капельные; 10) стакан со льдом; 11) карандаши по стеклу, маркеры.
№
пробирок
Добавленные реагенты,
условия инкубации
+10 капель 1 % крахмала
+10 капель слюны, разведенной
1 : 5 (некипяченой)
Пробирка
+помещают на 10 минут в тер№1
мостат при 38 ºС
+по истечении времени
содержимое делят пополам
№
пробирки
Ход работы:
Готовят разведение слюны 1 : 5.
В чистую пробирку наливают небольшое количество слюны, разведенной 1 : 5 (3 мл) и кипятят ее в течение 5 минут, после чего охлаждают.
Реакции
для оценки
активности
фермента
1.1
+2 капли раствора
Люголя
+5 капель 10 % NaOH
1.2 +5 капель 5 % CuSO4,
+нагревают
117
Окраска
t ºC раствора,
вывод
ТЕМА 5.
+10 капель 1 % крахмала
+10 капель слюны, разведенной
1 : 5 (некипяченой)
Пробирка
+помещают на 10 минут в стакан
№2
со льдом
+по истечении времени содержимое делят пополам
+10 капель 1 % крахмала
+10 капель прокипяченной слюны
Пробирка +оставляют на 10 минут при
№3
комнатной температуре
+по истечении времени содержимое делят пополам
+10 капель 1 % крахмала
+10 капель дистиллированной
Пробирка воды
№4
+оставляют на 10 минут при
(контроль) комнатной температуре
+по истечении времени содержимое делят пополам
2.1
+2 капли раствора
Люголя
+5 капель 10 % NaOH
2.2 +5 капель 5 % CuSO4,
+нагревают
3.1
+2 капли раствора
Люголя
+5 капель 10 % NaOH
3.2 +5 капель 5 % CuSO4,
+нагревают
+2 капли раствора
4.1 Люголя
+5 капель 10 % NaOH
4.2 +5 капель 5 % CuSO4,
+нагревают
Задание: проведите реакции (реакцию с йодом и реакцию Троммера),
запишите в таблицу результат (окраску растворов) и вывод об активности
амилазы при разных температурных условиях, действовавших на нее.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Как можно оценить активность амилазы?
2. Какая температура является оптимальной для ферментов?
3. Как повлияет снижение температуры ниже 0 градусов на активность фермента?
4. Как повлияет нагревание на активность фермента? Объясните, чем
будет обусловлен такой эффект.
Лабораторная работа № 16.
Влияние рН на активность ферментов
Принцип: каждый фермент наиболее активен в пределах довольно
узкой зоны рН (оптимум рН). Влияние рН среды на активность ферментов объясняется тем, что белковая молекула фермента является амфотерным полиэлектролитом и его каталитическая активность зависит от степени ионизации функциональных групп, входящих в активный центр.
Изменение рН нарушает связь между белковой частью ферментов и их
простетическими группами и соответственно связь субстрата с ферментом. При изменении рН в любую сторону от оптимального значения активность фермента уменьшается. Работа заключается в исследовании активности амилазы слюны при различных значениях рН. Оптимальной для
действия этого фермента является рН 6,8–6,9.
118
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Реактивы и оборудование:
1) слюна в разведении 1 : 50; 2) крахмал, 0,5%-ный раствор; 3) фосфатный буфер с рН 5,6; 6,8; 8,1; 4) раствор 0,1%-ного йода в 0,2%-ном
йодистом калии (раствор Люголя); 5) градуированные пипетки на 1 и 5 мл;
6) пипетки капельные; 7) водяная баня или термостат (температура 38 оС).
Ход работы:
Готовят разведение слюны 1 : 50.
№
пробирок
Добавленные реагенты
Условия
+5 мл 0,5 % крахмала
в термостат при темпе+1 мл фосфатного буфера ратуре 38 ºС;
Пробирка с рН 5,6
№1
+по 1 мл слюны, разведенной 1 : 50
+перемешать
через 15 мин
пробирки вынимают из
+5 мл 0,5 % крахмала
+1 мл фосфатного буфера термостата и в каждую
прибавляют по 3 капли
Пробирка с рН 6,8
раствора Люголя
№2
+по 1 мл слюны, разведенной 1 : 50
+перемешать
+5 мл 0,5 % крахмала
+1 мл фосфатного буфера
Пробирка с рН 8,1
№3
+по 1 мл слюны, разведенной 1 : 50
+перемешать
рН
Окраска с йодом,
вывод
5,6
6,8
8,1
Задание: проведите реакции, заполните таблицу, сделайте выводы о
влиянии рН на активность амилазы.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Объясните результаты опыта.
2. Почему сдвиг рН в любую сторону от оптимума снижает активность фермента?
3. Почему ацидоз и алкалоз опасен для жизни?
Лабораторная работа № 17.
Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов
Принцип: вещества, усиливающие действие ферментов, называются
активаторами. Активаторы стимулируют действие ферментов, но в отличие от коферментов не принимают участия в реакции.
Ингибиторами (парализаторами) называются вещества, снижающие
скорость ферментативных реакций. Ингибирование действия ферментов
может происходить в том случае, если с активным центром фермента вместо
119
ТЕМА 5.
специфического субстрата соединяется близкий структурный аналог субстрата, т. е. вещество, близкое по строению к субстрату (конкурентное
торможение). Ингибиторами нередко являются продукты промежуточных или конечных реакций какого-либо биохимического процесса.
Активность амилазы слюны усиливается в присутствии хлористого
натрия – специфического активатора амилазы. Сернокислая медь оказывается тормозящее действие на активность амилазы. Крахмал и декстрины открывают реакцией с раствором йода.
Реактивы и оборудование:
1) слюна в разведении 1 : 5; 2) крахмал, 1%-ный раствор; 3) NaCl, 1%ный раствор; 4) CuSO4, 1%-ный раствор; 5) 0,1%-ного раствора йода в 0,2%ном йодистом калии (раствор Люголя); 6) пробирки; 7) градуированные
пипетки на 1 и 2 мл; 8) пипетки капельные.
Ход работы:
Готовят разведение слюны 1 : 5.
№
пробирок
Добавленные реагенты
+3 мл слюны,
Пробирка разведенной 1 : 5
№1
+4 капли 1 % NaCl
+5 капель 1 % крахмала
+3 мл слюны,
Пробирка разведенной 1 : 5
№2
+4 капли 1 % CuSO4
+5 капель 1 % крахмала
+3 мл слюны, разведенПробирка ной 1 : 5
№3
+4 капли дистиллиро(контроль) ванной воды
+5 капель 1 % крахмала
Условия
Окраска с йодом,
вывод
оставляют на 2 минуты
при комнатной
температуре;
после чего проделывают
реакцию на крахмал,
приливая по 1 капле
раствора Люголя
Задание: проведите реакции, заполните таблицу, сделайте выводы о
влиянии исследуемых веществ на активность амилазы (что из них активатор, а что – ингибитор?)
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Объясните результаты опыта.
2. К каким регуляторам (обратимым или необратимым) относятся
ацетат свинца и сульфат меди? Почему?
3. Предложите механизм действия ионов хлора на активность амилазы.
4. Почему отравления солями тяжелых металлов лечат введением в
пищеварительный тракт сырых яиц или молока?
120
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Тест для самоконтроля:
1. Ферменты – это:
а) катализаторы углеводной природы;
б) катализаторы белковой природы;
в) катализаторы неорганической природы;
г) катализаторы липидной природы.
2. Центр фермента, в котором происходит присоединение субстрата, называется:
а) каталитический;
б) аллостерический;
в) субстратный;
г) активный.
3. Апоферментом называют:
а) небелковую часть сложного фермента;
б) белковую часть сложного фермента;
в) сложный фермент.
г) вещество, подвергающееся ферментативному воздействию
4. Центр фермента, при присоединении к которому какого-либо низкомолекулярного вещества изменяется активность фермента, называется:
а) каталитический;
б) аллостерический;
в) субстратный;
г) активный.
5. Клеточные ферменты, локализованные в цитоплазме, проявляют
максимальную активность при рН, близком:
а) 7;
б) 2–3;
в) 4–5;
г) 9–10.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Понятие о ферментах, их значение в процессах жизнедеятельности, история ферментологии.
2. Химическая природа и структура ферментов. Чем сложные ферменты отличаются от простых ферментов?
3. Что такое кофактор фермента? Химическое строение кофактора.
4. Чем коферменты отличаются от простетических групп? Приведите примеры.
5. Дайте понятие об активном центре ферментов. Строение активного центра простых и сложных ферментов.
6. Понятие об аллостерическом центрах ферментов. Аллостерические ферменты.
121
ТЕМА 5.
7. Стадии ферментативной реакции. Понятие об энергии активации.
8. Свойства ферментов как биокатализаторов: специфичность действия, термолабильность, зависимость ферментативной активности от рН
среды, регуляция эффекторами.
9. Может ли продукт реакции регулировать активность фермента?
Какое это может иметь биологическое значение?
10. В ряде случаев субстрат способен активировать фермент. В чем
биологический смысл этого явления? Может ли субстрат усилить синтез
фермента?
11. Активаторы и ингибиторы ферментов. Типы ингибирования ферментативных реакций. Применение ингибиторов ферментов как лекарственных препаратов в медицинской практике.
12. Конкурентные и неконкурентные ингибиторы. Механизм их действия. Что такое конкурентное ингибирование? Как в медицине используются конкурентные ингибиторы? Изменение кинетических параметров
ферментативной реакции под влиянием ингибиторов разного действия.
13. Ингибиторы необратимого действия. Примеры.
14. В чем сходство и различие аллостерического регулирования и химической модификации?
15. В чем сходство и различие между химической модификацией и
ограниченным протеолизом?
16. Имеет ли физиологическое значение необратимое ингибирование активности ферментов? Поясните.
17. Напишите уравнение реакции гидролиза крахмала до глюкозы
под влиянием ферментов слюны. Напишите уравнение реакции
Троммера с глюкозой.
18. Принципы определения и единицы ферментативной активности.
Удельная активность фермента.
19. Классификация ферментов. Дайте характеристику каждого класса.
20. Задание: заполнить таблицу.
Шифр
Класс
Реакции, катализируемые ферментом
Важнейшие
подклассы
Примеры
КФ 1.
КФ 2.
КФ 3.
КФ 4.
КФ 5.
КФ 6.
КФ 7.
Приведите уравнения реакций (не менее 3) и схему метаболических
путей с участием фермента (ферментов) какого-либо класса.
122
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Лабораторно-практическое занятие
ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ РАЗНЫХ КЛАССОВ.
ЭНЗИМОПАТИИ. ЭНЗИМОДИАГНОСТИКА.
ИЗОФЕРМЕНТЫ
ТЕОРИЯ
Использование ферментов в медицине идет по трем основным
направлениям:
Энзимопатология – изучает значение нарушений активности ферментов в развитии заболеваний.
Энзимодиагностика:
а) применение ферментов для определения различных веществ в биологических жидкостях;
б) измерение активности ферментов или изоферментов в крови и моче
для диагностики болезней, сопровождающихся разрушением клеток.
Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лекарств.
а) при нарушении пищеварения;
б) для очистки гнойных ран;
в) для лечения вирусных заболеваний (ДНК-аза, РНК-аза).
Энзимопатии
В основе многих заболеваний лежат нарушения работы ферментов в
клетке – энзимопатии. Различают первичные (наследственные) и вторичные (приобретенные) энзимопатии.
Первичные энзимопатии
Первичные энзимопатии связаны с нарушениями в структуре гена
фермента. Дефектные ферменты наследуются в основном по аутосомнорецессивному типу. При этом активность фермента может частично или
полностью отсутствовать. В результате этого наблюдается нарушение
определенных метаболических путей, следовательно, первичные энзимопатии можно отнести к метаболическим болезням. При этом возможно
несколько вариантов развития событий. Рассмотрим схему метаболического пути (рис. 53, п.1).
Субстрат метаболического пути – вещество А в результате нескольких последовательных ферментативных реакций должно превратиться в
продукт Р. Но при генетическом дефекте одного из ферментов этого пути
последовательность превращений нарушается. Например, присутствует
дефект гена фермента Е3. При этом возможны следующие нарушения в
метаболическом пути:
123
ТЕМА 5.
Рис. 53. Схемы нарушения метаболических путей при первичных энзимопатиях
1. Нарушение образования конечных продуктов: при этом недостаток конечного продукта Р быстро приведет к появлению характерных
клинических симптомов заболевания (рис. 53, п. 2). Примером такой энзимопатии является альбинизм. При данном заболевании вследствие дефекта (или полного отсутствия) фермента тирозиназы в меланоцитах
нарушен синтез пигментов меланинов из аминокислоты тирозин. Наблюдается слабая пигментация кожи, светлые волосы, красная радужка глаз
из-за просвечивающих капилляров.
2. Накопление субстратов предшественников: в данном случае речь
идет о накоплении субстрата реакции, катализируемой дефектным (или
полностью отсутствующим) ферментом, а также его предшественников
ввиду невозможности нормально превращаться до конечных продуктов (Р)
(рис. 53, п. 3). Накопление этих веществ также может приводить к появлению клинических проявлений заболевания. Примером такого заболевания
является алкаптонурия. При данной энзимопатии дефектным является
фермент оксидаза гомогентизиновой кислоты, что приводит к накоплению в организме ее субстрата – гомогентизиновой кислоты (промежуточный продукт катаболизма тирозина). Гомогентизиновая кислота при этом
содержится в высоких концентрациях в крови и в моче, при контакте с
кислородом воздуха она превращается в алкаптоны – соединения черного
цвета. Моча таких больных при контакте с воздухом в считаные минуты
теменеет, в связи с чем патология получила еще название «черная моча».
С возрастом алкаптоны могут откладываться и в тканях организма, например в коже, сухожилиях, суставах, влияя на их функцию.
124
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
3. Нарушение образования конечных продуктов и накопление субстратов предшественников: при этом и накопление субстрата, и недостаток или же полное отсутствие конечного продукта (Р) пути приводит
к клиническим проявлениям заболевания (рис. 53, п. 4). В качестве примера в этом случае подходит гликогеноз I типа (или болезнь Гирке), при
котором дефектным является фермент глюкозо-6-фосфат-фосфатаза. Это
приводит к нарушениям распада гликогена печени и освобождения глюкозы от фосфатного остатка, а соответственно, становится невозможным
выход глюкозы в кровь из гепатоцита. У таких больных наблюдается гипогликемия, а также гепатомегалия (увеличенная в размерах печень) изза чрезмерного накопления в ней гликогена.
Вторичные энзимопатии
Вторичные (приобретенные) энзимопатии являются следствием
других заболеваний (заболеваний внутренних органов, перенесенных вирусных и бактериальных инфекций и т. д.), а также длительного недостатка
витаминов (их коферментных форм) и других кофакторов ферментов. Примером этого является недостаточность лактазы и других кишечных
ферментов вследствие воспалительного процесса в кишечнике; или нарушение работы аминотрансфераз и декарбоксилаз аминокислот из-за глубокого гиповитаминоза витамина В6; нарушение работы пируватдегидрогеназного комплекса при дефиците витаминов В1, В2, В3, В5 (особенно В1).
Энзимодиагностика
Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания
(или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека.
Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:
– при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается активность внутриклеточных
ферментов поврежденных клеток;
– количество высвобождаемого фермента должно быть достаточно
для его обнаружения;
– активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, должна быть стабильна в течение достаточно длительного времени и должна отличаться от нормальных величин;
– ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определенных органах (органоспецифичность и тканеспецифичность);
– существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов (например, какие-то ферменты локализованы только в цитозоли, какието – только в митохондриях, а какие-то – и в цитозоли, и в митохондриях).
125
ТЕМА 5.
При многих заболеваниях происходит повреждение клеток, и их содержимое, в том числе и ферменты, высвобождаются в кровь. Это может
происходить вследствие нарушения проницаемости мембраны клеток
(при воспалительных процессах) или нарушения целостности клеток
(при некрозе).
Определение в крови активности ряда ферментов используется для
диагностики заболеваний сердца, печени, скелетной мускулатуры и других органов и тканей. Уровень активности ферментов в плазме крови при
этом хорошо коррелирует со степенью повреждения клеток.
Для энзимодиагностики также имеет большое значение знание о субклеточной локализации ферментов. Например, появление в плазме крови
ферментов, имеющих только цитозольную локализацию, будет свидетельствовать о воспалительном процессе; а при обнаружении митохондриальных или ядерных ферментов можно делать заключение о более
глубоких повреждениях клетки, например о некрозе.
Однако повышение концентрации ферментов не всегда связано с повреждением тканей. При избыточной клеточной пролиферации, например, при онкопролиферативных процессах, при повышенной скорости
синтеза некоторых ферментов в клетках или при нарушенном клиренсе
(способности выводиться почками) наблюдают повышение концентрации
в крови определенных ферментов. Также следует учитывать, что нормальные значения активности ферментов в крови детей и беременных женщин
отличаются от показателей, характерных для взрослых здоровых людей.
Изоферменты
Изоферменты – это множественные формы фермента, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся по первичной
структуре белка. Чаще всего это обусловлено различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты. Различия в первичной структуре ведут
к различиям в физико-химических свойствах белков-ферментов. Это позволяет им катализировать одну и ту же реакцию, но при этом они отличаются друг от друга кинетическими параметрами (Vмакс и Км), условиями активации, особенностями взаимодействия апофермента и кофермента, чувствительностью к регуляторам, тканевой локализацией, зарядом, а значит, и электрофоретической подвижностью и т. д. На различиях в физикохимических свойствах основаны и методы определения изоферментов.
