Микробиологические опыты без лаборатории: справочник для учителей

Городской информационный научно–методический центр
(ГИНМЦ)
Н.Н. Волченко
А.Н. Криштопа
Д.В. Нимченко
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ
ОПЫТЫ БЕЗ ЛАБОРАТОРИИ
Справочные материалы
Краснодар 2007
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
УДК 579 (076)
ББК 28.4 я 721
В 689
Рецензенты:
Кандидат биологических наук, профессор кафедры генетики, микробиологии и
биотехнологии Кубанского государственного университета,
директор центра «Биотехнология» Кубанского государственного университета
Э.В. Карасёва
Методист Краснодарского краевого института дополнительного профессионального
педагогического образования
К.П. Казарян
Учитель биологии лицея № 4 г.Краснодара
О.А. Кононова
Волченко, Н.Н., Криштопа, А.Н., Нимченко, Д.В.
В 689 Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без
лаборатории: справочные материалы /Н.Н. Волченко, А.Н. Криштопа, Д.В. Нимченко. –
Краснодар, 2007. – 36 с.: ил. 200 экз.
Издание «Микробиологические опыты без лаборатории» содержит сведения о
микробиологических опытах, доступных вне лабораторных условий, с методическими
указаниями по их проведению, а также необходимые сведения о современной системе живого
мира, месте в ней микробиологических объектов, общих принципах систематики, методах
определения систематической принадлежности выращенных культур.
Издание предназначено преподавателям общеобразовательных учреждений и может
быть использовано при изучении разделов «Бактерии», «Грибы», «Простейшие»,
«Многообразие живого мира» в курсе биологии, подготовке к дополнительным и
факультативным занятиям, проведении элективных курсов в рамках эксперимента по
предпрофильной подготовке и профильном обучении.
Публикуется в авторской редакции
© Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В., 2007
2
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.………………………………………………………………..........................
1. КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ ПО СИСТЕМАТИКЕ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ………….
2. СИСТЕМА ВЫСШИХ ТАКСОНОВ ЖИВОГО МИРА И МЕСТО В НЕЙ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ……………………………………………….
2.1. СИСТЕМА ВЫСШИХ ТАКСОНОВ ЖИВОГО МИРА………………………….
2.2. ЦАРСТВО БАКТЕРИИ (BACTERIA)…………………………….…………………
2.3. ЦАРСТВО ПРОТИСТЫ (PROTISTA)…………………………………………….…
2.4. ЦАРСТВО ГРИБЫ (MYCOTA, MYCETALIA, MYCOPHYTA, FUNGI)………………...
2.5. ЦАРСТВО ВИРУСЫ (VIRA)………………………………………………………..
3. МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ………………………..
3.1. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ……………………………………………...
3.2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ……………………………………………………….…
3.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ………………………………...
3.3.1. Стерилизация, её правила и методы………………………………………..
3.3.2. Общие правила работы с культурами микроорганизмов и выделение
изолированных колоний…………………………………………………………...
3.4. МИКРОСКОПИРОВАНИЕ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ
МИКРОСКОПИРОВАНИЯ…………………………………………………………….
3.5. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОПЫТЫ……………………………………….……
3.5.1. Серия опытов «Микроорганизмы в окружающей среде»………………...
3.5.1.1. Выделение микроорганизмов из почвы и определение их количества в
почвенной пробе………………………………………………..
3.5.1.2. Выделение микроорганизмов из воды. Сравнение количества микробов в
водопроводной воде и воде, взятой из различных источников
3.5.1.3. Выделение микроорганизмов из воздуха. Сравнение количества микробов в
классе до и после занятия (проветривания), на улице и в парке
3.5.1.4. Выделение микроорганизмов с поверхностей бытовых предметов
3.5.1.5. Выделение микроорганизмов из пищевых продуктов……………...
3.5.2. Серия опытов «Микроорганизмы, обитающие на растениях»…………...
3.5.2.1. Получение культуры сенной палочки……………………………….
3.5.2.2. Получение культуры картофельной палочки……………………….
3.5.2.3. Выделение микроорганизмов, вызывающих болезни растений…...
3.5.3. Серия опытов «Микроорганизмы человеческого тела»…………………..
3.5.3.1. Выделение микроорганизмов с поверхности кожи человека. Влияние водных процедур на количество микробов на поверхности кожи
3.5.3.2. Демонстрация стерильности крови человека……………………….
3.5.4. Опыт «Источники питания микроорганизмов». Необходимость углерода, азота,
фосфора, микроэлементов для жизнедеятельности микроорганизмов. Источники этих
соединений…………………………………………………
3.5.5. Серия опытов «Влияние физических условий окружающей среды на микроорганизмы»…………………………………………………………………..
3
5
6
8
8
9
9
10
10
11
11
12
13
13
14
15
16
16
16
17
18
18
19
20
20
20
20
21
21
22
22
23
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
3.5.5.1. Влияние температуры на жизнедеятельность микроорганизмов….
3.5.5.2. Гибель микроорганизмов от высоких температур………………….
3.5.5.3. Влияние кислотности среды на жизнедеятельность микроорганизмов…………………………………………………………………………..
3.5.5.4. Влияние солёности среды на жизнедеятельность микроорганизмов
3.5.5.5. Влияние света на жизнедеятельность микроорганизмов…………..
3.5.5.6. Влияние кислорода на жизнедеятельность микроорганизмов. Отношение
микроорганизмов к кислороду…………….……………………
23
24
24
25
25
26
3.5.5.7. Влияние концентрации кислорода на жизнедеятельность микроорганизмов.
Сравнение ростовой активности дрожжей и нефтеокисляющих бактерий при разных уровнях аэрации…………………………………
26
3.5.6. Серия опытов «Влияние химических соединений на микроорганизмы»..
27
3.5.6.1. Влияние дезинфицирующих средств на жизнедеятельность микроорганиз27
мов…………………………………………………………………..
3.5.6.2. Влияние антибиотиков на микроорганизмы………………………..
3.5.6.3. Влияние фитонцидов растений на микроорганизмы……………….
3.6. МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЫРАЩЕННЫХ КУЛЬТУР…..
4. ИНТЕРЕСНЫЕ ФАКТЫ О МИКРООРГАНИЗМАХ И НЕ ТОЛЬКО О НИХ……..
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ……….…………………………………………………………..
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК…………………………………………………….
4
28
29
30
33
35
36
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
ВВЕДЕНИЕ
Земля полна произведений Твоих
Библия. Пс. 103: 24
Если ты стоишь достаточно высоко,
то должен воспитывать других к тому,
чтобы они поднялись наверх к тебе!
Ф. Ницше
В рамках программ по биологии, реализуемых в общеобразовательных учреждениях,
микробиологии, как её особому разделу, уделяется недостаточно внимания, в силу чего учащимися часто слабо усваиваются знания о микроорганизмах. Доступной литературы по данному
разделу в целом немало, но часто она узкоспециальна, не всегда отличается удачным сочетанием научности и доступности.
Одним из методов, позволяющих активизировать познавательную активность учащихся,
является проведение лабораторных и практических занятий, предусмотренных в школьном курсе биологии, но наблюдение за ростом и развитием культур микроорганизмов не предусматривается по нескольким причинам: сложность в приобретении материалов, отсутствие оборудования, несоответствие нормам СанПиН. Однако подобрать такие микробиологические опыты, которые не предусматривали бы ни специального оборудования, ни труднодоступных материалов
и не представляли никакой опасности для человека, возможно.
В данном издании содержатся сведения о безопасных с микробиологической точки зрения опытах, доступных вне лабораторных условий, с методическими указаниями по их проведению, а также необходимые сведения о современной системе живого мира, месте в ней микробиологических объектов, общих принципах систематики, способах и методах определения систематической принадлежности выращенных культур.
Тем не менее, обращаем внимание, что учащиеся могут быть привлечены ТОЛЬКО
к приготовлению питательных сред, стерилизации ДО НАЧАЛА опыта, постановке опыта и к осмотру полученных культур БЕЗ ОТКРЫВАНИЯ ЁМКОСТЕЙ, в которых производилось культивирование. Все процессы, связанные с открыванием ёмкостей с микробиологическими культурами (пересев, анализ культур, подготовка препаратов для микроскопирования, стерилизация ПОСЛЕ постановки опыта) производятся ТОЛЬКО учителем БЕЗ ПРИСУТСТВИЯ учащихся, в лаборантской и только в случае отсутствия у педагога аллергических реакций. Во всех остальных случаях применение данного набора
опытов НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ.
После каждого из опытов предлагаются вопросы и задания, которые учитель при постановке и анализе опыта может использовать для активизации познавательной активности учащихся, причём задания, связанные с открыванием ёмкостей с культурами и приготовлением
препаратов могут выполняться только в соответствии с изложенным выше.
Издание предназначено преподавателям общеобразовательных учреждений и может
быть использовано при изучении разделов «Бактерии», «Грибы», «Простейшие»,
«Многообразие живого мира» в курсе биологии, подготовке к дополнительным и
факультативным занятиям, проведении элективных курсов в рамках эксперимента по
предпрофильной подготовке и профильном обучении.
Замечания по структуре и содержанию издания просьба направлять на электронные адреса: volchenko.n@gmail.com, krishtopa@inbox.ru, nimchenkodv@list.ru.
5
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
1. КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ ПО СИСТЕМАТИКЕ
ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ
Живой мир Земли чрезвычайно разнообразен, и для того, чтобы ориентироваться в этом
многообразии, его элементы необходимо классифицировать, то есть распределить в
иерархически расположенные группы. Разделами биологии, занимающимися различными
аспектами данного распределения, являются систематика, таксономия и номенклатура.
Систематика – раздел биологии, задачей которого является изучение биологического
разнообразия, выявление, описание всех существующих и вымерших групп живых организмов
и их классифицирование согласно родственным взаимоотношениям. Теорией и практикой
описания и наименования живых организмов занимается таксономия. Номенклатура – это
система названий живых организмов и положений по образованию и употреблению этих
названий.
Основателем современной научной номенклатуры считается всемирно известный
шведский ученый Карл Линней (K. Linnaeus, K. Linne). В своем труде «Система природы» он
дал краткие характеристики всем известным в то время видам, родам, отрядам и классам
животных и растений. Книга Линнея выдержала двенадцать изданий при жизни автора и одно,
тринадцатое, посмертное издание. В настоящее время исходным (основным) считают десятое
издание, вышедшее в 1758г., в котором Линней впервые со всей строгостью применил для
каждого вида латинское название, составленное из двух слов – из родового и собственно
видового (к примеру, Bacillus subtilis). Латинское название из двух слов дается каждому виду
живого организма, распространенному в любой части земного шара, в стране, населенной
народом, говорящим на любом языке. За исходные принимают названия, данные видам именно
в десятом издании книги Линнея (1758). Все названия, в том числе и латинские, данные
различными авторами до 1758 г., в расчёт не принимаются. Латинское название рода всегда и
обязательно пишется с прописной (заглавной) буквы, а название вида – со строчной
(маленькой) буквы, если даже оно означает имя собственное. Слово, означающее название
вида, писать без родового или первой буквы родового названия не принято, но сокращение
родового названия до одной, двух или трех букв допускается. Для форма–таксонов (то есть
отдельных стадий) некоторых грибов разрешается использовать особые названия.
Вид является основной систематической (таксономической) категорией, но вместе с тем
представляет собой сложную биологическую систему. В настоящее время в науке принята
политипическая концепция вида (концепция широкого биологического вида), т.е.
подразумевается, что вид может быть представлен группами разнообразных по многим
морфофизиологическим признакам особей.
Для обозначения особых разновидностей иногда используют термины «varietas», морфа
– «morpha», форма – «forma». Считается, что, в отличие от подвида, морфа (как и раса) не
обязательно связана с определённым ареалом. В микробиологии также используют такие
термины, как «клон», «штамм».
Если один и тот же вид был описан авторами под разными названиями, то
действительным (валидным, законным) названием согласно правилу приоритета признаётся то,
которое было опубликовано в соответствии со всеми предъявляемыми требованиями ранее
других, более поздние названия считаются синонимами.
В систематических списках, монографиях и определителях, кроме полного латинского
названия, принято писать (тоже латинскими буквами) фамилию автора, впервые описавшего
данный вид или подвид и год этого (первого) описания. В написании общеизвестных фамилий
авторов допускаются сокращения до одной или нескольких букв (к примеру, Linnaeus, 1758
можно записать как L., 1758). Если фамилия автора неизвестна, то пишется «Anon.» (или
«Anonymous»), что означает неизвестность (анонимность (аnonymous)) автора. Если автор всё
же предполагается, то после «Anon.» пишется его фамилия в квадратных скобках. После
фамилии автора описания указывается год опубликования названия.
6
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
Многие живые организмы, особенно среди микроорганизмов, не имеют названий на
русском языке, поэтому их называют так, как читается по–русски их латинское научное
название. Часто русское название не соответствует дословному переводу с латыни; это
допускается. В случае, если биологический объект не удалось определить до вида, принято
записывать название рода, а после него – «sp.» («species» – вид).
К настоящему времени в биологии установилась система так называемых
таксономических (систематических) категорий, то есть ранговых названий, применяемых в
систематике (империя, царство, отдел (тип у животных), класс, порядок (отряд у животных),
семейство, род, вид). Основной таксономической категорией является вид. По современным
представлениям, вид – это группа близких между собой организмов, имеющих общее
происхождение и на данном этапе эволюции характеризующихся определенными
морфологическими, биохимическими и физиологическими признаками, обособленных отбором
от других видов и приспособленных к определенной среде обитания.
Помимо основных, ввиду сложности родственных взаимосвязей живых организмов,
применяют и дополнительные таксономические категории, обычно образуемые с помощью
префиксов «над–» и «под–». Какими именно должны быть суффиксы или окончания для
таксономических категорий тех или иных рангов – по этому поводу существуют разногласия.
Для некоторых (не для всех!) таксономических категорий предусмотрены стандартные
окончания, иногда отличающиеся в пределах разных царств (табл. 1, данные сведения
потребуются тем, кто пожелает изучить систематику углублённо). Группы организмов,
составляющие таксономическую категорию, называют таксонами. К примеру, «семейство» –
это таксономическая категория, а какое–либо конкретное семейство со всеми входящими в его
состав родами и видами – таксон.
В целом вопросы номенклатуры находятся в ведении международных комиссий,
регулярно выпускающих международные номенклатурные кодексы. К данным изданиям и
необходимо обращаться при разрешении спорных номенклатурных вопросов.
