ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ ЛЕНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. А.С. ПУШКИНА Кафедра естествознания и географии КУРСОВАЯ РАБОТА по дисциплине Основы биотехнологии Применение бактериальных препаратов для деструкции нефтепродуктов во внешней среде Обучающейся 2 курса очной формы обучения направления 19.03.01 Биотехнология, профиль - молекулярная биология Научный руководитель Доктор биол. наук, профессор ______________ (подпись) ______________ (подпись) Санкт-Петербург 2024 г. Усовой Лилии Ивановны Терлецкий Валерий Павлович Содержание Введение .................................................................................................................. 3 Глава 1. Основные механизмы действия бактерий при деструкции нефтепродуктов ..................................................................................................... 5 1.1 . Метаболизм бактерий, разрушающий нефтепродукты ....................... 5 1.2. Процессы биодеградации нефтепродуктов ................................................ 6 1.3. Факторы, влияющие на эффективность бактериальной деструкции нефтепродуктов .................................................................................................... 8 Глава 2. Оптимизация бактериальных препаратов .................................... 11 2.1. Генная инженерия и биотехнологические подходы к созданию эффективных бактериальных препаратов ....................................................... 11 2.2. Подбор оптимальных условий для максимальной активности бактерий при деструкции нефтепродуктов ...................................................................... 13 Глава 3. Практическое применение бактериальных препаратов в удалении нефтяных загрязнений ..................................................................... 15 3.1 Биоремедиация загрязненных почв и водоемов ....................................... 15 3.2 Применение бактериальных препаратов в очистке промышленных объектов и нефтеперерабатывающих заводов ................................................ 18 Глава 4. Экологические и экономические аспекты применения бактериальных препаратов .............................................................................. 20 4.1 Влияние биоремедиации на экосистемы и биоразнообразие .................. 20 4.2 Экономическая эффективность использования бактериальных препаратов........................................................................................................... 21 4.3 Перспективы и вызовы, стоящие перед применением бактериальных препаратов в деструкции нефтепродуктов ...................................................... 24 Заключение ........................................................................................................... 29 Список использованных источников ............................................................. 30 2 Введение Нефть и нефтепродукты являются приоритетными загрязнителями всех компонентов биосферы - почвенного покрова, растительности, поверхностных вод и атмосферного воздуха. Экологические последствия загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами зависят от параметров загрязнения, свойств почвы и характеристик внешней среды. Загрязненная почва в результате резкого снижения биологической продуктивности и физико-химических свойств не способна полноценно выполнять свои экологические функции [20]. В последние годы проблема нефтяных загрязнений становится все более актуальной. Развитие промышленности и транспорта требует увеличении добычи нефти как энергоносителя и сырья для химической промышленности. Нефть, являясь самым распространенным источником топлива в мире, относится к наиболее опасным загрязнителям биосферы, в том числе и водной среды. Нефтяные загрязнения подавляют развитие зоо- и фитопланктона, замедляют процессы минерализации органических веществ, повышают окисляемость воды, меняют ее солевой состав [2]. В связи с этим настоящим экологическим бедствием являются разливы нефти и нефтепродуктов на поверхности морей и океанов. Так, при транспортировке нефти в Мировом океане по разным данным ежегодно разливается от 5 до 16 млн. т нефти [2, 19]. Решающая роль в разложении углеводородов в море и включении последних в общий круговорот углерода в океане принадлежит микроорганизмам [17]. Несмотря на наличие механизмов самоочищения моря, в экстренных ситуациях необходимо применение дополнительных мер для ликвидации нефтяного загрязнения. Одним из наиболее перспективных способов устранения поллютантов является биоремедиация акватории с помощью метаболического потенциала микроорганизмов [15]. Использование микробных препаратов является наиболее безопасным способом ликвидации последствий нефтяного загрязнения. В настоящее 3 время изучено множество микроорганизмов-нефтедеструкторов и способов их применения [4]. Актуальность работы заключается в том, что применение бактериальных препаратов для деструкции нефтепродуктов во внешней среде является наиболее эффективным и перспективным способом защиты природной среды от антропологического воздействия, связанного с добычей и использованием нефтепродуктов. Цель: изучить применение бактериальных препаратов для деструкции нефтепродуктов. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить механизмы действия бактерий при основные способы применения деструкции нефтепродуктов. 2. Выделить бактериальных препаратов в настоящее время. 3. Рассмотреть использование бактериальных препаратов с экологической, экономической и практической точек зрения. Объектом исследования являются бактерии. Предмет исследования – бактериальные препараты. 