1 10.1. АМЕРИКАНСКИЙ ГНИЛЕЦ (Histolysis infectiosa perniciosa larva apium, Pestis apium americana: англ. american foulbrood; син.: бранденбургский гнилец, вирулентный гнилец, злокачественный гнилец) болезнь печатного расплода, сопровождающаяся разложением (гниением) личинок и предкуколок. Заболевание с признаками поражения и гибели личинок было известно в Древней Греции, Риме и Египте. Аристотель (384-322 г. до н.э.) отмечает при этом неприятный запах из ульев. Об опасности поражения расплода и массовой гибели пчел сообщают Плиний Старший (/23/24/-79/) и Элиан (2 в. н.э.); Колумелла (1 в н.э.), приводя недошедшую до нас литературу, рекомендует вырезать пораженные участки сотов с расплодом, удалять больные семьи с пасеки. В последующем N.Jacob, 1568 указывает на важность удаления всего меда и излагает детальные методы борьбы, используемые в настоящее время: изъятие сотов, 3-х дневное голодание взрослых пчел, перегон их в чистые улья. Его ученик M.J.Colerus, 1604 вводит термин faule Brüth гнилой расплод, гнилец, гнилобой, получивший общее признание. Сведений о гнильце на территории нашей страны можно найти в "Переписных книгах государевых отписных пасек за 1621-1675 гг.", где сообщается: "жара пчел, вследствие появившейся на них болезни, которая называется гнилец", "пал на них гнилец и от того стало мереть 80 ульев", "все пчелы были побиты... пасеке быть в том месте непристойно". В работах 18-19 веков выдвигаются различные причины возникновения болезни, и указывается на ее заразный характер, детально приводятся признаки заболевания, отмечаются различия в сходных болезнях расплода, предлагаются меры борьбы (A.Schirach, 1766, 1770; Tessier, 1765; DellaRocca, 1790; Leuckart, 1860; 1868 и др.). На бактериальную природу гнильца впервые обратил внимание в 1868 г. Preuss, который при микроскопии мазков из погибших личинок обнаружил маленькие около 2 мкм в поперечнике тельца, которые назвал Cryptococcus alveolaris (C.Toumanoff, 1951). Микробиолог Кон, предложивший разделение бактерий по морфологии на 6 родов, показал, что обнаруженные Прейссом тела являются спорами бактерий, которые принадлежат к ряду Bacillus (Schönfeld, 1874, цит. по И.Л. Сербинов, 1910). Однако возбудитель болезни печатного расплода Bac. larvae был установлен только в 1904 году J.F.White в США и почти одновременно на территории Германии как Bac. brandenburgiensis (A.Massen, 1906; И.Л. Сербинов, 1910), в других странах этот организм фигурировал также под названием Bac. burri Cowan и Bacillus (L.F.White, 1920), в дальнейшем было принято первое наименование, предложенное L.F.White, 1906. В последующем V.Drobnikova et al, 1994 показали идентичность Bac. larvae, образующих сероватобеловатые и оранжевого цвета колонии и взаимосвязь этого микроорганизма с Bac. pulvifaciens Katznelson, 1950 возбудителя самостоятельного заболевания пчел – порошковидного расплода в США (H.Katznelson, 1950; M.Gilliam, D.K.Dunham, 1978). Сходство микроорганизмов было подтверждено в ПЦР, и они были отнесены к роду Paenilacillus (C. As h. et al, 2 1993), а затем установлены как два подвида P. larvae subsp larvae, и P. larvae subsp pulevifaciens (M.Hegndrickx et al, 1996). Американский гнилец считают наиболее опасным заболеванием медоносных пчел, из-за гибели расплода происходит резкое ослабление и последующая гибель семей. Он высоко контагиознен, и если не принять соответствующих мер, может распространиться на другие семьи пасеки и на соседние пасеки. Отнесен к числу карантинных болезней пчел, помещен в группу В, подлежащих обязательной регистрации болезней Международных Эпизоотических Бюро (МЭБ). Встречается в умеренных и субтропических зонах мира с развитым пчеловодством. По данным 1988 г. заболевание обнаружено в 58 государствах. Регистрируется 1% в Англии и Уэльсе, 3-5% в Швейцарии, 7% в Тасмании, около 1% в США (в некоторых штатах до 10%) (L.Bailley, 1981), в юго-восточных департаментах Франции установлен в 30% проб (J.P.Faucon et al, 2002), в последние десятилетия отмечено увеличение случаев выявления этого гнильца в Европе (H.Hansen, C.J.Brodsgaard, 2001). На территории бывшего СССР обнаружение гнильца составляло 56,6% от всех проб пораженного расплода. Особенно интенсивно он проявлялся в Закавказье и Средней Азии. Отдельные случаи отмечены в северных регионах до 62 с.ш. (Цветков, 1930). Экономический ущерб, наносимый американским гнильцом, значительно выше, чем от всех остальных болезней расплода. Больная семья не добирает в год от 5 до 40 кг меда и 0,5 кг воска, опылительная деятельность снижается на 30-80%. Однако основные потери связаны с уничтожением семей, вместе с ульями и сотами на неблагополучных пасеках. Ущерб возрастает из-за невозможности воспроизводства, выезда на медосбор, затраты на проведение комплекса мероприятий по предупреждению дальнейшего распространения возбудителя. Возбудитель Paenibacillus larvae subsp larvae тонкая с умеренно закругленными концами, грамположительная палочка, размером 1,5-6,0 мкм 0,5-0,6 мкм. В мазках располагаются по одиночке, но нередко в виде длинных, тонких нитей. Подвижна, перитрих, иногда сбившиеся вместе жгутики формируют характерные спирохетоподобные образования. Образуют овальные центрально или термально расположенные эндоспоры размером 1,3 0,6 мкм. Факультативный анаэроб. Температурные границы роста 20-45°С, оптимум 34-37°С. Содержание Г+Ц в ДНК 45,1 мол % (D.W.Dingman, 1983). Для роста и споруляции, культуры требуют тиамин и аминокислоты. В качестве питательных сред, содержащих ростовые вещества, используют экстракт личинок пчел (G.F.White, 1907), яичный желток с молоком (G.F.White, 1920), яичный желток с дрожжами, морковный экстракт и пептоны (Sturtevant, 1932), яичный желток с молоком (M. Jelinski et al., 1975). Для начального роста на этих средах необходим высев нескольких миллионов спор, т. к. меньше 10% их способны к прорастанию (H.Shimauski, 1963), на среде с мозго-сердечным настоем Дифко возможен посев 100 спор 3 (H.Shimauski, D.A.Knox, 1988), предложена также среда для выявления 10 спор в 1 см3 меда (D.M.T.Schuch et al, 2001); модифицированная среда Уиллиса-Гоббза с содержанием 150-180 мг % аминного азота позволяет устанавливать возбудителя при высеве 400 спор/см3 на 2-5 сутки (Е.Н. Руденко, 2003). Первоначальный рост лучше происходит в анаэробных условиях, но спорообразование только при наличии кислорода воздуха. Для культивирования используют мясопептонный агар или бульон с 10% нормальной лошадиной сывороткой крови без консерванта, рН 6,6-7,7 (среда Томашеца). Рост не всегда интенсивный, спорообразование отсутствует, для поддержания культуры пересевают через 2 недели. Лучший рост происходит на полужидком агаре с добавлением 1% дрожжевого экстракта, 1%-глюкозы, 1%-крахмала, 0,136% К2НРO4 рН 6,6 по КОН (автоклавирование при 116°С 20 минут) при 34° споры P.l. larvae прорастают на глубине 5-10 мм, на 2-3 день позднее рост распространяется по поверхности. Для споруляции вегетативные клетки переносят на агаризированные среды без глюкозы (L.Bailey, D.Lee, 1962). На кровяном агаре при добавлении 7% дефибринированной стерильной крови крупного рогатого скота или овцы: к охлажденному мясопептонному агару рост отмечают на вторые сутки. Более интенсивному росту способствует культивирование в атмосфере 5-10% СО2 (J.Lloyd, 1986). Хорошие результаты дает использование модифицированной молочножелточной среды Уиллиса-Гоббза. Используют свежие молоко и яйца. Обезжиренное молоко (60 мл) после центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10 минут или снятия пенки при кипячении стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин во флаконах вместимостью 500 мл с бусами. К охлажденному молоку стерильно добавляют один яичный желток и перемешивают до однородной эмульсии. Эмульсию нагревают до 40°С и добавляют 250 мл 2%-го мясопептонного агара, с рН 6,9-7,0 и температурой не выше 60°С. Смесь тщательно перемешивают, разливают над пламенем горелки в пробирки по 4,5 мл и скашивают. Рост отмечают на вторые сутки, спорообразование происходит в зависимости от штаммов на 3-9 сутки. Среда обеспечивает возможность учесть наличие протеаз и липаз, хранение до 1,5 месяцев без дополнительных пересевов и дает в 4-5 раз больше накопление бактериальной массы (М.Шабанов, М.Иелинский, 1978, Е.В.Руденко, 1987). P. l. larvae также хорошо растет на развивающихся куриных эмбрионах (В.И.Полтев, 1964). Колонии серовато-белые, иногда оранжевые, полупрозрачные, края неровные, локонообразные, волокнистые, центр выпуклый. При интенсивном росте через 2-3 суток колонии сливаются, разрастаются по поверхности. Мясопептонный сывороточный бульон через 24 часа мутнеет, в дальнейшем на дне пробирки образуется хлопьевидный, легко разбивающийся при встряхивании осадок. Образует кислоту без газа из глюкозы, фруктозы, галактозы, трегалозы, глицерина, вариабельна в отношении лактозы, маннита, салицина, сахарозы; взбраживает молоко, гидролизует желатину и казеин, не разлагает крахмал, образует сероводород, индол не образует. 