Таблица 1
Общепринятые стандартные окончания в латинских названиях таксонов
Таксономическая
категория
Царство
Отдел (тип)
Подотдел
(подтип)
Класс
Подкласс
Порядок
(отряд)
Подпорядок
(подотряд)
Надсемейство
Семейство
Подсемейство
Триба
Подтриба
Род
Вид
Царства живого мира
Бактерии,
Архебактерии
–
–
Протисты
Растения
Грибы
Животные
Вирусы
–
–
–
-phyta
–
-mycota
–
–
–
–
–
–
-phytina
-mycotina
–
–
–
–
–
–
–
–
-mycetes
-mycetidae
–
–
–
–
-ales
–
-ales
-ales
–
–
–
–
-ineae
-ineae
–
–
–
–
-acea
-acea
-oidea
–
-aceae
–
-aceae
-aceae
-idae
-viridae
-oideae
–
-oideae
-oideae
-inae
-virinae
–
–
–
–
–
–
–
–
-eae
-inae
–
–
-eae
-inae
–
–
-ini
-ina
–
–
–
–
-virus
–
7
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
2. СИСТЕМА ВЫСШИХ ТАКСОНОВ ЖИВОГО МИРА
И МЕСТО В НЕЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
2.1. СИСТЕМА ВЫСШИХ ТАКСОНОВ ЖИВОГО МИРА
В настоящее время нет общепринятой, признаваемой всеми учеными системы живого мира,
но имеется ряд систем, в разной степени принимаемых научной общественностью. Одна из
принятых точек зрения допускает подразделение живых организмов на семь царств,
относящихся к двум империям (табл. 2).
Таблица 2
Высшие таксоны живого мира
№
п.п.
Царства живого мира
3
4
5
6
Империя клеточные (Cellulata)
Надцарство доядерные (Procaryota)
Бактерии (Bacteria)
Архебактерии (Archaebacteria)
Надцарство ядерные (Eucaryota)
Протисты (Protista)
Растения (Plantae, Vegetabilia)
Грибы (Mycota, Mycetalia, Fungi)
Животные (Animalia, Zoa)
7
Вирусы (Vira)
1
2
Приблизительное
количество видов
5 000
110
66 000–120 000
290 000
53 000–62 000
1 – 2 млн
Империя доклеточные (Noncellulata)
более 1 600 *
____________
* Понятие «вид» для вирусов в полной мере неприменимо, более верно говорить о разновидностях
вирусов, группируемых в семейства. Бинарная номенклатура для вирусов не используется.
Некоторыми систематиками предлагаются иные варианты:
разделить представителей царства протисты (Protista) на три части: часть отнести в
качестве подцарства простейшие к царству животные, часть в качестве водорослей – к царству
растения, часть – к царству грибы; такая схема до недавнего времени в нашей стране была
общепринятой и до сих пор широко используется, особенно в учебной литературе для учащихся
общеобразовательных учреждений; с этим связано и несколько иное, чем в ряде литературных
источников, количество видов в табл. 2;
не считать вирусы формой живого на основании того, что у них отсутствует ряд свойств,
характерных для живых организмов.
Царства бактерии, архебактерии, вирусы традиционно изучают в курсе «Микробиология»,
низших представителей царства растения, царство грибы, часть групп царства протисты – в курсах
«Ботаника низших растений», высших представителей царства растения – в курсе «Ботаника
высших растений», часть групп царства протисты – в курсе «Зоология беспозвоночных», царство
животные – в курсах «Зоология беспозвоночных» и «Зоология позвоночных».
Протистов следует рассматривать в отдельном курсе «Протистология». Для их изучения
необходим унифицированный подход, так как их главное свойство – одноклеточный уровень
организации на всех стадиях жизненного цикла – позволяет судить об их гораздо большей
близости друг с другом, чем с многоклеточными растениями, животными или грибами. Однако
в настоящее время протисты должны быть объединены в единое царство «до выяснения
обстоятельств».
К микробиологическим объектам относятся представители пяти царств: бактерии (все
представители), архебактерии (все представители), грибы (некоторые группы), протисты
8
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
(большинство групп), вирусы (все представители). В рамках школы практически невозможно (и
не рекомендуется) выращивание архебактерий и большинства вирусов.
Таким образом, микробиологические объекты, которые возможно вырастить во внелабораторных условиях, относятся к царствам бактерии, протисты, грибы.
Подавляющее большинство предложенных в данном издании опытов будет связано с
представителями царства бактерии.
2.2. ЦАРСТВО БАКТЕРИИ (BACTERIA)
Тело имеет клеточное строение. Имеется обмен веществ, ряд клеточных органоидов. В
клетке одновременно присутствуют два типа нуклеиновых кислот – ДНК и РНК. Как правило,
свободноживущие, внутри- и межклеточные паразиты встречаются редко. Самостоятельно
синтезируют ферменты. Органо– и литотрофы.
Бактерии представляют собой одиночные клетки или простые ассоциации сходных
клеток размером в среднем от 0,2 до 10 мкм. Нуклеоплазма никогда не бывает отделена от
цитоплазмы ядерной мембраной. Клеточные мембраны двуслойные липопротеидные, часто
образуют разнообразные впячивания внутрь клетки. Липиды представлены триглицеридами.
Основной структурный компонент клеточной стенки многих бактерий – муреин.
Чувствительны к антибиотикам. Питание гетеро– или автотрофное. Представители ряда групп
способны к фото– и хемосинтезу, в качестве фотосинтетического пигмента присутствует
пигмент бактериохлорофилл или (у цианобактерий) хлорофилл а. Космополиты.
Современная классификация бактерий (используемая в классическом «Определителе
бактерий Берджи») в настоящее время составлена без учета филогении ввиду недостаточной
изученности родственных связей, и не все систематики придерживаются данной
классификации. Классификация Н.А. Красильникова (1949 г., с изменениями) считается
устаревшей, но тем не менее до сих пор встречается в некоторых справочных руководствах.
Бактерий около 5 000 видов (в том числе – около 2 000 видов цианобактерий), но
действительное количество, вероятно, во много раз больше.
Следует отметить, что не все бактерии культивируются в лаборатории и, тем более,
не все могут быть культивируемы и рекомендованы для культивирования вне лабораторных
условий.
2.3. ЦАРСТВО ПРОТИСТЫ (PROTISTA)
Протисты характеризуются следующими особенностями: ядро полностью обособленно от
цитоплазмы ядерной оболочкой, ядерная ДНК расположена линейно, имеются хромосомные
белки. Большинство представлено одноклеточными формами, но некоторые группы образуют
колонии либо существуют в виде многоядерных плазмодиев (так называемых симпластов).
Размножение бесполое (агамогония) и в той или иной мере связанное с половым процессом
(гамогония), у некоторых форм встречается так называемый одноступенчатый мейоз. По типу
питания протисты разнообразны: среди них имеются способные в фотосинтезу автотрофы,
имеющие пластидную систему и хлорофилл, обнаружены и протисты, способные к хемосинтезу,
однако большинство протистов являются гетеротрофами, питающимися готовой органикой.
Часть из них обладает голозойным типом питания (фагоцитоз и пиноцитоз), характеризующимся
образованием пищеварительных вакуолей. Другие протисты являются осмотрофами – поглощают
растворенную органику через покровы тела, при этом пищеварительные вакуоли не образуются.
Некоторые виды простейших способны к смешанному питанию. Общепринятой системы
протистов нет, но многими учёными принимается рабочая система С.А. Карпова. Около 66 000–
74 000 (вероятно, гораздо больше) видов.
Следует отметить, что не все протисты культивируются в лаборатории и, тем более,
не все могут быть культивируемы и рекомендованы для культивирования вне лабораторных
условий. Фактически в данных условиях могут быть выделены и (или) культивированы представители воротничковых жгутиконосцев, корненожек, многожгутиковых, ресничных, эвгленовых.
9
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
2.4. ЦАРСТВО ГРИБЫ (MYCOTA, MYCETALIA, MYCOPHYTA, FUNGI)
Клетки грибов с наружной клеточной стенкой, основу которой составляет хитин.
Гетеротрофы с пассивным абсорбционным способом питания, аэробы. Запасные вещества –
гликоген и жирные масла. Вегетативное тело – мицелий, состоящий из системы ветвящихся
нитей (гиф).
Общепринятой системы грибов нет, но обычно грибы рассматривают как
филогенетическую группу, подразделяя на 5 отделов. Некоторые систематики рассматривают
грибы как сборную группу, или царство с тремя подцарствами, считая грибами ряд отделов
протистов (в т.ч. слизевиков и оомицетов) (что до недавнего времени было общепринятым), или
как отдел в царстве растений (что является очень устаревшим и не соответствует современным
представлениям), и тогда отделы грибов считаются классами. Около 53 000 – 62 000 видов.
Следует отметить, что не все грибы культивируются в лаборатории и, тем более, не
все могут быть культивируемы и рекомендованы для культивирования вне лабораторий, но
фактически во внелабораторных условиях могут быть выделены и (или) культивированы
представители всех отдело. Особенно просто выращивание дрожжей – представителей
одной из групп аскомицетов.
2.5. ЦАРСТВО ВИРУСЫ (VIRA)
Тело не имеет клеточного строения. Имеется лишь один тип нуклеиновых кислот – ДНК
(кольцевая или линейная) или РНК, которые могут быть двуцепочечными или
одноцепочечными. Количество генов минимально – от 4 до 250 или несколько более. У
некоторых вирусов РНК представлена 10–12 фрагментами. Клеточных органоидов нет. Обмена
веществ нет. Являются облигатными клеточными паразитами. В среднем размеры вирусов
примерно в 50 раз меньше размера бактерий. Вирусы открыты в 1892 г. русским биологом
Д.И. Ивановским.
Общепринятой системы вирусов нет. Обычно вирусы классифицируют по типу
нуклеиновой кислоты (выделяя одно– и двуцепочечные ДНК– содержащие и одно– и
двуцепочечные РНК– содержащие вирусы) и разделяют на 54–86 и более семейств,
включающих рода и разновидности вирусов, обычно без группировки семейств в отряды и
классы (что в некоторых системах всё же предлагается). Вероятно, в будущем ранг семейств
вирусов может возрасти. Помимо этого, вирусы классически разделяют на вирусы животных,
растений, бактерий (бактериофаги, фаги). Построение филогенетической системы вирусов в
настоящее время не представляется возможным, вероятно полифилетическое происхождение
вирусов.
Предложена алфавитно–цифровая система называния вирусов (к примеру, фаг Т2).
Иногда вирусы классифицируют по типу симметрии, но эта классификация является
искусственной. Общепринятое понятие вида применимо не для всех семейств вирусов. Вирусы
являются единственной группой живых организмов, для которых не применяется бинарная
номенклатура. Следует отметить, что описание новых разновидностей вирусов идет достаточно
активно.
Кроме того, в природе встречаются вирусы, вызывающие так называемые медленные
инфекции, неклассифицированные вирусы, а также вирусоиды, представляющие собой
небольшие кольцевые молекулы РНК, заключенные в белковый капсид, и способные
реплицироваться лишь в присутствии вирусов – помощников.
Следует отметить, что не все вирусы в лаборатории могут быть культивируемы, и
опыты по культивированию вирусов проводить вне лабораторных условий не рекомендуется.
10
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
3. МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
Для проведения опытов даже вне лабораторных условий необходим некий минимум
оборудования и материалов (табл. 3), которые используются в предлагаемых опытах. В правой
части таблицы приведён перечень того, чем можно заменить лабораторное оборудование и
материалы.
Таблица 3
Необходимое лабораторное оборудование и материалы
и их возможная замена во внелабораторных условиях *
Необходимое лабораторное
оборудование и материалы
Ватно–марлевая пробка
Весы
Игла микробиологическая
Индикаторная бумага (рН)
Колбы
Красители для окрашивания
препаратов
Мерная посуда
Микробиологические пипетки
Микроскоп
Петля бактериологическая
Пробирки
Спиртовка
Стаканы химические
Ферментёр (биореактор)
Чашки Петри
Шпатель стеклянный
Чем можно заменить необходимое лабораторное
оборудование во внелабораторных условиях?
Ватно–марлевая пробка, изготовленная в домашних условиях
–
Металлическая игла на деревянном держателе
–
Стеклянные ёмкости, подходящие по объёму
Спиртовый раствор бриллиантового зелёного («зелёнка»)
Любая посуда с мерными делениями
Шприцы медицинские
–
Петля бактериологическая, изготовленная в домашних
условиях
–
–
Стеклянные ёмкости, подходящие по объёму
Ферментёр, изготовленный в домашних условиях
Невысокие стеклянные ёмкости с притёртой крышкой
(примерное соотношение диаметр/высота – 1/4 – 1/10)
«Г–образно» изогнутая металлическая проволока d=2–3 мм
_____________
* Знак «–» означает нежелательность замены; данное оборудование (материалы) обычно нетрудно найти в
кабинете биологии, химии, физики.
Для изготовления ватно–марлевой пробки плоский кусок ваты скатывают валиком между ладонями, обёртывают снаружи чистым куском марли, концы которой сверху закрепляют
нитью. Для обычной пробирки длина пробки должна быть около 4 см. Пробка должна входить в
пробирку на 1,5–2 см и не должна быть слишком плотной, что затруднило бы газообмен с
окружающей средой. Нельзя обертывать пробки материалами, не пропускающими пар, так как
при стерилизации среды не прогреются до нужной температуры.
Петля бактериологическая представляет собой фрагмент металлической проволоки
(диаметром 0,5–1 мм, длиной 7–8 см), прикрепленной к деревянному держателю длиной
12–15 см. Свободный конец проволоки загибают в виде кольца диаметром 2–3 мм, которым и
захватывают небольшое количество микробной массы.
Ферментёр необходим для непрерывного культивирования микроорганизмов при некоторых опытах, требующих дополнительного перемешивания и (или) подачи воздуха (среды).
Простейший ферментёр представляет собой стеклянную банку объёмом 1–3 л, накрываемую
капроновой крышкой с тремя отверстиями, предназначенными для следующих целей: первое –
для пропускания воздухоподающей трубки, присоединённой к аквариумному компрессору,
второе – для выхода лишнего воздуха (заткнуто ватой), третье – для отбора проб тонкой пипеткой либо добавления чего–либо внутрь ферментёра.
11
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
3.2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Питательные среды служат для выделения из исследуемого материала культур микробов
и изучения их свойств. В состав сред должны входить необходимые для построения клетки
элементы: азот, углерод, водород, кислород, фосфор, калий, сера, натрий, магний, железо, микроэлементы.