По своей структуре изоферменты в основном являются олигомерными
белками (белками с четвертичной структурой). Та или иная ткань преимущественно синтезирует определенные виды протомеров. В результате определенной их комбинации формируются ферменты с различной структурой –
изомерные формы, например лактатдегидрогеназа (изоформы: ЛДГ1 –
НННН, ЛДГ2 – НННМ, ЛДГ3 – ННММ, ЛДГ4 – НМММ, ЛДГ5 – ММММ)
126
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
и креатинкиназа (изоформы: КК-ММ, КК-МВ, КК-ВВ). Также обнаружены изоформы ферментов – белков с третичной структурой, что
обусловлено наличием в геноме разных генов, кодирующих их первичную структуру, например альфа-амилаза (изоформы: S – саливарная и
Р – панкреатическая).
Обнаружение определенных изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.
Изоформы лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и ее использование в диагностике
ЛДГ катализирует обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную.
Рис. 54. Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой
Активной формой лактатдегидрогеназы является тетрамер, состоящий из четырех субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов. В тетрамере субъединицы занимают эквивалентные положения; каждый мономер содержит активный центр.
В организме млекопитающих имеются два различных типа субъединиц ЛДГ (Н и М), незначительно различающихся по первичной структуре
(от англ. «Heart» – сердце, «Muscle» – мышца). Они могут случайным образом участвовать в образовании тетрамера. В связи с этим известно 5
различных изоферментов ЛДГ, а именно НННН, МННН, ММНН, МММН
и ММММ, или Н4, Н3М, Н2М2, НМ3, М4, соответствующую изоферментам ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5.
Изоферменты ЛДГ (рис. 55), обладая почти одинаковой ферментативной активностью, различаются некоторыми физико-химическими
свойствами: молекулярной массой, электрофоретической подвижностью,
отношением к активаторам и ингибиторам и др. Для каждой ткани в
норме характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр)
ЛДГ. Это связано с тем, что синтез Н- и М-типов субъединиц осуществляется различными генами, в разных органах они экспрессируются поразному. Например, в сердечной мышце преобладает Н4, т. е. ЛДГ1, а в
скелетных мышцах и печени – М4 (ЛДГ5). В эволюционном плане возникновение разных изоформ ЛДГ было обусловлено особенностями
окислительного метаболизма тканей. Так, изоферменты ЛДГ4 и ЛДГ5 (М-
127
ТЕМА 5.
типы ЛДГ) работают эффективно в анаэробных условиях, а ЛДГ1 и ЛДГ2
(Н-типы ЛДГ) – в аэробных, когда пируват быстро окисляется до СО 2 и
Н2О, а не восстанавливается до молочной кислоты.
В клинической практике изучение появления изоферментов ЛДГ (и
ряда других ферментов) в сыворотке крови представляет интерес для
дифференциальной диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей. По изменению содержания изоферментов в сыворотке крови можно судить о топографии патологического процесса и о
степени поражения органа или ткани.
Рис. 55. Изоформы лактатдегидрогеназы: А – строение различных изоформ ЛДГ;
Б – распределение на электрофореграмме и относительные количества изоформ ЛДГ
в различных органах; В – содержание изоформ ЛДГ в плазме крови в норме
и при патологии (электрофореграммы – слева и фотометрическое сканирование – справа)
При ряде заболеваний исследуют активность ЛДГ в плазме крови.
В норме активность ЛДГ составляет 170–520 Ед/л. Повышение активности наблюдатся при острых поражениях сердца, печени, почек, а также
при мегалобластных и гемолитических анемиях. Однако это указывает на
повреждение лишь одной из перечисленных тканей.
128
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Для постановки диагноза необходимо исследование изоформ ЛДГ в
плазме крови методом электрофореза. Выявление в плазме крови тканеспецифических изоформ ЛДГ используют как маркер повреждения
данной ткани.
Энзимодиагностика при инфаркте миокарда
Примерно 30 % больных инфарктом миокарда имеют атипичную
клиническую картину этого заболевания. Поэтому необходимо проводить дополнительные исследования для подтверждения повреждения
сердечной мышцы.
При инфаркте миокарда наблюдают достоверные изменения в крови
активности ферментов КК, ЛДГ и аспартатаминотрансферазы (ACT), которые зависят от времени, прошедшего от начала развития инфаркта и от
зоны повреждения. Типичные кривые изменения активности этих ферментов представлены на рисунке 56.
Рис. 56. Изменение активности ферментов в плазме крови при инфаркте миокарда
После закупорки (окклюзии) коронарного сосуда в крови вначале отмечают повышение активности КК изоформы MB, но данный фермент
быстро удаляется из кровотока. Обнаружение повышенной активности
КК в плазме крови – основной энзимодиагностический критерий инфаркта миокарда. Если у пациента с загрудинными болями не обнаружено изменения в активности КК, диагноз инфаркта миокарда маловероятен.
129
ТЕМА 5.
Дополнительным подтверждением диагноза инфаркта миокарда служит
обнаружение повышенных активностей ферментов ACT и ЛДГ в крови
больных в характерной динамике (рис. 56). Активность ACT в норме составляет 5–40 МЕ/л. При инфаркте миокарда активность ACT повышается через
4–6 ч; максимум активности наблюдают в течение 2–3 дней. Уровень ЛДГ
также увеличивается в плазме крови через несколько часов после закупорки
кровеносного сосуда; максимум активности приходится на 3–4-й день, затем
наступает постепенная нормализация активности. Уровень повышения активности ЛДГ коррелирует с размерами повреждения сердечной мышцы.
Энзимотерапия. Применение ферментов в качестве лекарственных средств
Использование ферментов в качестве лекарственных средств имеет
много ограничений вследствие их высокой иммуногенности. Тем не менее энзимотерапия активно развивается в следующих направлениях:
– заместительная терапия – использование ферментов в случае их недостаточности. Например, использование ферментов эффективно при различных желудочно-кишечных заболеваниях, когда нарушена выработка или
отделение пищеварительных секретов. Так, показано использование препаратов пепсина при гипоацидном гастрите, анацидном гастрите и ахилии.
Прием таких препаратов как креон, фестал, мезим-форте и др.) может помочь скомпенсировать недостаточность ферментов поджелудочной железы.
– элементы комплексной терапии – применение ферментов в качестве
дополнительных терапевтических средств в сочетании с другим лечением.
Например, протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют местно для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей, а препараты, содержащие
рибонуклеазу и дезоксирибонуклеазу используют в качестве противовирусных препаратов при лечении аденовирусных конъюнктивитов и др.
Препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы применяют при тромбозах и тромбоэмболиях. Препараты с гиалуронидазой
(катализирует расщепление гиалуроновой кислоты) применяют внутримышечно и подкожно для размягчения рубцов, спаек. Также ферментные препараты использоются в лечении онкологических больных. Например, аспарагиназа применяется для лечения лейкозов. Связано это с тем, что в
лейкозных клетках дефектен фермент аспарагинсинтетаза, т. е. такие
клетки сами не могут синтезировать аминокислоту аспарагин, они могут
получать ее только из крови. Поэтому если начать вводит такому больному
препарат с аспарагиназой (расщепляет аспарагин), то в лейкозных клетках
наступит дефицит аспарагина, что в конечном счете приведет к гибели этих
клеток.
130
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 18.
Обнаружение активности липазы
О ферменте: липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира (триацилглицеридов) до свободных жирных кислот и моноацилглицеридов
(или свободного глицерина). Липаза синтезируется многими органами и
тканями. Но собое значение в диагностике имеет липаза, вырабатываемая
поджелудочной железой – панкреатическая липаза. Фермент выделяется
с соком поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку и тонкий
кишечник в неактивной форме (пролипаза) и активируется путем присоединения пептида (колипазы). Особую роль в активации панкреатической липазы также играет желчь. В кишечнике желчные кислоты и белки
способствуют эмульгированию жиров и тем самым активируют действие
липазы поджелудочной железы.
У грудных детей большое значение имеет активность лингвальной
липазы (вырабатывается в ротовой полости железами у корня языка,
работает в желудке, расщепляет жиры молока) и желудочной липазы
(работает в желудке), активность которых у взрослых не выражена. Желудочная липаза может действовать только на предварительно эмульгированные жиры, например на жир молока.
Принцип: липазу обнаруживают, добавив ее раствор к молоку, подщелоченному раствором карбоната натрия до бледно-розовой окраски на
фенолфталеин. В присутствии липазы происходит гидролитическое расщепление жира молока на глицерин и жирные кислоты, реакция среды
сдвигается в кислую сторону, розовая окраска исчезает.
Реактивы и оборудование:
1) вытяжка из препарата поджелудочной железы или 5%-ный раствор
панкреатина, содержащего липазу; 2) 5%-ный раствор сухих сливок, свежеприготовленный; 3) 1%-ный спиртовой раствор фенолфталеина; 4) 1%-ный
раствор Na2CO3; 5) пробирки; 6) пипетки капельные; 8) термостат на 38 оС.
Ход работы:
№
Добавленные реактивы и условия Фермент Субстрат
пробирки
10 капель 5 % р-ра сухих сливок;
+5 капель р-ра панкреатина;
+1 капля 1% р-ра фенолфталеина;
1
+по каплям 1 % раствор Na2CO3 до
(опыт)
появления бледно-розовой окраски
(нельзя добавлять избыток).
В термостат на 30 мин при 38 ºС.
131
Окраска на
фенолфталеин
исходная конечная
ТЕМА 5.
10 капель 5% р-ра сухих сливок;
+5 капель дист. воды;
+1 капля 1 % р-ра фенолфталеина;
2
+по каплям 1 % раствор Na2CO3 до
(контр.)
появления бледно-розовой окраски
(нельзя добавлять избыток).
В термостат на 30 мин при 38 ºС.
Задание: выполните лабораторную работу, заполните остальные
ячейки таблицы. Сделайте вывод об активности липазы.
Клинико-диагностическое значение:
При заболеваниях поджелудочной железы активность липазы значительно повышается. При этом она начинает массово выделяться в кровь.
Норма липазы для взрослых в крови составляет 20–160 Ед/л. При остром
панкреатите активность липазы в крови может увеличиваться более чем
в 150 раз через несколько часов после острого приступа. Основу диагностики острого панкреатита составляет одновременное определение активности липазы и альфа-амилазы в крови. Помимо общей липазы в
крови находятся липазы из различных органов. Суммарно они составляют липолитический индекс крови.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Какую реакцию катализирует липаза? Напишите уравнение реакции.
2. К какому классу ферментов относится липаза?
3. Где в организме синтезируется данный фермент? Где он осуществляет свои каталитические свойства?
4. Как можно открыть действие липазы?
5. Как происходит активация липазы в кишечнике?
6. Диагностическое значение определения активности липазы.
7. Что такое липолитический индекс крови?
Лабораторная работа № 19.
Обнаружение активности каталазы и пероксидазы
19.1. Обнаружение каталазы в крови
О ферменте: по химической природе каталаза является геминферментом. Каталаза ускоряет разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду: 2Н2О2 → О2↑ + 2Н2О
Таким образом, биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании перекиси водорода, образующейся в организме во время окислительно-восстановительных процессов.
Принцип: об активности каталазы крови судят по бурному выделению
пузырьков кислорода при добавлении перекиси водорода к капле крови.
132
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Реактивы и оборудование:
1) кровь; 2) 3%-ный раствор Н2О2; 3) пробирка; 4) пипетки капельная.
Ход работы:
Добавленные реактивы
и условия
Фермент
Субстрат
Реакция,
катализируемая
ферментом
Выявление
действия
фермента
10–15 капель 3 % р-ра Н2О2;
+ 1 капля крови
Задание: проведите реакцию; заполните все ячейки таблицы; сделайте вывод об активности каталазы.
19.2. Обнаружение пероксидазы в крови
О ферменте: к пероксидазам относятся ферменты, катализирующие
окисление субстрата с помощью перекиси водорода. От субстратов под
действием пероксидазы переносятся электроны на перекись водорода.
Образуется окисленный субстрат и вода. Пероксидазы относятся к геминовым ферментам; с состав их простетической группы входит гем. Пероксидаза в отличие от каталазы содержит одну гемовую группу на одну
молекулу фермента.
Принцип: об активности пероксидазы судят по изменению окраски
бензидина. Окисленный бензидин приобретает зеленую, синюю, постепенно переходящую в бурую окраску.
Реактивы и оборудование:
1) кровь, разбавленная водой в 2–3 раза; 2) 3%-ный раствор Н2О2;
3) 1%-ный раствор бензидина в ледяной уксусной кислоте; 4) пробирки;
5) пипетки капельные.
Ход работы:
№
пробирки
Добавленные реактивы
и условия
Реакция,
Фермент Субстрат катализируемая
ферментом
Выявление
действия
фермента
5 капель 1 % р-ра бензидина;
1
+ 5 капель 3 % р-ра Н2О2;
(опыт) + 5 капель разбавленной
крови
5 капель 1 % р-ра бензидина;
2
+ 5 капель 3 % р-ра Н2О2;
(контр.)
+ 5 капель дист. воды
Задание: проведите реакции; наблюдайте за изменением окраски; заполните все ячейки таблицы; сделайте вывод об активности пероксидазы.
133
ТЕМА 5.
Клинико-диагностическое значение:
Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и
макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при
раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.
Пероксидаза менее широко распространена. В организме животных
и человека пероксидаза содержится в слюне, соке поджелудочной железы, в тонком и толстом кишечнике, печени, почках, селезенке, легких,
лейкоцитах.
Как и каталаза, пероксидаза восстанавливает Н 2О2 до воды, используя в качестве доноров водорода фенолы, амины, органические кислоты.
Пероксидазная активность крови обусловлена в основном ее наличием в
гранулоцитах. Она адсорбируется на мембранах фагоцитированных бактерий, генерирует альдегиды, синглетный кислород, другие свободные
радикалы, которые повреждают клетки.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. К какому классу ферментов относятся каталаза и пероксидаза?
2. Какую реакцию катализирует каталаза? Напишите уравнение реакции.
3. При каких заболеваниях повышается активность каталазы? А при
каких понижается?
4. Охарактеризуйте механизм реакции, катализируемой пероксидазой. Как можно наблюдать действие пероксидазы?
5. Что такое геминовые ферменты? Охарактеризуйте их структуру.
6. Где в организме содержится пероксидаза?
Лабораторная работа № 20.
Энзимодиагностика острого панкреатита.
Количественное определение активности альфа-амилазы в моче
(по методу Вельгемута)
Принцип: метод количественного определения активности амилазы
мочи по методу Вольгемута состоит в том, что находят наименьшее содержание фермента, который полностью расщепляет все количество прибавленного крахмала, затем делают перерасчет на 1 мл мочи.
Реактивы и оборудование:
1) моча; 2) физиологический раствор, 0,9%-ный раствор NaCl;
3) 0,1%-ный раствор крахмала; 4) раствор Люголя; 5) пробирки; 6) градуированные пипетки на 1–2 мл; 7) термостат на 38 °С; 8) пипетки капельные; 9) штатив с пробирками.
134
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Ход работы:
В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл 0,9%-ного раствора NaCl.
В первую пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи, перемешивают, 1 мл смеси переносят во 2 пробирку, из второй пробирки 1 мл смеси
переносят в 3-ю пробирку и т. д. Из десятой пробирки 1 мл смеси выливают.
В каждую пробирку наливают по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала,
перемешивают и ставят на 30 минут в термостат при температуре 38 °С,
после чего добавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора Люголя.
Тщательно перемешивают содержимое каждой пробирки с помощью
стеклянной палочки.
Отмечают в таблице окраску:
№
пробирки
1
2
3
4
5
6
Разведение 1 : 2 1 : 4 1 : 8 1 : 16 1 : 32
7
8
9
10
1 : 64 1 : 128 1 : 256 1 : 512 1 : 1024
Окраска с
раствором
Люголя
Учитывают разведение мочи в последней пробирке с желтой окраской (или бесцветной).
Пример расчета: если последняя пробирка (в которой появилась
желтая окраска) – третья, то разведение мочи в ней равняется 1 : 8. Таким
образом, 1 мл неразведенной мочи может расщепить в 8 раз большее количество крахмала, а именно: А = 2 ∙ 8 = 16,
2 – количество 0,1%-ного раствора крахмала в мл, которое используется в опыте;
8 – разведение мочи в последней пробирке, где крахмал был расщеплен полностью.
Амилазная активность мочи (определенная по методу Вельгемута) в
норме колеблется от 16 до 64 единиц.
Задание: выполните лабораторную работу, сделайте расчет; результат запишите в протокол лабораторной работы; сравните с нормой; сделайте вывод об активности фермента в исследуемой моче.
Клинико-диагностическое значение:
Амилаза (КФ 3.2.1.1.) гидролизует крахмал и декстрины. В организме она преимущественно синтезируется в слюнных и поджелудочной
железах, хотя ее активность определяется и в печени, почках, кишечнике,
легких.
135
ТЕМА 5.
Повышение активности амилазы (гиперамилаземия) наблюдается
при панкреатите, перитоните, тромбозе сосудов, разрыве маточной
трубы при внематочной беременности, сокращении сфинктера Одди,
вследствие введения в организм АКТГ и кортизола. Также повышение
активности амилазы слюнных желез наблюдают при почечной недостаточности, стоматите, невралгии лицевого нерва, паркинсонизме. Следует
отметить, что при остром панкреатите активность амилазы возрастает
в первые 12–24 часа в крови в 10–40 раз, затем быстро снижается и приходит к норме на 2–6 сутки. При остром аппендиците, перитоните, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки активность амилазы повышается в 3–5 раз. Гиперамилаземию также вызывают: адреналин, гистамин, секретин, фуросемид, салицилаты, антикоагулянты, морфин, пантопон, опий, кодеин, тетрациклин, алкоголь.