4 Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Редукция нитратов в нитриты вариабельная. Не растет в присутствии 5% NaCl. В отличие от большинства спорообразующих бактерий P.l. larvae не разлагает перекиси водорода, на чем основан каталазный тест (W.Haynes, 1972). Протеолитические свойства устанавливают на казеине на 2 день инкубации, липазную активность в виде жемчужного слоя обнаруживают на среде с желтком яйца на 3-10 день культивирования. Липазы и протеолитические ферменты ядовиты при инъекции другим насекомым и скармливании пчелам и их личинкам (N.J.Pathel, T.A.Gochnauer, 1958; N.J.Pathel, L.K.Cutkomp, 1961; A.Borchert, 1966). Исследование 110 штаммов этого патогена по отношению к различным средам показало наличие 7 биохимических типов возбудителя (M.Jelinski, 1985). Штаммовые отличия проявляются также в содержании жирных кислот, липазной и протеолической активности возбудителя с различных пасек (Z.Glinski, 1997), различной степенью воздействия бактериофага (C. Toumanoff, 1951). Выделенные на территории Европы и Северной Америки умеренные фаги были морфологически идентичны. Их литическое действие на клетки возбудителя устанавливали через 40 мин после внесения, максимальный титр фага установлен через 120 мин и он удерживался в течение 1,5 часов (N. Bakhet, D.P. Stahley, 1988). Под действием фага микроб диссоциирует от типичных R-форм до атипичных S-форм, выпуклых, с гладкой поверхностью и ровными краями. В процессе диссоциации изменяются морфологические, культуральные и антигенные свойства. Палочки становятся короткими, грубыми, расположены одиночно или в виде палисада, расщепляют маннит, мальтозу, утрачивают типичный О-антиген и частично Н-антиген (В.А.Триленко, 1963). Жгутиковые (Н), соматические (О) и споровые антигены штаммов возбудителя из больных семей пчел различных стран и континентов показывают одинаковое антигенное строение (W.Fritsch, 1957). Исследование ДНК с помощью различных праймеров показало наличие четырех генотипов среди коллекционных штаммов P. l. larvae (A.M.Alippi et al., 2002). При росте P. l. larvae выделяет антибиотические вещества, препятствующие развитию грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, но не действуют на кислотоустойчивые бактерии. Выделяемые вещества растворимы в воде, спирте и органических растворителях, адсорбируются углем и инфузорной землей, стабильны при умеренном прогревании, но разрушаются при пастеризации и стерилизации. Наибольшие антибиотические свойства проявляют в присутствии глюкозы, они токсичны при интраперитониальном введении мышам, но не при скармливании (E.Holst, 1945). Благодаря этой особенности другие микроорганизмы в погибших от американского гнильца личинки обычно не развиваются, что позволяет в большинстве случаев выделять чистую культуру. Аналогичной способностью обладает близкородственный (90% подобия) P. larvae subsp. pulvifasciens, выделяемый ими в период спорообразования бактериоцин 5 вызывает лизис клеток возбудителей американского и европейского (Melissococcus plutonius) гнильцов. Отобранный апатогенный штамм P. l. pulvifasciens в настоящем проходит испытания (S.N. Prince, B.N. Dancer, 2000; M.S. Watkins et al., 2003). Споры возбудителя американского гнильца очень устойчивы во внешней среде, способны выживать многие годы в корме пчел, почве, сухих остатках погибших личинок. Из корочек личинок, хранящихся в запаянных ампулах, возбудителя выделили через 75-89 лет (Е. В. Руденко, 2002). В растворе антибиотиков они были жизнеспособны в течение 35 лет (Lodesane, 2001). По данным А. М. Смирнова споры способны к прорастанию через 15 лет, в вощине 5 лет, почве до 2 лет (срок наблюдения). Если вегетативные клетки в бульонной культуре погибают через 15 минут при нагревании до 60С (R.J. Rose, 1969), то споры в воде при 100 через 30 мин. (G.F.White, 1920); в воске при 121 30 мин (R.Kostecki, M.Jelinski, 1977), при 150 1,52,5 мин (M.Machova, 1993); в меде при 100 160 мин; 110 41 мин, 121 8,6 мин (E.J.Calesnick, J.W.White, 1952). Сулема в разведении 1:100 убивала споры через 4-5 дней; 5-10% раствор формалина 6 часов; 20% раствор формалина 30 минут; 1% перекись водорода, подкисленная кислотой 3 часа, 5% карболовая кислота несколько месяцев. Они сохранялись 0,5% серной кислотой 37,5 часов, в спиртовом растворе прополиса более 45 дней. При облучении на расстоянии 10 см ультрафиолетовые лучи убивали споры P.l. larvae в течение 10 минут, однако, находящиеся в корочках споры погибали только частично при воздействии на расстоянии 5 см и экспозиции 30 минут (А. Gianffret, 1965). Отмечены штаммовые различия в устойчивости спор к физическим и химическим факторам (H.Hansen, C.J. Brodsgaard, 2001), полученные в лабораторных культурах споры менее устойчивы, чем споры от естественно больных личинок (A. Borchert, 1966). Различия в устойчивости спор обусловлены генетической особенностью ДНК возбудителя, содержанием воды, дипиколиновой кислоты и металлов в них (М. Machova, 1993). Патогенность бактерии обусловлена наличием двух выявленных специфичных участков в ее ДНК, что позволило дифференцировать возбудителя от P. l. subsp pulvifasciens и других микроорганизмов в реакции цепной полимеризации (A.M. Alippi et al., 2002; D: De Graaf et al., 2003). Эпизоотология: Наряду с медоносной пчелой (Apis mellifera) этому заболеванию подвержена в Индии восковая пчела (A. cerana) (Singh, 1961), возбудитель выделен из сотов гигантской пчелы (A. dorsata). Американский гнилец экспериментально воспроизводится при заражении гнезд шершня (Vespa crabro) и oc (Vespwala vulgaris): расплод погибает на 3 день, а взрослые насекомые – через 4-6 дней. Известны случаи обнаружения спонтанного гнильца в гнездах ос (Н.С.Куликов и др., 1965). При инъекции вегетативных клеток гусеницам большой восковой огневки отмечена гибель 40-60% насекомых на 4-6 день; менее чувствительными к заражению были 6 гусеницы молочайного коконопряда (Malacosoma neustria) и непарного шелкопряда (Lymantria dispar). Травяная лягушка (Rana temporaria) при инъекции 0,05 см3 смыва 5-6 дневной культуры и содержании при 30С погибала через 12-24 часа, но при 18-24С выживала, в тоже время прудовая лягушка (R. esculenta) и зеленая ящерица (Lacerta viridis) были устойчивы при введении больших доз микроорганизма и содержании при 30С (C. Toumanoff, 1951). Устойчивы к заражению были также голуби, белые мыши, крысы, кролики, морские свинки (G.F. White, 1920; J. Tomasec, 1939). Заболевание у медоносных пчел впервые воспроизведено вскармливанием чистой культуры возбудителя (A. Maassen, 1908), однако лишь последующими исследованиями (H. Tarr, 1937) было показано, что за заражение ответственны споры бациллы. Вегетативные клетки не вызывают заболевания в семьях пчел, даже при внесении их в дозах 3000 раз превышающих количество спор, что связано с питанием молодой личинки кормом, содержащим 10-гидрокси-деценовую кислоту главного компонента липидной фракции маточного молочка с антибиотической активностью (E. Holst, 1946, Л. Н. Гузева, 1992). К заражению восприимчивы только молодые личинки в возрасте 24-28 часов, при этом 50%-летальная доза (ЛД50) составляет 8,49 спор/личинка (C. J. Brodsgaard et al., 1999), до 24 часов требуется меньше 10 спор (L. Bailey, 1963), хотя имеются и другие данные: ЛД50 для личинок P.l. larvae 350,82 спор/личинка (G.E. Buchner, 1958) или 38 спор/личинка (T. Hardie, 1978). После 48 часового возраста взаимосвязь доза-ответ недостоверна (H. Hansen, C. J. Brodsgaard, 2000), заражение личинок старше 48 часов не удается при дозе 105, для инфицирования 4-5 дневных личинок требовалась доза 107 спор (L. Bailey, 1963). Считается, что после 53 часов личинки не могут быть инфицированы. В их теле, по мере роста до 4 дневного возраста возрастает уровень ингибирующей развитие P.l. larvae активности, которая снижается к 6 дню, когда они не питаются и окукливаются. И хотя у взрослых личинок споры прорастают, вегетативные клетки не достигают эпителия кишечника и эвакуируются с фецес. Инкубационный период зависит от штамма возбудителя, особо вирулентные штаммы приводят к гибели на 2-3 день после заражения, однако обычно составляет 9-10 дней. Взрослые пчелы устойчивы к заражению американским гнильцом. Наибольшая способность подавлять прорастание спор и развитие вегетативных клеток отмечена в средней кишке 8-дневных пчел-кормилиц и у зимующих пчел. Ингибиторная субстанция последних термостабильна и сохраняет 60% активность при прогревании до 125° в течение 15 минут (U. Riessberger-Galle et al., 2000). Однако взрослые пчелы являются носителями спор P.l. larvae, которые остаются в их пищеварительном тракте более двух месяцев, сохраняя свою инфекционность для молодых личинок (W. T. Wilson, 1971, 1972). 