По составу питательные среды делят на натуральные (естественные) и синтетические
(искусственные). Натуральные среды состоят из продуктов животного и растительного происхождения, имеющих неопределённый химический состав. В состав синтетических сред входят только
определенные химические соединения, взятые в точно указанных количествах и соотношении.
По консистенции среды разделяются на плотные, жидкие и сыпучие. Плотные питательные среды готовят из жидких путем прибавления к ним загущающих веществ. Сыпучие среды
используются в промышленной микробиологии. Для постановки опытов, предлагаемых в данном пособии, потребуются натуральные и синтетические питательные среды, жидкие и плотные
по консистенции. На выбор, определяемый Вашими возможностями, авторы предлагают несколько вариантов натуральных питательных сред (жидких и плотных).
К так называемым жидким питательным средам относятся мясная вода, молоко (в виде
раствора), растительные отвары.
Мясная вода – жидкая натуральная питательная среда, используемая для культивирования гетеротрофов. Готовится из мяса, которое пропускают через мясорубку; 0,25 кг полученного мясного фарша заливают 0,5 л водопроводной воды и кипятят в течение часа (наблюдая за
процессом и при необходимости доливая воду). Затем среду фильтруют через ватно-марлевый
фильтр до полной прозрачности, доливают воду до первоначального объема и стерилизуют
тиндализацией (см. 3.3.1).
Молоко. Для приготовления данной среды следует использовать коровье молоко с минимальной жирностью. Молоко стерилизуют продолжительным (1 час) кипячением в скороварке.
Молоко является благоприятным субстратом для развития грибов и гетеротрофных бактерий.
Растительные отвары готовят следующим образом: 100 г измельченной растительной
массы (к примеру, молодых побегов травянистых растений) заливают 1 л воды и кипятят 30
мин. Затем среду фильтруют через вату и фильтровальную бумагу. Стерилизовать растительные отвары лучше тиндализацией. На отваре бобовых хорошо развиваются многие бактерии и
плесневые грибы, на отварах овощей и фруктов – дрожжи и плесневые грибы.
В каждую из предложенных сред можно добавлять дрожжевую воду как источник витаминов и микроэлементов, удовлетворяющий питательные потребности большого количества
видов микроорганизмов. Для приготовления дрожжевой воды берут 70 г прессованных
дрожжей, кипятят 30 мин в 1 л воды. Верхний прозрачный слой сливают и фильтруют. Доливают воду до первоначального объема и стерилизуют тиндализацией. Культивирование дрожжевых грибов рекомендуется проводить на натуральных питательных средах, в том числе на
мясной воде, молоке и растительных отварах с добавлением сахара. Рост дрожжей также можно
получить на минеральной среде с добавлением сахара в качестве источника углерода.
Минеральная среда состоит из дистиллированной воды и растворенных в ней минеральных солей, необходимых для жизнедеятельности культивируемых микробов. Рост гетеротрофов
на минеральной среде возможен после внесения органического источника углерода.
В культивировании микроорганизмов используют минеральные среды следующего состава (в граммах на 1 л воды): NH4Cl – 1, K2HPO4 – 0,5, MgSO4 x 7 H2O – 0,5, CaCO3 – 20–30, либо
KNO3 – 4, KHPO4 – 0,6, Na2HPO4 x 12 H2O – 1,4, MgSO4 x 7 H2O – 0,8. После внесения всех компонентов рекомендуется проверить кислотность полученной среды с помощью индикаторной
бумаги; среда должна быть нейтральной. Если это не так, необходимо добавить кислоту (при щелочной среде) или щёлочь (при кислой среде) и ещё раз проверить pH индикаторной бумагой.
Любую жидкую питательную среду можно превратить в плотную, добавив определённые загущающие вещества – агар, желатин, крахмал.
Агар чаще всего добавляют к средам в количестве 2%, при этом образуется гель, плавящийся при температуре +100оС и затвердевающий при +40оС. Продажей агара в г.Краснодаре
12
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
занимаются, в частности, фирмы «Эталон» (Элеваторный пер., 2, тел. 259-68-04, 254-18-92),
«Экрос» (Кузнечная ул., д. 39-а, тел. 256-81-63, 256-81-64). Агар достаточно дорог, но небольшого его количества хватает надолго.
Желатин добавляют в среду в количестве 15%. Работать с желатинсодержащей средой следует при температуре не выше комнатной (температура плавления желатина +25оС). Желатиновую
среду стерилизуют тиндализацией, но излишне продолжительное и многократное нагревание среды с желатином приводит к тому, что при остывании она перестает затвердевать. При температуре
воздуха выше +250С для лучшего застывания концентрацию желатина можно увеличить до 45%.
Крахмал вносят в состав нагретой питательной среды при помешивании в количестве
12–13 г на 100 мл. Недостатком сред с крахмалом является мутность и необратимость затвердевания. Стерилизацию проводят тиндализацией.
Применение каждого из вышеперечисленных веществ в качестве загустителей сред имеет свои преимущества и недостатки. Перед постановкой экспериментов рекомендуется провести ряд параллельных опытов по выращиванию микроорганизмов на средах с различными загустителями, что позволит выявить, на какой среде лучше растут культуры, какой из возможных
способов стерилизации наиболее эффективен, приготовление какой среды вызывает наименьшие трудности.
3.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Обращаем внимание, что учащиеся могут быть привлечены ТОЛЬКО к приготовлению питательных сред, стерилизации ДО НАЧАЛА опыта, постановке опыта и к
осмотру полученных культур БЕЗ ОТКРЫВАНИЯ ЁМКОСТЕЙ, в которых производилось культивирование. Все процессы, связанные с открыванием ёмкостей с микробиологическими культурами (пересев, анализ культур, подготовка препаратов для микроскопирования, стерилизация ПОСЛЕ постановки опыта) производятся ТОЛЬКО учителем
БЕЗ ПРИСУТСТВИЯ учащихся, в лаборантской и только в случае отсутствия у педагога
аллергических реакций. Во всех остальных случаях применение данного набора опытов
НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ.
3.3.1. Стерилизация, её правила и методы
Стерилизация – уничтожение живых микроорганизмов. Стерилизуют среды, лабораторную посуду и инструменты. Термическую стерилизацию можно проводить прокаливанием и
обжиганием (к примеру, горлышек колб и пробирок) в пламени спиртовки, горячим воздухом,
насыщенным паром под давлением (автоклавированием) и так называемой тиндализацией
(дробной стерилизацией).
Наиболее надежный способ стерилизации – стерилизация насыщенным паром под давлением. Способ основан на нагревании питательных сред и посуды до температуры более
+100оС за счет создания внутри автоклава давления выше атмосферного, при этом погибают как
вегетативные клетки, так и споры микроорганизмов. Вне лаборатории создать условия, сходные
с условиями внутри автоклава, можно с помощью обычной скороварки. В наполненной водой
скороварке стерилизуют среды и инструменты, прогревая до температуры +110оС в течение 30–
40 мин. Стерилизацию питательных сред рекомендуем проводить также тиндализацией, пастеризацией или длительным (1–2 часа) кипячением.
Тиндализация (дробная стерилизация) применяется для стерилизации сред, портящихся
под действием температур более +100оС. Проводят трехкратное нагревание среды при нормальном давлении (на «водяной бане» в парах кипящей воды 3 раза по 30–40 минут), а в период
между нагреваниями (8–12 часов) дают прорасти (при температуре около +30оС) жизнеспособным спорам бактерий, которые погибают при последующем прогревании. Использование метода вне лаборатории хорошо тем, что не требует сложного оборудования, работы с высокими
температурами и давлением.
Однократный прогрев материала при температурах не выше +100оС известен под названием пастеризации. Метод предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микробов,
13
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
поэтому в большинстве случаев не обеспечивает стерильности. Пастеризацию проводят на «водяной бане» при температуре +60…+80оС в течение 10–30 минут.
Стерилизуемые среды наливают не выше чем на половину высоты сосуда. Посуду со
средами закрывают ватно-марлевыми пробками, которые предохраняют среду от заражения
микрофлорой воздуха, горлышко сосуда закрывают бумагой, которую закрепляют завязками из
ткани. Стерилизуют одним из вышеописанных способов.
До застывания среды разливают в стерильные чашки Петри, пробирки и иные ёмкости,
предназначенные для культивирования микроорганизмов. Для получения так называемой скошенной среды пробирку заполняют не более чем на 1/3, стерилизуют, после чего пробирки
устанавливают наклонно под углом 200–300 и оставляют до застывания среды.
Посуда и инструменты перед стерилизацией должна быть тщательно вымыты и завернуты в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. Посуду разворачивают непосредственно перед употреблением. Пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги, обматывая
ею по спирали с конца, который опускается в среду. Чашки Петри, другие ёмкости – заворачивают каждую отдельно или по 2–3 штуки. Шпатели также стерилизуют завёрнутыми в бумагу.
Следует отметить, что методы стерилизации посуды и инструментов необходимо подбирать, исходя из условий опытов, предложенных в данном издании, и собственных возможностей. Например, для получения чистых культур микроорганизмов оптимальной является тиндализация.
По правилам работы с микроорганизмами стерилизацию также необходимо производить
и по окончании опытов. Запрещено сливать живые культуры микроорганизмов в канализацию,
выбрасывать в контейнеры с бытовыми отходами. Лучшим способом стерилизации является
кипячение: ёмкости с выращенными культурами микроорганизмов необходимо прокипятить в
какой–либо выделенной специально для этих целей и помеченной несмываемой краской
посуде (к примеру, кастрюле) на водяной бане не менее 2 ч. В воду, используемую для кипячения, можно добавить соду или стиральный порошок. После проведения процесса кипячения и
охлаждения жидкую часть отходов сливают в канализацию, твёрдую – помещают в полиэтиленовый пакет и выбрасывают в мусорный контейнер. Все ёмкости, контактировавшие с уничтоженными культурами микроорганизмов, тщательно моют водой с добавлением моющих
средств. Особенно тщательно необходимо стерилизовать ёмкости, в которых находились среды
с мясным бульоном, культивировались микроорганизмы с поверхностей, контактировавших с
человеком, а также ёмкости, в которых наблюдался рост грибов (см. 3.6.).
3.3.2. Общие правила работы с культурами микроорганизмов
и выделение изолированных колоний
В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают в пробирках, колбах, чашках
Петри, иных ёмкостях на жидких и плотных питательных средах. При пересеве микроорганизмов
с одной среды на другую или при извлечении клеток для приготовления препарата пользуются
бактериологической петлей. При работе необходимо соблюдать условия, предохраняющие
культуру от загрязнения другими микроорганизмами. Поэтому материал необходимо отбирать
простерилизованной бактериологической петлёй. Стерилизуют петлю, прокаливая докрасна её
металлическую часть в пламени спиртовки. Прикосновение к культуре (материалу) слишком
горячей петли может повредить клетки. Остудить петлю можно, прикоснувшись ею к внутренней
поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток.
Для извлечения микроорганизмов из пробирки (чашки Петри, иной ёмкости) (рис. 1) её
берут в левую руку таким образом, чтобы была видна вся поверхность среды. В правую руку
берут петлю так, как держат карандаш, и прокаливают её в пламени спиртовки. Затем мизинцем
правой руки, не выпуская петли, прижимают ватно-марлевую пробку к ладони, вынимают её из
пробирки и держат так во время последующих манипуляций. Края открытой пробирки
обжигают в пламени спиртовки и после этого вводят в пробирку стерильную петлю. Взяв
небольшое количество микробной массы, вынимают петлю из пробирки. Горлышко пробирки
обжигают в пламени спиртовки, пробирку закрывают пробкой и ставят в штатив. Если
14
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
пересевают на плотную среду, петлю вводят в ёмкость до дна и скользящим движением по
скошенной поверхности среды наносят от одной стенки пробирки к другой. При пересеве на
жидкие среды петлю с засевным материалом погружают непосредственно в среду. Оставшиеся
на петле после посева клетки микроорганизмов сжигают в пламени спиртовки при
прокаливании. Сходным образом производят манипуляции при посеве в чашки Петри (рис. 2) и
иные ёмкости.
При пересеве жидкой культуры и приготовлении
препарата можно использовать стерильную пипетку или
шприц. Пипетку освобождают от бумаги, в которой она
стерилизовалась, начиная с верхнего конца. Отбор
жидкой культуры пипеткой производится с помощью
резиновой груши. Шприц следует аккуратно извлечь из
асептичной
упаковки
непосредственно
перед
использованием. Все манипуляции следует проводить
около пламени спиртовки и по возможности быстро,
Рис. 1. Посев из одной пробирки в другую
чтобы
не
загрязнить
культуру
посторонней
(Селибер и др., 1953)
микрофлорой. Следует избегать резких движений около
работающего с чистой культурой человека, так как
движение воздуха увеличивает вероятность случайного
заражения культуры.
Выделение чистой культуры микробов является
обязательным этапом серьёзного микробиологического
Рис. 2. Работа с чашкой Петри
исследования, но вне лабораторных условий не
(Практикум по микробиологии, 1976)
обязательно. Чистая культура может быть получена из
отдельной колонии, а изолированная колония развивается из одной клетки. Выделение
изолированных колоний удобнее проводить на плотных питательных средах. Материалом
могут быть почва, вода, продукты питания, культуры микробов, пересеваемые с жидких и
плотных питательных сред. Жидкий исследуемый материал для посева набирают петлей или
пипеткой, шприцем, плотный – петлей. Высев на поверхность плотных питательных сред
проводят непосредственно из исследуемого материала или из его разведений в стерильной воде.
Разведения делают таким образом, чтобы получить на поверхности среды изолированные
колонии (см. 3.5.1.1). При посеве приоткрывают ёмкости и на поверхность среды наносят
каплю исследуемого материала (его разведения) петлей, пипеткой или шприцем. Нанесенную
каплю распределяют стеклянным стерильным шпателем (рис. 2).
Посев в ёмкости петлёй на среду (штриховой способ) осуществляется следующим
образом: засевной материал или его разведение набирают петлёй, проводят зигзагообразную
линию или параллельные штрихи через всю поверхность плотной питательной среды.
После посева ёмкости устанавливаются в специально подготовленные места, чашки
Петри переворачивают крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на
крышке, не помешала получить изолированные колонии.
3.4. МИКРОСКОПИРОВАНИЕ.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ
Подготовка препаратов для микроскопирования производятся ТОЛЬКО учителем
БЕЗ ПРИСУТСТВИЯ учащихся, в лаборантской и только в случае отсутствия у педагога
аллергических реакций. Во всех остальных случаях применение данного набора опытов
НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ.