4 Глава 1. Основные механизмы действия бактерий при деструкции нефтепродуктов 1.1 . Метаболизм бактерий, разрушающий нефтепродукты Способность усваивать микроорганизмам, углеводороды представленным нефти различными присуща систематическими группами. К ним относятся различные виды микромицетов, дрожжей и бактерий. Микромицеты — это грибы — эукариотические организмы, такие как плесень, мучнистая роса и ржавчина, которые имеют микроскопические структуры, продуцирующие споры [10]. Наиболее активные деструкторы нефти встречаются среди бактерий. Они характеризуются способностью к усвоению широкого спектра углеводородов, включая и ароматические, обладают высокой скоростью роста и, следовательно, представляют большой практический интерес. Деструкторы - (сапротрофы) организмы, питающиеся мёртвым органическим веществом. В зависимости от способа питания деструкторы делятся на детритофагов и редуцентов. Детритофаги - организмы, способные разложить (разрушить) крупные органические молекулы на составные части. К ним относятся черви, улитки, мокрицы. Редуценты - микроорганизмы (бактерии и грибы), разрушающие остатки мёртвых растений и животных и превращающие их в неорганические соединения. Таким образом основная биологическая функция деструкторов - минерализация органического вещества [10]. Углеводородокисляющая группа микроорганизмов природного происхождения таксономически очень разнообразна. Наиболее активные бактериальные штаммы относятся к родам: Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter, Flavobacterium, Corynebacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Nocardia, Brevibacterium, Mycobacterium, Beijerinkia, Bacillus, Enterobacteriaceae, Klebsiella, Micrococcus, Sphaerotilus. Среди актиномицетов внимание привлекает многочисленный род Streptomyces. Из дрожжей выделяют род Candida и Torulopsis [14]. 5 Многие исследователи предполагают, что клетки потребляют эмульгированный субстрат с помощью поверхностно-активных веществ (ПАВ). Эмульгирование - процесс смешивания двух или более несмешиваемых жидкостей. Это позволяет получить эмульсию – смесь двух взаимно нерастворимых жидкостей [20]. Поэтому способность к синтезу естественных поверхностно-активных веществ (ПАВ, биосурфактантов, биоэмульгаторов), обнаруженная у многих микроорганизмов-деструкторов, имеет решающее значение для эффективности процесса биодеградации и обуславливает способность бактерий усваивать углеводороды [11, 18]. Многие исследователи отмечают, что в процессе непосредственного взаимодействия углеводорода и микроорганизма важную роль играет строение клеточной стенки, то есть гидрофильно-гидрофобные свойства поверхности. Поверхностная активность и гидрофобный характер способствуют взаимодействию между микроорганизмом и нерастворимым субстратом, что дает возможность преодолеть ограниченную диффузию при его транспорте в клетку [11, 19]. 1.2. Процессы биодеградации нефтепродуктов Биодеградация (биологический распад, биоразложение) — разрушение сложных веществ, материалов, продуктов в результате деятельности живых организмов; чаще всего при упоминании биодеградации подразумевается действие микроорганизмов, грибов, водорослей [1]. Окисление отдельных классов углеводородов, входящих в состав нефти, в частности микробиологическое окисление, изучается в настоящее время довольно подробно, существует достаточно много работ по этим вопросам. Выделяют следующие наиболее общие этапы трансформации нефти [11]: разрушение 1) физико-химическое алифатических и частично углеводородов; 2) микробиологическое микробиологическое разрушение низкомолекулярных структур разных классов, новообразование смолистых веществ; 3) трансформация высокомолекулярных соединений смол, асфальтенов, полициклических углеводородов. 6 Углеводороды, попавшие дальнейшей деструкции дегидрогеназ и алифатическое в под гидролаз), микробную влиянием которые гидроксилирование, клетку, подвергаются эндоферментов (оксигеназ, осуществляют ароматическое и окислительное дезаминирование, гидролиз и т.д. Углеводороды в результате биохимических реакций окисляются до СО2 и воды или превращаются в соединения, утилизируемые другими микроорганизмами [9, 19]. Деструкция нефтяных отходов углеводородокисляющими бактериями изображена на рисунке 1. Рисунок 1. Биодеструкция нефтяных отходов бактериями [30] Наиболее активно утилизируются углеводороды с прямой цепью, нпарафины с длиной цепи С12-С22. В зависимости от условий они разлагаются на 10-90% в течение 1-2 месяцев при первоначальном суммарном содержании нефтяных углеводородов 0,5-2%. Большинство микроорганизмов не ассимилируют н-алканы, содержащие в цепочке менее 9 атомов углерода. Их окислять способны бактерии родов Flavobacterium, Mycobacterium, Nocardia. микробного Низкомолекулярные сообщества, н-алканы однако обычно вследствие угнетают летучести их развитие действие непродолжительно. Н-алканы с длиной цепи более С20 при температуре окружающей среды представляют собой вязкие жидкости либо твердые вещества, поэтому транспорт их к клеткам затруднен. В смеси с н-алканами с меньшей длиной цепи они находятся в виде жидкости и потребляются относительно легко [16, 26]. 7 Более устойчивы к окислению изоалканы, циклоалканы и ароматические углеводороды. Многие из них в виде моносубстратов не потребляются микроорганизмами, они разлагаются в режиме соокисления с другими более доступными углеводородами. Биодеградация тяжелых фракций нефти, содержащих смолы и асфальтены, затруднена устойчивостью к воздействию ферментов и малой способностью их диспергироваться в жидкой среде. Они содержат большое число полиароматических соединений с конденсированными ядрами, из них относительно биодеградируемы только соединения с тремя и четырьмя ароматическими кольцами. Биодеградация (биологический распад, биоразложение) — разрушение сложных веществ, материалов, продуктов в результате деятельности живых организмов; чаще всего при упоминании биодеградации подразумевается действие микроорганизмов, грибов, водорослей [5]. Время полураспада этих соединений варьирует от 3 до 2000 недель. Для почвенной среды средние скорости минерализации тяжелых фракций нефти, ила и сырых остатков варьируют между 0,02-0,6 г углеводородов на 1 кг почвы в сутки. В подпочвенных горизонтах скорость разложения даже наиболее доступных фракций нефти составляет 0,01-0,02 г/кг в сутки, т.е. меньше, чем на поверхности. За год в субтропиках биодеградируется ~ 40% нефти, оставшейся в почве после фотохимического разложения и испарения. В условиях холодного климата биодеградация нефти вследствие низкой активности естественных процессов может длиться десятки лет [24]. 