7 К заражению восприимчивы личинки маток, рабочих пчел, трутни. Наиболее чувствительными, вероятно, являются первые. Сравнительные испытания по заражению показали гибель 93% маточных личинок, 82% личинок рабочих пчел и 68% трутней, что связано различиями корма (количеством пыльцы), получаемого этими насекомыми (T. Rinderer, W. Rothenbuhler, 1969). В естественных условиях поражение личинок маток и трутней американским гнильцом, практически не встречаются; корм для личинок маток обладает наибольшим ингибирующим эффектом (U. Riessberger-Galle et al., 2000). Заболеванию подвержены все породы пчел. Среди испытанных чистокровных итальянских, украинских и кавказских пчел ни одна порода не обнаруживала каких-либо преимуществ в отношении устойчивости. Вместе с тем отдельные семьи пчел проявляют относительно большую устойчивость к заражению. При искусственном заражении (100 спор/личинка) в восприимчивой линии пчел выживало 32,3% личинок, в устойчивой 61% (R. Jendrejak, J. Kopernicky, 2000 и др.). Источником инфекции являются погибшая личинка в запечатанном расплоде, в трупе который формируется от 1,5 до 2,5 млрд. спор. 8-19% личинок заражаются при развитии в загрязненных ячейках сотов. В основном разносчиком возбудителя внутри семьи являются внутриульевые молодые пчелы, проводящие чистку ячеек сотов. На ротовом аппарате и теле они разносят микрооранизмы по всему улью. В больной американским гнильцом семье каждый грамм взятых пчел (10 экз.) содержит 24378106 спор, перга 4,5±1,2106, мед 24,3±7,8106, восковые крышечки сотов 9,0106, на 100 см2 поверхности внутренней стенки улья находят 0,36±0,13106 спор. В не проявляющей признаков болезни зараженной семье на той же площади стенок улья можно выделить 3,5±0,13106 спор (T. A. Gochnauer, 1981). При переработке нектара в мед споры заносятся пчелами в этот продукт, где их количество может колебаться от 1 до 50 млн. спор на 1 литр меда. Расположенный близко к зараженному расплоду мед содержит больше спор, чем мед в удаленных ячейках. Фуражирующие взрослые пчелы неблагополучных семей также несут на своей поверхности и в теле споры возбудителя. Формируемая такими пчелами на своем теле обножка пыльцы содержит значительное количество спор, что неоднократно подтверждалось исследованием ее в пыльцеуловителях и в партиях, поступающих в продажу. Загрязнение кормовых запасов семьи еще более усиливает заражение находящихся в ней особей. При дефекации в полете пчелы загрязняется окружающая среда, растительность, вода, почва. Приблизительно 25% спор остается на поверхности почвы после дождя. Естественным путем распространение инфекции на пасеках от семьи к семье происходит за счет пчелиного воровства. Больные семьи пчел становятся слабыми и подвергаются разграблению запасов со стороны здоровых, сильных семей, которые чаще заражаются гнильцом. Возможно заражение семей при воровстве пчелами хранящегося меда со складов. В распространении возбудителя американского гнильца имеют значения и 8 вредители ульев: восковые моли, ветчинный кожеед, клеши и т. д. Питаясь сотами, личинками, трупами пчел они механически на теле и с калом разносят споры. Прямой связи вспышек американского гнильца и массового поражения семей пчел клещом Varroa не установлено, хотя с поверхности тела самок варроа из неблагополучных по гнильцу семей выделены споры возбудителя (A. M. Alippi, 1992). Однако необходимо учитывать два фактора: поражение клещом сокращает продолжительность жизни пчел, приводит к нарушению выкормки расплода из-за дефицита белка в организме пчел-кормилиц, что отражается на весе личинок, у них установлена повышенная активность глутатион – S – трансферазы, указывающая на испытываемый физиологический стресс (S. A. Nielsen, 2003), а следовательно повышается восприимчивость к заражению меньшей дозой возбудителя. Во-вторых, картину усугубляет использование аскарицидов для борьбы с клещем, отрицательно отражающееся на организме пчел, особенно молодого расплода. Ослабление семей пчел за счет возбудителей других болезней (европейский гнилец, варрооз, нозематоз, аскосфероз и т. д.) и отравлений также неблагоприятны из-за снижения резистентности, находящихся в семье особей. Смешанные болезни проходят более тяжело и чаще заканчиваются летально. Вместе с тем показано, что спиртовые экстракты из погибших от аскосфероза личинок пчел ингибируют рост P. l. larvae (H. Shimanuki, et al., 1992) и этот феномен обусловлен содержащейся в экстракте гриба линолевой кислоты (M.F. Feldlaufer et al, 1993). Большое значение в распространении болезни играют широко используемые в пчеловодстве приемы: подсиливание семей, объединение семей, передача рамок из одной семьи в другую, осушка сотов после откачки меда, длительная эксплуатация сотов, использование загрязненных ульев и их оборудования от больных семей. Занос возбудителя на пасеку, возможен с роями, пакетами пчел. Блуждание рабочих пчел, вероятно, не является большим фактором в распространении болезни. Количество таких перелетающих пчел обычно не превышает 6%, кроме того, они не несут с собой достаточного количества спор для возникновения заболеваний. Еще меньше может быть спор в кишечнике маток (R.M. Goodwin et al, 1994; M. A. Z. Hornets, 1998). При введении в нуклеусы маток, которым скармливали споры возбудителя признаков американского гнильца у расплода не выявлено. При отборе маток из больных семей в содержимом их кишечника P. l. larvae выявляли редко. Более 90% спор было выделено в первые 24 часа с фекалиями, но выделение длилось до 28 дней. Вызвать клинические признаки в семьях можно при вскармливании пчелам 5106 – 2109 спор/семья. ЛД50 для семьи итальянских пчел была 2,66109 (H. Hansen, C. J. Brodsgaard, 1997). Считается, что пчелиная семья способна выдержать нагрузку до 50 млн. спор P. l. larvae без проявления признаков болезни. Однако возникновение болезни зависит от индивидуальных особенностей семьи. В большинстве случаев за год до заболевания происходит накопление спор в меде, что дает возможность прогнозировать вспышки американского 9 гнильца при систематическом анализе этого продукта на пасеках (H. Hansen, B. Rasmussen, 1987). Американский гнилец возникает в любое время года при наличии расплода в семье. Наиболее интенсивное проявление наблюдают во второй половине лета, июле-августе. Перегревание семей способствует возникновению болезни. Болезнь ослабевает в период главного медосбора из-за уменьшения концентрации возбудителя, сокращения расплода, повышения резистентности личинок из-за обильного поступления пыльцы. Заболевание чаще встречают в равнинной и предгорной зонах. Обнаружение снижается с увеличением высоты (Р. П. Ибрагимов, 1964). Отмечена периодичность вспышек заболевания через 10-15 лет в Германии и Швеции (Х. Оттен, 1996). В 1990-1993 гг. также значительно возросло количество случаев американского гнильца на пасеках России, Прибалтики, Украины и Казахстана (Г. В. Кашина, Е. В. Руденко, 1994). В Польше заболеваемость американским гнильцом в районах с преобладанием в почве фульвокислот было значительно выше, чем на почвах с присутствием большого количества гуминовых кислот (R. Niemczuk et al, 1978). Патогенез: При заглатывании спор P. l. larvae вегетативные клетки прорастают в содержимом средней кишки в течение 24 часов. Палочки обладают высокой подвижностью, выделяя экстрацеллюлярную протеиназу, они мигрируют через перитрофическую мембрану, проникают в эпителиальные клетки, которые погибают. В более обеспеченной кислородом ткани процесс размножения микроорганизма усиливается. За счет фагоцитоза и самостоятельного проникновения возбудитель попадает в гемоцель насекомого, разносится по всему организму, где начинает интенсивно размножаться. В период бактериемии происходит изменения в жировых клетках, клетках желез и гемолимфе; выделяемая патогеном протеиназа подавляет активность абецина и апидецинов, выделяемых пчелой иммунных протеинов на уровне проапидецина (P. Casteels et al, 1989; Z. Glinski, J. Jarosz, 1998). Зараженная личинка до периода окукливания продолжает развиваться, она увеличивается в длину, выделяет соответствующий феромон, сигнализирующий взрослым пчелам необходимость запечатывания ячейки; плетет кокон, приступает к метаморфозу; патоген не влияет на естественный уровень апоптоза клеток в ее организме. Бактеремия личинки в возрасте приблизительно 234 часа (9,75-11 дней) в период покоя после плетения кокона, стадии предкуколки или куколки ведет их к гибели, распаду тела, споруляции бактерии. Иногда гибель личинок и образование спор может наступить до запечатывания расплода. Споры P. l. larvae в небольших количествах находили у 2-3 дневных личинок, что зависело от заражающей дозы микроорганизма. Возбудитель в погибшей личинке присутствует практически в чистой культуре. Течение и клиническое проявление. Заболевание протекает в скрытой (бессимптомной) и явных формах. Обычно бессимптомный период предшествует проявлению явных признаков. При скрытой форме возбудителя болезни обнаруживают у взрослых особей пчелиной семьи и в 10 меде. Пчелы-кормилицы значительно раньше человека распознают заболевших личинок, и большое число таких личинок до образования спор в их организме удаляются взрослыми пчелами из открытого расплода. В этот период может быть удалено до 50-90% больных особей возрастом до 4 дней. Основное изъятие приходится на возраст 0,5-1,5 дней, оставшихся больных личинок насекомые более старшего возраста стремятся удалить в последующем. Очистка гнезд от больных личинок усиливается при обилии пыльцы и поступлении нектара во время главного