Наблюдение за микроорганизмами с помощью микроскопа ведется на заранее
приготовленных препаратах. Препараты готовят на предметных стёклах, тщательно вымытых и
обезжиренных спиртом.
Приготовление живых препаратов проводят с помощью методов так называемых
раздавленной и висячей капель. Для приготовления препарата «раздавленная капля» небольшой
15
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
объём суспензии клеток (см. «Словарь терминов») наносят на предметное стекло, сверху кладут
покровное стекло и препарат готов.
Для приготовления препарата «висячая капля» небольшой объём суспензии клеток
наносят на покровное стекло, переворачивают его каплей вниз и помещают его на предметное
стекло с углублением в центре. Капля должна не касаться краев и дна лунки. Препарат «висячая
капля» используют для наблюдения за размножением микроорганизмов, образованием спор,
подвижностью. При отсутствии предметных стёкол с углублением можно воспользоваться
следующим приёмом: из картона вырезается квадратик таких же размеров, как покровное
стекло, в центре квадратика делается отверстие. Квадратик предварительно кипятят в воде, а
затем мокрым накладывают на предметное стекло. Сверху на квадратик кладут покровное
стекло так, чтобы капля оказалась в центре отверстия.
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок.
Небольшое количество исследуемого материала распределяют тонким слоем по поверхности
предметного стекла. Материал берут бактериологической петлей или пипеткой, шприцем,
наносят на стекло и равномерно размазывают по поверхности стекла. Приготовленный на
предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Для
фиксации препарат несколько раз проводят над пламенем спиртовки, держа предметное стекло
мазком вверх. После фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла и при окраске клетки
не смываются.
При простых способах окраски микроорганизмов применяется какой-нибудь один из
красителей: фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, бриллиантовый зеленый. Во
внелабораторных условиях рекомендуется использовать раствор бриллиантового зелёного
(«зелёнка»): 1 мл 1% спиртового раствора разбавляют 10 мл дистиллированной воды.
Фиксированный препарат обливают раствором красителя из пипетки. Сроки окрашивания
указанными красителями колеблются от 1 до 3–5 минут.
Микроскоп для микроскопирования настраивают общепринятым способом.
3.5. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОПЫТЫ
Обращаем внимание, что учащиеся могут быть привлечены ТОЛЬКО к
приготовлению питательных сред, стерилизации ДО НАЧАЛА опыта, постановке опыта
и к осмотру полученных культур БЕЗ ОТКРЫВАНИЯ ЁМКОСТЕЙ, в которых
производилось культивирование. Все процессы, связанные с открыванием ёмкостей с
микробиологическими культурами (пересев, анализ культур, подготовка препаратов для
микроскопирования, стерилизация ПОСЛЕ постановки опыта) производятся ТОЛЬКО
учителем БЕЗ ПРИСУТСТВИЯ учащихся, в лаборантской и только в случае отсутствия у
педагога аллергических реакций. Во всех остальных случаях применение данного набора
опытов НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ.
3.5.1. Серия опытов «Микроорганизмы в окружающей среде»
Микроорганизмы являются самыми многочисленными обитателями окружающего нас
мира. Миллионы бактерий, вирусов, микроскопических грибов, протистов постоянно находятся
в почве, воде, воздухе, на поверхности всех предметов, в организме человека, животных, растений. В данном разделе приведены эксперименты, позволяющие выделить микробов, обитающих в различных средах, сравнить их количество и разнообразие.
3.5.1.1. Выделение микроорганизмов из почвы и
определение их количества в почвенной пробе
Много ли микробов в почве? Чрезвычайно много! Их там больше, чем где-либо ещё.
Почва является своеобразным «инкубатором микробов», в ней существуют условия, наиболее
благоприятные для их жизнедеятельности: наличие воды, питательных веществ, отсутствие
16
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
резких колебаний температуры, кислотности, др. Микробное разнообразие почв максимально
среди всех сред жизни, в почве осуществляются всевозможные превращения различных соединений, благодаря чему поддерживается её плодородие.
Оборудование и материалы. Колба с 50 мл стерильной воды – 1 шт., пробирки со стерильной водой (9 мл) – 6 шт., стерильные микробиологические пипетки или шприцы объёмом
1 мл – 8 шт., пронумерованные ёмкости с плотной питательной средой – 5 шт., стеклянный
шпатель – 1 шт, спиртовка, весы.
Ход опыта. Пробу почвы массой около 5 г (взятую из цветочного горшка с комнатным
растением) высыпают в колбу со стерильной водой и перемешивают путём встряхивания в течение 5–10 мин. При этом микроорганизмы, находящиеся в почве, переходят с почвенных частиц в водную среду. Оставляем колбу в покое на 5 минут, чтобы почва осела. Затем, соблюдая
условия стерильности, отбираем пипеткой или шприцем 1 мл жидкости и выливаем её в пробирку № 1. В почве содержится очень много микробов и если воду с бактериями капнуть сразу
на плотную питательную среду, их выросшие колонии покроют поверхность ёмкости с плотной
питательной средой сплошным газоном, в котором невозможно будет отличить отдельные колонии бактерий. Растворяя 1 мл водной вытяжки из почвы в 9 мл чистой стерильной воды, мы
уменьшаем исходную концентрацию микробов в 10 раз. Вращая пробирку между ладонями,
тщательно перемешиваем её содержимое, затем аналогично отбираем из неё 1 мл жидкости
(другой стерильной пипеткой или шприцем!) и переносим в пробирку с водой № 2 – исходный
миллилитр почвенной вытяжки мы разбавляем таким образом уже в 100 раз. Из второй пробирки, перемешав содержимое, переносим 1 мл в пробирку № 3, разбавив соответственно в 1 000
раз и так вплоть до пробирки № 7. Таким образом, если представить, что в 1 мл исходной почвенной вытяжки содержалось 107 клеток/мл, то в пробирке № 1 – 106, в № 2 – 105, в № 3 – 104 и
так до № 6 – 10. Для приготовления каждого разведения используем чистую стерильную пипетку (шприц), так как к их стенкам могут прилипнуть бактерии из первых разведений с более высокой концентрацией и исказить картину в более разбавленных разведениях. Из пробирок с № 6
по № 3 стерильно отбираем по 1 мл жидкости (в обратном порядке одной пипеткой или шприцем), выливаем в соответствующе подписанные ёмкости с плотной питательной средой и аккуратно размазываем стерильным шпателем по поверхности среды.
Через 1–3 суток осматриваем ёмкости: в некоторых колоний проросших бактерий нет
вообще (слишком сильное разбавление), в некоторых – сплошной газон роста (недостаточное
разбавление). В некоторых же наблюдаются отдельные изолированные колонии, которые можно рассмотреть и сделать из них препараты для микроскопирования. Подсчитав количество колоний на чашке и умножив на степень разведения, мы можем вычислить, сколько микробов содержалось в исследованном нами образце почвы (например: в чашке засеянной из пробирки
№ 3 (разведение в 10 000 раз) выросло 130 колоний, умножаем 130 х 104 = 1 300 000 = 1,3 х 106
клеток/г, т.е. в 1 грамме почвы содержалось один миллион триста тысяч бактерий).
Вопросы и задания. Как вы думаете, почему именно в почве условия для размножения микроорганизмов так благоприятны?
3.5.1.2. Выделение микроорганизмов из воды. Сравнение количества микробов
в водопроводной воде и воде, взятой из различных источников
Вода является менее благоприятной средой для жизни микроорганизмов, чем почва, однако в ней всегда содержится некоторое количество микробов. Если же вода содержит достаточное количество питательных веществ (например, в водоёмах со стоячей водой – болотах,
прудах, в каплях воды на немытой посуде), то микробы в ней могут активно развиваться. Особенно загрязнены водоёмы, куда производится сброс сточных вод населённых пунктов. Водопроводная питьевая вода специально дезинфицируется (обычно хлором) и в норме содержит
минимум микроорганизмов.
Оборудование и материалы. Стерильные пробирки – 2 шт., ёмкости с плотной питательной средой – 2 шт., зажигалка.
17
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
Ход опыта. Для опыта возьмём образцы воды из школьного крана и, к примеру, из вазы
со срезанными цветами. Воду следует набирать в стерильные пробирки по 10–15 мл. При наборе воды из крана его следует перед этим обработать пламенем зажигалки (для уничтожения
микробов на поверхности) и дать протечь воде 5 минут. В ёмкости с плотной питательной средой стерильно пипеткой или шприцем вносим 1 мл (чашка № 1) и 0,1 мл (чашка № 2) исследуемой воды. Равномерно распределяем воду по поверхности плотной среды стерильным стеклянным шпателем и оставляем на 1–3 суток. Сравниваем количество выросших микробных колоний воды из разных источников, вычисляем содержание бактерий в исходных образцах по методике предыдущего опыта (например: из 0,1 мл воды выросло 35 колоний, значит в исходном
миллилитре было 35 х 10 = 350 клеток микробов). Если воды была сильно загрязнена – количество колоний будет очень велико и не будет поддаваться подсчёту. В этом случае можно сделать серию десятикратных разведений 1 мл воды, как описано в предыдущем опыте и сделать
посев из них. Питьевая вода считается чистой, если общее количество бактерий в 1 мл не более
100, сомнительной – 100–150, загрязнённой – 500 и более.
Вопросы и задания. Где больше разнообразие колоний микроорганизмов – в воде из
крана или в воде из вазы с цветами и почему?
3.5.1.3. Выделение микроорганизмов из воздуха. Сравнение количества микробов в классе
до и после занятия (проветривания), на улице и в парке
Есть ли микробы в воздухе? Ну конечно есть! Но всё же воздух является довольно неблагоприятной средой для жизни микроорганизмов имеет питательный веществ, содержит
очень мало воды, выше интенсивность губительных для бактерий солнечных лучей). Микрофлору воздуха составляют микробы, попадающие в него из различных источников – от человека, из почвы и т.д. Некоторое время микробы находятся в воздухе, постепенно погибая. Соответственно, больше концентрация микробов в воздухе помещений, на улицах городов, в местах
скопления людей. Проветривание, влажная уборка, обработка ультрафиолетом снижают количество микробов.
Оборудование и материалы. Ёмкости с плотной питательной средой – 1–2 шт.
Ход опыта. Одна – две ёмкости с плотной питательной средой открыть на 5 мин в помещении класса до начала урока, другие 1–2 ёмкости – в этом же помещении после окончания
уроков (или после каждого урока, чтобы более точно определить динамику загрязнённости воздуха). Считается, что за 5 минут на 100 см2 поверхности оседает столько микробов, сколько их
содержится в 10 м3 воздуха. Исходя из этого соотношения и рассчитав площадь поверхности
ёмкости, вычисляем концентрацию микроорганизмов в 1 м3 воздуха.
Вопросы и задания. Сравните микробную заражённость воздуха на улице с интенсивным движением и в парке, лесу или роще. Как Вы думаете – где она будет больше? Что вы знаете о фитонцидах растений? По результатам вычислений содержания
микроорганизмов в воздухе в разных условиях, сделайте выводы о причинах
его загрязнения и возможных методах противодействия этому. Обратите внимание, что многие
колонии имеют желто-оранжевую окраску: цветные пигменты бактерий являются их защитой
от губительных ультрафиолетовых лучей.
3.5.1.4. Выделение микроорганизмов с поверхностей бытовых предметов
Микроорганизмы неплохо себя чувствуют на всевозможных окружающих человека
предметах, особенно на тех, которых люди часто касаются или где содержатся органические
вещества – дверных ручках, столах, водопроводных кранах, автобусных поручнях, стенках холодильников, любимых игрушках. В целом это не страшно, так как человек сосуществует с
микробами на протяжении всего периода своего эволюционного развития и обладает естественным иммунитетом ко многим из них. Опасность представляет ситуация, когда микробов
на предметах общественного пользования становится слишком много в силу нарушения правил
общественной и личной гигиены, когда они могут попасть в пищу, воду. Другой неприятный
18
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
случай – когда в популяции людей происходит активное распространение болезнетворных микроорганизмов. В данном опыте мы исследуем микробную заражённость предметов обихода, на
которые происходит активный перенос микроорганизмов.
Оборудование и материалы. Пробирки со стерильной жидкой питательной средой
(1/3 объёма) – по количеству проб, пробирки, доверху наполненные стерильной водой – 1–2
шт., стерильные палочки с ватой (готовый гигиенический набор или сделать самостоятельно из
проволоки и ваты) – по количеству проб. Палочки с ватой можно простерилизовать часовым
выдерживанием в пару над кипящей водой, предварительно завернув в бумагу.
Ход опыта. Посев производим следующим образом: достаём из бумаги стерильную палочку, смачиваем вату в пробирке со стерильной водой и аккуратно касательными движениями
трём ватной частью о поверхность предмета, с которого отбираем пробу. Далее аккуратно и
максимально стерильно открываем пробку на пробирке с жидкой средой и погружаем туда палочку так, чтобы вата была полностью погружена в среду и оставляем там.
Засеянные пробирки помещаем в тёплое место и просматриваем каждые сутки, отмечая
появление признаков роста бактерий – помутнение среды, появление в ней хлопьев, осадка,
плёнки, пузырьков газа. По времени начала и интенсивности роста можно судить о сравнительной загрязнённости исследуемых объектов. Из пробирок с активным микробным ростом можно
отобрать пробы для микроскопирования.
В качестве объекта для исследования рекомендуем использовать поверхность парт, ручки дверей, посуду, внутренние поверхности холодильника. Можно провести сравнение загрязнённости различных кнопок компьютерной клавиатуры: наиболее часто используемые кнопки
содержат больше микробов.
Вопросы и задания. В пробах, куда посеяли более загрязнённый смыв, рост будет
не только более значительным, но и начнётся раньше. Почему?
3.5.1.5. Выделение микроорганизмов из пищевых продуктов
Микробы успешно обитают и в пищевых продуктах, производимых и потребляемых человеком. В одних случаях это – нормальная микрофлора, необходимая для приготовления продуктов (например, простокваши, йогуртов, сыров), в других – её наличие нежелательно, хотя и
возможно. В любом случае, количество микроорганизмов в пище должно быть не выше определённых значений, которые строго регламентированы. Если микроорганизмов слишком много
– возникает подозрение в недоброкачественности исследуемого продукта и необходимы дополнительные исследования его микрофлоры на патогенность.