1.3. Факторы, влияющие на эффективность бактериальной деструкции нефтепродуктов Биологический метод очистки почв и акваторий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами предполагает использование природных микроорганизмов-деструкторов. Существует 3 основных направления биологической очистки почв [8]: 8 Биообработка твёрдой фазы. Обеспечение оптимальных условий для развития собственной почвенной микрофлоры. Биообработка в реакторах. Обработка почвы в виде пульпы в биореакторе, в котором обеспечивается за счёт перемешивания контакт микроорганизмов с водонерастворимыми загрязнителями и создаются условия для осуществления процесса микробной деградации. Биообработка in situ. Внесение в почву микроорганизмов- деструкторов загрязнений. Для успешного применения биотехнологий необходимо предварительное решение следующих задач [6]: определение химической природы загрязнителя; количественная оценка загрязнителя; растворимость загрязнения; опеределение уровень возможной биодеградации загрязнения; почвенная проницаемость. Основным преимуществом биотехнологий очистки нефтезагрязненных почв и вод является использование природных углеводородутилизирующих микроорганизмов. Это делает их более экологически безопасными по сравнению с механическими и физико-химическими методами удаления нефтяных загрязнений, так как подразумевает использование микроорганизмов, изначально выделенных из образцов почв и вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Вводимые в загрязненные экосистемы микроорганизмы, как правило, не являются для нее чужеродным агентом, что происходит при использовании различных химических способов очистки (адсорбенты, диспергенты) [6]. Условия, необходимые для деградации нефти микроорганизмами определили еще в 1928 г [4]: наличие воды и минеральных солей, наличие источников азота и фосфора, 9 присутствие свободного кислорода, нейтральное значение рН. Температура 30-40ОС Максимальное содержание нефти в среде не более 5-10% А так же микроорганизмы обладают свойством избирательного отношения к различным углеводородам, причем эта способность определяется не только различием в структуре вещества, но даже и количеством углеродных атомов, входящих в структуру. В благоприятных условиях основной процесс биодеструкции может протекать 3-4 недели, при этом численность углеводородокисляющих микроорганизмов увеличивается в 100-1000 раз, изменяется численность других гетеротрофных микроорганизмов [4]. 10 Глава 2. Оптимизация бактериальных препаратов 2.1. Генная инженерия и биотехнологические подходы к созданию эффективных бактериальных препаратов Развитие технологий геномного секвенирования, биоинформационного анализа и создания рекомбинантных ДНК, а также знания о генетике, физиологии и биохимии бактерий являются мощной базой для практического применения рекомбинантных микроорганизмов в практических целях, в том числе и для создания наиболее эффективных бактериальных препаратов для деструкции углеводородных загрязнений [28]. Секвени́рование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности (от лат. sequentum — последовательность). В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде [Рис. 2]. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов (next-generation sequencing) и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК или полных геномов организмов [10]. Рисунок 2. Секвенирование генома и экзома [32] 11 В настоящее время активно ведётся поиск микроорганизмов, разрушающих нефть, в особенности при низких температурах. Активные формы микроорганизмов выделяются из разнообразных водных и почвенных экосистем, особенно загрязнённых углеводородами или нефтью, а также из микрофлоры нефти и пластовых вод нефтяных месторождений [23]. ДНК-диагностика это - один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. В основе такой диагностики лежит ДНК-гибридизация. ДНК-мишень фиксируют на мембране, затем на мембрану наносят меченый ДНК-зонд, проводят гибридизацию и выявляют гибридные молекулы путем идентификации метки [28]. Т.В. Коронелли с группой коллег с целью выбора штамма, сохраняющего в наибольшей степени углеводородокисляющую активность при низких температурах, углеводородокисляющих провели бактерий (роды скрининг всей коллекции Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus) в агаризованной среде с парафином при температуре плюс 6°С. Отобранные таким образом 17 штаммов выращивали в жидкой среде с нефтью при плюс 8°С. Через 14 суток определяли концентрацию нефтяных углеводородов методом ИК-спектроскопии. Оказалось, что 12 штаммов использовали от 13 до 36% внесенной нефти, два штамма – 5- 6%, а три были неэффективными. Все 12 штаммов являлись представителями рода Rhodococcus: 11 принадлежали к виду R. Erythropolis; один – к виду R. Maris [14]. Немалый интерес представляют спорообразующие бактерии, так как они наиболее устойчивы к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды [23]. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородных загрязнений должен производиться с учетом ряда требований. При поиске микроорганизма-деструктора необходимо учитывать, что вносимая в почву микробная биомасса не должна быть чужеродной для почвенной микрофлоры. Еще одним важным требованием к вносимым в почву 12 микроорганизмам является их непатогенность. В связи с тем, что технология микробиологической очистки загрязненных почв предусматривает аэробные условия, необходимо вести выбор микроорганизма-деструктора среди аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов. Микробные клетки могут подвергаться воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, следовательно, микроорганизм-деструктор должен обладать высокой жизнестойкостью [23]. 2.2. Подбор оптимальных условий для максимальной активности бактерий при деструкции нефтепродуктов Специфичность применения бактериальных препаратов в отличие от физических и химических способов деструкции нефтяных загрязнений в биосфере заключается в том, что такие препараты требуют определенных условий для наиболее эффективного действия. Использование живых организмов в технологических целях невозможно без соблюдения определенных требований для осуществления жизнедеятельности выбранных организмов. Суть биотехнологического аспекта заключается еще и в том, чтобы направить эту жизнедеятельность в выгодное русло, сделать инструментом решения поставленной задачи, поэтому соблюдение условий, необходимых для максимальной активности бактерий в этом случае очень важно [3]. Учеными разработано множество бактериальных препаратов для биодеградации нефтяных продуктов на основе различных видов бактерий, но для большинства препаратов характерны общие рекомендации к применению. Главными микробного компонентами действия, нефти, оказываются которая является насыщенные объектом углеводороды. Биодеструкция сырой нефти, происходит интенсивнее, где содержание насыщенных углеводородов до 70%, чем в нефтепродуктах, где их 6-10%. В тех случаях, когда преобладает фракция ароматических углеводородов, скорость бактериального разложения нефтепродуктов еще меньше [Таб. 1]. 