медосбора. При осмотре сотов опытный специалист может отметить признаки болезни только у личинки в возрасте 4 дней и старше. Единственный признак, иногда устанавливаемый при этой форме болезни, это неравномерное, пестрое расположение расплода на соте. При скрытой форме болезни происходит накопление спор возбудителя в хранившемся меде гнезда, особенно в ячейках сотов, расположенных под расплодом и вокруг него. 9,7% исследованных датских медов содержали споры P. l. larvae, но только 3,7% из них получены из семей с симптомами американского гнильца (H.Hansen, 1992), на севере Германии количество положительных проб меда на наличие патогена колебалось от 3 до 10% (W. Von de Ohe et al., 1997). Семьи могут содержать мед с большим количеством спор многие годы и не проявлять симптома болезни, корреляция между числом спор в меде и первыми признаками поражения печатного расплода не отмечено, т. к. на возникновение заболевания оказывают влияние многие факторы (сила семьи, устойчивость к заражению, медосбор т. д.). Обычно толерантность семей пчел не превышает предела загрязнения меда 2,5105 спор в грамме продукта. По мнению большинства специалистов контаминирование меда и нарастание количества спор в семьях пчел за 1 или 2-3 года предшествует появлению клинических признаков американского гнильца (H. Hansen, C. J. Brodsgaard, 1995; 2001; W. von de Ohe et al, 1997 и др.). При явной форме гнильца расплод пестрый: на соте среди ячеек нормального печатного расплода в беспорядке встречаются ячейки с проваленными крышками, с отверстиями или без них. Однако признак пестроты расплода не надежен и может наблюдаться при других поражениях. Гнильцом поражается пчелиный расплод, редко трутневый и маточный. Возраст пораженных личинок не всегда однороден, но чаще признаки болезни выявляют между 10-15 днем развития у куколок и предкуколок. При сильно развившемся заболевании возможна гибель личинок в раннем возрасте, в открытом расплоде. Личинка теряет нормальный тургор, сегментация тела нечеткая, окраска мутная, без блеска, а затем светло-бурая. Часть крышек над печатным расплодом становится окрашенной, как бы влажной. Центр крышек опускается под массой погибшей личинки, прикрепленной к внутренней стороне крышки. Некоторые крышечки имеют различные величины и формы отверстия, чаше одно, реже два и больше. Недавно погибшие личинки светло-бурого цвета, по мере разложения они становятся шоколадно темно-коричневыми; тело личинки размягчается и превращается в гнилостную массу, образующей при выделении тонкие длинные нити, что 11 является диагностическим признаком. В горных зонах и влажном климате консистенция гнильцовых остатков личинки менее клейкая и тягучая, чем в равнинной местности (A. Borchert, 1966). Погибшие куколки так же подвержены мацерации, остатки их лежат на дне ячейки, иногда с выступающей над массой язычком-остатком головного конца, редко вверх торчат членики одной или более ног. Через 20-30 дней гнилостная масса высыхает в плотную, хрупкую корочку темно-коричневого или черного цвета, плотно прилипшую к нижней боковой стенки ячейки. Загнившаяся масса имеет характерный неприятный запах столярного клея, что связано с образованием летучих жирных кислот, особенно валерьяновой кислоты (T. Gochnauer, D. Shearer, 1981). Последняя идентификация летучих субстанций в культурах возбудителя показала наличие уксусного ангидрида, диметилдисульфида, диметил-трисульфида, изопропил-пиразина, метил-изопропилпиразина и диметил-изобутил-пиразина (D. Titera et al., 2003). При интенсивном поражении расплода, пчелы покидают пораженные соты, уходят за разделительную доску и при возможности начинают строить новые соты; в некоторых случаях слетают. Но обычно, заболевшая семья пчел без оказания помощи погибает. Прогноз выживания семьи при наличии в ней весной 100 пораженных ячеек расплода отрицательный. При таком заражении гибель семей происходит в середине лета, при меньшем заражении к концу лета. Часть больных семей может пойти на зимовку, но из-за отсутствия в них молодых пчел осеннего поколения большая часть погибает зимойвесной. Зараженные семьи могут перезимовать, но в следующем сезоне они плохо развиваются, подвергаются нападению пчел сильных семей и служат источником болезни на пасеках. Патологоанатомические признаки. Е. Шишкин, 1958 выделяет 4 стадии изменений у личинок, зараженных американским гнильцом. В 1 стадии происходит изменение формы и сглаживание сегментации, на теле обнаруживают грязно-желтые пятна, тело вытянуто в длину ячейки. Обычно удаляются пчелами, содержат вегетативные клетки возбудителя, неинфекционны. 2 стадия-потеря формы и сегментации. Трупы личинок искривлены, коричневые, консистенция слизистая, появляется неприятный запах клея, полностью не удаляется пчелами, содержат споры, инфекционны. 3 стадия тело превращается в кофейно-коричневую гнилостную массу, с трудом выделяемую из ячейки, очень инфекционна; 4 стадия – в виде темнокоричневых струпов личинки, плотно прикрепленных к ячейке, инфекционны. При проникновении возбудителя в организм личинки происходит увеличение клеток в тканях, размножение эноцитов, вызванное выделением токсических веществ патогеном. В клетках эпителия средней кишки личинки возникает зернистость и вакуолизация цитоплазмы, хроматолиз и кариорексис ядер (В. И. Полтев, 1948, A. Borchert, 1966). В ядрах и цитоплазме клеток обнаружен специфический белок, гистон-80, отсутствующий у здоровых насекомых. Клетки погибают (A. Yregorc, 2000). 12 Диагностика и дифференциальная диагностика. Предварительный диагноз на явную форму болезни устанавливают по следующим признакам: наличие проваленных, потемневших крышек с отверстиями печатного расплода в гнезде, присутствие в измененных ячейках сотов гнилостной коричневой с неприятным запахом массы, образующей тонкие длинные нити при выделении: на дне и сбоку ячейки масса погибшей куколки с выступающим языком; на нижних боковых стенках ячеек сота лежат плохо отделяемые темно-коричневые или черные корочки. Из погибших личинок в полевых условиях могут быть приготовлены мазки для последующего исследования. Окончательный диагноз устанавливают в лаборатории. Согласно Мануалу стандартов диагностических тестов и вакцин МЭБ (Manual of Standards for Diagnostic testy and vaccines OYE, 1996) рекомендовано высылать в лаборатории сот размером 9 см2 (согласно "Методических указаний по лабораторной диагностики американского гнильца утвержденных ГУВ Госагропрома СССР 18.08.86г." высылают сот размером 1015 см), содержащим максимальное количество измененного расплода. Сот кладут в твердый картонный или деревянный ящик на рейки, нельзя посылать в пластмассовых мешочках, фольге, жести, бумаге, стекле, из-за возможности плесневения. В лаборатории проводят осмотр сота и выделяют материал для исследования. Для обнаружения корочек в ячейках можно использовать ультрафиолетовое освещение с длиной волны 3100-4000 Ǻ, вызывающее флуоресценцию корочек, при этом следует учитывать свечение меда и перги. Из подозреваемого материала готовят водную суспензию. Каплю, суспензии переносят на предметное стекло, сушат, фиксируют на пламени спиртовки, красят карбол-фуксином 30 минут. Мазок споласкивают водой и на влажную поверхность наносят тонкий слой иммерсионного масла, слегка промокают фильтровальной бумагой и просматривают под большим увеличением микроскопа. В каплях воды, заключенных в масло, видно броуновское движение спор P.l. larvae (споры других представителей рода Bacillus фиксируются теплом). Грам-положительные вегетативные клетки и споры возбудителя могут быть установлены под иммерсией при микроскопии мазков, окрашенных по Граму и 2% -ным спиртовым раствором карболового фуксина соответственно. Высокая протеолитическая способность спорообразующей P. l. larvae позволяет ее выявлять с помощью молочного теста Holst'a: к суспензии растертой корочки (личинки) добавляют 3-4 мл однопроцентного водного раствора обезжиренного порошкообразного молока. Пробирку инкубируют при 37С, при наличии возбудителя суспензия через 10-20 минут становится прозрачной. Для абсолютной идентификации и дальнейших биохимических тестов проводят культивирование P.l. larvae. Рекомендуется для культивирования среда ВНУмозго-сердечный настой ДИФКО, обогащенный 0,2 мг/л тиамином и среда, состоящая из дрожжевого экстракта, растворимого крахмала, глюкозы и фосфата калия с рН 6,6. Используют жидкие, полутвердые (при добавлении 0,3% агара) и твердые среды. Суспензию материала готовят в пробирке в 9 мл стерильной воды, прогревают 10 минут при 80°С и высевают на твердую 13 среду ВНJ, инкубируют 2-3 дня при 34°С до появления небольших прозрачных колоний, при большом числе спор образуется сплошной газон. Возможны затруднения из-за роста других спорогенных бактерий. При культивировании для постановки диагноза рекомендованы тесты на восстановление нитратов: к среде ВНJ добавляют 1-2 мг/л среды нитрат калия, при размножении P. l. larvae добавление капли альфа-нафтил сульфаниловой кислоты вызывает окрашивание при восстановлении нитратов до нитритов. Этот тест самостоятельно не используют. Отсутствие