Оборудование и материалы. Ёмкости с плотной питательной средой – 4 шт., стерильная ступка и пестик для растирания (можно использовать простерилизованные ложку и глубокую тарелку), стерильная водопроводная вода – 90 мл, стерильные микробиологические пипетки или шприцы (1 мл) – 8 шт., пробирки с 9 мл стерильной воды – 4 шт.
Ход опыта. Метод подготовки проб зависит от того, какой консистенции исследуемый
нами продукт. Если он твёрдый (сыр, творог, мясо, фарш, колбаса) – отбираем навеску продукта массой 10 г из разных мест исследуемого образца, взвешиваем её на весах и тщательно растираем в ступке, понемногу добавляя 90 мл стерильной воды. Оставляем на несколько минут,
затем отбираем пипеткой или шприцем 1 мл полученной взвеси продукта в воде. Если продукт
жидкий (молоко, сливки, соки, прочие напитки), то сразу стерильной пипеткой или шприцем
отбираем 1 мл жидкости. Отобранный миллилитр жидкого продукта или его водной взвеси стерильно переносим в пробирку с 9 мл воды и перемешиваем, получив разведение исходного образца в 10 раз. Далее готовим серию разведений до 10-4 как описано в опыте «Выделение микроорганизмов из почвы и определение их количества в почвенной пробе». Для переноса 1 мл
жидкости в каждую последующую пробирку используем только чистую стерильную пипетку
или шприц. Посев в ёмкости с плотной питательной средой осуществляем из пробирок № 7 –
№ 1 в обратном порядке, одной пипеткой или шприцем. Нанесенную на поверхность плотной
среды жидкость аккуратно растираем стерильным стеклянным шпателем по всей площади чаш-
19
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
ки и оставляем на 2–5 суток. Подсчитываем количество выросших колоний. Умножив количество колоний на степень разведения (см. 3.5.1.1.).
Приблизительно считается, что нормальным количеством микроорганизмов в 1 г (1 мл)
является: в сыром молоке – до 104–106, пастеризованном молоке – до 103–104, сырах плавленых
– до 103, мороженном – до 105, мясе и фарше – до 105–106, колбасах варёных – до 103.
Вопросы и задания. Проведите исследование с сырым и прокипячёным молоком,
сырым и вареным мясом и другими продуктами и выясните, как влияет термическая
обработка на количество микроорганизмов в этих продуктах.
3.5.2. Серия опытов «Микроорганизмы, обитающие на растениях»
Микроорганизмы успешно обитают на растениях, которые содержат как собственную
постоянную, так и случайную микрофлору. Некоторые из микробов являются безопасными
спутниками для растений, некоторые – патогенны и вызывают их болезни.
3.5.2.1. Получение культуры сенной палочки
Оборудование и материалы. Ёмкость со 100 мл воды, сено – 10 г, ватный фильтр – 1 шт.
Ход опыта. Возьмите 10 г сена, поместите его в ёмкость с 100 мл воды и прокипятите в
течение 20–30 минут. Полученный настой перелейте в стакан или банку через ватный фильтр.
Закройте стакан стеклом и выдерживайте в тёплом месте 3–4 дня при температуре +25…+300С).
Постепенно жидкость помутнеет, а затем покроется белой плёнкой. Это и будет культура сенной палочки Bacillus subtilis. Промикроскопировав пробы жидкости, вы увидите подвижные палочкообразные бактерии, можно увидеть и споры бактерий. Споры – это покоящиеся клетки,
пережидающие неблагоприятные условия и покрытые специальной оболочкой, выделяемой самой бактерией. Если под покровное стекло с живыми бактериями добавить каплю метиленовой
синьки, то на голубом фоне у некоторых неподвижных бацилл видны внутри блестящие овальные образования. Это и есть споры. При отсутствии метиленовой синьки попробуйте окрасить
«зелёнкой». Рекомендуем использовать культуру сенной палочки как удобный объект в других
микробиологических опытах.
Вопросы и задания. Используйте свежевысушенное и старое сено и сравните результаты опыта. С чем могут быть связаны отличия в количестве выросших колоний?
3.5.2.2. Получение культуры картофельной палочки
Оборудование и материалы. Клубень картофеля – 1 шт., мел – 1 кусок, ёмкость с плотной питательной средой – 1 шт.
Ход опыта. Промываем клубни картофеля, не очищая от кожуры, нарезаем ломтями,
натираем поверхность ломтей мелом, кладём в ёмкость с плотной питательной средой и помещаем в тёплое место (с температурой +27...+300С). Через 2–3 суток на поверхности картофеля
образуется плотная морщинистая плёнка, представляющая собой скопление бактерий Bacillus
mesentericus.
Вопросы и задания. Разотрите фрагмент плёнки в капле воды и промикроскопируйте. Будут видны подвижные клетки картофельной палочки.
3.5.2.3. Выделение микроорганизмов, вызывающих болезни растений
Оборудование и материалы. Подгнившие плоды – 1–2 шт., микробиологическая петля
– 1 шт., ёмкость с плотной питательной средой – 1 шт., пробирка со стерильной водой – 1 шт.,
стеклянный шпатель (или палочка) – 1 шт., игла металлическая – 1 шт., спиртовка, спирт, мыло.
Ход опыта. Для выделения болезнетворных для растений микробов воспользуемся
фруктами, клубнями, корнеплодами, (лучше твёрдыми – яблоко, груша, картофель, морковь и
др.), на поверхности которых появились следы гниения. Тщательно моем с мылом выбранный
объект, можно протереть его поверхность спиртом. Стерильной микробиологической петлёй
20
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
аккуратно берем кусочек гниющей ткани (можно из глубины плода, предварительно стерильно
срезав верхнюю часть) и переносим в пробирку со стерильной водой. Тщательно взбалтываем
(не намочив пробку пробирки!) для того, чтобы микробы попали из ткани в воду. Берём петлей
каплю воды и наносим на поверхность плотной питательной среды. Равномерно размазываем
эту каплю по площади среды стерильным стеклянным шпателем, затем этим же шпателем, не
стерилизуя, повторяем размазывание ещё на одной чашке, потом ещё на одной. Таким образом
количество микробов на шпателе каждый раз уменьшается и на какой-то из ёмкостей будут получены отдельные изолированные колонии. Через несколько дней отмечаем – сколько разных
колоний, соответствующих разным видам бактерий, выросло в ёмкостях (см. 3.5.1.1. «Выделение микроорганизмов из почвы и определение их количества в почвенной пробе»). Некоторые
из них являются колониями бактерии – возбудителя заболевания, некоторые – сопутствующей
или случайной микрофлорой. Единственным способом, позволяющим определить возбудителя,
является постановка биопробы. Биопроба проводится только учителем (см. «Введение»), её результаты исследуются без открывания ёмкости, где производилось культивирование. Берём
здоровый плод без признаков гниения, тщательно моем с мылом, протираем спиртом. Прожжённой в пламени иглой делаем в нём количество уколов, соответствующее количеству исследуемых культур. Вновь стерилизуем иглу, охлаждаем её, и, коснувшись ею исследуемой колонии (так, чтобы «зацепить» некоторое количество микробов), делаем уколы в заранее приготовленные отверстия. Отмечаем, какой культурой куда сделали укол. Можно этими же культурами заразить плоды (или корнеплоды, клубни) другого вида, что бы сравнить возможности заражения разных растений. Оставляем заражённые плоды в сухой стеклянной банке в тёплом
месте на 3 – 7 суток. Отмечаем, в каких точках уколов отмечено появление следов гниения.
Сравниваем картину гниения у исходных и заражённых нами плодов, с соблюдением необходимых предосторожностей микроскопируем пробы гниющих тканей, взятые из исходного и заражённого плода. Если они совпадают – значит биопроба подтвердила патогенность выделенного нами микроорганизма.
Вопросы и задания. В медицине аналогично определяют патогенность микробов,
опасных для человека и животных. Как вы думаете, на ком в таком случае ставятся
так называемые биопробы? Бывают ли случаи постановки биопроб на людях?
3.5.3. Серия опытов «Микроорганизмы человеческого тела»
Микроорганизмы являются постоянными спутниками человека и сопровождают его от
рождения до смерти. Они способны обитать на поверхности кожи, слизистых оболочек, в кишечнике. Далеко не все микробы, встречающиеся у человека, являются болезнетворными, многие из них выполняют защитную функцию, участвуют в пищеварении, синтезируют витамины.
Однако возможно попадание в организм и болезнетворных микробов, вызывающих инфекции.
У человека с ослабленным иммунитетом могут вызвать заболевание и микробы – постоянные
спутники. Вот почему столь важно соблюдать правила гигиены, вести здоровый образ жизни. В
приведённых в этом разделе опытах описаны способы выделения микроорганизмов с поверхности кожи и слизистых человека, показаны возможные пути передачи микроорганизмов.
3.5.3.1. Выделение микроорганизмов с поверхности кожи человека.
Влияние водных процедур на количество микробов на поверхности кожи
Оборудование и материалы. Ёмкости с плотной питательной средой – 3 шт.
Ход опыта. Будем определять наличие микроорганизмов на наиболее контактных участках кожи человека – пальцах рук. Приготовьте стерильную плотную среду в трёх ёмкостях. Дно
ёмкостей разметьте радиальными линиями на 3–5 секторов и подпишите их цифрами или инициалами участников опыта. Участники опыта делятся на 3 группы по 3–5 человек: № 1 – не
моют рук перед опытом, № 2 – моют руки водой без мыла, № 3 – моют руки водой с мылом.
Ученики каждой группы делают посев на свою чашку следующим образом: слегка приоткрывается крышка чашки и подушечкой большого пальца руки делается легкий отпечаток на поверх-
21
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
ности среды, каждый в своём секторе. Прикасаться к среде надлежит осторожно, так чтобы не
продавить её.
Через 2–5 суток осматриваем ёмкости и сравниваем количество и разнообразие колоний
микробов, выросших из отпечатков пальцев различных групп учеников.
Вопросы и задания. Обсудите результаты опыта с учителем.
3.5.3.2. Демонстрация стерильности крови человека
Оборудование и материалы. Ёмкости с плотной питательной средой – 1 шт., стеклянный шпатель – 1 шт.
Ход опыта. Если в школе есть медпункт, просим медработника сделать стерильный прокол пальца ученику–добровольцу. Полученные капли крови помещаем на поверхность питательной среды и тщательно размазываем шпателем по поверхности (лучше для этого использовать слегка влажную среду). Оставляем чашку на 3–5 суток. В норме у здорового человека
кровь не содержит микроорганизмов, и в ёмкости ничего не должно вырасти.
Вопросы и задания. Какие особенности нашего организма выявляются в данном
опыте? Какое значение это имеет в нашей жизни?
3.5.4. Опыт «Источники питания микроорганизмов».
Необходимость углерода, азота, фосфора, микроэлементов для жизнедеятельности микроорганизмов. Источники этих соединений
Микроорганизмы, как и все живые существа, состоят из разнообразных химических элементов и для поддержания жизни им необходимо получать их из окружающей среды. Важнейшие из таких элементов – углерод, азот и фосфор – нужны в достаточно больших количествах.
Некоторые другие элементы необходимы в меньших количествах (они носят название микроэлементов). Необходим также определённый набор витаминов. Человек и животные получает
углерод, азот, фосфор, микроэлементы в составе сложных органических соединений пищи.
Микроорганизмы являются очень удобными объектами для проверки необходимости в питательных веществах, поскольку эти элементы им можно вносить раздельно, в виде простых химических соединений.
Оборудование и материалы. Стеклянные сосуды (0,75 л) – 6 шт., сахар (источник углерода) – 150 г, аммиачная селитра NH4NO3 (или КNO3) (источник азота) – 12 г, фосфат натрия
(или фосфат калия, фосфат кальция, другая фосфорная соль) (источник фосфора) – 1,8 г, драже
любого поливитамина (источник витаминов), 5 г культуры дрожжей или сенной (картофельной)
палочки.
Ход опыта. В каждый сосуд помещаем по 5 г дрожжей или культуры сенной палочки,
заливаем водой (желательно – дистиллированной, если её нет – водопроводной). В сосуд № 1 не
вносим более ничего – он служит контролем. В сосуд № 2 вносим 50 г сахара, в сосуд № 3 – 4 г
нитратной соли (KNO3, NH4NO3 или др.), в сосуд № 4 – 0,6 г фосфорной соли ((NH4)3 РO3 или
др.), в сосуд № 5 – сахар, азотную и фосфорную соль (в тех же количествах), в сосуд № 6 – всё
то же что и в сосуде № 5 с добавлением нескольких крупинок размолотого поливитамина. Во
все сосуды наливаем воду на 2/3 объёма и перемешиваем содержимое до полного растворения
внесённых соединений. Таким образом, микроорганизмы, попавшие в воду, имеют в своём распоряжении в достаточном количестве: в сосуде № 2 – только углерод, № 3 – только азот, № 4 –
только фосфор, № 5 – все три биогенных макроэлемента, № 6 – все три макроэлемента и микроэлементы. В сосуде № 1, куда залита чистая вода, микроорганизмы находятся в условиях голодания.
Закрываем горловины сосудов бумагой или ватно-марлевыми пробками, помещаем в достаточно тёплое место и в течение 1–2 недель наблюдаем за происходящими изменениями. О
начале роста микроорганизмов свидетельствует помутнение воды, образование пузырьков газа,
плёнки на поверхности воды, налёта на стенках. С помощью микробиологической пипетки
(стеклянной трубочки или шприца с длинной иглой) возьмите каплю воды с поверхностной
22
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
плёнки, из середины объёма и со дна сосуда. Сделав посев в ёмкости с плотной питательной
средой, можем вырастить изолированные культуры микроорганизмов.
Вопросы и задания. В каком из сосудов рост микроорганизмов начался раньше?
Где вы наблюдали в микроскоп более разнообразную картину микроорганизмов?
Как вы думаете – откуда могли получит микробы недостающие элементы в сосудах,
где вы их не вносили? Если экспериментальные сосуды стояли на свету, какой процесс мог в них начаться? Какой биогенный элемент и откуда получили бактерии в этом случае?
Что было бы, если бы мы закрыли соcуды плотными герметичными крышками? Что вы знаете
об азотфиксирующих микроорганизмах? Обсудите свои ответы с учителем. Опираясь на результаты опыта, подумайте, почему столь важно внесение азотно–фосфорных удобрений в почву в современном сельском хозяйстве?