Снижение активности амилазы (гипоамилаземия) чаще всего наблюдается при недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы, а также встречается у больных гепатитами, циррозами, злокачественными опухолями с метастазами в печень, обширными ожогами кожи, сахарным диабетом, гипотиреозом, при интоксикациях, при психических заболеваниях, которые сопровождаются возбуждением или депрессией.
Гиперамилазурия. При остром панкреатите в суточной моче активность амилазы возрастает в 10–40 раз. При этом активность амилазы
остается высокой до 7 суток. Отношение активности амилазы в крови к
активности амилазы в моче служит показателем функциональной полноценности почечного фильтра.
Гипоамилазурия диагностического значения не имеет.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. К какому классу ферментов относится амилаза?
2. Назовите субстраты для амилазы.
3. Где образуется амилаза и где действует?
4. Назовите продукты амилазной реакции.
5. Какой принцип лежит в основе метода определения активности
амилазы по Вельгемуту? Каковы значения нормы?
6. Для диагностики каких заболеваний используется определение активности амилазы в крови? В моче?
7. Каковы причины снижения активности амилазы крови?
Тест для самоконтроля:
1. Для фермента, катализирующего расщепление одних и тех же
связей в различных молекулах, характерна следующая специфичность:
а) абсолютная;
б) относительная;
136
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
в) стереоспецифичность;
г) аллостерическая;
д) специфичность пути превращения.
2. Класс фермента указывает на:
а) конформацию фермента;
б) тип кофермента;
в) тип химической реакции, катализируемой данным ферментом;
г) строение активного центра фермента.
3. При инфаркте миокарда диагностическое значение имеет определение в крови активности фермента:
а) альдолазы;
б) лактатдегидрогеназы;
в) каталазы;
г) альфа-амилазы.
4. При остром панкреатите диагностическое значение имеет определение в крови и моче активности фермента:
а) креатинфосфокиназы;
б) лактатдегидрогеназы;
в) альфа-амилазы;
г) пероксидазы.
5. Липаза, альфа-амилаза и трипсин относятся к классу:
а) оксидоредуктаз;
б) трансфераз;
в) лиаз;
г) гидролаз;
д) изомераз.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Классификация и номенклатура ферментов. Охарактеризуйте
свойства ферментов.
2. Какие ферменты и как действуют на пептидные связи? До каких
продуктов пепсин расщепляет белки?
3. Ферменты, действующие на сложноэфирные связи. Охарактеризуйте действие липаз.
4. Какие ферменты активируют окисление веществ путем дегидрирования?
5. Какие вещества входят в состав коферментов дегидрогеназ?
6. Приведите классификацию ферментов и дайте характеристику
каждому классу.
7. Что такое энзимопатии? Чем первичные энзимопатии отличаются от
вторичных энзимопатий? Примеры первичных и вторичных энзимопатий.
137
ТЕМА 5.
8. Энзимодиагностика: принципы энзимодиагностики, требования к
ферментам, которые могут быть использованы для диагностики заболеваний. Почему при ряде заболеваний изменяется активность ферментов
в крови? О чем говорит появление в крови ферментов с внутриклеточной
локализацией?
9. Изоферменты. Клиническое значение определения изоферментов.
Какие методы можно применить для выделения и изучения изоферментов.
10. Изоформы лактатдегидрогеназы и их использование в диагностике заболеваний.
11. Изоформы креатинкиназы и их использование в диагностике заболеваний.
12. Изоформы альфа-амилазы и их диагностическое значение.
13. Энзимодиагностика инфаркта миокарда. Степень изменения активности в крови ферментов – маркеров повреждения миокарда.
14. Энзимодиагностика острого панкреатита. Определение активности панкреатической липазы и панкреатической альфа-амилазы в крови.
15. Что такое энзимотерапия? Заместительная энзимотерапия. Примеры.
16. Приведите примеры использования ферментов в качестве дополнительных лекарственных препаратов при лечении патологий.
138
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Лабораторно-практическое занятие
СТРОЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ.
ВИТАМИНЫ КАК КОФЕРМЕНТЫ
Задание: используя учебную литературу, заполните таблицу. Охарактеризуйте свойства витаминов и оцените их коферментные функции:
Формула коферПризнаки
Название
БиологиСуточная
мента, в состав
Источники
витамина,
ческая гиповита- гипервита- потребность,
которого входит
витамина
формула
роль
мг
миноза
миноза
данный витамин
I. Жирорастворимые витамины
II. Водорастворимые витамины
ТЕОРИЯ
К витаминам относятся вещества различного химического строения.
Всех их объединяет то, что они необходимы для нормального течения
процессов обмена веществ и не синтезируются в организме человека (а
если некоторые из них и синтезируются, то в недостаточном количестве).
Поэтому они должны поступать с пищей. Уменьшение поступления витаминов вызывает болезни витаминной недостаточности – гиповитаминозы. Отсутствие витаминов в пище приводит к развитию авитаминозов.
Чаще встречаются гиповитаминозы – относительная недостаточность какого-либо витамина. Витаминная недостаточность может быть экзогенной и эндогенной, или вторичной. Основные причины гипо- и авитаминозов – экзогенные, эндогенные.
Крупные авитаминозы:
– рахит (D);
– цинга (С);
– пеллагра (РР);
– бери-бери (В1).
Избыточное накопление витаминов в организме называют гипервитаминозом.
Некоторые витамины входят в состав простетических групп ферментов, являются коферментами. Коферменты выполняют функцию переносчиков электронов, атомов или функциональных групп с одного субстрата на другой.
139
ТЕМА 5.
Соединения, которые не являются витаминами, но могут служить предшественниками их образования в организме, называются провитаминами.
Витамины делятся на растворимые в воде и растворимые в жирах.
Растворимость определяется особенностями структуры молекул витаминов (рис. 57, 58, 59, 60).
Рис. 57. Структура водорастворимых витаминов: В1, В2, В3, В5
Рис. 58. Структура водорастворимых витаминов: В6, В9, В12, Н, С
140
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Рис. 59. Структура жирорастворимых витаминов А и D
Рис. 60. Структура жирорастворимых витаминов Е и К
141
ТЕМА 5.
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 21.
Обнаружение некоторых жирорастворимых витаминов
Принцип:
Витамин А. Если рыбий жир содержит витамин А, то при добавлении серной кислоты, обладающей водоотнимающим свойством, возникает фиолетово-красное окрашивание, быстро переходящее в бурое.
Витамин К. Витамины этой группы обладают выраженным антигеморрагическим действием. Обнаруживают по цветной реакции с щелочным раствором цистеина.
Реактивы и оборудование:
1) раствор рыбьего жира в обезвоженном хлороформе; 2) 0,1%-ный
спиртовой раствор викасола; 3) H2SO4, конц.; 4) 0,025%-ный раствор цистеина; 5) 10 %-ный раствор NaOH; 6) часовое или предметное стекло;
7) пробирка; 8) пипетки капельные; 9) градуированные пипетки на 1 мл.
Ход работы:
Определяемый
витамин
Используемые реактивы
А
На сухое стекло наносят 5 капель р-ра
рыбьего жира в хлороформе;
+ 1 каплю концентрированной H2SO4.
Развивается окрашивание
К
В сухую пробирку наливают 1 мл 0,1 %
спиртового раствора викасола;
+ 2 капли 0,025 % р-ра цистеина;
+ 2 капли 10 % р-ра NaOH.
Развивается окрашивание
Наблюдаемое окрашивание
Задание: проведите реакции; результат запишите в таблицу; сделайте вывод об обнаружении витаминов.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Назовите биологические функции витамина А.
2. Назовите биологические функции витамина К.
3. Какой качественной реакцией можно обнаружить витамин А?
Какие условия и реактивы?
4. Какой качественной реакцией можно обнаружить витамин К?
Какие условия и реактивы?
5. Какие другие жирорастворимые витамины вы знаете? Охарактеризуйте их биологическую роль в организме человека.
142
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Лабораторная работа № 22.
Обнаружение витаминов группы В
Принцип:
Витамин В1. В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует
сложное комплексное соединение оранжевого цвета.
Витамин В2. Окисленная форма витамина В2 представляет собой
желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещество. Реакция
на витамин В2 основана на его способности легко восстанавливаться; при
этом раствор витамина В2, имеющий желтую окраску, приобретает сначала розовый цвет (за счет образования промежуточных соединений), а
затем обесцвечивается (восстановленная форма витамина В2 бесцветна).
Витамин РР. Витамин РР при нагревании с раствором ацетата меди
образует плохо растворимый синий осадок медной соли никотиновой
кислоты.
Витамин В6. Витамин В6 при взаимодействии с раствором хлорного железа образует комплексную соль типа фенолята железа красного
цвета.
Реактивы и оборудование:
1) 5%-ный раствор витамина В1; 2) 0,025%-ный раствор витамина В2
(перед определением раствор можно развести в 5 раз); 3) 3%-ный раствор
витамина РР в 10%-ном растворе уксусной кислоты; 4) 1%-ный раствор
витамина В6; 5) 1%-ный раствор сульфаниловой кислоты; 6) 5%-ный раствор NaNО2; 7) 10%-ный раствор Na2CO3; 8) HCl, конц.; 9) металлический
цинк; 10) 1%-ный раствор FeCl3; 11) 5%-ный раствор (CH3COO)2Cu;
12) сухие пробирки; 13) спиртовки, держатели; 14) пипетки капельные.
Ход работы:
Определяемый
витамин
В1
В2
Используемые реактивы
В пробирку вносят 5 капель 1 % р-ра
сульфаниловой кислоты;
+ 5 капель 5 % р-ра NaNО2;
+ 2 капли 5 % р-ра витамина В1;
+ 5 – 7 капель 10 % р-ра Na2СО3 (осторожно
по стенке пробирки!).
На границе двух жидкостей появляется кольцо
оранжевого цвета
В пробирку вносят 10 капель р-ра витамина В2;
+ 5 капель конц. HCl;
+ 1 горошинку металлического цинка. Начинается
выделение пузырьков водорода, жидкость постепенно розовеет, затем обесцвечивается
143
Наблюдаемое
окрашивание
ТЕМА 5.
РР
В6
Перед определением р-р витамина РР взбалтывают!
В пробирку вносят 20 капель р-ра
витамина РР. Нагревают до кипения.
Взбалтывают р-р ацетата меди (!) и прибавляют
20 капель его к нагретому раствору.
Содержимое пробирки доводят до кипения
и охлаждают под струей холодной воды.
Наблюдают выпадение осадка медной соли
никотиновой кислоты
В пробирку вносят 5 капель 1 % р-ра витамина В6;
+ 5 капель 1 % р-ра FeCl3.
Пробирки встряхивают.
Наблюдают развитие окрашивания
Задание: проведите реакции; результат запишите в таблицу; сделайте вывод об обнаружении витаминов.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Назовите биологические функции витамина В1.
2. Назовите биологические функции витамина В2.
3. Назовите биологические функции витамина РР.
4. Назовите биологические функции витамина В6.
5. Какой качественной реакцией можно обнаружить витамин В1?
Какие условия и реактивы?
6. Какой качественной реакцией можно обнаружить витамин В2?
Какие условия и реактивы?
7. Какой качественной реакцией можно обнаружить витамин РР?
Какие условия и реактивы?
8. Какой качественной реакцией можно обнаружить витамин В6?
Какие условия и реактивы?
Лабораторная работа № 23.
Обнаружение витамина С в растворе
Принцип: обнаружение аскорбиновой кислоты основано на ее способности вступать в окислительно-восстановительные реакции (рис. 61).
Окисляясь, аскорбиновая кислота восстанавливает такие вещества, как
железосинеродистый калий, метиленовый синий, молекулярный йод.
Рис. 61. Схема окислительно-восстановительных превращений аскорбиновой кислоты
144
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Реактивы и оборудование:
1) 1%-ный раствор аскорбиновой кислоты; 2) 10%-ный раствор NaOH;
3) 10%-ный раствор HCl; 4) 5%-ный раствор железосинеродистого калия;
5) 1%-ный раствор FeCl3; 6) 0,01%-ный раствор метиленового синего;
7) 10%-ный раствор Na2CO3; 8) раствор Люголя (0,1%-ный раствор йода
в растворе йодистого калия); 9) пробирки; 10) пипетки капельные;
11) спиртовки, держатели.
Ход работы:
Реакция
Проба
Используемые реактивы
1 капля 10 % р-ра NaOH;
+ 1 капля 5 % р-ра железосинеродистого
калия;
+ 5 капель р-ра аскорбиновой кислоты.
Опытная
Пробирку встряхивают и добавляют в нее
3 капли 10 % р-ра HCl и 1 каплю 1 %
р-ра FeCl3.
В пробирке образуется осадок берлинской
с железолазури
синеродистым
1 капля 10 % р-ра NaOH;
калием
+ 1 капля 5 % р-ра железосинеродистого
калия;
+ 5 капель дист. воды. Пробирку встряхиКонтрольная вают и добавляют в нее 3 капли 10 % р-ра
HCl и 1 каплю 1 % р-ра FeCl3.
Наблюдается бурое окрашивание, обусловленное образованием железосинеродистой
соли окиси железа
1 капля 0,01 % р-ра метиленового синего;
+ 1 капля 10 % р-ра Na2СО3;
Опытная
+ 5 капель р-ра аскорбиновой кислоты.
Нагревают на спиртовке. Происходит
обесцвечивание метиленового синего
с метиленовым
синим
1 капля 0,01 % р-ра метиленового синего;
+ 1 капля 10 % р-ра Na2СО3;
Контрольная + 5 капель дист. воды.
Нагревают на спиртовке. Раствор сохраняет
синюю окраску
10 капель дист. воды;
+ 2 капли р-ра Люголя;
+ 10 капель р-ра аскорбиновой кислоты.
Опытная
Раствор Люголя обесцвечивается в результате восстановления йода до йодистос раствором
водородной кислоты
Люголя
10 капель дист. воды;
+ 2 капли р-ра Люголя;
Контрольная
+ 10 капель дист. воды.
Раствор сохраняет желтую окраску
145
Наблюдаемое
окрашивание
ТЕМА 5.
Задание: проведите реакции; результат запишите в таблицу; сделайте вывод об обнаружении витамина С.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Охарактеризуйте структуру витамина С, его окислительно-восстановительные свойства.
2. Какова биологическая роль витамина С?
3. С помощью каких качественных реакций можно обнаружить витамин С в биологическом материале?
4. Какие патологии развиваются при недостаточности витамина С?
Тест для самоконтроля:
1. Химическое название пиридоксин имеет витамин:
а) В2;
б) Н;
в) В1;
г) К;
д) В6.
2. Болезнь цинга развивается при недостатке витамина:
а) С;
б) А;
в) В12;
г) D;
д) В5.
3. Одним из сильных природных антиоксидантов является витамин:
а) А;
б) В3;
в) D;
г) Е;
д) К.
4. Кишечными бактериями в организме синтезируется витамин:
а) А;
б) Н;
в) В12;
г) D;
д) С.
5. Витамин В12 содержит в своем составе катион:
а) калия;
б) кобальта;
в) натрия;
г) магния;
д) цинка.
146
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Что такое витамины? Витамины, их классификация. Чем отличаются водо- и жирорастворимые витамины?
2. Авитаминоз, гиповитаминоз, гипервитаминоз. Причины их возникновения. Возрастные особенности.
3. Антивитамины (сульфаниламидные препараты, дикумарол и др.),
их использование в медицине.
4. Провитамины (бета-каротин), синтетические витамины (викасол).
Витаминоподобные вещества.
5. Водорастворимые витамины, их участие в обмене веществ. Строение, биологическая роль и источники (В1, В2, В3, В5, В6, В9, В12, Н и С).
6. Жирорастворимые витамины, их участие в обмене веществ. Строение, биологическая роль и источники (А, D, E, K).
7. Какой витамин входит в структуру тиаминовых коферментов? Химическое строение и функции тиаминдифосфата (ТДФ).
8. Какой витамин входит в состав никотинамидных коферментов?
Химическое строение и роль НАД и НАДФ.
9. Какой витамин входит в состав флавиновых коферментов? Химическое строение ФМН и ФАД, их функции.
10. Какой витамин входит в состав пантотеновых коферментов? Из
каких компонентов состоит коэнзим А и какие функции он выполняет?
11. Какой витамин входит в состав пиридоксиновых коферментов?
Химическое строение фосфопиридоксаля и фосфопиридоксамина, каковы их функции?
12. Какой витамин входит в состав биотиновых коферментов? Химическое строение биотина и его роль.
13. Кобаламиновые и фолатные коферменты, их строение и функции.
14. Витамины как лекарственные препараты.
147
ТЕМА 5.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ К ИТОГОВОМУ ЗАНЯТИЮ
1. Характеристика ферментов. Сходство ферментов и неферментных
катализаторов. Отличия. Энергия активации ферментативной и неферментативной реакции. График, объяснение. Факторы, влияющие на снижение энергии активации ферментативной реакции.
2. Строение молекул простых и сложных ферментов. Апофермент
и кофактор. Химическая природа и строение кофактора, взаимодействие с апоферментом. Коферменты и простетические группы. Мультиферментные комплексы, взаимодействие ферментов и коферментов в
мультиферментном комплексе на примере пируватдегидрогеназного
комплекса.
3. Активный центр фермента. Строение активного центра простых и
сложных ферментов. Роль апофермента и кофактора в формировании активного центра.
4. Специфичность ферментов. Чем она определяется? Виды специфичности ферментов. Теории Фишера и Кошланда.
5. Влияние условий на активность ферментов (скорость ферментативной реакции). Влияние температуры и рН среды. Механизмы влияния
этих факторов на активность ферментов.
6. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации
фермента. Зависимость от концентрации субстрата. Уравнение Михаэлиса – Ментен. Кинетические параметры: Vmax и Km. Их характеристика. Значение определения.
7. Определение и оценка активности фермента. Единицы активности. Удельная активность ферментов.
8. Изоферменты. Примеры изоферментов. Отличия изоферментов
друг от друга. Значение изоферментов в медицине.
9. Влияние активаторов на скорость ферментативной реакции. Механизм действия активаторов.
10. Влияние ингибиторов на скорость ферментативной реакции.
Виды ингибиторов и типы ингибирования: обратимое и необратимое. Их
сравнительная характеристика. Значение.
11. Конкурентное ингибирование. Механизм действия конкурентных ингибиторов. Примеры конкурентных ингибиторов. Изменение кинетических параметров при конкурентном ингибировании. Использование конкурентных ингибиторов в медицине.
12. Неконкурентные ингибиторы и механизме их действия. Примеры
неконкурентных ингибиторов. Изменение кинетических параметров при
неконкурентном ингибировании. Значение неконкурентных ингибиторов.
13. Антиферметы. Примеры. Значение.
148
ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ. КОФЕРМЕНТНАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ
14. Бесконкурентное ингибирование. Примеры. Смешанное ингибирование. Изменение кинетических параметров при смешанном ингибировании.
15. Понятие о ключевых ферментах. Регуляция активности ключевых ферментов Ретроингибирование. Примеры.
16. Аллостерические ферменты. Организация аллостерического центра
ферментов. Механизм аллостерического изменения активности фермента.
Какие вещества могут выступать в роли аллостерических регуляторов?
17. Химическая модификация ферментов. Примеры. Ограниченный
протеолиз. Отличия от химической модификации. Значение для регуляции активности ферментов.
18. Классификация ферментов. Принципы, положенные в основу
международной классификации и номенклатуры ферментов. Международный код (шифр) ферментов.
19. Характеристика оксидоредуктаз. Механизм катализа реакций, основные группы оксидо-редуктаз. Примеры. Реакции дегидрирования –
значение в метаболизме.
20. Характеристика трансфераз. Механизм катализа реакций, основные группы трансфераз. Примеры. Значение в метаболизме.
21. Характеристика гидролаз. Механизм катализа реакций, группы
гидролаз. Примеры. Значение в метаболизме.
22. Характеристика лиаз, изомераз, лигаз, транслоказ. Механизмы
катализа реакций. Примеры. Значение в метаболизме.
23. Энзимопатии. Виды энзимопатий. Первичные и вторичные энзимопатии, их характеристика, примеры. Основные направления использования ферментов в медицине. Их характеристика. Ферменты в диагностике инфаркта миокарда и острого панкреатита.
24. Витамины, их классификация по структуре. Водо- и жирорастворимые витамины. Общие понятия витаминологии (витамины, антивитамины, провитамины, гипер-, гипо- и авитаминозы, витаминоподобные
вещества).
25. Водорастворимые витамины, их участие в обмене веществ. Строение, биологическая роль и источники (В1, В2, В3, В5, В6, В9, В12, Н и С).
26. Жирорастворимые витамины, их участие в обмене веществ.
Строение, биологическая роль и источники (А, D, E, K).
27. Коферментная функция витаминов. Коферменты – активные
формы витаминов. Их образование. Значение.
28. Болезни витаминной недостаточности. Общие признаки болезней витаминной недостаточности. Причины витаминной недостаточности. Патогенез крупных авитаминозов: рахит, цинга, пеллагра, бери-бери.
29. Витамины как лекарственные препараты, их клиническое применение.
149
ТЕМА 6.
Тема 6.
Гормоны. Передача сигнала
ТЕМА 6.
ГОРМОНЫ. ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА
Практическое занятие
ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА В КЛЕТКЕ. ГОРМОНЫ.
МЕХАНИЗМЫ ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ
Задание: изучите учебную литературу. В тетеради в виде конспекта
охарактеризуйте основные гормоны и механизмы гормональной регуляции по нижепредставленному плану. Выпишите основные эффекты на метаболизм.
План:
– название гормона, структура, химическая природа;
– железа, где этот гормон синтезируется;
– механизм действия гормона, посредник;
– регуляция выработки;
– ткани-мишени;
– метаболические эффекты (регуляторное воздействие на обмен белков, жиров и углеводов);
– физиологические эффекты и иные;
– нарушение функции:
– гиперпродукция гормона;
– гипопродукция гормона.
ТЕОРИЯ
Сообщение между клетками обеспечивают сигнальные молекулы
(межклеточные регуляторы). Они выделяются из одних клеток и переносятся к другим, доставляя сигналы к тем из них, которые снабжены рецепторами, способными воспринимать эти сигналы. Связывание сигнальной молекулы со своим рецептором приводит к биохимическому ответу клетки, а впоследствии – к ответу органа или ткани.
Биохимическая регуляция может быть срочной и долговременной.
Срочная регуляция связана с быстрой перестройкой обмена веществ. Эти
изменения в обмене веществ обусловлены включением срочных механизмов регуляции клеточного метаболизма, а именно действием регуляторов
на проницаемость клеточных мембран и активность ферментов. Долговременная регуляция выражается в стойкой перестройке обмена веществ,
развивающейся вследствие длительного действия межклеточных регуляторов. При этом включаются долговременные механизмы регуляции,
направленные на синтез ферментов и других функциональных белков.
Если по каким-то причинам не формируется требуемый биохимический
150
ГОРМОНЫ. ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА
ответ на действие межклеточных регуляторов, то ткани, да и организм в
целом, не могут приспособиться к сложившимся условиям среды, что
проявляется в виде болезней.
Таким образом, все процессы, идущие в организме, оказываются тесно
взаимосвязаны и подчинены главной задаче – поддержанию гомеостаза.
Гомеостаз – это сохранение постоянства внутренней среды. Оно достигается за счет регуляции, включающей процессы интеграции и координации.
Интеграция – это объединение элементов системы в единое целое.
Координация – это соподчинение отдельных элементов между собой, например, менее важных – более важным.
Регуляция осуществляется при помощи прямых и обратных связей
между регулятором и регулируемым объектом.
Различают два вида регуляции:
1) клеточная ауторегуляция,
2) дистантная (межклеточная) регуляция: а) гуморальная и б) нервная.
Механизмы клеточной ауторегуляции:
1. Компартментализация (мембранный механизм)
Роль мембран состоит в следующем:
а) мембраны делят клетки на отсеки и в каждом из них осуществляются свои процессы;
б) мембраны обеспечивают активный транспорт и регулируют потоки молекул в клетку и из клетки;
в) в мембраны встроены ферменты;
г) мембраны защищают клетку от внешних воздействий.
Воздействием на функции мембран клетка может регулировать тот
или иной процесс.
2. Изменение активности ферментов
Механизмы изменения активности ферментов:
а) аллостерический;
б) химическая модификация;
в) взаимодействие белок-белок;
г) конкурентное ингибирование.
3. Изменение количества ферментов путем воздействия на биосинтез белков (индукция и репрессия белков).
Классификация межклеточных регуляторов
Анатомо-физиологическая:
а) Гормоны – межклеточные регуляторы, доставляемые к клеткаммишеням током крови. Вырабатываются в эндокринных железах или рассеянных железистых клетках.
151
ТЕМА 6.
б) Нейрогормоны вырабатываются нервными клетками и выделяются в синаптическую щель, то есть в непосредственной близости от
клетки-мишени. Нейрогормоны делятся на медиаторы и модуляторы.
Медиаторы обладают непосредственным пусковым эффектом. Модуляторы изменяют эффект медиаторов. Примерами медиаторов являются
ацетилхолин и норадреналин; модуляторов – гамма-аминомасляная кислота, дофамин.
в) Локальные гормоны – это межклеточные регуляторы, действующие на близлежащие к месту их синтеза клетки. Пример: гормоны, производные жирных кислот.
Классификация по широте действия:
а) Гормоны универсального действия действуют на все ткани организма (например, катехоламины, глюкокортикостероиды).
б) Гормоны направленного действия действуют на определенные органы-мишени (например, АКТГ действует на кору надпочечников).
Классификация по химическому строению:
а) Белково-пептидные гормоны:
– олигопептиды (кинины, АДГ);
– полипептиды (АКТГ, глюкагон);
– белки (СТГ, ТТГ).
б) Производные аминокислот:
–катехоламины и йодтиронины – образуются из тирозина;
– ацетилхолин – образуется из серина;
– серотонин, триптамин, мелатонин – образуются из триптофана.
в) Липидные гормоны:
– стероидные гормоны (гормоны коры надпочечников и половые
гормоны);
– производные полиненасыщенных жирных кислот (простагландины, тромбоксаны, лейкотриены).
Механизмы действия межклеточных регуляторов
Все межклеточные регуляторы (в дальнейшем – гормоны) управляют
только путем вмешательства в ауторегуляцию клетки. Обязательным
участником гормонального влияния является рецептор.
Рецепторы – это белковые молекулы, специфически связывающие
данный гормон, в результате чего возникает какой-либо эффект.
Гормон начинает свое действие с соединения с рецептором, образуя
гормон-рецепторный комплекс.
Гормон и рецептор имеют одинаковое значение. Эффект зависит от
каждого из них в равной степени.
152
ГОРМОНЫ. ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА
Рецепторы могут находиться внутри клетки, а также на клеточной мембране.
Механизм действия гормонов через внутриклеточные рецепторы
Гормон проникает в клетку, связывается с рецептором. Образованный таким образом гормон-рецепторный комплекс перемещается в ядро
и действует на генетический аппарат клетки. В результате меняется процесс транскрипции, а в дальнейшем – синтез белков. Таким образом, данные гормоны влияют на количество ферментов в клетке.
Механизм действия гормонов через рецепторы плазматических
мембран
В этом случае гормон не проникает в клетку, а взаимодействует с
рецептором на поверхности мембраны. Далее возможны два варианта событий:
Первый вариант – с рецептором связан фермент, который из специфического субстрата образует второй посредник. Второй посредник далее связывается со своим рецептором в клетке. Чаще всего рецептором
посредника является протеинкиназа, которая за счет фосфата АТФ, фосфорилирует белки. В результате изменяются их свойства, возникает биохимический и физиологический эффект.
Второй вариант – рецептор связан не с ферментом мембраны, а с
ионным каналом. При связывании гормона с рецептором канал открывается, ион поступает в клетку и выполняет функции второго посредника.
Хорошо изученными вторыми посредниками являются циклические
нуклеотиды (цАМФ, цГМФ) и Ca2+.
Механизм действия гормонов через цАМФ
Когда соответствующий гормон связывается с рецептором, в мембране активируется фермент аденилатциклаза, который из АТФ образует
цАМФ. цАМФ является аллостерическим активатором протеинкиназы,
которая фосфорилирует белки и изменяет их свойства. Например, фосфорилирование фосфорилазы приводит к повышению ее активности, а
фосфорилирование гликогенсинтетазы – к снижению. цАМФ расщепляется до АМФ фосфодиэстеразой.
Содержание цАМФ в клетке увеличивают: глюкагон, катехоламины
(через -рецепторы), антидиуретический гормон, гистамин (Н2-рецепторы), простагландин-Е, простациклин, тиреотропный гормон, АКТГ,
холерный токсин.
Содержание цАМФ в клетке снижают: ацетилхолин (М-холинорецепторы), катехоламины (2-рецепторы), соматостатин, ангиотензин II,
опиаты, коклюшный токсин.
153
ТЕМА 6.
Функции цАМФ
Как второй посредник участвует в регуляции:
– проницаемости мембран;
– синтеза макромолекул;
– активности ферментов;
– процессов деления;
– в нейронах – увеличения возбудимости;
– в сердце – стимуляции;
– в гладких мышцах – расслабления;
– в железах – увеличения секреции;
– изменения иммунных реакций;
– дезагрегации тромбоцитов.
Механизм действия гормонов через Са2+
В невозбужденной клетке концентрация кальция 10-7М. При возбуждении концентрация кальция возрастает до 10-6–10-5М. Источниками
кальция для этого являются: межклеточная жидкость (содержание кальция – 10-3М), эндоплазматический ретикулум (тоже содержание кальция –
10-3М).
Когда гормон связывается с рецептором, в мембране открывается
кальциевый канал. В результате содержание кальция в клетке возрастает.
Кальций связывается с белком клеток – кальмодулином, образуется комплекс, который может действовать непосредственно на белки, вызывая
эффекты, или действовать на кальмодулин-зависимую протеинкиназу.
Эта протеинкиназа фосфорилирует белки, в результате изменяются их
свойства.
Са2+ в качестве второго посредника выполняет те же функции, что и
цАМФ, за исключением того, что в гладких мышцах вызывает сокращение, в тромбоцитах – агрегацию.
Содержание кальция в клетке повышают: катехоламины через 1рецепторы, ацетилхолин через М-холинорецепторы, гистамин через Н1рецепторы, тромбоксан, ангиотензин II.
Тест для самоконтроля:
1. Инсулин относится:
а) к пептидным гормонам;
б) к стероидным гормонам;
в) к прочим гормонам.
2. Тироксин и трийодтиронин синтезируются:
а) в щитовидной железе;
б) в мозговом веществе надпочечников;
в) в передней доле гипофиза.
154
ГОРМОНЫ. ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА
3. Женские половые гормоны называются:
а) эстрогены и прогестины;
б) андрогены;
в) катехоламины.
4. Содержание катионов кальция и анионов фосфорной и лимонной
кислот в крови регулирует гормон:
а) кальцитонин;
б) паратгормон;
в) соматотропин.
5. Наиболее важный мужской половой гормон:
а) эстрадиол;
б) тестостерон;
в) альдостерон.
Контрольные вопросы для подготовки к коллоквиуму по теме занятия:
1. Происхождение сигнала. Понятие сигнального пути.
2. Механизмы передачи гормонального сигнала внутрь клетки: а)
действие гормонов-нейромедиаторов; б) действие пептидных гормонов
(гидрофильных); в) действие липофильных стероидных и тиреоидных
гормонов, а также активных форм витаминов А и D.
3. Типы клеточных рецепторов. Мембранные рецепторы: а) рецепторы, связанные с G-белком; б) рецепторы, обладающие ферментативной
активностью; в) рецепторы, связанные с ионными каналами.
4. Типы клеточных рецепторов. Внутриклеточные рецепторы (цитоплазматические и ядерные).
5. Активация экспрессии генов ядерными рецепторами.
6. Белки сигнальных путей: а) ГТФ-связывающие белки (G-белки, их
семейства); б) протеинкиназы и протеинфосфатазы; в) адаптерные белки.
7. Вторичные посредники: а) циклические нуклеотиды (цАМФ и
цГМФ); б) ионы кальция; в) липидные вторичные посредники (фосфатидилинозитол и сфинголипиды); г) монооксид азота.
8. Амплификация и прекращение действия сигнала.
9. Аденилатциклазная и гуанилатциклазная система.
10. Фосфатидилинозитолфосфатная система.
11. Сигнальный путь Ras / Raf / MAPK.
12. Сигнальный путь PI3K / AKT / mTOR.
13. Классификация гормонов. Иерархия гормональной регуляции.
14. Гормоны гипоталамуса. Характеристика. Строение. Биологическая роль.
15. Гормоны гипофиза. Характеристика. Строение. Биологическая
роль. Механизмы действия. Соматотропный гормон (СТГ), его эффекты
155
ТЕМА 6.
на обмен веществ. Адренокортикотропный гормон (АКТГ), его эффекты
на обмен веществ.
16. Йодтиронины. Действие на обмен веществ. Физиологические эффекты трийодтиронина. Синтез йодтиронинов.
17. Гормональная регуляция обмена кальция. Гормоны: кальцитонин, паратгормон, кальцитриол. Строение, место синтеза, физиологическая роль.
18. Гормоны поджелудочной железы: глюкагон, инсулин, амилин.
Регуляция синтеза. Биологическая роль.
19. Катехоламины. Типы рецепторов. Механизм передачи сигнала.
Биологическая роль. Биосинтез и деградация катехоламинов.
20. Синтез стероидных гормонов, его регуляция, нарушения.
21. Глюкокортикоиды. Влияние на обмен веществ. Минералокортикоиды.
22. Гормоны, регулирующие репродуктивную функцию: андрогены,
прогестагены, эстрогены, хорионический гонадотропин. Биологические
эффекты.
23. Гормоны и нейропептиды пищеварительной системы: соматостатин, панкреатический полипептид, гастрин, бомбезин, гастрин-высвобождающий пептид, грелин, холецистокинин, секретин, мотилин, инсулиноподобный фактор роста, глюкагонподобный пептид-1, гастроинтестинальный пептид, пептид YY, вазоинтестинальный пептид. Место и регуляция синтеза, биологическая роль.
24. Гормоны жировой ткани: лептин, адипонектин, резистин. Строение, биологическая роль.
25. Гормоны эпифиза. Синтез и функции мелатонина. Гормоны вилочковой железы.
26. Цитокины: хемокины, интерлейкины, лимфокины, монокины.
Основные биологические функции.
156
ГОРМОНЫ. ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА
ТЕМА 7.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
Практическое занятие
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ:
СТРОЕНИЕ, ФУНКЦИИ, МЕХАНИЗМЫ ТРАНСПОРТА ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ
Контрольные вопросы для подготовки к коллоквиуму по теме занятия:
1. Строение мембран. Липиды мембран. Перемещения липидов в
бислое мембраны: латеральная подвижность, ротационная подвижность,
вертикальная подвижность (флип-флоп).
2. Белки клеточных мембран. Особенности строения и расположения. Заякоренные белки.
3. Текучесть мембран. Липидные рафты.
4. Функции мембран: барьерная, структурная, транспортная, энергетическая, сигнальная.