каталазной активности, характерное для P. l. larvae, диагностируют следующим образом: на активно растущие культуры наносят каплю 3% перекиси водорода; отсутствие пузырьков, в результате разложения перекиси водорода на воду и кислород, свидетельствует об отрицательной реакции. Для выявления скрытой формы болезни и прогноза появления заболевания на пасеке исследуют наличие спор P. l. larvae в смывах с поверхности тела и в суспензии кишечника внутриульевых молодых пчел, взятых с расплодных рамок и взрослых пчел из зимующих семей (L. Lindström, I. Fries, 2002). Исследование меда на наличие спор P.l. larvae также проводят для выявления скрытой формы американского гнильца и оценке санитарного состояния пасек. Анализ этого продукта обязателен в комплексе мероприятий по борьбе с гнильцом в ряде стран Европы. Кроме того, он необходим при экспорте меда. Для определения наличия спор в семьях пчел мед берут с участков сотов, расположенных над расплодом или по бокам от него: для выявления присутствия их в товарном продукте отбор образцов проводят из партий откаченного меда. Образцы жидкого (5 г) из ячеек сотов или свежеоткаченного меда нагревают для удаления вегетативных стадий бактерий, иногда доводят температуру до 100. Из каждой пробы наносят мед стандартной бактериологической петлей на поверхность среды (5 г триптона, 15 г. экстракта дрожжей, 20 г. агара, 3 г. К2НРО4, 2 г. глюкозы/л дистиллированной воды) в трех чашках Петри. Инкубируют при 36С обычно до 6 дней (максимум 11 дней). Подсчитывают число выросших типичных колоний (колоний-образующих единиц; КОЕ), из которых каждая соответствует 1000-3000 спор/г меда, делают расчет степени загрязнения продукта (пКОЕ1000-3000). Наличие P.l. larvae подтверждают микроскопией окрашенных мазков, споры обнаруживают при фазовоконтрастной микроскопии (H. Hansen, 1884) или используют тест на катализу (K. H. Steinkraus, R. A. Morse, 1992). Метод позволяет установить загрязненность меда при наличии 2000 спор в грамме продукта. Вязкие, засахаренные меда требуют предварительного разведения и последующей концентрации возбудителя. МЭБ рекомендует для этих целей два метода. Образец меда (25 г) нагревают до 45С (целесообразно сохранять аналогичную навеску для повторного исследования), разбавляют водой 1:1. Разведенный мед переносят в лежащую горизонтально диализную 1,75дюймовую (44 мл) трубку, завязанную с одной стороны. Открытый конец 14 завязывают после заполнения. Трубки погружают на 18 часов в текущую воду или водяную баню, в которой проводят 3-4 кратную смену воды. После диализа содержимое трубки центрифугируют при 2000g 15 минут. Супернатантную жидкость удаляют, осадок разводят 9 мл воды. Суспензию нагревают при 80С в течение 10 мин и высевают на среду BHJ. Или одну часть меда разводят двумя частями фосфорно-калиевого буфера (рН 6,6) и центрифугируют в вышеуказанных режимах. Осадок разводят 0,5 мл воды, нагревают до 80° в течение 15 минут, высевают на кровяной (овечий) агар, к которому добавляют 3 мкг/мл налидиксиновой кислоты, иногда вместе с пипермидиновой кислотой (A. M. Alippi, 1995) для подавления роста Paenibacillus alvei. В отечественной практике используют метод двойного центрифугирования: 15-20 г. меда растворяют в таком же объеме стерильного физиологического раствора в водяной бане при 35-40°С. Тщательно смешивают и центрифугируют в течение 15 минут при 2000 g/мин. Осадок высевают на мясопептонный сывороточный бульон (качественная проба) (А. М. Смирнов, 1987) или мясопептонный сывороточный агар, для определения КОЕ. Одновременно из осадка делают два мазка, которые окрашивают соответственно по Граму и 2% карболовым фуксином, проводят микроскопию. Выросшие культуры идентифицируют бактериологическими методами (Л. Н. Гузева, 1992). В ряде случаев возникает необходимость исследования искусственной вощины, воска, пыльцы для выявления поверхностного загрязнения спорами P. l. larvae. Отбирают 1% стандартных пачек вощины из партии и маркируют их. С соблюдением стерильности вскрывают упаковку и отбирают 5 листов вощины. Обе стороны листа протирают ватно-марлевым тампоном, смоченным 50 мл стерильного физраствора. Жидкость собирают в стерильные емкости и затем центрифугируют при 2000g в течение 15 минут. Собранный осадок нагревают при 90 15-20 минут. Часть осадка высевают на твердую питательную среду, а другую – на жидкую среду. Или кусочки по 10 г от каждого выбранного листа (или такое же количество воска от партии в 1 тонну) заливают 50 мл петролейным эфиром (ксилолом или серным эфиром) в колбе с закрытой пробкой и выдерживают на водяной бане при 35-50°С в течение 6 часов (работу проводят в вытяжном шкафу). Растворенные пробы воска центрифугируют при 2000g в течение 20 минут. Осадок разбавляют в 5-7 раз физиологическим раствором, тщательно встряхивают и нагревают при 90 в течение 15-20 минут и вновь центрифугируют при 2000g 20 минут. Осадок высевают на твердые питательные среды. Образцы (15-20 г) пыльцы помещают в стерильную ступку и растирают до получения гомогенной массы, затем вносят в ступку 100 мл стерильного физраствора и вновь тщательно смешивают. Жидкость фильтруют через стерильные ватно-марлевые фильтры, а затем дважды через фильтровальную бумагу. Фильтрат центрифугируют при 3000g 20 мин, осадок нагревают (20 мин при 90) и высевают на питательные среды (А. М. Смирнов, 1972, 1987). 15 Помимо бактериологических исследований, индикация P.l. larvae возможна различными серологическими методами. Отмытые от гнилостной массы или корочек вегетативные клетки и споры могут быть установлены в реакции агглютинации со специфической антиларвейной сывороткой (1:100 – 1:400), полученной от кроликов (В. В. Триленко, 1953, W. Fritsch, 1957; V. I. Poltev, 1959; 1972; Ф. М. Алексеенко, А. С. Асадов, 1969; A. Giauffret et al, 1970). Экстракт больных личинок с не разведенной антиларвейной сывороткой дает кольцо преципитации (В. Л. Полтев, 1953, 1959, 1972), использовалась также реакция связывания комплемента (В. А. Триленко, 1953). Применение сыворотки крови лошади, ослов по сравнению с кроличьей сывороткой в реакциях пробирочной и капельной агглютинации повысило обнаружение P.l. larvae при смешанных (с европейским гнильцом) инфекциях с 87,7-92,40 до 98-98,2% (М. В. Яловицин, 1960). Высокочувствительными и специфическими были реакции иммунодиффузии (А. С. Асадов, 1968; 1971, В. И. Полтев, 1972, Peng, K. Peng, 1979), прямой и непрямой иммунофлуоресценции (Ф. М. Алексеенко, А. С. Асадов, 1967, А. С. Асадов, 1971, В. М. Жавненко, 1971; В. И. Полтев. 1972; A. Toskov et al. 1970, Y. Peng, K. Peng, 1979; Е. В. Руденко, 1988). При непрямой иммунофлуоресценции 10-15 небольших личинок или корочек растирают со стерильным физиологическим раствором. Суспензию фильтруют через ватно-марлевый фильтр и центрифугируют при 5000-6000 g в течение 15 минут. На обезжиренных предметных стеклах из осадка готовят 3-4 тонких мазка. Мазки фиксируют метанолом 5 минут и сушат. На мазок наносят специфическую гипериммунную сыворотку, и препараты на 30 минут помещают во влажную камеру. Затем промывают водой, после забуфференным физиологическим раствором с рН 7,2-7,5 и сушат. На мазки наносят меченную флуоресцин-изоцианатом сыворотку против глобулинов кролика в рабочем разведении и помещают во влажную камеру на 30 минут. Затем промывают 10 минут забуфференным физраствором. Для устранения специфического свечения используют бычий альбумин, меченный родамином "Б" по общепринятой методике. Просмотр проводят под иммерсионной системой люминесцентного микроскопа. В качестве иммерсионного масла используют диметилфталат. Для контроля специфичности на один мазок наносят нормальную кроличью сыворотку в разведении 1:50. Реакция считается положительной при интенсивном свечении и наличии четко обозначенных спор и вегетативных клеток P.l. larvae (Л. Н. Гузева, 1992). Метод рекомендован МЭБ, как высокоспецифичный, чувствительный, быстро осуществимый способ выявления единичных вегетативных клеток и спор P. l. larvae, позволяющий выявлять возбудителя при смешанных заболеваниях. В отдельных случаях используют иммуноферментный анализ (ELJSA). (P. E. Olsen et al, 1990). Серологические методы значительно сокращают время по выявлению возбудителя из патологического материала и могут быть использованы для идентификации культур. 16 Проблемой является отсутствие налаженного производства стабильных диагностикумов, приверженность к классическому бактериологическому способу диагностики. В последние годы интенсивно развивается диагностика с помощью ПЦР возбудителя из культур (C.F.Y. Ash et al., 1993; V. A. Govan et al., 1999) и непосредственно из больных личинок (A. M. Alippi et al., 2002). Для пасечной диагностики американского гнильца выпускается (фирма Vita (Europa) Lmt, Великобритания) набор компонентов, позволяющий по изменению цвета устанавливать возбудителя с возможной ошибкой 1,4% (R. Waite et al., 2003). Для выявления возбудителя и идентификации чистых культур испытана фагодиагностика (Н. И. Смирнова. 