3.5.5. Серия опытов «Влияние физических условий окружающей среды
на микроорганизмы»
3.5.5.1. Влияние температуры на жизнедеятельность микроорганизмов
Температура окружающей среды является важным фактором, определяющим жизнедеятельность микроорганизмов. Большинство микробов лучше всего развиваются при температуре
+200С…+400С – они называются мезофилами. Некоторые микробы предпочитают жить в условиях повышенных температур (более +450С) – они называются термофилами. Существуют холодоустойчивые микробы, нормально развивающиеся при +50С…+100С – психрофилы. Большинство микроорганизмов практически не переносят повышенные температуры – на этом их
свойстве основаны методы стерилизации, необходимые для обеззараживания пищевых продуктов при консервировании, медицинских инструментов, фармацевтических препаратов. Простейшим методом стерилизации является кипячение – при нагреве до +1000С погибает большинство микроорганизмов (но выживают споровые формы). Влияние температуры на рост и
активность микробов можно показать в следующих опытах.
Оборудование и материалы. Ёмкости с плотной питательной средой – несколько (в зависимости от количества предполагаемых проб). Культуры дрожжей или сенной (картофельной) палочки.
Ход опыта. Выбираем несколько мест, стабильно различающихся температурой, например – около батареи отопления, в помещении класса, в холодильнике на нижней полке, на
верхней полке. Производим предварительные замеры температур комнатными термометрами и,
по количеству подобранных мест готовим соответствующее количество ёмкостей с плотной питательной средой. Ёмкости засеваем картофельной или сенной палочкой: в предварительно
приготовленную суспензию бактерий погружаем стерильную бактериологическую иглу и делаем ею укол в среду, повторяем операцию 5–7 раз, равномерно распределив уколы по поверхности среды. Часть подготовленных ёмкостей засеваем дрожжами. Ёмкости подписываем и помещаем в условия разных температур. Через 3–5 дней сравниваем рост микроорганизмов. В ёмкостях, засеянных бактериями, сравниваем и измеряем диаметр колоний, выросших на месте
уколов – чем большего диаметра достигла колония, тем более высокой была скорость размножения бактерий.
Вопросы и задания. Какие выводы можно сделать, измерив диаметр колоний в разных ёмкостях. Как различается скорость роста микробов при разных температурах?
Какая температура оказалась наиболее благоприятной? Аналогичное сравнение проводим для дрожжевых культур, сравнивая их мутность. Делаем выводы о влиянии
температуры на рост микроорганизмов. Результаты опыта обсудите с учителем.
23
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
3.5.5.2. Гибель микроорганизмов от высоких температур
Многие методы стерилизации основаны на действии высоких температур. Значительная
часть консервированных продуктов подвергалась предварительной термической обработке. Из
житейской практики вам известно, что кипячение жидких бульонов продлевает срок их хранения. Это происходит вследствие гибели микроорганизмов в них. Поставим следующий опыт.
Оборудование и материалы. Пробирки стерильные с ватно-марлевыми пробками –
5 шт., молоко свежее, разливное или пастеризованное, не содержащее веществ–консервантов –
100 мл. Вместо молока в этом опыте можно использовать мясную воду.
Ход опыта. В сосуд нальём 100 мл молока и поставим кипятиться. Приготовим 5 стерильных пробирок, заткнутых стерильными ватно-марлевыми пробками. Когда молоко дойдёт
до состояния кипения, отберём пробу в 10 мл и поместим её в пробирку № 1. Продолжим кипячение и следующую пробу отберём через 15 мин и поместим её в пробирку № 2. Через 30 мин –
в пробирку № 3, через 45 мин – в пробирку № 4, через 60 мин – в пробирку № 5. Все пробирки,
закрыв ватно-марлевыми пробками, помещаем в тёплое место с температурой +250С…+300С.
Будем ежесуточно отмечать внешний вид молока – через сколько дней в каждой пробирке
начнутся процессы скисания, свидетельствующие о развитие кисломолочной микрофлоры
(например, бактерий родов Lactobacillus, Streptococcus).
Вопросы и задания. В какой пробирке процессы роста микроорганизмов начались
раньше / позже? О чём это свидетельствует? Можно промикроскопировать образцы
скисшего молока, зарисовать наблюдаемую микрофлору. Результаты опыта обсудите
с учителем.
3.5.5.3. Влияние кислотности среды на жизнедеятельность микроорганизмов
Реакция среды (её кислотно–щелочной баланс – рН) отражает концентрацию ионов водорода (протонов) Н+ или гидроксил–ионов ОН– (повторите соответствующий раздел химии
либо уточните у учителя химический смысл данных обозначений!) и выражается в числах от
1 до 14. Реакция среды играет важнейшую роль в жизни микробов. Большинство микроорганизмов выживает при нейтральных или близких к нейтральным рН и гибнет в кислой или щелочной среде. С этим связан и один из защитных механизмов человеческого организма –
вспомните, в каком отделе пищеварительной системы выделяется соляная кислота HCl ?
Для разных микробов характерны различные оптимумы рН: бактерии предпочитают
нейтральную или слабощелочную среду с рН 7–8, дрожжи и плесени – слабокислую с рН 5–7.
Поэтому, в зависимости от реакции в одной и той же среде могут развиваться разные микроорганизмы. На этом эффекте основаны способы межвидовой конкуренции микроорганизмов. Так,
бактерия, вызывающая сбраживание молока (молочнокислый стрептококк Streptococcus lactis)
выделяет в окружающую среду молочную кислоту, чем подавляет развитие других микроорганизмов, не позволяя им развиваться в своём любимом молоке.
Оборудование и материалы. Пробирки стерильные – 9 шт., индикаторная бумага,
набор кислот и оснований, мясная вода, дрожжи или культура сенной, картофельной палочки.
Ход опыта. Разольём мясную воду по 10–15 мл в 9 пробирок и подпишем на каждой
уровень рН, который будем в ней устанавливать – 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. С помощью индикаторной бумаги из школьного кабинета химии определим реакцию среды в пробирке № 7 – она
должна быть нейтральной и равняться 7. Из химического набора берём имеющуюся кислоту
(например, HCl, HNO3, CH3COOH) и основание (например, KOH, NaOH). Кислоту добавляем
пипеткой по каплям в пробирки № 3–6. После каждого добавления содержимое пробирки перемешиваем встряхиванием и проверяем рН индикаторной бумагой. Если вы добавили излишек
кислоты, то пробирку с субстратом необходимо заменить или нейтрализовать до нужного значения добавлением щёлочи. Аналогично поступаем с пробирками № 8–11, добавляя к ним основание. Если в пробирке № 7 исходный рН субстрата отличается от нейтрального – доводим
его значение до 7, прибавляя кислоту или основание. Добавляем в каждую из пробирок по 1 мл
24
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
культуры дрожжей или сенной (картофельной) палочки. Оставляем пробирки при комнатной
температуре и в течение 5–10 дней наблюдаем за происходящими изменениями.
После проведения опыта проведите уничтожение полученных культур (см. 3.3.)
Вопросы и задания. В каких пробирках первыми появились следы роста микроорганизмов (смена цвета, появление запаха, пузырьков газа, плёнки или осадка биомассы)? О чём это свидетельствует? Как можно применить на практике полученные
вами сведения? Какие кислоты обычно используют в домашнем консервировании и
на чём основано их применение? Обсудите результаты опыта.
3.5.5.4. Влияние солёности среды на жизнедеятельность микроорганизмов
Одним из важных факторов окружающей среды, влияющих на жизнедеятельность микробов, является содержание солей в среде роста (вспомните из курса химии, что такое соли, какими свойствами они обладают). Соли являются важным источником биогенных элементов для
многих микробов (см. опыт «Необходимость углерода, азота, фосфора, микроэлементов для
жизнедеятельности микроорганизмов. Источники этих соединений»), однако их избыточное
количество может подавлять жизнедеятельность микроорганизмов. Подавление роста бактерий
высокой концентрацией солей издавна известно человеку и активно им используется для консервирования продуктов. В древние времена поваренная соль была практически единственным
универсальным консервантом, поэтому стоила весьма дорого, её везли в Европу за сотни километров с солончаков Азии, в России соль активно добывали на Урале (вспомните поговорку
«Пермяк – солёны уши»). Однако существует группа микроорганизмов – галофилов (от греч.
halos – соль), способных жить в условиях высокой солёности. Они обитают преимущественно в
различных водоёмах с солёной водой. На высокой солёности основываются, в частности, и целебные свойства морской воды – на курортах в прибрежной полосе в летнее жаркое время купаются тысячи людей, однако развития и переноса инфекций через воду не происходит.
Оборудование и материалы. Пробирки 10–15 мл – несколько шт. (по количеству опытных образцов), растворы поваренной соли в концентрации 0%, 3%, 6% и 9% (можно приготовить 9%-ый раствор (9 г NaCl на 100 мл воды) и последовательно разбавить его до 6% и 3%),
небольшие кусочки мяса или плодов растений (огурца, томата).
Ход опыта. Определим концентрацию соли, подавляющую жизнедеятельность микробов. Для этого будем моделировать консервирование мясных или растительных продуктов.
Прокипятим все растворы соли 10–15 мин и зальём их по 10–15 мл в стерильные пробирки. В
каждую из них поместим по кусочку промытого сырого мяса или плода растений (огурец, яблоко, др.) одинакового размера. Закроем пробирки пробками и оставим при комнатной температуре, наблюдая за ними в течение 10–15 дней. Наблюдаются ли какие-либо изменения? При каких концентрациях соли и на какие сутки?
Вопросы и задания. О чём свидетельствуют наблюдаемые в опыте изменения?
Узнайте у учителя, что такое плазмолиз, осмотическое давление и какое значение
имеет знание этих процессов для понимания результатов данного опыта.
3.5.5.5. Влияние света на жизнедеятельность микроорганизмов
«Солнце, воздух и вода – наши лучшие друзья!». Эта пословица известна всем. Имеет ли
она под собой основание, исходя из данных микробиологии?
Оборудование и материалы. Прозрачная ёмкость с плотной питательной средой –
1 шт., медицинский шприц – 1 шт., плотная чёрная бумага.
Ход опыта. Поверхность плотной питательной среды засеем так называемым «сплошным газоном» сенной палочки. Как получить жидкую культуру сенной палочки Bacillus subtilis,
описано в опыте 3.5.2.1. Можно использовать и культуру, выросшую на плотной среде, растворённую в стерильной воде. Несколько капель (около 1 мл) полученной жидкой культуры нанесём на середину поверхности твёрдой питательной среды и равномерно распределим стерильным стеклянным шпателем по всех поверхности чашки. При прорастании бациллы и дадут так
25
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
называемый сплошной газон роста. Сразу после посева на внешнюю сторону дна ёмкости
наклеим вырезанные из плотной чёрной бумаги какие либо буквы или рисунки (размером не
менее нескольких сантиметров). Поместим ёмкость в освещённое солнечным светом место буквами вверх и оставим на пару часов, потом уберём в тень на несколько суток для проращивания. Какую картину вы наблюдаете?
Вопросы и задания. Почему колонии микробов выросли только в тех местах среды,
которые были затенены тёмной бумагой? Какие выводы можно сделать о влиянии
солнечных лучей на микробов? Что вы знаете о составе солнечного света – на какие
области спектра он подразделяется? Какие из них наиболее губительны для микроорганизмов?
3.5.5.6. Влияние кислорода на жизнедеятельность микроорганизмов.
Отношение микроорганизмов к кислороду
Как вам известно, человек, животные и высшие растения не могут существовать без кислорода. Микроорганизмы отличаются более разнообразным отношением к нему: для некоторых
он также жизненно необходим – эти микробы называют аэробами (от греч. aeros – воздух), для
некоторых – не нужен и даже вреден, эти микробы называют анаэробами. Существуют микроорганизмы, успешно развивающиеся как в присутствии, так и в отсутствии кислорода – факультативные анаэробы. Определить отношение того или иного микроорганизма к кислороду
можно, проведя следующий опыт.
Оборудование и материалы. Пробирка с плотной питательной средой – 1 шт., металлическая игла – 1 шт.
Ход опыта. Приготовим пробирки, залитые плотной питательной средой на 2/3 своего
объёма. Наберём на кончик микробиологической иглы немного биомассы исследуемых микроорганизмов или субстрата с микробами и произведём укол иглой вертикально вниз – в глубину
столбика среды. Микроорганизмы, таким образом, попадают как на поверхность среды, так и в
её глубину. Оставляем засеянную пробирку на 3–5 дней, наблюдая за ростом колоний. Если
рост культуры происходит на поверхности, т.е. в зоне контакта с кислородом воздуха – это
аэробный микроорганизм. Если в глубине среды, где кислорода меньше – анаэробный. Если повсеместно – факультативно анаэробный. Для культивирования анаэробов среду долго кипятят
(для удаления растворённого кислорода (О2), а после посева микробов заливают в пробирку поверх среды слой вазелинового масла (1 см), что препятствует проникновению кислорода воздуха.
Вопросы и задания. С какими химическими процессами связано потребление кислорода живыми организмами?
3.5.5.7. Влияние концентрации кислорода на жизнедеятельность
микроорганизмов. Сравнение ростовой активности дрожжей и нефтеокисляющих
бактерий при разных уровнях аэрации
Подавляющее большинство микроорганизмов, с которыми мы сталкиваемся в быту и которые человек использует в своих целях, для своей жизнедеятельности требуют кислород. Он
необходим для протекания в клетках процесса окисления, служащего для получения энергии.
Особенно кислород необходим, если микроорганизм растёт на химически стойких, трудно
окисляемых субстратах, например – на углеводородах нефти.
Оборудование и материалы. Ферментёры – 2 шт., дрожжи или 10 г. почвы, раствор сахара или (в зависимости от культуры, с которой предполагаем работать) минеральная питательная среда, дизельное топливо, керосин или нефть в количестве 1–5 мл на 100 мл среды.
Ход опыта. Сравним ростовую активность дрожжей или нефтеокисляющих бактерий
при разных уровнях аэрации. Для этого будем выращивать их в ферментёре, где происходит
постоянное пропускание воздуха через питательную среду и в сосуде без дополнительной аэрации. Сосуд необходимо подобрать такого же объёма, как и сосуд ферментёра, соответственно в
них заливаются одинаковые объёмы среды. Если проводим опыт с дрожжами – простерилизуем
сосуд кипячением и зальём стерильной питательной средой на 2/3 объёма. Если проводим опыт
26
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
с нефтеокисляющими бактериями – заполняем нестерильной минеральной средой. В обоих
случаях закрываем горло сосуда стерильной ватной пробкой, а если диаметр горлышка слишком велик для этого – подбираем соответствующую капроновую крышку или пробку, сквозь
которую вставляем трубку, заполненную ватой. Трубку с ватой необходимо простерилизовать
над паром. Для заражения питательных сред в них вносят соответственно 10 г/л пекарских
дрожжей или 10 г/л почвы, которую желательно отобрать на автозаправках и прочих местах,
где на почву попадают нефтепродукты. В качестве углеводорода вносим дизельное топливо,
керосин или нефть в количестве 1–5 мл на 100 мл среды. Один сосуд оставляем с естественной
слабой аэрацией (за счёт пассивной диффузии кислорода в среду из воздуха), во втором организуем повышенную аэрацию путём продувки воздуха. Культивирование проводим в течение
3–7 суток.