13 Таблица 1 Классификация компонентов нефтей по их способности к биодеградации [10, 24] Группа Отношение к Степень воздействию биодеградации, микроорганизмов % к исходному, Компоненты нефти содержанию I Высокочувствительные 80-100 н-алканы; изо-алканы II чувствительные 60-80 цикланы с 6, 1, 5 и двумя кольцами; Sароматика; моноароматика III умеренно 45-60 чувствительные циклоалканы с 3 и 4 кольцами; триароматические УВ IV устойчивые 30-45 тетраароматические УВ; стераны; тритерпаны; нафтеноароматические УВ V высокоустойчивые 0-30 пентаароматические УВ; асфальтены; смолы Установлено, что температура, при которой происходит деструкция, влияет на скорость реакции расщепления углеводородов и характер продуктов, которые образуются в процессе биоразложения. Наибольшая активность биоразложения наблюдается при температуре 25-300°С [15]. Ученые активно работают над созданием высокотехнологичных бактериальных препаратов, способных к биоремедиации при более низких температурах и при большем процентом содержании углеводородов в среде [17]. 14 Глава 3. Практическое применение бактериальных препаратов в удалении нефтяных загрязнений Для 3.1 Биоремедиация загрязненных почв и водоемов биоремедиации используются различные бактериальные препараты, способные разрушать и потреблять загрязнения. Биоремедиация — комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с использованием метаболического потенциала биологических объектов — растений, грибов, насекомых, червей и других организмов [24]. Одним из наиболее перспективных направлений совершенствования процессов биоремедиации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, является использование потенциала не только микробных, но и других природных сообществ разных трофических уровней и, в первую очередь, травянистых растений, которые могли бы не только удалять загрязнители, но и способствовать восстановлению потенциального плодородия почв [20]. Для водоемов так же в комплексе с бактериальными препаратами используются адсорбенты растительного происхождения для локализации нефтяных пятен более эффективной их дальнейшей биодеградации. Биоремедиация эффективна в экологическом плане за счет того, что средства биодеградации загрязнений, устраняя нефтяные отходы, полностью внедряются в экосистему, не создавая негативных последствий. Они наоборот способствует разнообразию бактериальной фауны и росту популяций гетеротрофов на микробиологическом уровне [20]. Биоремедиация может быть классифицирована на два типа: in-situ и exsitu. Биоремедиация in-situ включает в себя лечение загрязненного участка путем введения микроорганизмов или питательных веществ для усиления роста существующих микроорганизмов. Биоремедиация ex-situ включает в себя удаление загрязненной почвы или воды и обработку ее в контролируемой среде [20]. Применение бактериальных препаратов относится к такому методу биоремедиации, как биоаугментация. Этот метод включает в себя добавление 15 конкретных бактерий или грибов к водоемам, чтобы повысить их способность к деструкции загрязняющих веществ. Добавленные бактерии или грибы могут быть природными или генетически модифицированными для расширения их возможностей и для разрушения загрязняющих веществ [20]. Практическое применение бактериального препарата для деструкции нефтепродуктов на примере препарата «Эконадин» [29]: Биотехнологический метод с использованием биопрепарата «Эконадин» применяется в едином комплексном решении ликвидации нефтяного разлива после сбора основного загрязнения механическими средствами. Использование биотехнологии с применением препарата «Эконадин» в арсенале средств для быстрого реагирования при ликвидации нефтяного загрязнения воды и почвы позволяет [29]: 1) Блокировать в сжатые сроки загрязнения и предупреждать его распространения. 2) Ликвидировать загрязнение с минимальным экологическим ущербом. 3) Обеспечивать дальнейшее действие по восстановлению природных биоценозов с привлечением и стимуляцией самоочищающихся биологических механизмов. Несомненными преимуществами этого метода является эффективность, экономичность, экологическая безопасность, технологическая гибкость и отсутствие вторичных загрязнений. Необходимое количество препарата 1: 4, 1: 8 (1 кг препарата на 4-8 кг нефтепродуктов). При значительном загрязнении необходимое количество препарата определяется следующим образом [29]: Определяется средняя толщина пленки нефтепродукта на твердой поверхности, воде или почве h (мм) примерно определяется площадь нефтяного пятна S (м2) рассчитывается объем нефтепродукта по формуле [29]: 16 Vн = h × S Тогда необходимое количество препарата составляет по объему [29]: V = (1 ... .2) × Vн При ликвидации нефтеразливов также используют сорбирующие боновые заграждения в сочетании с естественным сорбирующим материалом - соломой. Главными компонентами нефти, которая является объектом микробного действия, оказываются насыщенные углеводороды [3]. Биодеструкция сырой нефти, происходит интенсивнее, где содержание насыщенных углеводородов до 70%, чем в нефтепродуктах, где их 6-10%. В тех случаях, когда преобладает фракция ароматических углеводородов, скорость бактериального разложения нефтепродуктов еще меньше. Установлено, что температура, при которой происходит деструкция, влияет на скорость реакции расщепления углеводородов и характер продуктов, которые образуются в процессе биоразложения. Наибольшая активность биоразложения наблюдается при температуре 25-300°С [3]. Метод биодеструкции позволяет за короткий срок локализовать углеводородное пятно и предотвратить его растекание, достигая высокой эффективности очистки, что составляет около 99%. В результате сорбции образуются устойчивые агрегаты, которые легко удаляются с поверхности механическими методами. Сорбент уменьшает опасность повторного загрязнения поверхности в результате десорбции углеводородов [3]. Биологически активный сорбент на фитооснове, созданный с применением бактериальных препаратов, предназначен для комплексной очистки почвы от нефти, и нефтепродуктов, получаемый путем смешивания основных компонентов: гидрофобизированного нефтяного сорбента, концентрата почвенных бактерии, смеси семян сельскохозяйственных растений представлен на рисунке 3. 