1953, 1956; V. Drobnikova, Y. Ludvik, 1982). При работе со штаммами P. l. larvae была применена газожидкостная хромотография жирных кислот (T. Kaneda, 1969; V. Drobnikova et al., 1994); используются системы API 50 СНВ и Biolog специальные пластины для выявления штаммовых различий этого возбудителя (E. Carpana et al., 1995; R. Reiche et al., 1997; J. Goyache et al., 1997). Летучие ароматические кислоты и летучие сульфиды из гнильцовых корочек, оказавшиеся неспецифичными (T. Gochnauer, V. Margetts, 1981), не нашли применения в лабораторной практике, но исходящий специфический запах больных американским гнильцом семей иногда используют для выявления их на пасеках натренированными собаками. Американский гнилец необходимо дифференцировать от порошковидного расплода (наличие в печатном расплоде сухих корочек, чешуек, порошковидную массу при выделении), европейского гнильца (преобладает поражение открытого расплода, гниющая масса при выделении из ячеек не образует длинных нитей, запах иной, корочки легко отделяют от стенок ячейки), парагнильца (приблизительно равное поражение открытого и закрытого расплода, последний плохо удаляется пчелами, гниющая масса образует короткую нить), застуженного расплода (гибель открытого и запечатанного расплода сбоку или снизу на крайних гнездовых сотах или снизу на центральных сотах, масса сухая, крошащаяся или гнилостная, на груди и брюшке погибших куколок темно или серо-зеленые пятна, легко удаляются из ячеек), мешотчатого расплода (погибшие личинки при осторожном выделении в виде мешочка, заполненного беловатой жидкостью, у куколки резко увеличено мешкообразное брюшко, корочки ладьевидные, легко выделяются из ячеек). При поражении расплода грибами (аскосфероз, аспергиллез) трупы личинок куколок мумифицированы, твердые. При горбатом расплоде расположение пораженных ячеек с таким расплодом на соте зигзагообразное по ходу личинок восковой моли, трупы личинок легко выделяются из сотов; иногда принимают за остатки корочек трупов личинок пятна фекалий в ячейках сотов, однако они расположены по краю ячейки, легко счищаются иглой. Иммунитет и специфическая профилактика. Восприимчивость и устойчивость пчел к P. l. larvae связана с рядом факторов. 17 Пыльца содержит микроорганизмы, которые антагонистически воздействуют на патогена (R.Reihe et al., 1981). Эти антагонисты так же изолированы из средней кишки личинок, взрослых пчел, вызывают подавление роста бациллы P. l. larvae. Скармливание пыльцы личинками 6-18 часового возраста достоверно снижала их смертность от этого возбудителя в экспериментах (T. E. Rinderer et al., 1974). Количество потребляемой пыльцы личинками маток, рабочих пчел, трутней объясняется их различие в восприимчивости к заражению (Т. Е. Rinderer, W. C. Rothenbuhler, 1969). Кроме того семьи пчел отличаются различной степенью устойчивости к заболеванию, выраженностью поведенческих реакций рабочих особей по обнаружению, вскрытию ячеек, удалению пораженных личинок. В резистентных семьях основную массу их пчелы распознают и удаляют до образования спор возбудителя. Пчелы так же вскрывают ячейки над погибшим расплодом, при этом свежепечатный расплод удаляют лучше, чем куколок в возрасте 5 дней и старше. Время удаления и реинфекции зависят от интенсивности поражения. При обилии нектара и пыльцы устойчивые семьи удаляют пораженный расплод в 4 раза быстрее, чем при дефиците корма (Y. P. Momot, W. C. Rothenbuhler, 1971). В основе такой поведенческой реакции лежат генетические факторы: ген "u" контролирует печатывание расплода, а ген "r" ответственен за удаление погибшей особи. Для устойчивости семьи необходимы сочетание этих генов (W. C. Rothenbuhler, 1964). По данным (R. F. Moritz, 1988) процесс удаления контролируют два взаимосвязанных гена. Особи более устойчивой семьи имеют более высокий уровень октопамина-биогенного амина в нейронах мозга, инъекцией этого соединения удается повысить обонятельную реакцию пчел по выявлению погибших личинок и их удаления в неустойчивых к гнильцу семьях насекомых (M. Spivak, M. Gilliam, 1988). Взрослые пчелы устойчивых семей удаляют за счет фильтрации корма провентрикулюсом медового зобика 79% спор, а пчелы неустойчивых семей - только 59%; благодаря этому механизму снижается загрязнение хранящегося в улье меда и перги, а также отрыгиваемого пчелой-кормилицей корма для личинок (A. P. Sturtevant, J. L. Revell, 1953; S. B. Plurad, P. A. Hartman, 1965). Молоко, продуцируемое гипофаренгиальными железами рабочих пчел для кормления личинок, в устойчивых семьях пчел более эффективно подавляет прорастание спор, сокращает их жизнеспособность, уменьшает число вегетативных клеток бациллы, чем у пчел неустойчивых семей (R. J. Rose, J. D. Briggs, 1969; M. A. Z. Hornitzky, 1998). Антимикробное действие маточного молочка связано с рядом содержащих лизин пептидов и в частности с пептидом с молекулярной массой 5523 Да, названного рейолизином, который подавляет рост P. l. larvae и грамположительных бактерий. Пчелы здоровых и неблагополучных по американскому гнильцу семей отчетливо различаются по количеству этих ингибирующих возбудителя субстанций (K. Bilikova, J. Simuth, 2000; Y. Klaudiny et al., 2000). В устойчивых семьях личинки в возрасте от 24 часов менее чувствительны к заражению (W. C. Rothenbuhler, I967) и полностью невосприимчивы к 18 возрасту 1,5 суток (I. F. Bam brick, W. C. Rothenbuhler, 1961; T. R. Homage, W. C. Rothenbuhler, 1966). Эта особенность, вероятно, обусловлена физическими и химическими факторами, связанными с перитрофической мембраной и клетками эпителия средней кишки личинки (H. Hansen, C. I. Broadsgaard, 2001). С середины 30-х годов в США была показана возможность передачи по наследству признаков устойчивости пчел к американскому гнильцу, маткидочери сохраняли это свойство даже при спаривании с неотселекционированными трутнями. Путем постепенного отбора устойчивых семей были оздоровлены от гнильца крупные промышленные пасеки (C. Mraz, 1982). В последние годы, в связи с установлением устойчивости возбудителя к антибиотикам, вновь проявился интерес к этому направлению работ во многих странах мира. В 1997 г., используя отбор и искусственное осеменение маток, в США создана продуктивная и устойчивая Starline bees, проверенная на практике (M. Spivak, M. Gilliam, 1998). Устойчивые к американскому гнильцу семьи пчел приобретают также определенную резистентность к аскосферозу, варротозу и акарапидозу. В гемолимфе взрослых пчел и здоровых личинок из больных американским гнильцом семей установлены агглютинины (N. Gary et al., 1948), обладающие относительной специфичностью и способные реагировать с другими микроорганизмами (M. Gilliam, W. S. Jeter, 1970). Инактивированная вакцина против кислого гнильца пчел (Enterococcus faecalis) создавала также определенную устойчивость семей пчел к заражению P. l. larvae (Е. В. Руденко, 1987). В последующем была приготовлена вакцина на основе убитых клеток P. l. larvae (Е. В. Руденко, 1988), скармливание которой пчелам показывало хорошие защитные свойства, достоверное увеличение лизоцима, структурные изменения в протеиновом профиле гемолимфы, связанные с синтезом гемагглютининов, повышение активности последних у личинок вакцинированных семей. Эта активность сохранялась в течение 21 дня и была выше к P. l. larvae, чем к P. alvei (Е. В. Руденко, 1997). Таким образом, семьи пчел обладают против американского гнильца многочисленными филогенетическими разноуровневыми механизмами защиты, проявление и реализация которых во многом зависит от условий кормления и содержания. Профилактика заболевания направлена на предупреждение заноса возбудителя, его накопление в гнездах пчел и передачу, а также повышение резистентности семей. Пасеку формируют только здоровыми семьями пчел, что должно быть подтверждено: благополучием окружающих пасек в зоне 5 км от хозяйствапоставщика, отсутствие американского гнильца в течение последних 2 лет по записи в паспорте пасек, тщательным осмотром семей пчел и санитарного содержания пасеки, отрицательными результатами лабораторных исследований меда, взрослых пчел и расплода на споры P. l. larvae. Благополучие семей (пакетов), маток, подтверждается справкой (форма вет.1), дающая возможность на перевозку, пересылку, продажу пчел. Пчел 19 перевозят (пересылают) в чистых, продезинфицированных ульях (пакетах), на светлых сотах, бывших в употреблении не более 2 лет или в бессотовых пакетах. Поступивших пчел размещают на изолированных участках (6-7 км от пасеки) и наблюдают за ними в течение 45 дней (требование МЭБ) и только после получения отрицательных результатов передают на основную пасеку. При выезде на медосбор необходимо учитывать благополучие местности и соседних пасек по американскому гнильцу. Опасность представляет размещение ульев на перелете пчел ближайшей пасеки. Передача возбудителя возможна с сотами, ульями, медом, пчеловодным инвентарем и оборудованием из неблагополучных по гнильцу хозяйств. Предупреждение американского гнильца требует строгого соблюдение санитарных правил содержания пчел, территории пасеки и подсобных помещений. Весной при ревизии семей, их пересаживают в продезинфицированные улья; на каждой пасеке необходимо