5. Механизмы транспорта через мембрану: простая диффузия, облегченная диффузия, первично-активный и вторично-активный транспорт.
6. Облегченная диффузия. Пример: облегченная диффузия глюкозы.
7. Первично-активный транспорт. Примеры: Na+/К+-АТФаза, Н+/К+АТФаза, Са2+-АТФаза.
8. Вторично-активный транспорт. Примеры: Na+-симпортер,
+
Na /Са2+-антипортер.
9. Рецептор-опосредованный эндоцитоз.
10. Заболевания, связанные с патологией мембранных транспортных
белков.
157
ТЕМА 8.
Тема 8.
ТЕМА 8.
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ.
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
Лабораторно-практическое занятие
ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН. МАКРОЭРГИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ.
МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ. ЦИКЛ КРЕБСА
ТЕОРИЯ
Окисление – это отщепление от вещества электронов; восстановление – это присоединение электронов.
Метаболизм – это обмен веществ и энергии. Он имеет две стороны:
катаболизм и анаболизм.
Катаболизм – это расщепление сложных органических веществ до
более простых, энергия при этом высвобождается.
Анаболизм – это синтез сложных веществ из простых веществ с затратой энергии.
Под биологическим окислением понимают все окислительно-восстановительные реакции, происходящие в организме.
Этапы катаболизма
1-й этап. На этом этапе макромолекулы расщепляются до своих мономеров (или строительных блоков). Так, пролисахариды распадаются до
моносахаридов (гексоз и пентоз); жиры – до глицерина и жирных кислот;
белки – до аминокислот. Этот этап является специфическим, так как каждая макромолекула (полимер) своим набором ферментов расщепляется до
мономеров. 1-й этап катализируется ферментами класса гидролаз. Он локализован в пищеварительном тракте для пищевых (экзогенных) макромолекул, а для эндогенных (находящихся в клетках организма) – в основном
в лизосомах. Этот этап энергетической ценности не имеет (в нем выделяется
менее 1 % энергии), вся образованная энергия рассеивается в виде тепла.
2-й этап. Является специфическим путем катаболизма – происходит
унификация, объединение потоков реакций. На этом этапе каждый из мономеров своим собственным путем превращается в одну из карбоновых
кислот. Моносахариды, глицерин и некоторые аминокислоты превращаются в пируват. Жирные кислоты и часть аминокислот – в ацетил-КоА
(активную уксусную кислоту). Некоторые аминокислоты превращаются
в оксалоацетат или альфа-кетоглутарат. 2-й этап происходит в митохондриях и цитозоле клеток. Образующаяся при этом энергия выделяется
158
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
Введение в метаболизм – обмен веществ и энергии. Биологическое окисление. Свободные радикалы. Перекисное окисление липидов
в виде тепла и АТФ. На этом этапе образуются два центральных метаболита обмена веществ – пируват и ацетил-КоА.
3-й этап. Является общим для разных классов веществ. На этом
этапе пируват в процессе окислительного декарбоксилирования превращается в ацетил-КоА. Ацетил-КоА, оксалоацетат и альфа-кетоглутарат
распадаются в цикле Кребса до СО2 и Н2, который окисляется в дыхательной цепи до воды, при этом выделяется энергия в виде тепла и АТФ. Все
реакции этого этапа локализованы в митохондриях.
Таким образом, конечными продуктами расщепления веществ являются СО2 и Н2О, а также АТФ и тепло.
Окислительное декарбоксилирование пирувата
Два центральных метаболита обмена веществ, пируват и ацетилКоА, связаны друг с другом: пируват может превращаться в ацетил-КоА
при участии мультиферментного комплекса (пируватдегидрогеназного
комплекса) в матриксе митохондрий у эукариот (у прокариот – в цитозоли клетки) (рис. 62). Обратная реакция у человека невозможна.
Рис. 62. Схема процесса окислительного декарбоксилирования пирувата
(состав пируватдегидрогеназного комплекса: пируватдегидрогеназа,
дигидролипоилтрансацетилаза, дигидролипоилдегидрогеназа)
Цикл Кребса (цикл трикарбоновых кислот, цикл лимонной кислоты)
Суммарное уравнение цикла Кребса (схема процесса представлена
на рис. 63):
Ацетил-КоА + 3НАД+ + ФАД + 2Н2О + АДФ + Н3РО4 → 2СО2 +
3НАДН+3Н+ + ФАДН2 + АТФ
Конечные продукты цикла Кребса и пути их использования:
– СО2 выдыхается с воздухом, небольшая часть используется в реакциях карбоксилирования;
159
ТЕМА 8.
ведение в метаболизм – обмен веществ и энергии. Биологическое окисление. Свободные радикалы. Перекисное окисление липидов
Введение в метаболизм – обмен веществ и энергии. Биологическое окисление. Свободные радикалы. Перекисное окисление липидов
– НАДН и ФАДН2 окисляются в дыхательной цепи;
– АТФ используется на различные виды работы:
1) механическая работа (сокращение мышц, движение сперматозоидов, лейкоцитов);
2) осмотическая работа или активный транспорт, то есть движение против градиента концентрации;
3) химическая работа, когда энергия АТФ используется в биосинтетических процессах и на активацию субстратов;
4) электрическая работа (генерация биотоков);
5) при передаче гормонального сигнала (для работы аденилатциклазы и протеинкиназы).
Рис. 63. Схема цикла Кребса (цикла трикарбоновых кислот, ЦТК)
Регуляция цикла Кребса осуществляется путем влияния на ключевые
ферменты: цитратсинтазу (начинает процесс), изоцитратдегидрогеназу
160
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
(лимитирующий фермент), альфа-кетоглутаратдегидрогеназу (фермент,
стоящий на развилке).
Значение цикла Кребса:
– поставляет водород в дыхательную цепь в виде НАДН и ФАДН2;
– катаболическое и энергетическое: цикл Кребса является общим
конечным путем распада для метаболитов всех классов соединений; в
нем образуется АТФ в результате субстратного фосфорилирования; он
является главным поставщиком водорода для дыхательной цепи;
– анаболическое или биосинтетическое: промежуточные метаболиты цикла Кребса используются на синтез других соединений. Например, из оксалоацетата, альфа-кетоглутарата и сукцината образуются аминокислоты; из оксалоацетата – глюкоза и другие углеводы; сукцинилКоА используется на синтез гема;
– регуляторное: метаболиты – цитрат и АТФ являются регуляторами
других процессов. Они активируют синтез жирных кислот и ингибируют
гликолиз.
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 24.
Количественное определение пировиноградной кислоты
в биологических жидкостях
Принцип: пировиноградная кислота (ПВК) является одним из центральных метаболитов обмена веществ. Для количественного определения ПВК используется цветная реакция с 2,4-динитрофенилгидразином.
В результате взаимодействия образуется продукт красного цвета.
Реактивы и оборудование:
1) сыворотка крови, моча; 2) пробирки; 3) 2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор; 4) NaOH, 5%-ный раствор; 5) дистиллированная
вода; 6) градуированные пипетки на 1 и 2 мл, или автоматические дозаторы; 7) спектрофотометр, кюветы на 5 мм.
Ход работы:
Добавленные реактивы
Опытная проба
Контрольная проба
Исследуемая биологическая жидкость
(моча или сыворотка крови)
0,2 мл
–
Дистиллированная вода
–
–
0,2 % раствор 2,4-динитрофенилгидразина
(2,4-ДНФГ)
0,1 мл
0,1 мл
Перемешивают. Пробы оставляют на 20 минут при комнатной температуре
5 % раствор NaOH
0,5 мл
0,5 мл
Перемешивают. Пробы оставляют на 15 минут при комнатной температуре
Дистиллированная вода
1,8 мл
1,8 мл
161
ТЕМА 8.
Пробы фотоколориметрируют. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию ПВК в исследуемой пробе (опытной) и определяется
на спектрофотометре при длине волны 490 нм в кювете 5 мм против контроля.
Расчет проводят по формуле:
C = 46 ∙ ∆D, где
С – концентрация ПВК, мкМ/л;
ΔD – экстинкция измеренная;
46 – коэффициент перерасчета.
Задание: выполните лабораторную работу; результат занесите в протокол лабораторной работы; делайте вывод.
Клинико-диагностическое значение
В крови здорового человека содержится 45–115 мкМ/л пировиноградной кислоты, с мочой за сутки ее выделяется 15–25 мг.
Содержание ПВК повышается в крови при В1-витаминной недостаточности, заболеваниях печени, инсулинзависимом сахарном диабете,
респираторном алкалозе, гиперфункции гипофизарно-адреналовой и
симпатико-адреналовой систем. Кроме того, содержание ПВК резко возрастает в спинномозговой жидкости при травмах ЦНС и воспалительных
процессах мозга (менингит, абсцесс).
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Напишите структурную формулу пировиноградной кислоты.
2. Напишите уравнение реакции превращения пировиноградной кислоты в молочную кислоту.
3. Опишите принцип количественного определения пировиноградной кислоты.
4. Каково значение пировиноградной кислоты в энергетическом обмене?
5. Каково в норме содержание пировиноградной кислоты в крови?
А в моче?
6. При каких состояниях содержание пировиноградной кислоты в
крови повышается?
Тест для самоконтроля:
1. Общим путем катаболизма является:
а) гликолиз;
б) цикл Кребса;
в) пентозофосфатный путь;
г) липолиз.
162
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
2. При окислительном декарбоксилировании альфа-кетоглутарата
в ЦТК образуется:
а) ацетил-КоА;
б) сукцинил-КоА;
в) изоцитрат;
г) оксалоацетат.
3. В цикле трикарбоновых кислот в реакцию субстратного фосфорилирования вступает:
а) ацетил-КоА;
б) изоцитрат;
в) сукцинил-КоА;
г) малат;
д) сукцинат.
4. В цикле Кребса путем субстратного фосфорилирования образуется:
а) 2 АТФ;
б) 5 ГТФ;
в) 12 АТФ;
г) 11 АТФ;
д) 1 ГТФ.
5. Энергетический выход одного оборота цикла Кребса:
а) 2 АТФ;
б) 5 АТФ;
в) 12 АТФ;
г) 11 АТФ;
д) 1 АТФ.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Понятие об обмене веществ и энергии. Макроэргические соединения, пути образования и расходования. Строение АТФ и ее значение.
2. Основные метаболические пути промежуточного (внутриклеточного) обмена. Общий катаболический путь, его этапы.
3. Центральные метаболиты и стадии катаболизма, дающие энергию.
4. Окислительное декарбоксилирования пирувата. Пируватдегидрогеназный комплекс: ферменты, коферменты, локализация, реакции.
5. Цикл трикарбоновых кислот Кребса (ЦТК): определение, механизм, ферменты, коферменты, значение.
6. Энергетический баланс и регуляция ЦТК.
7. Анаболическая роль ЦТК.
8. Субстратное форсфорилирование. Макроэргические соединения
ЦТК.
163
ТЕМА 8.
Лабораторно-практическое занятие
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. РАБОТА ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ.
ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ.
СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ. РОЛЬ В ПАТОЛОГИИ
ТЕОРИЯ
Часть 1. Работа дыхательной цепи
Окислительное фосфорилирование
Дыхательная цепь (цепь переноса электронов) – это цепь сопряженных окислительно-восстановительных реакций, в ходе работы которой водород, отщепленный от субстратов, переносится на кислород с образованием воды и энергии. Назначение дыхательной цепи – генерирование энергии.
Дыхательная цепь – заключительный этап (механизм) аэробного катаболизма, заключается в последовательной работе белков-переносчиков
электронов согласно их окислительно-восстановительному потенциалу
(иными словами, это совокупность окислительно-восстановительных реакций, конечным акцептором в цепи которых является молекулярный
кислород).
Компоненты дыхательной цепи называются дыхательными переносчиками. Большинство из них (кроме убихинона) являются сложными белками:
1) НАДН-дегидрогеназа (НАДН-ДГ);
2) КоQ (убихинон);
3) Цитохромы (b, c1, c, a, а3).
Ионы кислорода и протоны водорода взаимодействуют с образованием воды (эндогенная или метаболическая вода).
Перенос электронов по дыхательной цепи происходит по градиенту
окислительно-восстановительного потенциала (Ео). Синтез АТФ происходит в тех участках дыхательной цепи, где наибольший перепад окислительно-восстановительного потенциала.
Таким образом, в дыхательной цепи синтез АТФ (фосфорилирование) энергетически сопряжен с переносом электронов, то есть окислением дыхательных переносчиков.
Синтез АТФ, сопряженный с переносом электронов по дыхательной
цепи, называется окислительным фосфорилированием. Осуществляется
комплексом АТФ-синтазой во внутренней мембране митохондрий.
Окисление 1 молекулы НАДН приводит к синтезу 3 молекул АТФ,
окисление 1 молекулы ФАДН2 – к образованию 2 молекул АТФ.
Энергия переноса электронов запасается на внутренней мембране
митохондрий в виде электрохимического потенциала.
164
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
В настоящее время экспериментально определена последовательность расположения переносчиков электронов в дыхательной цепи.
Окислительно-восстановительный потенциал переносчиков электронов
в этой последовательности постепенно становится все более положительным.
В 60-х гг. XX в., благодаря методам мягкого разрушения интактных
митохондрий, были выделены четыре дыхательных комплекса (I, II, III, IV):
– комплекс I (НАДН: KoQ-оксидоредуктаза) катализирует перенос
электронов от НАДН к KoQ;
– комплекс II (сукцинат: KoQ-оксидоредуктаза) – перенос электронов от сукцината к KoQ;
– комплекс III (KoQH2: цитохром с-оксидоредуктаза) – перенос
электронов от KoQH2 к цитохрому с;
– комплекс IV (цитохромоксидаза) катализирует перенос электронов
от цитохрома с к кислороду.
Реакции переноса электронов – это окислительно-восстановительные реакции. Соединения, отдающие электроны в такой реакции, называются донорами электронов, или восстановителями, а соединения, присоединяющие электроны, – акцепторами, или окислителями.
Окислители и восстановители всегда функционируют как сопряженные окислительно-восстановительные пары (редокс-пары). Способность каждой сопряженной окислительно-восстановительной пары обратимо отдавать электрон выражают стандартным окислительно-восстановительным потенциалом Е0 (или просто стандартный восстановительный потенциал).
Переносчики дыхательной цепи располагаются в определенной последовательности, в которой каждый из них способен присоединять электроны от предыдущего и передавать их тому, который следует за ним.
Окислительно-восстановительный потенциал переносчиков электронов в дыхательной цепи постепенно становится все более положительным (рис. 64).
– 0,32 В → – 0,12 В → 0 → + 0,07 В → + 0,22 В → + 0,26 В → + 0,55 В → + 0,82 В
Чем более отрицательной величиной выражается восстановительный
потенциал системы, тем выше ее способность отдавать электроны; и наоборот, чем более положительной величиной выражается восстановительный
потенциал, тем выше способность системы присоединять электроны.
Многие белки-переносчики в дыхательной цепи содержат атом железа,
который в ходе переноса электронов меняет степень окисления с +3 на
+2 и обратно. За исключением одного из этих белков (ферродоксин),
165
ТЕМА 8.
в котором атом железа соединен с серой, во всех остальных атом железа
находится в гемме – порфириновом кольце – органической молекуле с
системой сопряженных двойных связей и четырьмя атомами азота, которая образует комплекс с атомом железа.
Рис. 64. Комплексы дыхательной цепи митохондрий
с указанием окислительно-восстановительного потенциала каждого компонента
Мембрана непроницаема для ионов, особенно протонов, их транслокация с внутренней стороны мембраны (из матрикса) на наружную сторону внутренней мембраны митохондрий осуществляется за счет процесса окисления в дыхательной цепи, т. е. транспорта высокоэнергетических электронов. При этом на мембране генерируется трансмембранный
электрохимический протонный потенциал (градиент) ΔμН+, который
складывается из химического потенциала ΔрН и электрического со знаком (+) на наружной стороне мембраны Δψ:
ΔμН+ = ΔрН + Δψ = 0,05 + 0,20 = 0,25 В.
Градиент протонов, создающий разность химических и электрических потенциалов, и является источником энергии, необходимой для реакции
АДФ + Н3РО4 → АТФ + Н2О
ΔG°' = +31 кДж/моль
Процесс фосфорилирования катализируется независимым АТФ-азным комплексом Н+-АТФ-синтетазой (рис. 65), представляющим собой
сложный комплекс, состоящий из растворимого каталитического компонента F1 и мембранного компонента Fo.
Компонент Fo, во-первых, участвует в связывании F1 с мембраной, вовторых, в нем имеется протон-проводящий канал, через который происходит
166
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
перенос Н+ с внешней стороны мембраны (по градиенту электрохимического потенциала) к компоненту F1, который при этом активируется и
становится способным осуществить процесс синтеза АТФ. АТФ-синтетазная система фиксирована в мембране векторно, т. е. характеризуется
определенной пространственной направленностью, а комплекс F1 выступает в матрикс и обеспечивает синтез АТФ.
Рис. 65. Схема строения АТФ-синтазного комплекса
Для объяснения механизма окислительного фосфорилирования
в 1961 г. Питером Митчеллом была предложена хемиосмотическая теория.
Согласно хемиосмотической теории, электроны от НАДН и других
окисляемых субстратов проходят через цепь переносчиков электронов,
ассимметрично расположенных во внутренней мембране митоходнрий.
Перенос электронов сопровождается выкачиванием через мембрану протонов из матрикса в межмембранное пространство, что приводит к возникновению химического градиента (∆рН) и электрического градиента
(∆φ). Внутренняя мембрана непроницаема для протонов. Протоны могут
вернуться в матрикс только через специальные каналы в белковом комплексе Fo. Переход ионов H+ из зоны с более высокой концентрацией в
зону с более низкой концентрацией сопровождается высвобождением
свободной энергии, за счет которой происходит синтез АТФ, катализируемый связанными между собой белковыми комплексами Fo и F1.