17 Рисунок 3. Восстанавливающий биологически-активный биосорбент [31] Отработанные сорбенты могут использоваться как для дорожного покрытия, заменяя грунтовую добавку, так и в производстве пористого керамического строительного материала [3]. 3.2 Применение бактериальных препаратов в очистке промышленных объектов и нефтеперерабатывающих заводов Нефтеперерабатывающая промышленность является достаточно водоемкой, в этой отрасли постоянно совершенствуются системы водоиспользования и канализации для максимально возможного сокращения водопотребления и водоотведения. Однако, несмотря на разработку и использование процессов безотходной технологии нефтеперерабатывающих производств, модернизацию средств добычи нефти, совершенствование процессов хранения и транспортировки нефтепродуктов, в целом уровень загрязнения водоемов и почв нефтепродуктами остается достаточно высоким [24]. В биохимической очистке промышленных сточных вод в 60-70-е гг. XX в. применяют как аэробные, так и анаэробные методы биологической очистки. Специфическим методом очистки некоторых видов 18 производственных сточных вод является так называемый микробный метод, впервые предложенный и реализованный в промышленных масштабах Н.Т. Путилиной для сточных вод, содержащих фенолы концентрацией до 2 г/л. Особенностью предложенного метода является использование специально выращенной монокультуры фенолразлагающих бактерий [26]. Наиболее активные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов, окисляющие в значительной степени устойчивые к биодеградации компоненты нефти, являются наиболее перспективными для создания на их основе биопрепаратов по очистке почв от нефтяного загрязнителя. 19 Глава 4. Экологические и экономические аспекты применения бактериальных препаратов 4.1 Влияние биоремедиации на экосистемы и биоразнообразие Биоремедиация является естественным и экологически чистым способом устранять антропогенные природной среды не – загрязнения. единственное свойство Однако очищение данного процесса. Биоремедиация так же способствует повышению микробиологического разнообразия в природных средах. В процессе биоаугментации бактерии разлагают нефтяные отходы на углекислый газ и воду. Увеличение популяции бактерий влечет за собой увеличение популяции микробиологических гетеротрофов, которые данными бактериями питаются, круглых червей (для почв) и планктона (для вод). Биологическая аугментация - это добавление архей или бактериальных культур, необходимых для ускорения разложения загрязняющего вещества, метод биоремедиации. В итоге в среде повышается биоразнообразие микроорганизмов, что влечет за собой постепенное увеличение численности других организмов, находящихся выше по пищевой цепи. Механизм действия бактериальных препаратов при очистке почвы заключается не только в биохимической деструкции нефти и нефтепродуктов высокоактивными бактериями, но и в активизации природных микробных биоценозов продуктами метаболизма Это действие можно отметить как исключительно положительное, но, как и любое вмешательство в природные среды, оно требует четкого контроля и наблюдения, во избежании нарушения баланса пищевой цепи на микро- и макроуровнях [7]. Биоаугментация благоприятна для загрязненных почв, которые подверглись биоремедиации, но все еще представляют опасность для окружающей среды. Это происходит потому, что микроорганизмы, которые изначально находились в окружающей среде, не выполнили свою задачу во время биоремедиации, когда дело дошло до расщепления химических 20 веществ в загрязненной почве. Разрушение исходных бактерий может быть вызвано стрессом окружающей среды, а также изменениями в популяции микроорганизмов из-за частоты мутаций. Когда добавляются микроорганизмы, они потенциально больше соответствуют природе нового загрязняющего вещества, в то время как более старые микроорганизмы похожи на более старые загрязнения [15]. Однако это всего лишь один из многих факторов; размер участка также является очень важным определяющим фактором. Чтобы понять, следует ли проводить биоаугментацию, необходимо учитывать общие условия. Кроме того, некоторые высокоспециализированные микроорганизмы не способны адаптироваться к определенным условиям. Хотя биоаугментация может показаться идеальным решением для загрязненной почвы, у нее могут быть недостатки. Например, неправильный тип бактерий может привести к потенциальному засорению водоносных горизонтов, или результат восстановления может быть неполным или неудовлетворительным [25]. 4.2 Экономическая эффективность использования бактериальных препаратов Многофункциональные очистительные сооружения на нефтедобывающих и нефтеперерабатывающих заводах имеют комплексное строение, для их реализации требуется большое количество ресурсов и экономических затрат. Но они эффективны только на первых стадиях очищения сточных вод от нефтяных продуктов. На дальнейших уровнях загрязнения, при которых растворимость нефтяных отходов очень высока, они уже не имеют такой эффективности, что приводит к загрязнению почв и водоемов на молекулярных уровнях. В таких случаях наибольшую эффективность имеют бактериальные препараты для деструкции загрязняющих среду нефтепродуктов [2]. Экономическая выгода бактериальных препаратов заключается во многих аспектах. Для создания таких препаратов не требуются большие технологические затраты. В их состав входят: фитосубстрат (субстрат на 21 основе растений, оказывающий адсорбционное действие при деструкции нефтепродуктов, он связывает нефтяные отходы, создавая из рассредоточенных разливов общую массу, повышая биодеструкционное действие бактерий), минеральные вещества (увеличивают активность бактерий-деструкторов и питают загрязненную среду), колония бактерийдеструкторов, выращенная в лаборатории на питательных субстратах [20]. В сравнении со сложными техническими разработками для деструкции нефтяных отходов, в проектировании, создании, транспортировке и эксплуатации которых задействовано множество человеческих, материальных и финансовых ресурсов, бактериальные препараты являются более