иметь не менее 15% запасных ульев. Очень важно систематически и ежегодно обновлять не менее 1/3 сотов гнезда. Эксплуатация сотов, включая соты магазинных надставок, не должны превышать двух лет. В странах Скандинавии проводят ежегодную смену сотов (H. Hansen, C. J. Brodsgaard, 2001), в США рекомендована замена сотов через 5 лет (C. Wennig, 2003). Использование старых сотов, часто практикуемое пчеловодами при формировании идущих на зимовку семей, часто является роковой причиной последующего возникновения в них различных заболеваний. Если учитывать, что ежегодно в ячейках сотов воспитывается 4-7 поколений пчел, и остаются личиночные шкурки личинок, остатки коконов, обильно покрытые микроорганизмами, то, несмотря на очистку и приполисование ячеек рабочими пчелами, полного удаления патогенов не достигается. В активный период жизнедеятельности пчелиной семьи не допускают ее перегревания, систематически проводят осмотр состояния расплода во всех семьях пасеки с целью своевременного выявления заболевания, результаты осмотра записывают в журнал пасеки. Использование таких приемов, как перенос расплода из сильной семьи в слабую, перераспределение сотов с кормом между семьями пасеки, обезличенное использование хранящихся пустых сотов (суши) или рамок с кормом, возможно только при полной уверенности отсутствия скрытого или явного заболевания. Следует иметь в виду, что сильные семьи чаще поражаются американским гнильцом. Недопустимо обезличенное осушивание пчелами сотов после откачки меда; скармливание сиропа из общей кормушки на пасеке, из-за возможности переноса спор и развития пчелиного воровства. Для предупреждения последнего на пасеке: пчел содержат в ульях без щелей, осмотр семей проводят в период выделения нектара растениями или в вечернее время; при работе нельзя оставлять капли меда на стенках улья или вокруг него; помещение для хранения сотов должно быть недоступно для пчел. При нападении пчел во время осмотра семей работу прекращают. 20 Важным моментам в профилактике всех заболеваний является повышение общей резистентности пчел. Так как индивидуальная устойчивость особей в семье повышается с каждой генерацией пчел в сезон и достигает максимума к осени, необходимо, чтобы с момента весеннего наращивания пчел их гнезда имели не менее 8 кг меда и около 2 кг перги. Использование для этой цели продаваемое канди, содержащие мед и пыльцу без предварительной проверки их на споры P. l. larvae, может представлять опасность, приводить к заражению. Исследование коммерческих медов показывает их высокую загрязненность возбудителем (таблица 1). Таблица 1. Результаты исследования медов на споры P. l. larvae Число исслед./% Кол-во Автор Страна и вид меда проб со спорами спор Австралия (коммерческий мед) 393/10, 11 Германия -/3-5 -/3-10 Дания - зарубежный мед - местный мед Дания -местный мед из больных семей -местный мед из семей без признаков болезни Швейцария - зарубежный мед - местный мед Австрия - Ed. Aust Beekeeper, 1990 X. Ommen, 1996 W. Von der Оhe et al., 1997 75/81 56/13 - H. Hansen, 1984 11/81,8 6-12х103 H. Hansen, 1986 510/7,45 3х106 (в одной пробе) R. Ferraro, 1995 58/95 89/17 -/62 США и Канада 85/8,5 (местный мед) США - коммерческий мед -/100 -мед с отдельных -/30 пасек 104-12х106 - Derakhshifer, 1994 (цит. по Х. Оттен, 1996) H. Steink-Rous, R. A. Morse, 1992 H. Steinkraus, D. A. Knox, 1988 Особую опасность представляет купажирование меда, смешивание партий меда с различных пасек, при его фасовке. Даже небольшие поступления этого продукта из семьи со скрытой формой болезни может в большей степени загрязнить этот продукт, чем тоже количество меда из 21 семьи с признаками болезни при откачке сотов на центрифуги внутри пасеки. В связи с этим целесообразна проверка меда для приготовления канди на наличие спор бациллы. Заготовка пыльцы должна проводиться только здоровыми семьями пчел; перед приготовлением канди ее также исследуют на наличие спор. В резистентности семьи большую роль играет генетическая предрасположенность ее особей. Поскольку пчелы отдельных семей имеют различную степень устойчивости к американскому гнильцу и это связано со степенью вскрытия и удаления погибших личинок из печатного расплода, на пасеке могут быть отобраны семьи для последующего размножения. На участке сота 56 см2 (100 ячеек) введением иглы в свежезапечатанный расплод убивают личинок и контролируют их удаление взрослыми пчелами. Устойчивые семьи очищают ячейки от трупов за 48 часов, неустойчивым семьям требуется для этого 5 и более дней. Спаривание маток резистентных семей с 10-20 трутнями, имеющими подобные признаки, закрепляют в потомстве устойчивость (R. F. Trump et al., 1967). Временное повышение гигиенической способности семьи возможно введением в нее 15-50% пчел из семей, обладающих таким свойством. В то же время подсиливание семей за счет расплода из других семей без учета их гигиенического поведения нередко снижает эту особенность (M. Spivak, M. Gilliam, 1998). Из средств специфической профилактики испытана формолвакцина, приготовлена на основе вегетативных клеток P. l. larvae (патент СССР № 1403411 от 15. 02. 88) 70 мл вакцины в 1 л сахарного сиропа скармливают весной четыре раза через 4-5 дней (Е. В. Руденко, 1987, 1988, 1994). Эффект составляет 80%. Вакцина обладает определенным, но несколько меньшим профилактическим эффектом против европейского гнильца и парагнильца, как показало ее испытание в различных регионах бывшего СССР (Г. В. Кашина, Е. В. Руденко, 1994). К сожалению, последующие работы были прекращены, производство вакцин на территории России не освоено. Хотя скармливанием антибиотиков и сульфаниламидных препаратов в семьях можно уничтожить возбудителя до образования спор, применение их в виде паст (канди), опрыскивания или скармливания с сиропом для профилактики гнильца на пасеках, особенно товарно-медового направления нецелесообразно, так как делает мед, непригодным к реализации из-за остатков препаратов в нем, приводит к возникновению устойчивости возбудителей, способствует накоплению спор P. l. larvae в меде и не гарантирует в последующем вспышек заболеваний. Этот способ профилактики, к сожалению, нашел широкое применение во многих странах мира. В США некоторые пчеловоды дают террамицин (окситетрациклин) семьи пчел от 4 до 10 раз в год. Согласно требованиям Всемирной торговой организации использование лечебных средств с указанием препаратов, доз, кратности их применения, на фермах (пасеках) фиксируется ветеринарной службой и продукт (мед) подлежит проверке на остатки антибиотиков, сульфамиламидных и прочих опасных веществ (директива ЕЭС 96/23 от 29.04. 96). 22 Учитывая бессимптомное течение гнильца, необходимо периодически проводить исследование меда из семей пасеки на споры P. l. larvae. Ульи, соты, инвентарь, подвергают профилактической дезинфекции, проводят очистку и побелку складских помещений. Систематически, еженедельно очищают предлетковые площадки. Лечение больных семей пчел с явными признаками болезни предпринимаются только на интенсивно пораженных пасеках и оценки возможности его полного осуществления в хозяйстве из-за высоких трудозатрат и контроля пчелопродуктов. Для лечения американского гнильца в большинстве стран мира используют сульфатиазол и окситетрациклин; в нашей стране применяют норсульфазол натрия (сульфатиазол), окситетрациклин и рифампицин (бактопол), как проверенные высокоэффективные средства при многих болезнях пчел. В Скандинавских странах и Германии антибиотики вообще не зарегистрированы для применения в пчеловодстве (H.Hansen, C.J.Brоdsgaard, 2001). Успех лечения зависит от максимального удаления инфекционного начала, перед лечением удаляют соты с пораженным расплодом и инфицирование корма, пересаживают пчел в чистый улей. Перегон семей с однократной дачей окситетрациклина и перегон семей без дачи антибиотиков были в равной степени эффективны (D.A.Knox et al., 1976). Препараты не действуют на споры возбудителя и не предупреждают проявления рецидива болезни, даже при интенсивной терапии некоторые семьи не поддаются оздоровлению. Лечение способствует большой контаминации меда спорами возбудителя. (W.Ritter, 2002), что часто требует для закрепления результатов успешной терапии последующего перегона семей и выполнения комплекса, вышеуказанных мер борьбы со скрытой инфекцией. Использование лекарственных препаратов способствует возникновению устойчивости у возбудителей, и в последние годы появились сообщения об устойчивости P. l. larvae к окситетрациклину в ряде стран мира. В свете требований к чистоте продуктов пчеловодства от остатков лекарственных препаратов, следует учитывать длительность сохранения антибиотиков в медах: при весеннем использовании окситетрациклина в канди, его обнаруживают в откаченных осенью медах (W.T. Wilson, 1974) он сохраняет 97% активности в улье в течение 11 недель (M. Gilliam, R.I. Argauer, 1975). Хлортетрациклин и стрептомицин сохраняются в медах около года, мало поддаются разрушению при нагревании, обнаруживаются в пробах реализуемого меда (В.