167
ТЕМА 8.
Сопряженность дыхательной цепи можно оценить по коэффициенту
Р/О. Коэффициент Р/О равен числу молей АТФ, образующихся из АДФ
и Н3РО4, на 1 грамм-атом поглощенного кислорода.
Разобщение – это такое состояние дыхательной цепи, когда окисление идет, а фосфорилирование не происходит, то есть пункты фосфорилирования выключены полностью или частично. Разобщение в дыхательной цепи могут вызывать липофильные вещества, которые способны переносить протоны водорода с внешней стороны внутренней мембраны
митохондрий на внутреннюю, минуя АТФ-синтазу. В результате энергия мембранного потенциала будет рассеиваться в виде тепла.
Разобщение вызывают: 2,4-ДНФ (динитрофенол), многие яды промышленных производств, бактериальные токсины, набухание митохондрий, жирные кислоты, ионофоры (вещества, переносящие ионы через
мембрану).
Разобщители повышают скорость переноса электронов по дыхательной цепи и выводят ее из-под ингибирующего влияния АТФ.
Регуляция дыхательной цепи:
1. АДФ стимулирует работу дыхательной цепи. Это явление называется дыхательным контролем.
2. АТФ тормозит работу дыхательной цепи и потребление кислорода.
3. Разобщители повышают скорость переноса электронов по дыхательной цепи и выводят ее из-под контроля АТФ.
4. Ротенон блокирует дыхательную цепь на участке НАДН – КоQ;
5. Амитал, антимицин – на участке между цитохромами b и c; цианиды и окись углерода блокируют цитохромоксидазу, при этом вся дыхательная цепь не работает.
6. Адреналин и глюкагон активируют работу дыхательной цепи.
Свободное окисление – это окисление без образования АТФ.
Ферменты свободного окисления: оксидазы, оксигеназы, некоторые
дегидрогеназы.
Значение свободного окисления:
– терморегуляция;
– образование биологически важных соединений (катехоламинов,
глюкокортикостероидов, коллагена, активация витамина D и т. д.);
– обезвреживание ксенобиотиков (ядов, токсинов, лекарств, веществ
бытовой химии).
Тканевые и возрастные особенности окислительных процессов
Анаэробные ткани могут получать энергию без кислорода. К анаэробным тканям относятся скелетные мышцы, эритроциты, периферические
нервы, мозговое вещество почек, кость, хрящ, соединительная ткань.
168
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
Аэробные ткани получают энергию с использованием кислорода и полностью зависят от кровотока. Аэробными тканями являются головной мозг,
сетчатка глаза, сердце, кора почек, печень, слизистая тонкого кишечника.
Потребление кислорода, а значит, и интенсивность окислительных
процессов с возрастом падают.
Часть 2. Свободно-радикальное окисление
Образование АФК. Роль в патологии
Ведущую роль в развитии многих патологических состояний организма играют процессы свободно-радикального окисления. В роли инициирующих и повреждающих агентов выступают свободные радикалы,
зачастую это активные формы кислорода (АФК), которые являются эффективным инструментом локального действия за счет высокой реакционной способности (рис. 66, табл. 9).
Рис. 66. Спектр активных форм
Свободные радикалы (СР) – частицы, отличающиеся от обычных
тем, что в электронном слое одного из атомов на внешней орбитали находится всего лишь один электрон, оказывающий характерное влияние на
химическую активность молекулы вещества. СР могут образовываться
путем отщепления от молекулы атома (иона) водорода, а также присоединения (неполного восстановления) или отдачи (неполного окисления)
одного из электронов.
Одним из наиболее широко распространенных в организме свободных
радикалов является продукт неполного восстановления молекулы кислорода – супероксидный анион-радикал (О2●). Он постоянно образуется с
участием специальных ферментативных систем в клетках многих болезнетворных бактерий, лейкоцитах, макрофагах, альвеолоцитах, клетках слизистой оболочки кишечника и некоторых других органов, в которых имеется
ферментативная система, продуцирующая этот супероксидный анион-радикал кислорода. Большой вклад в образование супероксид аниона вносят митохондрии – вследствие «утечки» части электронов с митохондриальной
цепи и переноса их непосредственно на молекулярный кислород.
169
ТЕМА 8.
Таблица 9
Характеристика основных активных форм в организме млекопитающих:
образование, свойства, утилизация
Форма АКМ,
время жизни,
радиус действия
О2супероксидный
анион-радикал;
10-6 с,
0,3 мкм
НО2
пергироксильный радикал;
10-3 с,
10 мкм
Н2О2
пероксид
водорода;
стабилен
НО∙
гидроксильный
радикал;
10-9 с,
<10 нм
Механизмы образования в живых системах
Биологическое
действие
Ингибиторы
Одноэлектронное вос- Усиление пролифера- Mn-СОД; Cu, Zn-СОД;
становление О2 ксанти- ции лимфоцитов;
убихинон; аскорбиноноксидазой, NADPH- индукция ПОЛ;
вая кислота;
оксидазой фагоцитов, высвобождение жецерулоплазмин;
оксидазами аминокис- леза из ферритина;
глутатион; тирозамин;
лот; образование в
разрушение мембран NO∙
цепи переноса электро- эритроцитов;
нов митохондрий и
образование НО∙2,
микросом;
Н2О2, ОН∙ и 1О2; воспри окислении оксиге- становление цитомоглобина
хрома с;
внутриклеточная регуляция; вазомоторное действие
Присоединение Н+ к
Индуцирует ПОЛ;
Аскорбиновая кислота;
О2- в кислой среде;
переходит в Н2О2 и в мочевая кислота;
реакция Н2О2 с органи- О2- (при взаимодейселен; убихинон;
ческими радикалами; ствии с органичеα-токоферол
промежуточный
скими молекулами);
продукт в реакциях
обладает цитотоксивосстановленных фла- ческим действием
винов с О2
Двухэлектронное
Цитотоксичность;
Внутриклеточные
восстановление О2
локальное закисление каталаза и глутатиксантиноксидазой и
среды; сосудосужива- онпероксидазы;
флавиновыми оксида- ющее действие;
церулоплазмин
зами;
образование ОН∙ в ререакция дисмутации акциях типа ФентоО2- с участием или без новской;
участия СОД
ингибирование пролиферации лимфоцитов
Разложение Н2О2
Сильный окислитель: Мелатонин;
ионами металлов пере- разрывает любую
основания ДНК;
менной валентности
СН-связь;
мочевая кислота;
(реакция Фентона);
вызывает поврежде- тиомочевина; бензоат;
действие ионизирую- ние нуклеиновых кис- диметилсульфоксид;
щих излучений на Н2О; лот и белков;
одно- и многоатомные
образование при мик- индуцирует процессы спирты;
росомальном окисле- ПОЛ;
аскорбиновая кислота
нии, при взаимодейобладает сильным
ствии с О2цитотоксическим,
мутагенным и канцерогенным действием
170
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
О2
синглетный кислород;
10-6 с,
0,3 мкм
1
Сопутствующий про- Индуцирует процессы Акцепторы и тушидукт в реакциях с
ПОЛ; вызывает потели: глутатион;
пероксидазами;
вреждения молекул
гистидин; мочевая и
при спонтанной дисму- белков и нуклеиновых аскорбиновая кислоты;
тации О2-;
кислот – обладает ци- каратиноиды; α-токопри взаимодействии
тотоксическим и му- ферол; билирубин;
Н2О2 с NO∙;
тагенным действием; холестерол; ароматифотоиндуцированные переход в О2 сопро- ческие углеводороды;
реакции
вождается излучеалкены; производные
нием при 1260 нм
фурана; азиды; амиды
В качестве наиболее вероятных участков образования супероксид
анион-радикала на электронтранспортной цепи митохондрий предполагаются два (рис. 67):
– между коэнзимом Q (KoQ) и цитохромом b;
– между флавинмононуклеотидом (ФМН) и серусодержащим белком
комлекса I.
Рис. 67. Две главные точки генерации супероксид-аниона
в дыхательной цепи митохондрий
По современным представлениям в аэробных условиях примерно
90 % поступающего в организм кислорода потребляется митохондриальной цитохромоксидазой с образованием двух молекул воды в ходе четырехэлектронного восстановления молекулы кислорода. От 5 до 15 % кислорода подвергается одноэлектронному восстановлению с образованием
супероксид анион-радикала, неспаренный электрон которого используется в различных реакциях.
Супероксид может давать начало другим АФК (рис. 68).
СР оказывают воздействие на различные компоненты клеток –
белки, митохондриальную ДНК и, прежде всего, на содержащие ненасыщенные жирные кислоты липиды плазматических мембран (фосфолипиды, эфиросвязанный холестерол). Происходит перекисное окисление
липидов (рис. 69).
171
ТЕМА 8.
Рис. 68. Реакции образования основных активных форм кислорода
Рис. 69. Окислительные повреждения липидов, белков и ДНК
Перекисное окисление липидов (ПОЛ)
Краткая схема ПОЛ показана на рисунке 70.
Перекисное окисление липидов (ПОЛ), вероятно, наиболее широко
изученный процесс, индуцируемый свободными радикалами.
Установлено два пути перекисного окисления липидов:
1) неферментативный, аскорбатзависимый, активируемый ионами
металлов переменной валентности;
172
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
2) ферментативный, НАДФН-зависимый, осуществляемый с участием НАДФН-зависимой микросомальной диоксигеназы, генерирующей супероксид анион.
По первому пути ПОЛ протекает во всех мембранах, по второму –
только в эндоплазматическом ретикулуме.
Первичными продуктами ПОЛ являются ацилгидроперекиси. В результате в мембранах появляются участки («дыры»), через которые,
словно через поры, устремляется содержимое как самих клеток, так и органелл – происходит цитолиз.
Рис. 70. Краткая схема ПОЛ
Гидроперекиси липидов – весьма нестойки и довольно быстро разрушаются с образованием вторичных продуктов ПОЛ: альдегидов, кетонов,
спиртов и эпоксидов. Наиболее известен малоновый диальдегид (МДА),
определяемый по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Относится к
группе так называемых ТБК-активных веществ.
Реагируя с SH- и CH3-группами белков, МДА подавляет активность
ферментов: цитохромоксидазы (угнетая тем самым тканевое дыхание),
гидроксилазы, осуществляющей превращение холестерола в желчные
кислоты. Реагируя с аминогруппами белков, МДА характерно изменяет
структуру эластических волокон легочной ткани, нарушает функцию
аэрогематического барьера, усугубляя прогрессирование атеросклероза.
При взаимодействии МДА с аминогруппами фосфолипидов образуются конечные продукты ПОЛ – шиффовы основания, приводящие к полимеризации и поликонденсации молекул, межмолекулярным сшивкам.
173
ТЕМА 8.
Антиоксиданты
Существуют антиоксидантные системы, препятствующие протеканию свободно-радикальных процессов, в частности, ПОЛ. Неферментативными ингибиторами свободнорадикального окисления являются
альфа-токоферол (витамин Е), стероидные гормоны, тироксин, фосфолипиды, ретинол, аскорбиновая кислота. Ферментативные ингибиторы –
глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, супероксиддисмутаза (СОД),
каталаза, пероксидаза и др.
Изучение свободно-радикальных процессов
Для изучения реакций образования и удаления веществ, прежде
всего, нужно располагать прямыми методами количественного анализа
этих веществ.
Но, к сожалению, свободные радикалы обладают столь высокой реакционной способностью, что их невозможно изолировать, исследовать
и количественно определять обычными биохимическими методами.
Все методы оценки свободных радикалов можно разделить на:
– косвенные, к которым относятся методы анализа продуктов реакций, протекавших с участием свободных радикалов (например, гидроперекисей липидов) и ингибиторный анализ;
– прямые, к которым можно отнести метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и метод хемилюминесценции.
Изучение ПОЛ
Поскольку индуцированное свободными радикалами ПОЛ является
сложным процессом и происходит в несколько этапов, существует
много методов обнаружения и определения продуктов ПОЛ в биологических образцах. Общими методами являются колориметрические,
ферментативные и хемилюминесцентные методы. ПОЛ может быть оценено путем измерения потери ненасыщенных жирных кислот, образования первичных продуктов ПОЛ или вторичных продуктов перекисной
деградации.
Значение ПОЛ в развитии различных патологий
Активация свободно-радикального окисления на уровне клеточных
мембран и снижение активности антиоксидантных ферментов определяют многие жизненно важные функции организма. Если количество
продуктов ПОЛ в организме преобладает, то развивается окислительный
стресс, который является пусковым механизмом для целого ряда патологических состояний, в том числе атеросклеротических изменений эндотелия сосудов, острого инфаркта миокарда, при котором нарушена
структура клеточных мембран, нарушений обменных процессов, гемостаза и т. д.
174
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
Негативные последствия активации ПОЛ:
– повреждение липидного бислоя мембран, в результате чего в клетки
проникает вода, ионы натрия, кальция, что приводит к набуханию клеток,
органелл и их разрушению;
– преждевременное старение клеток и организма в целом;
– взаимодействие высокореактивных продуктов ПОЛ с аминогруппами белков с образованием шиффовых оснований;
– изменение текучести (вязкости) мембран, в результате чего нарушается транспортная функция мембран (функционирование ионных каналов);
– нарушение активности мембраносвязанных ферментов, рецепторов.
Активация ПОЛ характерна для многих заболеваний и патологических состояний: атеросклероз и другие сердечно-сосудистого заболевания; поражения ЦНС (болезнь Паркинсона, Альцгеймера); воспалительные процессы любого генеза; дистрофия мышц (болезнь Дюшенна); онкологические заболевания; радиационные поражения; бронхолегочные
патологии.
В настоящее время участие активных форм показано в этиопатогенезе
более чем 200 патологий (табл. 10), многие из которых связаны с неблагоприятным воздействием окружающей внешней среды (экологические патологии) или жестко ассоциируются с возрастом (возрастные патологии).
Таблица 10
Состояния, патологии и заболевания, ассоциированные с АФК и ПОЛ
Группа болезней
Примеры болезней
Воспалительно-имунные
нарушения
Гломерулонефрит; васкулит (вирус гепатита В, лекарства);
аутоиммунные заболевания; ревматоидный артрит
Нарушения метаболизма
Амилоидоз; коллагенопатии; диабет и связанные с ним поражения внутренних органов; маннозидоз; фиброматоз
Ишемия/реперфузия
Инсульты, инфаркты; трансплантация органов
Нарушения, связанные с
избытком железа
Идиопатический гемохроматоз; талассемия; алиментарные
дефициты (квашиоркор)
Гипербарическая оксигенация; дефицит витамина Е;
нейротоксины (6-гидроксидофамин и др.); болезнь Пика;
болезни Паркинсона, Альцгеймера; амиотрофический латеральный склероз; болезнь Верднига-Хофмана; синдром Дауна; гипертиреозное цереброваскулярное поражение; липофусциноз (болезнь Баттена); миастения гравис; тардивная
дискинезия; аллергический энцефаломиелит; усиление
травматических поражений; менингит; менингоэнцефалит;
атаксия-телеангиэктазия; эпилепсия; шизофрения
Поражения мозга
и нервной системы
175
ТЕМА 8.
Окончание табл. 10
Поражения глаз
Поражения сердечнососудистой системы и
сердца
Поражения легких
Патологии желудочнокишечного тракта
Поражения почек
Нарушения системы
репродукции
Поражения кожи
Поражения мышц
Патологии
эритроцитарного звена
Патологии фагоцитов
Другие патологии
и состояния
Катарктогенез; глаукома; дегенеративное повреждение сетчатки; ретинопатии недоношенных; фоторетинопатия
Кардиомиопатии; болезнь Кешана (дефицит Se); атеросклероз; ишемическая болезнь сердца; кардиотоксичность антрациклиновых антибиотиков, этанола; гемохроматоз
Курение; эмфизема; токсическое действие прооксидантов
(гипероксия, О3, SO2, NOx) и химикатов (паракват, блеомицин); бронхолегочная дисплазия; острый респираторный
дистресс-синдром; астма; идиопатический фиброз легких;
туберкулез легких
Повреждение печени эндотоксином, хинонами, железом,
ацитаминофеном, галогенированными углеводородами (галотан, бромбензол, CCl4); диабетогенное действие аллоксана, стрептозотоцина; пневмокониозы; синдром Вегенера; саркоидоз; гепатит В; язва желудка и двенадцатиперстной кишки; колит; болезни поджелудочной железы
Аутоиммунный нефротический синдром; нефротоксичность аминогликозида, тяжелых металлов; хроническая почечная недостаточность; пиелонефрит; уремия
Эндометриоз; женское и мужское бесплодие; импотенция
Действие солнечного света, ионизирующей радиации;
ожоги; порфирия; контактный дерматит; псориаз; склерозирующий лишай
Мышечная дистрофия; множественный склероз; физические нагрузки
Токсическое действие примахина, фенилгидразина, ртути,
сульфаниламидов; фотоокисление протопорфирина; малярия; анемии (серповидноклеточная, фавизм, талассемия);
дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы; анемия
Фанкони
Болезнь Крона; болезнь Бехчета; хронический гранулематоз; дефицит миелопероксидазы
Алкоголизм, радиационное поражение, канцерогенез, старение, СПИД, сепсис; побочное действие лекарств и действие токсинов
176
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
ПРАКТИКА
Лабораторная работа № 25.