выгодными со всех точек зрения. В отличие от традиционных методов восстановления, таких как дноуглубительные работы или раскопки, биоремедиация не требует использования тяжелой техники или утилизации загрязненной почвы или отложений. Это делает её более устойчивым подходом к восстановлению загрязненных водоемов и почв [20]. Но стоит учесть, что бактериальные препараты эффективны на крайних стадиях деструкции нефти, что делает их использование необходимым в комплексе с очистительными сооружениями. Особенно это актуально для сточных вод нефтеперерабатывающих предприятий [20]. Научные эксперименты апробации технологии рекультивации земель на основе аборигенных штаммов проводятся уже давно и положительные результаты получены во всех опытах. Процент биодеградации углеводородов нефти составил от 58 до 90 %. Установлено, что на скорость деструкции нефти и нефтепродуктов влияют уровень и давность нефтяного загрязнения, но технология эффективна на различных типах почв, в разных климатических условиях и при разном уровне нефтяного загрязнения [Таб. 2]. 22 Таблица 2 Относительная степень нарушенности почв, содержащих различные количества нефти и нефтепродуктов [2]. №п/п Содержание Степень нарушенности почв нефтепродуктов в почве, мг/кг 1 100 – 500 повышенный фон 2 500 до 1000 умеренное загрязнение 3 1000 до 2000 умеренно опасное загрязнение 4 2000 до 5000 Опасное загрязнение (высокое) 5 свыше 5000 Очень сильное загрязнение, подлежащее санации Количество нефтепродуктов при высокой степени замазученности (280 г/кг) за один вегетационный период снижается в 4,7 раза (до 60 г/кг), а при низком уровне (120 г/кг) – в 10 раз (до 12 г/кг). Интенсивность деструкции нефтяных соединений достигается за счет внесения больших доз биопрепарата на основе аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов. На одну тонну нефти вносится около 1 кг бактериального порошка. При степени загрязнения почвы от 150 г/кг до 200 г/кг необходимое количество препарата «Деворойл» составляет от 1650 кг до 2200 кг. Экономическая эффективность работы за год можно проследить по затратам на покупку порошка [1]. Порошковые препараты резко увеличивают стоимость рекультивационных работ. Обработке подверглись 11 га загрязнённой поверхности почвы. Стоимость рекультивационных работ биопрепаратом на основе порошка составляет: 1650 кг*9000 руб/кг = 14850000 руб (затраты па приобретение препарата «Деворойл» при загрязнении почвы 150 г/кг) 2200 кг*9000 руб/кг = 19800000 руб (затраты на приобретение препарата «Деворойл» при загрязнении почвы 200 г/кг) [2]. Рекультивация (лат. re — 23 приставка, обозначающая возобновление или повторность действия; cultivo — обрабатываю, возделываю) — комплекс мер по экологическому и экономическому восстановлению земель и водных ресурсов, плодородие которых в результате человеческой деятельности существенно снизилось. Целью проведения рекультивации является улучшение условий окружающей среды, восстановление продуктивности земель и водоёмов [1]. 4.3 Перспективы и вызовы, стоящие перед применением бактериальных препаратов в деструкции нефтепродуктов Наиболее известными зарубежными биопрепаратами являются американские препараты “Микробар” и “Парабан” (США). В товарном виде они представляют собой порошкообразные вещества и хорошо растворимые в воде. По данным НИИ гигиены имени Ф.Ф. Эрисмана, они деструктируют углеводороды с длиной цепи С12, однако в строго определенном диапазоне рН (6,5-7,5), солености, температуры (10-35оС) [13]. Российские ученые разработали такие препараты, как “Деворойл”, “Лестан”, “Нафтокс”, “Родотрин”, “Экойл”, “Псевдомин” и др. В состав биопрепарата “Деворойл” (Институт микробиологии предприятие “Биотехинвест”) входит консорциум микроорганизмов (в том числе дрожжи рода Candida), растущих на углеводородах различных классов и их производных. Титр живых клеток составляет не менее 108. Они устойчивых к повышенной солености (до 150 г/л NaCl), к резким колебаниям температуры (от -5 до +40°С), с активностью в широком диапазоне рН (от 4,5 до 9,5), а также добавок, активизирующих процесс биодеструкции нефти, при интенсивности загрязнения почвы нефтью более 5%. Высокая эффективность применения «Деворойла», по данным разработчиков, определяется тем, что в состав препарата входят лиофильные и гидрофильные микроорганизмы: бактерии, окисляющие нефтяные алканы и ароматические соединения, в частности фенол, крезол и пирокатехин; дрожжи, характеризующиеся высокой нефтеокисляющей активностью и способные выделять в среду аминокислоты, витамины и поверхностно-активные вещества. Выгодным 24 отличием этого препарата от ряда других является его способность работать и на границе контакта с углеводородами, и непосредственно в толще нефтяного слоя. Используемые другими представителями почвенного биоценоза продукты жизнедеятельности бактерий и сами клетки отмирающих бактерий легко усваиваются сапрофитной микрофлорой биоценоза [13]. Доза внесения препарата составляет 10 л на 1 м2 загрязненной почвы. Нанесение суспензии осуществляют путем дождевания с использованием специальных агрегатов. Спустя 2-3 недели после обработки препаратом проводят минеральную подкормку загрязненной почвы раствором диаммофоса и аммиачной селитры [13]. Торфяной препарат “Псевдомин” был разработан на основе штамма Pseudomonas putida, обладающего способностью использовать низкомолекулярные алканы, что позволило его применять на почвах загрязненных нефтью и нефтепродуктами. “Псевдомина” почти полностью трансформирует нефтепродукт (94,5-99,8%) [13]. Основу препарата “Олеоворин” составляет штамм микроорганизмов Acinetobacter oleovorum, являющихся аэробами, выделенными из природных биоценозов. Штамм непатогенен, нетоксичен. Имеющиеся материалы по исследованию окислительной активности препарата по отношению к углеводородам нефти свидетельствуют о его достаточно высокой эффективности. Степень очистки за 2...3 месяца составляет 75...80 % [13]. Бактериальный биопрепарат “Родотрин” содержит активный штаммдеструктор Rhodococcus erythropolis. Данный препарат прошел испытания в условиях Татарстана и Крайнего Севера. Через 3 месяца после обработки была достигнута высокая степень очистки почвы от нефти и нефтепродуктов [13]. В настоящее время возможны два подхода к очистке от нефтезагрязнений: на месте и в биореакторах и биомодулях. В первом