Вопросы и задания. Сравним изменения в сосудах с естественной и принудительной аэрацией. Где рост микроорганизмов лучше? Где произошло большее разрушение углеводородной плёнки? Сделайте вывод о влиянии аэрации на активность исследуемых организмов. Обсудите результаты опыта с учителем.
3.5.6. Серия опытов «Влияние химических соединений на микроорганизмы»
Микроорганизмы, как и любые другие живые существа, постоянно контактируют со
множеством химических соединений, находящихся в окружающей среде. Некоторые из этих
веществ являются для микроорганизмов полезными – используются ими в пищу или являются
регуляторами метаболизма, другие – нейтральными или вредными.
В этом разделе мы рассмотрим влияние вредных для микроорганизмов веществ, так как
именно они активно используются человеком и другими организмами для борьбы с болезнетворными микробами. Подобные соединения принято делить на бактерицидные (убивают микробов) и бактериостатические (подавляют рост микробов, но полностью не уничтожают их).
Мы рассмотрим действие широко принятых в быту моющее–дезинфицирующих средств, природных фитонцидов, химических антибиотиков.
3.5.6.1. Влияние дезинфицирующих средств на жизнедеятельность микроорганизмов
В настоящее время в быту используется множество синтетических моющих средств,
производители которых позиционируют их в рекламе как дезинфицирующие («убивают всех
известных микробов!»). Настоящим опытом предлагаем проверить это. В этом опыте необходимы тест–организмы – микробы, на которых мы и будем испытывать действие препаратов. В
качестве тест–объекта можно использовать сенную или картофельную палочку.
Оборудование и материалы. Ёмкости с плотной питательной средой – несколько шт. (в
зависимости от количества производимых нами опытов), заранее выращенные культуры микроорганизмов, кусочки неокрашенной хлопчатобумажной ткани (или фильтровальной бумаги),
рекламируемые и (или) имеющиеся в продаже дезинфицирующие либо моющие средства.
Ход опыта. Каждую из исследуемых тест–культур высеваем на поверхность плотной
питательной среды. Для этого приготовляем суспензию культуры в стерильной воде (см. «Словарь терминов»), наносим 1 мл суспензии на поверхность среды и равномерно распределяем
стеклянным шпателем по площади чашки. Оставляем засеянные чашки на 1–2 суток до появления признаков роста культуры (множество маленьких колоний, диаметром менее 1 мм) и начинаем опыт.
Согласно приведённым на упаковках моющих средств инструкциям готовим их рабочие
растворы (например, 50 мл средства на 1 л воды, т.е. 5% раствор). Отдельно готовим квадратные кусочки какой–либо ткани, желательно неокрашенной хлопчатобумажной, тщательно прополаскиваем их в воде, прокипятим для стерилизации и поместим на 5 мин в приготовленные
растворы моющих средств до полной пропитки. Вместо ткани можно использовать плотную
фильтровальную бумагу.
27
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
Пропитанный исследуемым средством клочок ткани осторожно вытаскиваем, даём стечь
лишней жидкости, аккуратно отжимаем (о края сосуда или пальцами, предварительно протёртыми спиртом), помещаем на поверхность среды с бактериями. Таким образом, часть бактериальных колоний оказывается в непосредственном контакте с моющим/дезинфицирующим средством (те, которые оказались под тканью), а часть нет. Выдерживаем в течение 15–30 мин – в
соответствии с инструкцией к применению средства или собственному здравому смыслу и удаляем ткань из ёмкостей. Наблюдаем за ростом бактерий в чашках в течение 2–7 суток. Отмечается ли рост колоний в области, подверженной действию химических средств (её лучше заранее
по периметру ткани обвести маркером поверх стекла ёмкости)? Если да, то отличается ли количество колоний от участков, не подвергнутых обработке. Если рост отсутствует, отметьте через
5–7 суток – не появились ли колонии (т.е. средство обладало бактериостатическим эффектом)
или так и не выросли (т.е. оно является бактерицидным). Если возможно, подсчитайте количество колоний на площади среды, подверженной и не подверженной обработке, вычислите разницу между ними и определите процент убитых средством микроорганизмов.
Вопросы и задания. Сделайте выводы об эффективности исследованных вами
средств в качестве антимикробных и справедливости рекламы данных средств.
3.5.6.2. Влияние антибиотиков на микроорганизмы
Антибиотики – вещества биологического происхождения, синтезируемые, в частности,
плесневыми грибами, бактериями и оказывающие губительное действие на другие микроорганизмы. Они служат средством борьбы за существование между организмами. Первый антибиотик – пенициллин – был получен из плесневого грибы пеницилла (Penicillum). В настоящее
время используется огромное количество всевозможных, преимущественно синтетических, антибиотиков. В связи с их широким применением, сложилась порочная практика самостоятельно
лечиться ими от всего на свете. Но это не только не даёт заметного положительного эффекта, но
вызывает постепенное привыкание болезнетворной микрофлоры к антибиотикам и, в итоге, появлению новых, трудноизлечимых болезней. Поэтому применять антибиотики можно только по
определённой системе, согласно рекомендациям врача. В данном опыте мы продемонстрируем
степень влияния различных антибиотиков на микроорганизмы
Оборудование и материалы. Ёмкости с плотной питательной средой – по предполагаемому количеству опытов, культура сенной палочки, различные антибиотики. Для исследования
необходимо купить в аптеке наиболее простые, дешёвые антибиотики в таблетках, причём таблетки должны быть небольшого диаметра – в пределах 5–7 мм.
Ход опыта. Засеваем питательную среду в ёмкостях сплошным газоном тест-культуры
микроорганизма (например, сенной или картофельной палочки). Когда засеянная среда чуть
подсохнет (чтоб на поверхности не было подвижной жидкости) простерилизованным в пламени
пинцетом осторожно помещаем на поверхность среды таблетки антибиотиков. Их можно разместить по кругу (в 1–1,5 см от края ёмкости) – 6 штук и одну в центр. Можно слегка погрузить
таблетки в глубину среды лёгким надавливанием. Наблюдаем за ростом микробов в течение
3–5 суток. Вокруг некоторых из таблеток рост может отсутствовать – образуется кольцевая зона, свободная от колоний – зона задержки роста. Она образуется потому, что молекулы антибиотика, постепенно растворяясь, диффундируют в слое питательной среды. Если данное вещество способно действовать на тестируемую микробную культуру, то в местах, где проник антибиотик, рост бактерий отсутствует или замедляется. Чем более «убийственным» для микроба
является данный антибиотик, тем больший диаметр будет иметь зона задержки роста.
Вопросы и задания. Есть ли среди исследованных вами лекарств такие, что не оказали никакого воздействия на микроорганизмы? Как Вы полагаете, будет ли эффективным их применение в качестве лечебных средств в случае заболевания данным
микроорганизмом, если бы он был патогенен?
28
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
3.5.6.3. Влияние фитонцидов растений на микроорганизмы
Как было отмечено в разделе «Микроорганизмы, обитающие на растениях», некоторые
микроорганизмы являются патогенными для растений и способны вызывать их заболевания. В
процессе длительного совместного сосуществования растения выработали средство защиты от
микроорганизмов – выделение губительных для микробов веществ – фитонцидов. На действии
фитонцидов основан лечебный эффект лука, чеснока, использование в консервировании крапивы, хрена. Воздух хвойных лесов наполнен фитонцидами настолько, что врачи рекомендуют
нахождение там в качестве лечения при некоторых серьёзных болезнях (например, туберкулёзе).
Оборудование и материалы. Предметные и покровные стёкла, «зубок» чеснока или
фрагмент луковицы.
Ход опыта. На предметное стекло наносим каплю воды с суспензией микроорганизмов
(см. «Словарь терминов»), накрываем покровным стеклом и рассматриваем под микроскопом
(можно немного подкрасить метиленовой синькой или «зелёнкой»). Видны различные микроорганизмы. Берём «зубок» чеснока или немного лука, тщательно растираем до состояния кашицы – при этом разрушаются клетки растения и содержащиеся в них фитонциды выходят наружу
вместе с соком и в воздух. Полученную кашицу размещаем рядом с покровным стеклом так,
что бы сок постепенно просачивался под него. Продолжая микроскопирование препарата, можем заметить, что по мере проникновения сока микроорганизмы начинают терять подвижность.
Это связано с губительным для них действием фитонцидов лука или чеснока. Данный опыт
можно провести аналогично опыту 3.5.6.1., пропитав кусочки ткани соком тех или иных растений (какие растения выбрать – решите с учителем!)
Вопросы и задания. Подумайте, какие ещё растения из известных вам обладают антимикробным действием? Как и где применяется это их свойство? Антимикробные
вещества растительного происхождения обладают большими перспективами в качестве относительно безопасных и дешёвых антисептиков.
Вы можете поставить серию опытов с растениями, обитающими в вашей местности, определяя
их антимикробную активность. На основании этих опытов можно сделать интересное исследование, где будут связаны описание растительного разнообразия и практического применения
местных растений.
29
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
3.6. МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК И
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЫРАЩЕННЫХ КУЛЬТУР
Подготовка препаратов для микроскопирования производятся ТОЛЬКО учителем
БЕЗ ПРИСУТСТВИЯ учащихся, в лаборантской и только в случае отсутствия у педагога
аллергических реакций. Во всех остальных случаях изготовление препаратов НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ.
Микроорганизмы (не только бактерии, но и часть протистов) – мельчайшие и мелкие
живые существа, размеры которых обычно не превышают 1–2 мкм (у бактерий) и – до нескольких миллиметров – у некоторых протистов. Помимо систематического деления, многие микроорганизмы отличаются и по морфологии (строению). Определить не только видовую, но даже и
родовую принадлежность подчас бывает сложно даже в лаборатории, но определить принадлежность к систематической группе высокого ранга по морфологии часто бывает возможно.
Какие же бывают микроорганизмы, которые можно разглядеть в микроскоп?
Если клетки в целом напоминают известных из школьных учебников амёбу, инфузориютуфельку, эвглену – то мы имеем дело с протистами (рис. 3, сильно увеличено). Для более
детального определения рекомендуем воспользоваться определителями, предложенными в
книгах: К. Хаусман «Протозоология» /Пер. с нем. М.: Мир, 1988; «Фауна аэротенков». М., 1984.
Точное систематическое определение протистов до вида возможно только в лабораторных
условиях.
Рис. 3. Внешний вид протистов разных групп (www.pirx.com/droplet)
1 – локсофиллюм, 2 – литонотус, 3 – амфилептус, 4 – дилептус, 5 – лакримария. 6 – спиростомум, 7 – ихтиофтириус, 8 – стихотриха, 9 – хилодонелла, 10 – колепс, 11 – колпода, 12 – фронтония, 13 – парамециум, 14 – анизонема, 15 – эвглена, 16 – антофизис, 17 – акинета, 18 – турикола, 19 – спиролокулина, 20 – уростила, 21 – стилонихия, 22 – уроцентрум, 23 – тетрахимена,
24 – амфизиелла, 25 – диофрис, 26 – эуплотес, 27 – гальтерия, 28 – циклидиум, 29 – лембадион, 30 – стромбидиум, 31 –
плевронема, 32 – нассула, 33 – блефаризма, 34 – рабдостила, 35 – вортицелла, 36, 37 – стентор, 38 – кархезиум, 39 – диффлюгия, 40 – актинофрис, 41 – эуглифа, 42 – аэрелла, 43 – центропиксис, 44 – амёба, 45 – актиносфериум
30
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
Если в вашей ёмкости для культивирования выросли колонии (чаще всего – округлой
формы или как бы повторяющие «путь» предмета, которым вы засевали ёмкость, либо
заполняющие всю поверхность питательной среды), то перед нами – бактерии (рис. 4) или
грибы (рис. 5–6). В случае появления предположительно грибных колоний, во избежание
аллергических реакций, рекомендуется уничтожить содержимое или быть
«микробиологически» чрезвычайно аккуратным (см. 3.3.).
Рис. 4. Внешний вид колоний бактерий на твёрдых
питательных средах в чашке Петри (слева) и пробирках
на скошенной среде (справа) (Жизнь растений. Т. 1)
Рис. 5. Внешний вид колонии пекарских дрожжей
в чашке Петри (Жизнь растений. Т. 2)
Рис. 6. Колонии пенициллов и аспергиллов в чашках Петри
(Жизнь растений. Т. 2)
Дальнейшее определение можно провести микроскопированием (см. 3.4).
Если при микроскопировании в выращенной культуре заметно подобие нитей, то,
вероятнее всего, мы имеем дело с особой группой бактерий – актиномицетами (рис. 7, 1) либо с
грибами (рис. 7, 2). Если при микроскопировании видны клетки, сходные с изображёнными на
рис. 8, то мы имеем дело с дрожжами.
Рис. 7. Внешний вид колонии актиномицетов (1) и мицелия гриба
(2) при микроскопировании (Практикум по микробиологии, 2005)
Рис. 8. Внешний вид клеток дрожжей (Селибер и др., 1953)
Определение грибов по мицелию весьма затруднительно, а для многих групп
невозможно без биохимического анализа в лабораторных условиях.
31
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
Если при микроскопировании мы видим некрупные неподвижные или малоподвижные
клетки, то это, вероятнее всего, бактерии.
Далее можно попытаться выяснить, к какой группе относятся различаемые нами в
микроскоп бактерии (рис. 9).
Некоторые группы бактерий
можно
достаточно
уверенно
отнести
к
одной
из
систематических групп исходя из
их внешнего вида, но точное
определение
систематического
положения
организма
часто
бывает
возможно
только
в
лаборатории, с использованием
специальных методов и определителей (к примеру, «Определитель
бактерий Берджи» под ред. Дж.
Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др., в
2–х т. М.: Мир, 1997).
Вирусы во внелабораторных
условиях увидеть при микроскопировании в принципе невозможно.