Сравнение окислительно-восстановительных потенциалов
рибофлавина и метиленовой сини
Направление и последовательность переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий зависит от величины редокспотенциала. Редокспотенциал (РОП) – это электрический заряд, который возникает на платиновых электродах, опущенных в раствор окисленной и восстановленной формы одного и того же вещества. Вещества с большим РОП окисляют вещества с меньшим РОП. Транспорт электронов и протонов происходит от более отрицательного потенциала к более положительному.
Таким образом, порядок переноса электронов и протонов ферментными
системами в дыхательной цепи не случайный. Он обусловлен величиной
РОП их коферментов.
Принцип: восстановление метиленовой сини водородом (Н2), который
получают взаимодействием цинка с соляной кислотой, происходит раньше,
чем восстановление рибофлавина. Это связано с тем, что РОП (Ео=+0,11В)
метиленовой сини больше, чем РОП рибофлавина (Ео=-0,02В). При отсутствии водорода сначала окисляется восстановленный рибофлавин, а затем окисляется лейкоформа метиленовой сини.
Реактивы и оборудование:
1) раствор рибофлавина; 2) раствор метиленовой сини; 3) металлический цинк; 4) конц. HCl; 5) дист. вода; 6) пробирки; 7) пипептки капельные.
Ход работы:
В пробирку вносят 4–6 капель дистиллированной воды, 2 капли
взвеси рибофлавина и несколько капель раствора метиленовой сини до
появления синего или сине-зеленого окрашивания. Затем в пробирку вносят кусочек цинка и каплю концентрированной соляной кислоты, что
приводит к выделению пузырьков водорода. По мере насыщения раствора водородом, РОП снижается. Происходит последовательное восстановление метиленовой сини, а затем – рибофлавина.
При этом цвет содержимого пробирки последовательно переходит из
синего в зеленый, желто-зеленый, желтый и полностью обесцвечивается.
Обычно желтый цвет рибофлавина при его восстановлении меняется
вначале на розовый – образуется промежуточный продукт восстановления – родофлавин, который далее полностью обесцвечивается. Восстановление рибофлавина и метиленовой сини является обратимым процессом.
Обесцвеченную жидкость переливают в другую пустую пробирку и
наблюдают переход окраски в обратной последовательности – до возникновения сине-зеленой и синей.
177
ТЕМА 8.
Данный факт объясняется тем, что водород в раствор больше не поступает и переносится последовательно через рибофлавин, метиленовую
синь на кислород (О2) воздуха. В отсутствие водорода происходит окисление восстановленного рибофлавина. Он отдает свой водород через метиленовую синь на кислород и окрашивается в желтый цвет (часть водорода поступает на кислород, минуя индикатор). Следующим этапом является окисление лейкоформы метиленовой сини. Раствор в пробирке меняет окрашивание на зеленое, а затем на синее.
Задание: выполните лабораторную работу; результат занесите в протокол лабораторной работы; сделайте вывод.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Что такое стандартный окислительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал)?
2. Как можно измерить редокс-потенциал?
3. В каком направлении происходит транспорт электронов согласно
редокс-потенциалу?
4. Чему равны редокс-потенциалы рибофлавина и метиленовой
сини? Какое из этих веществ будет лучшим окислителем, а какое – лучшим восстановителем?
5. Как можно наблюдать изменение редокс-потенциалов рибофлавина и метиленовой сини (по лабораторной работе)?
Лабораторная работа № 26.
Обнаружение перекисных соединений в растительном масле
Принцип: при взбалтывании хлороформного раствора растительного масла в кислой среде с раствором йодистого калия жидкость приобретает желтую окраску вследствие образования молекулярного йода из
йодистого калия, окисляемого перекисными соединениями. Присутствие
йода подтверждается окрашиванием крахмала в синий цвет.
Реактивы и оборудование:
1) смесь ледяной уксусной кислоты с хлороформом, 2 : 1; 2) йодистый
калий, 2%-ный раствор; 3) крахмал, 0,5%-ный раствор; 4) гипосульфит,
0,1 н. раствор; 5) растительное масло; 6) пробирки; 7) пипетки капельные.
Ход работы:
В одну пробирку вносят 2 капли свежего подсолнечного масла, в другую – 2 капли несвежего. (Либо исследуют несколько растительных масел
различной степени свежести.) Добавляют в каждую пробирку по 10 капель
смеси ледяной уксусной кислоты с хлороформом, по 5 капель раствора йодистого калия и встряхивают. Затем еще по 2 капли 0,5%-ного раствора
178
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
крахмала. Одна пробирка остается бесцветной (свежее масло), в другой –
жидкость окрашивается в синий цвет (несвежее масло).
В пробирку, окрашенную в синий цвет, добавляют по каплям раствор
гипосульфита и наблюдают исчезновение синей окраски. Чем больше капель гипосульфита пошло на обесцвечивание, тем выше содержание перекисных соединений. Чем свежее масло, тем меньше реактива (гипосульфита) уйдет на обесцвечивание.
Задание: выполните лабораторную работу; результат занесите в протокол лабораторной работы; сделайте вывод о свежести исследуемых масел.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Что такое ацилгидроперекиси? Как они образуются?
2. Объясните принцип определения перекисных соединений в растительном масле?
3. К каким методам изучения свободных радикалов (прямым или
косвенным) относится данная методика? Ответ поясните.
4. Что такое свободный радикал?
5. Приведите примеры активных форм кислорода.
Лабораторная работа № 27.
Количественное определение активности каталазы крови
(по методу Баха и Зубковой)
Принцип: каталаза (Н2О2 : Н2О-оксидоредуктаза) является ферментом, катализирующим разложение перекиси водорода на воду и молекулярный кислород:
2Н2О2 → 2Н2О + О2.
Каталаза известна как один из наиболее активных ферментов. Она
содержится почти во всех клетках организма, но особенно ею богаты
эритроциты и печень. Каталаза выполняет основную защитную функцию
по освобождению организма от перекиси водорода. Вместе с тем каталаза
непосредственно участвует в процессах биологического окисления и
фосфорилирования. Простетической группой этого фермента является
гематин, содержащий трехвалентное железо.
Активность фермента выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы.
Каталазным числом называют количество мг перекиси водорода, которое расщепляется одним мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности
количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной
и опытной проб.
179
ТЕМА 8.
Реакция идет по уравнению:
2КМnО4 + 5Н2О2 + 3Н2SО4 = 2MnSО4 + К2SО4 + 8Н2О + 5О2
Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к
количеству миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.
Реактивы и оборудование:
1) основной раствор крови (готовят лаборанты); 2) колбочки или стаканчики для титрования (плоскодонные); 3) 1%-ный раствор перекиси
водорода; 4) 10%-ный раствор серной кислоты; 5) 0,1 М раствор КМnО4;
6) бюретка или установка для титрования; 7) пипетки на 1, 2 и 5 мл.
Приготовление основного раствора крови (готовят лаборанты):
в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз
тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1 : 1000), который используется для определения каталазного числа.
Ход работы: в две колбочки (опыт и контроль) для титрования наливают по 7 мл воды и прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбочку вносят точно по 2 мл 1%-ного раствора перекиси водорода.
В контрольную колбочку добавляют 3 мл 10%-ного раствора серной
кислоты для расщепления каталазы. Обе колбочки оставляют при комнатной температуре на 30 минут. Затем в опытную колбочку наливают 3 мл
10%-ного раствора серной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М
раствором перманганата калия до появления розового окрашивания.
Расчет: разницу между результатами контроля и опыта умножают
на 1,7 и получают каталазное число крови:
КЧ = (A − B) ∙ 1,7 , где
А и В – количество мл 0,1 М раствора перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб соответственно.
Пояснение к расчету: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит,
в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу
между количеством мл 0,1 М раствора перманганата калия, пошедшего
на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг перекиси водорода, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывается каталазное число.
Каталазное число крови крыс 5 ± 0,3; у человека колеблется в пределах от 10 до 15 единиц.
Задание: выполните лабораторную работу; результат занесите в протокол лабораторной работы; сделайте вывод об активности каталазы.
180
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
Клинико-диагностическое значение
Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много ее в строме эритроцитов и печени.
Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и
макроцитарной анемии, а также при введении в организм кофеина, ацетоновых тел, алкоголя.
Содержание каталазы в крови снижается при ряде заболеваний:
раке, анемии, туберкулезе; при ряде инфекционных заболеваниях, при
хроническом отравлении фосфором, свинцом, ртутью, мышьяком, наркотиками.
Контрольные вопросы к защите лабораторной работы:
1. Напишите уравнение каталазной реакции. Какое значение в организме она имеет?
2. К какому классу ферментов относится каталаза?
3. Что является субстратом каталазы?
4. На чем основан принцип количественного определения каталазы?
5. Где в организме встречается каталаза?
6. Как определить окончание титрования?
7. О чем будет свидетельствовать повышенная, а о чем пониженная
активность каталазы крови?
Тест для самоконтроля:
1. Энергетический выход полного окисления ПВК до СО2 и Н2О составляет:
а) 5 АТФ;
б) 1 АТФ;
в) 3 АТФ;
г) 15 АТФ.
2. Коэнзим А выполняет функцию переносчика:
а) метильной группы;
б) аминогруппы;
в) ацетильных групп;
г) формильной группы;
д) фосфатных групп.
3. Ферменты дыхательной цепи цитохромы относятся к классу:
а) оксидоредуктаз, подклассу гидропероксидаз;
б) гидролаз, подклассу гликозидаз;
в) изомераз, подклассу внутримолекулярных оксидоредуктаз;
г) оксидоредуктаз, подклассу анаэробных дегидрогеназ;
д) трансфераз, подклассу метилтрансфераз.
181
ТЕМА 8.
4. Укажите компонент дыхательной цепи, свободно передвигающийся внутри мембраны:
а) цит в, FeS, цит с1 ;
б) КоQ;
в) ФМН, FeS;
г) цит а, цит а3 .
5. Укажите компонент полной дыхательной цепи, жестко встроенный во внутреннюю мембрану митохондрий:
а) сукцинатдегидрогеназа
б) цит с
в) КоQ
г) НАДН-дегидрогеназа
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. История развития учения о биологическом окислении (работы
М. О. Баха, В. И. Палладина и др.).
2. Современные представления о биологическом окислении. Ферменты и коферменты дыхательной цепи, структура I, II, III, IV комплексов и их значение. Редокспотенциал, его значение в дыхательной цепи.
3. Тканевое дыхание. Образование Н2О2 и СО2 в тканях. Вспомогательные ферменты тканевого дыхания. Ингибиторы тканевого дыхания.
4. Ферменты и коферменты дыхательной цепи. Их локализация в
мембране.
5. Комплексы дыхательной цепи – структура I, II, III, IV комплексов и
их значение. Окислительно-восстановительный потенциал. Редокс-пары.
6. Работа дыхательной цепи, перенос электронов и сопряженный перенос протонов. Ингибиторы дыхательной цепи.
7. Окислительное фосфорилирование. Основные положения хемиоосмотической теории Митчелла. Генерация ΔμН +. Коэффициент окислительного фосфорилирования Р/О и его значение.
8. Строение и работа АТФ-синтазного комплекса.
9. Розобщители окислительного фосфорилирования и тканевого дыхания.
10. Теплообразование. Роль бурой жировой ткани и термогенина.
Механизм термогенеза. Образование бежевой жировой ткани.
11. Патологии биологического окисления. Дыхательная цепь как источник активных форм кислорода, роль в развитии заболеваний.
12. Что такое АФК? Перечислите основные активные формы, встречающиеся в организме млекопитающих. Охарактеризуйте их.
13. Какова роль дыхательной цепи в образовании АФК? Охарактеризуйте ее.
182
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
14. Супероксид анион-радикал, где образуется, в какие реакции он
способен вступать. Биологическое значение.
15. Перекись водорода, биологическое значение, реакции образования и обезвреживания, ферменты. Напишите схемы реакций, катализируемых этими ферментами.
16. Гидроксильный радикал, его образование, участие в реакциях,
биологическое значение.
17. Пути развития ПОЛ. Первичные, вторичные и третичные (конечные) продукты ПОЛ. Их биологическое действие.
18. Методы исследования свободных радикалов и их действия.
19. Антиоксиданты: ферментные и неферментные. Харакетристика
механизма действия.
20. Патологии, связанные с действием свободных радикалов, и в
частности, АФК.
183
ТЕМА 8.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ К ИТОГОВОМУ ЗАНЯТИЮ
1. Обмен веществ и энергии – метаболизм. Катаболизм и анаболизм.
Общая характеристика. Связь обмена веществ и обмена энергии. Формы
аккумуляции энергии в клетке: макроэргические соединения (АТФ, ГТФ
и др.); восстановительные эквиваленты (характеристика пиридин-зависимых и флавин-зависимых дегидрогеназ, реакции дегидрирования в метаболизме); мембранный потенциал и механизмы его формирования.
2. Центральный катаболический путь обмена белков, углеводов, липидов. Стадии, дающие энергию. Центральные метаболиты – пировиноградная кислота (ПВК) и ацетил-КоА, их характеристика и значение для
метаболизма.
3. Образование ацетил-КоА – окислительное декарбоксилирование
ПВК, связь с дыхательной цепью. Строение и работа пируватдегидрогеназного комплекса.
4. Цикл трикарбоновых кислот Кребса (ЦТК): реакции и их механизм, ферменты, продукты и энергетический выход ЦТК – реакция субстратного фосфорилирования.
5. Энергетический баланс и регуляция ЦТК. ЦТК – как амфиболический путь. Патологии, связанные с генетическими мутациями ферментов
ЦТК.
6. История развития учения о биологическом окислении (работы
М. О. Баха, В. И. Палладина и др.). Современные представления о биологическом окислении.
7. Тканевое дыхание. Образование Н2О и СО2 в тканях. Вспомогательные ферменты тканевого дыхания. Ингибиторы тканевого дыхания.
8. Белки-ферменты переносчики электронов и коферменты дыхательной цепи. Комплексы дыхательной цепи – структура I, II, III, IV комплексов и их значение. Их локализация в мембране.
9. Работа дыхательной цепи, перенос электронов и сопряженный перенос протонов. Окислительно-восстановительный потенциал. Редокспары.
10. Окислительное фосфорилирование. Основные положения хемиосмотической теории Митчелла. Генерация ΔμН +. Коэффициент окислительного фосфорилирования Р/О и его значение. Дыхательный контроль.
Строение и работа АТФ-синтазного комплекса. Строение АТФ и ее значение.
11. Разобщение окислительного фосфорилирования и тканевого дыхания. Разобщители и механизм их действия. 2,4-динитрофенол как пример искусственного разобщителя. Ингибиторы дыхательной цепи. Механизм их действия.
184
ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ – ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. БИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОКИСЛЕНИЕ. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
12. Теплообразование. Роль бурой жировой ткани и термогенина.
Механизм термогенеза. Роль норадреналина и каскад усиления. Образование бежевой жировой ткани.
13. Свободные радикалы. Активные формы кислорода (АФК). Роль
митохондриальной дыхательной цепи в генерации АФК. Основные АФК,
время их жизни и радиус действия.
14. Супероксид анион-радикал. Образование, реакции, биологическое значение, обезвреживание – роль супероксиддисмутазы.
15. Перекись водорода. Образование, реакции, биологическое значение, обезвреживание – роль каталазы и пероксидазы (строение, роль в
нейтрализации перекиси водорода, катализируемые реакции и их механизмы, значение для клеток, повышение и понижение каталазной и пероксидазной активности при разных патологиях).
16. Перекисное окисление молекул: перекисное окисление липидов
(ПОЛ), окислительная модификация белков и ДНК. Модификации молекул клетки под воздействием АФК и других свободных радикалов. Последствия такой модификации.
17. ПОЛ. Цепной характер перекисного окисления. Первичные, вторичные и третичные (конечные) продукты ПОЛ. Их биологическое действие. Окисление липидов и митоптоз.
18. Антиоксиданты. Ферментные и неферментные антиоксиданты,
характеристика механизма действия. Витамин Е и витамин С как антиоксиданты. Механизм антиоксидантного действия. Антиоксиданты растительного происхождения.
19. Патологии биологического окисления. Развитие окислительного
стресса. Роль окислительного стресса в развитии заболеваний. Патологии, связанные со свободно-радикальным действием и влиянием АФК.
185
ЛИТЕРАТУРА
Основная литература:
1. Биохимия : учебник / под ред. Е. С. Северина. – 5-е изд., испр. и доп.–
Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2019. – 768 с. – ISBN 978-5-9704-4881-6.
2. Биохимия с упражнениями и задачами : учебник / В. А. Голенченко,
О. В. Корлякова, С. А. Силаева, Т. А. Титова; Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова. – Москва : ГЭОТАР-Медиа,
2019. – 384 с. – ISBN 978-5-9704-5008-6.
3. Комов, В. П. Биохимия в 2 ч. Часть 1 : учебник / В. П. Комов, В. Н. Шведова.
– 4-е изд., испр. и доп. – Москва : Юрайт, 2019. – 333 с. – ISBN 978-5-534-02059-5.
4. Комов, В. П. Биохимия в 2 ч. Часть 2 : учебник / В. П. Комов, В. Н. Шведова. – 4-е изд., испр. и доп. – Москва : Юрайт, 2020. – 315 с. – ISBN 978-5-53402061-8.
Дополнительная литература:
1. Аппель, Б. Нуклеиновые кислоты: От А до Я / Б. Аппель, Б.-И. Бенеке,
Я. Бененсон и др. / Под ред. С. Мюллер. – Москва : БИНОМ. Лаборатория знаний,
2013. – 413 с.
2. Березов, Т. . Биологическая химия : учебник для студентов медицинских
вузов / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. – 3-е изд., стереотипное. – Москва : Медицина, 2008. – 703 с. – ISBN 5-225-04685-1.