случае для биоразложения строят полигон площадью несколько гектаров, 25 организуют аэрацию, периодически вносят минеральные удобрения и перепахивают грунт, во втором - биообезвреживание проводят в специальных реакторах с подогревом, куда перевозят замазученные почвогрунты, осадки и нефтешламы. Процесс разложения нефтепродуктов бактериальными препаратами - медленный: в условиях полигона - три летних месяца, в реакторах - 7 и более дней. Степень очистки грунта от нефтепродуктов - 80...90 % [12]. Для условий России, биообезвреживание грунтов открытым способом малоэффективно, и очистить грунт до норматива за летний период на широте выше положения г. Москвы не удается. Для низких средних температур разрабатываются закрытые биореакторы изотермического типа. Такие реакторы могут работать круглогодично за счет поддержания оптимальных температурных условий, необходимых для размножения микроорганизмов и биоразложения нефтепродуктов [12]. Конструктивно подается биореакторы загрязненный представляют нефтепродуктами грунт собой и камеру, внутри куда которой осуществляется перемешивание грунта и периодическая дозированная подача воды, удобрений и микрофлоры. Перед загрузкой в биореактор грунт измельчается с помощью культиватора, так как чем меньше размер частиц грунта, тем выше диффузия экотоксикантов к микроорганизмам. Использование микробиологических препаратов часто рассматривают как альтернативу агротехнической биорекультивации. Существуют ситуации, когда использование специальных микробиологических препаратов просто необходимо. В частности, это оправдано для районов с непродолжительным теплым периодом, где внесением интродуцента можно искусственно усилить процессы биодеструкции нефти в почве [12]. При благоприятных условиях среды (оптимальная температура, соленость, рН, достаточная степень аэрации, обеспеченность элементами минерального питания) удачно подобранная культура или смесь штаммов способны за короткое время практически полностью утилизировать десятки 26 тонн нефтяных углеводородов, трансформируя их в органическое вещество собственной биомассы, углекислый газ и безвредные для окружающей среды продукты [12]. В 1994 г. произошла Усинская катастрофа - серия прорывов на нефтепроводе Харьяга - Усинск, вызванная его изношенностью. Тогда вылилось около 100 тыс. тонн нефти, что позволило считать эту аварию самым крупным разливом нефти на суше. В пяти поселках была объявлена чрезвычайная экологическая ситуация. В месте катастрофы почти полностью уничтожена фауна и флора. Многочисленные притоки рек, озера отравлены. Тонны нефти, попавшей в многочисленные притоки Печоры, на много лет поставили под удар жизнь и здоровье людей, населяющих не только эти места, но и прилегающие районы. Особую тревогу вызвала возможность попадания нефти в Баренцево море. Негативные экологические последствия могли затронуть Канаду, США и ряд стран Северной Европы [12]. Успешные проекты биоремедиации с применением бактериальных препаратов: В 2010 году в результате разлива нефти на платформе Deepwater Horizon в Мексиканском заливе в морскую экосистему попали миллионы баррелей сырой нефти. Ученые и инженеры-экологи обратились к биоремедиации. Они завезли в пораженные участки бактерии, питающиеся нефтью (такие как Alcanivorax). Эти бактерии поглотили углеводороды нефти, эффективно разлагая ее. Результатом является значительное снижение загрязнения масла с течением времени. Биоремедиация может стать мощным инструментом смягчения последствий крупномасштабных разливов нефти, способствуя естественным процессам восстановления [12]. Успешно выполненные задачи биеремедиации с применением бактериальных препаратов [2]: В регионах с высоким содержанием мышьяка в грунтовых водах (распространено в некоторых частях Бангладеш и Индии) успешно применяется биоремедиация. Исследователи выявили устойчивые к мышьяку 27 бактерии (Bacillus, Pseudomonas), которые способны превращать токсичный неорганический мышьяк в менее вредные органические формы. Инокулируя загрязненную почву этими бактериями, они способствовали удалению мышьяка. Бактериальные препараты могут преобразовывать токсичные металлы, делая загрязненную почву более безопасной для сельского хозяйства и проживания людей. Река Рейн в Европе столкнулась с серьезным загрязнением из-за промышленных сбросов, в том числе токсичных химикатов, таких как хлорированные растворители. Усилия по биоремедиации включали введение специфических бактерий, способных разлагать эти соединения. Со временем качество воды в реке значительно улучшилось. Адаптация микробных сообществ к борьбе с конкретными загрязнителями имеет решающее значение для успешной биоремедиации в сложных экосистемах. На свалках образуется фильтрат — токсичная жидкость, содержащая органические и неорганические загрязнители. Метаногенные археи играют жизненно важную роль в расщеплении органических веществ и снижении их токсичности. Повышая активность этих микробов, операторы свалок могут более эффективно управлять фильтратом. Трихлорэтилен (ТХЭ) является распространенным загрязнителем подземных вод, образующимся в результате промышленной деятельности. Исследователи выделили бактерии Dehalococcoides, которые могут дехлорировать ТХЭ в безвредный этилен. Биоремедиация in situ с использованием этих бактерий позволила успешно очистить участки, загрязненные ТХЭ. Некоторые растения, известные как гипераккумуляторы, могут накапливать в своих тканях тяжелые металлы, такие как кадмий. Исследователи объединили фиторемедиацию (с использованием растений) с помощью бактериальных препаратов. Некоторые бактерии усиливают поглощение металлов корнями растений, способствуя удалению кадмия из загрязненной почвы [12]. 