В рамках школы определение
рекомендуется
проводить
до
уровня морфологического облика
бактерии (рис. 9). Для более
точного определения рекомендуетРис. 9. Основные формы внешнего вида микроорганизмов (бактерий), схема
ся обращаться (после предвари(Асонов, 1989): 1–3 – шаровидные (1 – стафилококки, 2 – диплококки,
тельного
согласования
по
3 – стрептококки, 4 – тетракокки, 5 – сарцины); 6 – 12 – шаровидные
(6 – бактерии, 7 – стрептобактерии, 8 – бациллы, 9 – стрептобациллы,
телефону) в биологические или
10 – вибрионы, 11 – спириллы, 12 – спирохеты)
медицинские
учреждения
соответствующей направленности
(кафедра генетики, микробиологии и биотехнологии Кубанского государственного
университета (г.Краснодар, Ставропольская ул., 149), кафедра микробиологии Кубанского
государственного медицинского университета (г.Краснодар, Седина ул., 4), кафедра
микробиологии и вирусологии Кубанского государственного аграрного университета
(г.Краснодар, Калинина ул., 13)).
Важно помнить: лучше верно определить до уровня крупной группы, чем неверно –
до рода или вида.
Для учащихся, заинтересовавшихся микроорганизмами и микробиологией, имеется
масса изданий энциклопедического характера. Также можно воспользоваться сведениями сети
Интернет. Начать изучение мира микроорганизмов рекомендуем со следующих книг и сайтов:
1. Крайф, де, Поль «Охотники за микробами». М., 1957 (можно взять и другие издания
данной книги).
2. Жизнь растений. М.: Просвещение, 1974, 1976. Т. 1, 2.
3. Molbiol.ru – www.molbiol.ru
32
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
4. ИНТЕРЕСНЫЕ ФАКТЫ О МИКРООРГАНИЗМАХ
И НЕ ТОЛЬКО О НИХ
Интересные факты
Лет 60 назад в Риме состоялся научный конгресс, на котором говорили и о женской
одежде. Доктор Казардини убедительно показал вред ношения слишком длинных платьев: исследовав шлейфы дам, он обнаружил на них большое количество болезнетворных микробов. В
то же время в Дрездене по специальному ходатайству населения муниципалитет издал постановление, запрещающее женщинам появляться в общественных домах и на улице с длинными
шлейфами и длинными накидками.
Однажды к Луи Пастеру пришёл незнакомец и представился секундантом некоего графа,
которому показалось, что учёный оскорбил его. Граф требовал сатисфакции. Пастер спокойно
выслушал и сказал: «Раз меня вызывают на дуэль, я имею право выбрать оружие. Вот две колбы: в одной – возбудитель холеры, в другой – чистая вода. Если человек, приславший вас, согласится выпить жидкость одной из них на выбор, я выпью жидкость из другой колбы». Дуэль
не состоялась.
Бык весом 500 кг, находящийся на пастбищном содержании, синтезирует в сутки лишь
0,5 кг белка, а 500 кг микроорганизмов за такое же время могут дать 1 250 кг белка, иначе говоря, они синтезируют белок в 2 500 раз быстрее, чем животные. Источником для синтеза белка
микроорганизмам могут служить различные отходы производства, например меласса, некоторые нефтепродукты.
Дрожжевые грибки очень прожорливы. За сутки 56 кг дрожжей «съедают» 1 500 кг питательных веществ, «выпивают» 27 000 литров воды и используют для дыхания 765 м3 воздуха.
После этого они увеличивают свой вес до 450 кг.
В одном из кварталов Мадрида перед ареной для боя быков стоит памятник первооткрывателю пенициллина Александру Флемингу. Хотя Флеминг не был тореадором и даже не увлекался боем быков, памятник поставил ему синдикат, организующий корриды: открытие лечебных свойств пенициллина стало помогать спасать раненных тореадоров от заражения крови.
На самом холодном материке земли – Антарктиде, был найден ящик с продуктами,
оставленный экспедицией Скотта за 50 лет назад. Лабораторный анализ дрожжей, извлечённых
из ящика показал, что они отнюдь не утратили жизнеспособность.
После месячного ношения одежды количество микробов на одном квадратном сантиметре её увеличивается в 2 – 4 раза.
Чистая, неповреждённая кожа здорового человека обладает свойством убивать микробов. Если на участок чистой кожи нанесено 30 миллионов микробов, то через час их окажется
720 тысяч, а через 2 часа – только 7 тысяч. Чем грязнее кожа, тем больше микробов могут проникнуть внутрь организма при её повреждении.
Подсчитано, что с кожи человека во время мытья в ванне смывается от 20 миллионов до
миллиарда различных микроорганизмов.
(По: Жданов В.М., Выгодчиков Г.В., Ершов Ф.И., Ежов А.А., Коростелев Н.Б. Занимательная микробиология. М.: Знание, 1967).
В верхних дыхательных путях человека обитает около 100 видов микроорганизмов.
(По: Цифры и факты //Наука и жизнь. 2007. № 1. С. 30).
33
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
Самые маленькие
«Корона» лилипутов среди микробов пока официально принадлежит представителям
группы бактерий, называемых микоплазмами (Mycoplasma). Эти неподвижные бактерии, не
имеющие оболочки, имеют сферическую или нитевидную форму и размеры 150–500 нм (0,15–
0,5 мкм); микоплазмы относятся к так называемым фильтрующимся бактериям. Из-за малости
размеров даже среди микробов микоплазмы и некоторые другие бактерии иногда называют
нанобактериями (нанобами).
Какой минимальный размер могут иметь живые клетки? Учёные попробовали вычислить
это. Для синтеза белка необходимы рибосомы. Типичные рибосомы имеют почти сферическую
форму и размеры 25–30 нм. Типичная современная клетка может содержать несколько сотен
тысяч рибосом. Поскольку молекулы имеют объем, должен быть нижний предел размера организма. Сфера диаметром около 200 нм – вот тот минимальный объем, в котором могут уместиться все молекулы, необходимые организму с известной нам биологией.
(По: Яковенко Л.В. Нанобы – новая форма жизни //Биология. 2003. № 23.)
Вироиды
В 1972 г. Т.О. Дайнером были открыты инфекционные агенты – вироиды, которые по
размерам немного меньше вирусов и представляют собой молекулы короткой кольцевой
суперспирализованной РНК (около 360 нуклеотидов) без белковой оболочки. Живыми
организмами вироиды фактически не являются. Вироиды вызывают болезни животных,
человека и растений.
В настоящее время считается, что существует два семейства вироидов – Pospiviroidae (к
примеру, Pospiviroid (Potato spindle tuber viroid), Hostuviroid (Hop stunt viroid)) и Avsunviroidae
(к примеру, Avsunviroid (Avocado sunblotch viroid)).
Бинарная номенклатура для вироидов не используется.
Прионы
В начале 80–х гг XX в. из мозга овцы, больной так называемым скрейпи, был выделен
белок, который даже после многократной очистки, гарантированно свободный от вирусов или
микроорганизмов, вызывал подобную же болезнь у грызунов. Ученый С. Прузинер из
университета Сан–Франциско в 1982 г. предположил, что такие дегенеративные болезни мозга,
как куру, скрейпи, болезнь бешенства коров и болезнь Крейтцфельдта–Якоба вызываются
особыми белками – прионами.
Термин «прион» происходит от начальных букв английских слов: proteinaceous –
белковый, infective – инфекционный; on – окончание, означающее «частица». Живыми
организмами прионы не являются.
Прионы представляют из себя субмикроскопические инфекционные частицы,
вызывающие дегенерацию головного мозга. В отличие от вирусов, построенных из белка и
нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК), прионы представляют собой мелкие белковые частицы, не
содержащие молекул наследственного вещества – нуклеиновой кислоты. Прион состоит в
основном, а может быть, и целиком, из молекул аномального прионного белка, который в
норме обнаруживается преимущественно на поверхности нервных клеток, хотя какую функцию
он там выполняет, не ясно. Нормальный прионный белок кодируется. Однако нарушения в
процессе синтеза этого нормального белка приводят к появлению необычных, атипичных
молекул, которые становятся инфекционными и, вероятно, могут «заражать» нормальные,
«переделывая» их «по своему образу и подобию». Возможно, постепенно в нейронах
накапливаются «неправильные» молекулы прионов, что медленно разрушает мозг, но данная
гипотеза в настоящее время не является полностью доказанной.
Предложено классифицировать прионы по группе живых организмов, в которых они
обнаружены, давая каждой разновидности ещё и собственное название (не используя бинарную
номенклатуру, так как живыми организмами прионы не являются).
Выделяют прионы млекопитающих (Mammalian prions, к примеру – Scrapie prion,
TME prion, Kuru prion), прионы грибов (Fungal prion, к примеру– [URE2+] prion, [PSI+] prion).
34
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ
Автотрофы – организмы, использующие для построения своего тела СО2 в качестве
единственного или главного источника углерода и обладающие как системой ферментов для
ассимиляции СО2, так и способностью синтезировать все компоненты клетки.
Бинарная номенклатура – система, предложенная К. Линнеем, согласно которой
каждый вид живого организма имеет латинское название, состоящее из двух слов.
Вирион – отдельная вирусная частица.
Гетеротрофы – организмы, использующие в качестве источника углерода экзогенные
(т.е. взятые извне) органические вещества.
Интроны – участок ДНК эукариот, который не несёт, как правило, информации,
относящейся к синтезу белка, кодируемого данным геном; расположен между другими
фрагментами структурного гена – экзонами.
Клон – совокупность клеток (особей), произошедших от общего предка (в случае
микроорганизмов – от одной клетки) путём бесполого размножения.
Литотрофы – организмы, использующие неорганические вещества в качестве
окисляемых субстратов – доноров электронов. Различают фото– и хемолитотрофы.
Монофилетическое происхождение – происхождение данной группы организмов от
одного общего предка.
Номенклатура – система названий живых организмов и положений по образованию и
употреблению этих названий.
Нуклеоплазма – содержимое ядра или часть клетки с генетическим материалом.
Осмотическое давление – давление жидкости, поддерживаемое разницей в
концентрации солей.
Органотрофы – организмы, использующие органические вещества в качестве
окисляемых субстратов – доноров электронов.
Плазмолиз – отделение пристеночного слоя цитоплазмы от твёрдой оболочки
растительной или бактериальной клетки. Происходит только в живых клетках под влиянием
раствора с более высокой солёностью, находящегося вокруг клетки.
Полифилетическое происхождение – происхождение данной группы организмов от
нескольких предковых групп, не связанных близким родством, осуществляется путём
конвергенции.
Систематика – раздел биологии, задачей которого является изучение биологического
разнообразия, выявление, описание всех существующих и вымерших групп живых
организмов и их классифицирование согласно родственным взаимоотношениям.
Суспензия клеток – масса клеток, полученная на поверхности питательной среды,
перенесённая (с соблюдением стерильности!) в небольшое количество стерильной воды и
размешанная в ней.
Таксон – группа организмов, составляющая какую–либо таксономическую категорию.
Таксономические (систематические) категории – ранговые названия, применяемые
в систематике.
Фотосинтез – процесс, при котором на свету в клетках ряда групп живых организмов
происходит образование органических веществ из неорганических.
Хемосинтез – тип питания некоторых бактерий, основанный на усвоении СО2 за счёт
окисления неорганических соединений.
Штамм – чистая культура микроорганизма, выделенного из определённого источника
или полученного в результате мутаций. Разные штаммы одного и того же микроорганизма
могут различаться по ряду особенностей.
35
Волченко Н.Н., Криштопа А.Н., Нимченко Д.В. Микробиологические опыты без лаборатории
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Асонов Н.Р. Микробиология. М.: Агропромиздат, 1989.
Биологический энциклопедический словарь /Гл. ред. М.С. Гиляров. М.: Сов. энциклопедия, 1989.
3. Вирусология: В 3–х т. /Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа, при участии Р. Ченока,
Б. Ройзмана, Дж. Мелника, Р. Шоупа. – М.: Мир, 1989.
4. Воробьев А.А., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология: Учебник.
М.: Медицина, 1994.
5. Воронцов Н.Н., Сухорукова Л.Н. Эволюция органического мира. Факультативный курс.
Учебное пособие. М.: Просвещение, 1991.
6. Высший уровень классификации царства PROTISTA (Протисты) – http://www.zin.ru/BioDiv
7. Гарибова Л.В., Лекомцева С.Н. Основы микологии: Морфология и систематика грибов и
грибоподобных организмов. Учеб. пособие. М.: Товарищество научных изданий КМК,
2005.
8. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология: В 3–х т./ Под ред. Р. Сопера. М.: Мир, 1996
9. Жданов В.М., Выгодчиков Г.В., Ершов Ф.И., Ежов А.А., Коростелев Н.Б. Занимательная
микробиология. М.: Знание, 1967.
10. Жизнь растений. М.: Просвещение, 1974, 1976. Т. 1, 2.
11. Издательское оформление публикаций и библиографических записей в списках
литературы /Сост. Г.Ф. Низяева, ред. Г.П. Кочмарева – http://www.kcs.iks.ru
12. Классификация и систематика вирусов – http://www.biblus.ru
13. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и
вирусология. Учебник. СПб: Специальная литература, 1998.
14. Криштопа А.Н. Систематика живого мира. Краснодар, 2006.
15. Международный кодекс зоологической номенклатуры. СПб., 2000.
16. Международный кодекс ботанической номенклатуры. СПб., 2001.
17. Определитель бактерий Берджи /под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др., в 2 –х т.
М.: Мир, 1997.
18. Постановление главного санитарного врача Российской Федерации от 28 ноября 2002 г.
N 44 «О введении в действие санитарно–эпидемиологических правил и нормативов
СанПиН 2.4.2.1178-02».
19. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие /под ред. Н.С. Егорова. М.: МГУ, 1976
20. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М.
Захарчук и др. Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Академия, 2005.
21. Простейшие – www.pirx.com/droplet .
22. Протисты: Руководство по зоологии. Ч. 1. СПб.: Наука, 2000.
23. Селибер Г.Л., Кацнельсон Р.С., Скалон И.С., Катанская Г.А. Микробиология в опытах.
Пособие для учителя. М.: Издательство Академии наук, 1953.
24. Серавин Л.Н. Простейшие… Что это такое? Л.: Наука, 1984.
25. Хаусман К. Протозоология: Пер. с нем. М.: Мир, 1988.
26. Цифры и факты //Наука и жизнь. 2007. № 1. С. 30.
27. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. М.: Мир, 1987.
28. Яковенко Л.В. Нанобы – новая форма жизни //Биология. 2003. № 23.
29. Classification by genome type – http://www.encyclopedia.dictionary.com
1.
2.
36