3. Корочанская, С. П. Биохимические особенности обмена веществ у детей :
учебное пособие / С. П. Корочанская, И. М. Быков, Т. С. Хвостова. – 2-е изд, перераб. и доп. – Санкт-Петербург : Лань, 2019. – 140 с. – ISBN 978-5-8114-3762-7.
4. Кузнецова, О.М. Основы биохимии: руководство к практическим занятиям. Учебное пособие: специальности «Лечебное дело», «Фармация», весенний
семестр / О. М. Кузнецова, В. И. Иванова-Радкевич, В. С. Покровский. – Москва :
Е-ното, 2022. – 238 с. – ISBN 978-5-906023-31-5.
5. Мушкамбаров, Н. Н. Молекулярная биология : учебное пособие для студентов медицинских вузов / Н. Н. Мушкамбаров, С. Л. Кузнецов. – 2-е изд., испр.
– Москва : Медицинское информационное агентство (МИА), 2007. – 535 с. – ISBN
5-89481-618-1.
6. Нельсон, Д. Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т.1. Основы биохимии.
Строение и катализ / Д. Нельсон, М. Кокс; пер. с англ. – Москва : Бином. Лаб.
знаний, 2011. – 694 с. – ISBN 978-5-94774-365-4.
7. Нельсон, Д. Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т.2. Биоэнергетика и
метаболизм / Д. Нельсон, М. Кокс; пер. с англ. – Москва : Бином. Лаб. знаний,
2014. – 636 с. – ISBN 978-5-94774-366-1.
8. Нельсон, Д. Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т.3. Пути передачи информации / Д. Нельсон, М. Кокс; пер. с англ.– Москва : Бином. Лаб. знаний, 2015.
– 448 с. – ISBN 978-5-94774-367-8.
9. Основы биохимии : учебное пособие для студентов медицинских вузов /
Под. ред. Н. Н. Чернова, В. С. Покровского. – 2-е изд, перераб. и доп. – Москва :
Е-ното, 2024. – 392 с. – ISBN 978-5-906023-38-4.
10. Покровский, В. С. Биохимия человека. Обмен липидов / В. С. Покровский. – Москва : Е-ното, 2023. – 496 с. – ISBN 978-5-906023-34-6.
186
11. Покровский, В. С. Биохимия человека. Обмен углеводов / В. С. Покровский. – Москвуа : Е-ното, 2022. – 360 с. – ISBN 978-5-906023-32-2.
12. Функциональная биохимия органов и тканей / А. В. Шестопалов,
В. В. Давыдов, О. П. Шатова [и др.]. – Москва : Е-ното, 2024. – 600 с. – ISBN 9785-906023-39-1.
13. Частная биохимия : учебное пособие для студентов медицинских вузов /
В. С. Покровский, О. Ю. Алексеева, Д. Д. Жданов [и др.]. – Москва : Е-ното,
2020. – 368 с. – ISBN 978-5-906023-25-4.
Ссылки на рисунки:
Рис. 1. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 10.
Рис. 2. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 11.
Рис. 3. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 13.
Рис. 4. – URL: https://studfile.net/preview/4387909/page:6/.
Рис. 5. – URL: https://studref.com/400783/matematika_himiya_fizik/ustroystvo_
printsip_raboty_spektrofotometrov/.
Рис. 6. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 17.
Рис. 7. – URL: https://www.eppendorf.com/th-en/lab-academy/topics-methodstechnology/pipetting-dispensing/impact-of-pipetting-techniques/)
Рис. 8. – URL: https://studfile.net/preview/4387909/.
Рис. 9. – URL: https://studfile.net/preview/4387909/.
Рис. 10. – URL: https://studfile.net/preview/4387909/.
Рис. 11. – URL: https://studfile.net/preview/4387909/.
Рис. 12. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 28.
Рис. 13. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 29.
Рис. 14. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 29.
Рис. 15. – URL: https://lifelib.info/biochemistry/leninger/18.html/.
Рис. 16. – URL: https://ebooks.grsu.by/osnovi_biohimii/7-obshchie-predstavleniyao-belkakh.htm/.
Рис. 17. – URL: https://studfile.net/preview/4597043/page:18/.
Рис. 18. – URL: http://vmede.org/sait/?page=13&id=Bioorganicheskaja_himija_
tykavkina_2010&menu=Bioorganicheskaja_himija_tykavkina_2010/.
187
Рис. 19. – URL: http://vmede.org/sait/?page=13&id=Bioorganicheskaja_himija_
tykavkina_2010&menu=Bioorganicheskaja_himija_tykavkina_2010/.
Рис. 20. – URL: http://vmede.org/sait/?page=13&id=Bioorganicheskaja_himija_
tykavkina_2010&menu=Bioorganicheskaja_himija_tykavkina_2010/.
Рис. 21. – URL: https://studfile.net/preview/9006791/page:6/.
Рис. 22. – URL: https://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/1108649/.
Рис. 23. – URL: https://ppt-online.org/149261 (слайд 3).
Рис. 24. – URL: https://lailas.ru/biochemistry/shulc/43.html/.
Рис. 25. – URL: https://en.wikipedia.org/wiki/File:Pyruvate_kinase_protein_
domains.png/.
Рис. 26. – URL: http://profil.adu.by/mod/book/tool/print/index.php?id=3901/.
Рис. 27. – URL: https://www.books-up.ru/en/read/biohimiya-12172884/?page=27/.
Рис. 28. – URL: https://kartinkof.club/kartinki/kartinki-dlja-srisovki/23556-dena
turacija-belka-kartinki-48-foto.html/.
Рис. 29. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 45.
Рис. 30. – URL: https://ppt-online.org/647936 (слайд 6).
Рис. 31. – авторский.
Рис. 32. – URL: https://studfile.net/preview/9903392/.
Рис. 33. – URL: https://studfile.net/preview/12477247/page:7/.
Рис. 34. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 69.
Рис. 35. – URL:
https://gcagro.by/assets/images/osobaja-struktura-i-funkciibelkov-goldkovagro-minsk-belarus-analizatory-moloka6.png/.
Рис. 36. – URL: https://ppt-online.org/246192 (слайд 26).
Рис. 37. – URL: https://biokhimija.ru/lipidy/transport-lipidov-krovi.html/.
Рис. 38. – URL: https://www.researchgate.net/figure/a-phosphorylation-proteinkinases-chemically-transfer-g-phosphate-from-ATP-or-GTP-to-a_fig2_321326261/.
Рис. 39. – URL: https://cs13.pikabu.ru/post_img/big/2023/07/28/5/1690524064
287923988.png/.
Рис. 40. – URL: https://lailas.ru/biochemistry/bases_2/bases_2.files/image154.jpg/.
Рис. 41. – URL: https://studfile.net/preview/9276644/page:15/.
Рис. 42. – URL: https://studfile.net/preview/9276644/page:15/.
Рис. 43. – URL: https://lifelib.info/biochemistry/leninger/43.html/.
Рис. 44. – URL: https://lifelib.info/biochemistry/leninger/43.html/.
Рис. 45. – URL: https://studentus.net/book/141-lekcii-po-organicheskoj-ximii/46monosaxaridy.html/.
Рис. 46. – URL: https://www.calc.ru/imgs/articles2/94/26/3766055854fb914f812.
05075313.png/.
Рис. 47. – URL: https://clck.ru/3HSqQx/.
Рис. 48. – URL: – https://konspekta.net/megalektsiiru/baza9/6992448018806.files/
image022.gif; https://bstudy.net/htm/img/17/12425/343.png/.
Рис. 49. – URL: https://pikabu.ru/story/klassifikatsiya_zhirov_i_pochemu_eyo_nuz
hno_znat_tem_kto_khochet_korrektirovat_svoy_ves_i_priderzhivatsya_pp_8335010/.
188
Рис. 50. – URL:
https://www.ok-t.ru/studopediaru/baza8/153511820894.files/
image016.jpg/;
https://ozlib.com/htm/img/18/21177/39.png/.
Рис. 51. – URL: https://him.1sept.ru/view_article.php?ID=201001105
Рис. 52. – URL: https://studfile.net/preview/6659418/page:33/
Рис. 53. – URL: https://lifelib.info/biochemistry/biochemistry_4/17.html/.
Рис. 54. – URL: https://lifelib.info/biochemistry/biochemistry_4/18.html/.
Рис. 55. – URL: https://lifelib.info/biochemistry/biochemistry_4/18.html/.
Рис. 56. – URL: https://lifelib.info/biochemistry/biochemistry_4/18.html/.
Рис. 57. – URL: https://studref.com/htm/img/33/7346/37.png/;
https://studfile.net/html/2706/660/html_8IrE7fTsjC.VmJW/img-V60Qtv.png/;
https://studfile.net/html/88758/613/html_OOmdT70gWV.2ZE9/htmlconvdighllR_html_99ca52c21abbf43c.jpg/;
https://studfile.net/html/2706/862/html_iFa9zO_Ij3.MG2G/htmlconvdpHAQ5H_html_2af6208bce6a40f7.png/.
Рис. 58. – URL: https://konspekta.net/studopediainfo/baza10/1482274243668.files/
image068.gif/;
https://konspekta.net/studopediaorg/baza4/1493258804048.files/image059.jpg/;
https://studfile.net/html/64343/18/html_LZX4iio2Bv.LbDt/htmlconvd-hGGMiF_
html_cc6afcc2cc0aa6c.png/;
https://patenton.ru/patent/RU2496784C2/i/00000014.png/;
https://avatars.mds.yandex.net/i?id=6bb1f8939d82adbfecbe2b99300c570b4866546-images-thumbs&n=13/.
Рис. 59. – URL: https://www.researchgate.net/profile/Monica-Butnariu/publication/306270755/figure/fig2/AS:396464405663748@1471535888826/The-chemicalstructure-of-retinol-retinal-and-retinoic-acid.png/,
https://xn--80ahcakf4adnndt.xn--p1ai/wa-data/public/photos/44/04/444/444.970.jpg/.
Рис. 60. – URL: https://lpi.oregonstate.edu/book/export/html/178/;
https://biokhimija.ru/vitaminy/vitamin-e.html/.
Рис. 61. – URL: https://studfile.net/preview/8840867/.
Рис. 62. – URL: https://ru.m.wikipedia.org/wiki/%D0%A4%D0%B0%D0%B9%
D0%BB:Pyruvate_decarboxylation_ru.svg/.
Рис. 63. – URL: https://biokhimija.ru/obshhwie-puti-katabolizma/cikl-trikarbonovyhkislot.html/.
Рис. 64. – URL: https://studme.org/280227/geografiya/organizatsiya_dyhatelnoy_
tsepi_transporta_elektronov/.
Рис. 65. – URL: http://www.setlab.net/?view=LiveDesign_motors/.
Рис. 66. – URL: clck.ru/3HSrMN/.
Рис. 67. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 178.
Рис. 68. – Выполнен автором О. В. Поповой.
Рис. 69. – Биохимия: учебно-методическое пособие. Ч. I / авт.-сост.: О. В. Попова, О. Э. Краснощёкова, М. В. Дубинин. – Йошкар-Ола : Марийский государственный университет, 2017. – С. 180.
Рис. 70. – URL: https://ppt-online.org/202366 (слайд 25).
189
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список используемых сокращений ................................................................ 3
Предисловие........................................................................................................ 5
Тема 1. Введение в биохимию. Методы биохимических
исследований ...................................................................................................... 7
Лабораторно-практическое занятие. Введение в биохимический
практикум ....................................................................................................... 7
Тема 2. Аминокислоты и белки (строение, свойства, функции) ............. 22
Лабораторно-практическое занятие. Аминокислоты. Образование
пептидной связи. Пептиды. Качественное определение аминокислот
и белков......................................................................................................... 22
Лабораторная работа № 1. Качественные реакции на аминокислоты и
белки ....................................................................................................... 34
Лабораторно-практическое занятие. Уровни организации белковых
молекул. Физико-химические свойства белков. Диализ белка. Осаждение белков .............................................................................................. 40
Лабораторная работа № 2. Проведение диализа белоксодержащего
раствора .................................................................................................. 49
Лабораторная работа № 3. Проведение и изучение денатурации
белков ...................................................................................................... 51
Лабораторно-практическое занятие. Простые и сложные белки. Исследование состава сложных белков .......................................................... 56
Лабораторная работа №4. Определение химического состава
казеиногена молока ................................................................................ 65
Лабораторная работа № 5. Выделение муцина из слюны и
обнаружение углеводного компонента ................................................ 66
Лабораторно-практическое занятие. Количественное определение
белка в биологическом материале .............................................................. 70
Лабораторная работа № 6. Количественное определение белка в моче
по помутнению, образующемуся при добавлении
сульфосалициловой кислоты ................................................................ 70
Лабораторная работа № 7. Количественное определение белка в
сыворотке крови биуретовым методом ................................................ 73
Тема 3. Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты (строение, свойства,
функции). Нуклеопротеины........................................................................... 80
Лабораторно-практическое занятие. Нуклеотиды, нуклеиновые
кислоты и нуклеопротеины ......................................................................... 80
Лабораторная работа № 8. Изучение состава нуклеопротеидов ........ 85
Тема 4. Углеводы и липиды (строение, свойства, функции) ................... 90
190
Лабораторно-практическое занятие. Строение, функции и определение углеводов ........................................................................................... 90
Лабораторная работа № 9. Качественные реакции на углеводы ....... 94
Лабораторная работа № 10. Определение восстанавливающей
способности углеводов .......................................................................... 97
Лабораторно-практическое занятие. Строение и функции липидов ..... 100
Лабораторная работа № 11. Обнаружение липидов в сыворотке
крови и растительном масле ............................................................... 105
Лабораторная работа № 12. Сравнение ненасыщенности жиров .... 106
Лабораторная работа № 13. Определение кислотного числа жира . 107
Тема 5. Ферменты. Витамины. Коферментная роль витаминов .......... 111
Лабораторно-практическое занятие. Строение и свойства ферментов. Определение активности ферментов ................................................ 111
Лабораторная работа № 14. Определение специфичности действия
ферментов ............................................................................................. 115
Лабораторная работа № 15. Влияние температуры на активность
ферментов ............................................................................................. 117
Лабораторная работа № 16. Влияние рН на активность ферментов 118
Лабораторная работа № 17. Влияние активаторов и ингибиторов на
активность ферментов ......................................................................... 119
Лабораторно-практическое занятие. Действие ферментов разных классов. Энзимопатии. Энзимодиагностика. Изоферменты..... 123
Лабораторная работа № 18. Обнаружение активности липазы ....... 131
Лабораторная работа № 19. Обнаружение активности каталазы и
пероксидазы .......................................................................................... 132
Лабораторная работа № 20. Энзимодиагностика острого панкреатита.
Количественное определение активности альфа-амилазы в моче
(по методу Вельгемута) ....................................................................... 134
Лабораторно-практическое занятие. Строение и биологическая
роль витаминов. Витамины как коферменты .................................... 139
Лабораторная работа № 21. Обнаружение некоторых
жирорастворимых витаминов ............................................................. 142
Лабораторная работа № 22. Обнаружение витаминов группы В .... 143
Лабораторная работа № 23. Обнаружение витамина С в растворе . 144
Тема 6. Гормоны. Передача сигнала .......................................................... 150
Практическое занятие. Пути передачи сигнала в клетке.
Гормоны. Механизмы гормональной регуляции .............................. 150
Тема 7. Биологические мембраны .............................................................. 157
Практическое занятие. Биологические мембраны: строение,
функции, механизмы транспорта через мембрану ............................ 157
191
Тема 8. Введение в метаболизм – обмен веществ и энергии.
Биологическое окисление. Свободные радикалы.
Перекисное окисление липидов .................................................................. 158
Лабораторно-практическое занятие. Энергетический обмен.
Макроэргические соединения. Метаболические пути. Цикл Кребса ...158
Лабораторная работа № 24. Количественное определение
пировиноградной кислоты в биологических жидкостях .................. 161
Лабораторно-практическое занятие. Биологическое окисление.
Работа дыхательной цепи. Окислительное фосфорилирование.
Свободно-радикальное окисление. Роль в патологии....................... 164
Лабораторная работа № 25. Сравнение окислительновосстановительных потенциалов рибофлавина и метиленовой
сини ....................................................................................................... 177
Лабораторная работа № 26. Обнаружение перекисных соединений в
растительном масле ............................................................................. 178
Лабораторная работа № 27. Количественное определение активности
каталазы крови (по методу Баха и Зубковой) .................................... 179
Литература ...................................................................................................... 186
192
Уч еб но е и з да ни е
БИОХИМИЯ. ЧАСТЬ I
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ
Составители:
ПОПОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА
СЕМЕНОВА АЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА
РЫБАКОВА АЛЁНА ИВАНОВНА
КРАСНОЩЁКОВА ОЛЬГА ЭДУАРДОВНА
За содержание, цитирование,
использование графического материала
юридическую ответственность несут составители
Литературный редактор
А. Ф. Соловьева
Компьютерная верстка
И. В. Вострикова
Тем. план 2025 г. № 14.
Подписано в печать 07.10.2025. Формат 60×84/16.
Усл. печ. л. 11,28. Уч.-изд. л. 8,20. Тираж 300. Заказ №
48,50
Оригинал-макет подготовлен к печати в РНиУЛ
ФГБОУ ВО «Марийский государственный университет».
424002, Россия, Республика Марий Эл, г. Йошкар-Ола, ул. Кремлевская, 44, к. 216.
Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Принтекс».
424003, Россия, Республика Марий Эл, г. Йошкар-Ола, ул. Суворова, д. 15А, к. 204.
Тел.: 8 (8362) 38-56-56, доб. 204; e-mail: info@printecs.com, www.printecs.com
193
194