28 Заключение В данной курсовой работе были рассмотрены бактериальные препараты для деструкции нефти во внешней среде, механизмы их действия, оптимизации и применении в настоящее время технологии. Механизм действия биодеструкторов заключается в том, что бактерии, выделенные из сред с большим содержанием различных углеводородных соединений, используют углеводороды для своего жизненного цикла, разлагая их на углекислый газ и воду. Немаловажно их свойство поглощать взвешенные в водной среде скопления нефтепродуктов. Благодаря этому адсорбционному свойству, применение бактерий-нефтедеструкторов эффективно как на суше, так и в воде. Применение биодеструкторов нефтяных отходов было предложено в середине прошлого века. Метод заключается в том, что в загрязненную нефтяными отходами среду вводят препарат на растительной основе с большим содержанием бактерий-нефтедеструкторов. Использование бактериальных препаратов для деструкции нефти во внешней среде – актуальный, экологичный и экономически выгодный способ восстановления загрязненных участков природных сред. Их применение способствует очищению почв и водоемов, повышению микробиологического биоразнообразия и сохранению природных сред от антропогенного воздействия. Создано множество препаратов, включающих различные виды бактерий, и предназначенных для разных сред и задач. Бактериальные препараты для деструкции нефтяных отходов - неотъемлемая часть сохранения здоровой экологической обстановки не только в России, но и по всему миру. На данный момент актуальной задачей является создания более функциональных препаратов: с более широким способом применения, менее зависимых от внешних факторов, более выгодных экономически. Бактериальные препараты для деструкции нефти во внешней среде – перспективный продукт, призванный сохранять природу нашей планеты. 29 Список использованных источников 1. Абиева Л.К. Экологическое состояние почвенного покрова территории нефтегазовых промыслов Восточного Прикаспия. Нефть и газ, 2004. С.105-109. 2. Арене В.Ж, Гридин О.М. Экология и промышленность России, 2006. С. 3-37. 3. Арене В.Ж., Гридин О.М. Эффективные сорбенты для ликвидации нефтяных разливов. Экология и промышленность России, 2006. С. 30-37. 4. Бутаев А.М., Кабыш Н.Ф. О роли углеводородокисляющих микроорганизмов в процессе самоочищения прибрежных вод. Вестник Дагестанского научного центра РАН, 2002. С. 44-51. 5. Войно Л.И. Биодеградация нефтезагрязнений почв и акваторий. Фундаментальные исследования, 2006. С. 46. 6. Волкова С. Р., Орлова А. С., Красноперова С. А. Экологический мониторинг загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на примере нефтяного месторождения Удмуртской Республики. Сборник тезисов IX научно-практической конференции. Совет молодых специалистов АО «Белкамнефть» им. А.А. Волкова. Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2019. С. 53-58. 7. Гриднева В.В., Куликова И.Ю. Аборигенные углеводородокисляющие микроорганизмы в биоремедиации Северного Каспия от нефтяного загрязнения. Юг России: экология, развитие, 2010. С. 78-80. 8. Давыдова С.Л., Тагасов В.И. Нефть и нефтепродукты в окружающей среде. М.: Изд-во РУДН, 2004. С. 2-15. 9. Дзержинская И.С., Курапов А.А. и др. Микроорганизмы в процессах деструкции и биоремедиации (проблемные лекции). АГТУ. НИИ проблем Каспийского моря.- Астрахань: Издатель: Сорокин Р.В., 2009. С. 240. 30 10. Егорова Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб. Пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995. С.66. 11. Звягинцева И. С. Деградация нефтяных масел накардиоподобными бактериями. Микробиология, 2001. С. 34-36. 12. Ильинский В.В. Гетеротрофный бактериопланктон: экология и роль в процессах естественного очищения среды от нефтяных загрязнений, 2000. С. 53. 13. Кауричев И.С. Панов Н.П. и др. Почвоведение. Под ред. Кауричева И.С. 4е изд., перераб. и доп. М.: Агропромиздат, 1989. С. 719. 14. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В. бактериоценозов Видовая водных структура экосистем углеводородоокисляющих разных климатических зон. Микробиология, 1994. С. 105-124. 15. Куликова И.Ю. Дзержинская И.С. Микробиологические способы ликвидации последствий аварийных разливов нефти в море. Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе, 2008. С. 24-29. 16. Ленглер Й., Древс Г., Шлегель Г. Современная микробиология. Прокариоты. (В двух томах). Москва: Мир, 2009. С. 84-158. 17. Миронов О. Г. Бактериальная трансформация нефтяных углеводородов в прибрежной зоне моря. Морской экологический журнал, № 1, Т. I, 2002. С. 56-66. 18. Павленко Н.И., Хенкина Л.М., Бега З.М. Эмульгирующая активность углеводородусваивающих микроорганизмов. Микробиологический журнал, 1994. С. 90-91. 19. Патин С. А. Нефть и экология континентального шельфа. – М.: Изд-во ВНИРО, 2001. С. 247. 20. Пиковский Ю.И. Трансформация техногенных потоков нефти в почвенных экосистемах. Восстановление нефтезагрязненных почв экосистем. М.: Наука, 1988. С. 254. 31 21. Плешакова Е. штаммом Dietzia maris, В. Биодеградация ее нефтяных генетические углеводородов особенности. Известия Саратовского университета, 2007. С. 54-57. 22. Сопрунова О.Б., особенности Клюянова М.А. бактериальных Эколого-физиологические штаммов, изолированных из нефтезагрязненных экосистем Нижнего Поволжья. Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе, 2008. С. 64-68. 23. Струппуль Н.Э., Сигида Е.А., Трофименко Н.Н., Коломеец Е.Р., Снопкова Н.А., Дворник А.А. Исследование нефтеокисляющей способности морских микроорганизмов Pseudoalteromonascitrea, Pseudoalteromonaselyakovii и Oceanisphaeralitoralis. Электронный научный журнал «Нефтегазовое дело», 2009. С. 11. 24. Тимергазина И.Ф. К проблеме биологического окисления нефти и нефтепродуктов углеводородокисляющими микроорганизмами. И.Ф. Тимергазина, Л.С. Переходова. Нефтегазовая геология. Теория и практика, 2012. С. 8-43. 25. Ф. М. Тимоти Биоаугментация как подход к биоремедиации почвы. Современное мнение в области биотехнологии, 1996. С. 311-316. 26. Хотимский Б.Г. Преобразование нефтей микроорганизмами. Б.Г. Хотимского, А.И. Акопиан. Л.: ВНИГРИ, 1970. С 93. 27. Шамраев А. В., Шорина Т. С. Влияние нефти и нефтепродуктов на различные компоненты окружающей среды. Вестник ОГУ, 2009. С. 642645. 28. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новосибирск: Сибирское университетское издание, 2004. С. 31-41. 29. нефтяном Юдетская А. И. Использование биопрепарата «эконадин» при загрязнении в качестве сорбента. Киев: Киевский Политехнический Институт, 2009. С. 372-373. 32 Интернет-ресурсы: 30. Microzym.ru Экобиотехнология МИКРОЗИМ. Режим доступа: http://microzym.ru/oilspills.htm (дата обращение 17.05.2024). 31. Sorbonaft.ru Восстанавливающий Биосорбонафт Режим доступа: (дата https://sorbonaft.ru/biosorbenty/vosstanavlivayushhij-biosorbonaft-florar/ обращение 18.05.2024). 32. Zemla43.ru Секвенирование генома. Режим доступа: https://zemla43.ru/sekvenirovaniya-genoma (дата обращение 17.05.2024). 33