И. Головнев, 1970). В связи с этим возникает необходимость проводить раздельную откачку меда от семей, подвергшихся (мед для промышленных целей) и не подвергавшихся (для реализации в качестве натурального продукта) лечению нельзя смешивать такие меда при хранении. Использование препаратов нитрофуранового ряда из-за их опасности для человека в пчеловодстве не возможно. Ведутся поиски лечебных средств среди менее опасных соединений. Показано, что насыщенные и жирные ненасыщенные кислоты, такие как лауровая, миристолеивая и пальмитиновая, обладают in vitro высокой антибиотической активностью 23 против P.l. larvae (M.F.Feldlaufer, 1993). Получены обнадеживающие результаты профилактики и борьбы с американским гнильцом с помощью патогенного штамма P. l. рpulvifaciens (M.S. Watkins et al., 2003). Меры борьбы. При установлении заболевания пчел американским гнильцом пасеку и территорию вокруг нее в радиусе 5-7 км объявляют неблагополучной. О наложении карантина оповещают ветеринарных специалистов и владельцев пасек, расположенных в данной местности и главных ветеринарных врачей соседних районов. Внутри неблагополучной зоны осматривают все семьи пчел и отбирают от них мед на исследование на споры P. l. larvae. По требованиям и условиям карантина запрещается вывоз с пасеки в другие хозяйства пчелиных семей, маток, продуктов пчеловодства оборудования и инвентаря, выезд на медосбор. Применяют противороевые меры, не допускают содержание слабых безматочных семей. Усиливают ветеринарный контроль над санитарным состоянием пасек, проводят строгую выбраковку всех хранившихся в семьях и на сотохранилищах запасных сотов; пригодные для использования соты, а так же инвентарь и оборудование после тщательной механической очистки дезинфицируют. Исключают все пчеловодные приемы, ведущие к заражению семей на пасеках (подсиливание слабых семей расплодом, объединение семей), передача сотов с медом возможна только из благополучных семей по результатам осмотра и лабораторного исследования меда, взрослых пчел из них. При появлении американского гнильца в благополучной местности, где заболевание ранее не регистрировалось, администрация по предложению главного ветеринарного врача может принять решение об уничтожении больных семей. Способ своевременного выявления клинического проявления американского гнильца и полное уничтожение улья с его содержимым, считается наиболее эффективным во многих странах мира, особенно в местностях с незначительным (1%) распространением болезни. Хотя на пасеках, нередко, приходится уничтожать сильные семьи, но это позволяет избежать последующих затрат. В штате Нью-Йорк (США) этим способом в течение 15 лет сокращено выявление американского гнильца с 7 до 1% (F.L. W. Rotnieks, 1992), сведено к спорадическим случаям в Великобритании (R. Waite et al., 2003). За уничтожение семей пчел в присутствии полиции в ряде стран мира выплачивают страховое возмещение. Выявление заболеваний пчел, на пасеках в странах Европы проводят выбранные общественные инспекторы, под руководством ветеринарных специалистов, осмотр семьи пчел оплачивается в Болгарии, инспектор получал в 1975 году 0, 2 лева/семья пчел (Д.Янев, Н.Неделчев, 1975). В Германии при американском гнильце уничтожают соты больной семьи с выплатой 6 нем. марок за 1 кг суши для приобретения соответствующего количества вощины. Стоимость уничтоженного улья и рамок оплате не подлежат, поскольку они могут быть повторно использованы после дезинфекции (Stehle, 1977). Попытки освободить соты от прочно прилипшей личинки (гнилостной массы) с помощью обработки их споровой суспензией Penicillium waeksmani, 24 растущего на этом субстрате и разрушающем его, не дали должных результатов (S.Tutt, W.Wilson, 1975, 1977; W.Wilson et al., 1978). Хотя в этом направлении необходимы дальнейшие работы. Согласно отечественной инструкции соты, содержащие погибший расплод, перетапливают на воск, вытопки сжигают. Воск от пчелиной семьи с неблагополучных пасек направляют на технические цели (основанием служит запись в ветеринарносанитарном паспорте пасеки). К сожалению, из-за отсутствия должного контроля этот воск нередко используют для приготовления вощины, особенно большую опасность в распространении заболевания представляет вощина, изготовленная кустарным способом (А. М. Смирнов, 1995; И. Гечев, 1995). При невозможности уничтожения и в местностях с выявлением более 2% неблагополучных семей с явными признаками поражения, используют методы одинарного или двойного перегона семей с голоданиями. В улей больной семьи впускают несколько клубов дыма из дымаря, взрослых пчел вместе с маткой сметают в роевню, вечером, того же дня ее пополняют вернувшимися в улей пчелами. Роевню выдерживают двое суток в сухом, темном, прохладном помещении (зимовнике). Затем пчел больной семьи из роевни встряхиваем на лист бумаги и по сходням направляют дымом в леток продезинфицированного улья на рамки с вощиной или с ее полосками, укрепленными вверху рамки. Через 3-4 дня, после того как начнется отстройка сотов, делают второй перегон пчел в чистый улей с вощиной. Во время первого перегона удаляют старую матку и в улей в клеточке дают новую. При незначительном приносе нектара пчел подкармливают сахарным сиропом. Бумагу после перегона пчел сжигают. За счет голодания и размещения пчел на вощине в большинстве случаев удается освободить семьи от спор возбудителя или значительно снизить их количество; в меде нового улья они могут быть обнаружены через 2-12 месяцев (C.J.Brodsgaard, H.Hansen, 1999). Преимущество метода перегона: сохраняют семьи пчел, в меде и воске отсутствуют остатки лекарственных препаратов; недостатки: потери до 20% семей (D.A.Knox et al., 1976) от запаривания из-за плохой вентиляции и других причин, ослабление и снижение работоспособности сохранившихся семей за счет гибели 2-25% рабочих пчел с малым запасом корма в зобике при голодании (Р.П.Ибрагимов, 1962). Для семьи со скрытой формой американского гнильца можно использовать перегон без голодания. В конце дня при поддерживающем медосборе улей такой семьи оставляют в сторону, на его место ставят продезинфицированный улей, заполненный вощиной. Пчел встряхивают с сотов на лист чистой бумаги и направляют дымом в леток. Старую матку заменяют новой, плодной. Бумагу сжигают. Рамки с расплодом без признаков поражения переносят в сетчатом изоляторе в семью-инкубатор, имеющую такую же скрытую форму заболевания, после 25 выхода пчел из расплода их направляют в основную семью, а пчел семьиинкубатора перегоняют в чистый улей на вощину. Улья с сотами больных семей убирают в недоступные для пчел помещения. Мед откачивают, и он может быть использован только для пищевых целей внутри хозяйства или в кондитерской промышленности. Соты, не содержащие корочек погибшего расплода, рамки, улья и медогонку после тщательной механической очистки дезинфицируют. Особо важным моментом в борьбе с американским гнильцом является дезинфекция. Сравнение обработки корпусов ульев после тщательной очистки огнем паяльной лампы, горячей мыльной водой, холодной водой под давлением, 1% раствором виркона показало 80% эффективность методов; лишь стерилизация паром с погружением в кипящий раствор щелока с последующей промывкой холодной водой под давлением обеспечивало эффект на 99,97%. Последующее содержание пчел в таких ульях не привело к возникновению заболевания и эти методы рекомендованы для практического применения (H. Hansen, C.J. Brodsgaard, 2001). Вместе с тем недостатками этих методов является рассыхание ульев после погружения в жидкости, необходимость окраски после обработки; при многократном прожигании огнем паяльной лампы трудно установить необработанные участки. В Новой Зеландии успешно используют погружение ульев в горячий парафин (A. Matheson, 1992), что повышает длительность эксплуатации ульев. В нашей стране рекомендованы следующие способы и режимы обработки: ульи, подставки, рамки и другие деревянные предметы после тщательной механической очистки обжигают огнем паяльной лампы до побурения или обрабатывают одним из следующих дезинфицирующих растворов: раствором 10% перекиси водорода и 3% муравьиной кислоты из расчета 1 л/м2 трехкратно с часовым интервалом или теплым (30-40С) щелочным раствором формалина 0,5 л/м2 двукратно с часовым интервалом, промывают водой через 5 часов. Рамки, разделительные решетки кипятят в 2% растворе едкого натра или в 4% каустифицированной содо-поташной смеси в течение 15 минут. Ульевые холстики, наволочки, утеплительные подушки кипятят в 3% растворе кальцинированной соды в течение 30 минут, прополаскивают и сушат. Халаты, полотенца, лицевые сетки погружают в 2% раствор перекиси водорода на 3 часа или 10% раствор формалина, тщательно промывают в воде и сушат. Мелкий металлический инвентарь прокаливают на огне или кипятят 30 минут в 3%-ном растворе кальцинированной соды. Медогонки промывают водой и обрабатывают горячим (50-55C) щелочным раствором формалина (5% формальдегид и 5% едкий натрий) из расчета 1 л/м2 внутренней и наружной поверхности. Через 5 часов тщательно промывают водой. Газовая дезинфекция сотов, инвентаря, оборудования окисью этилена (ОЭ) и бромистого метила 1:1,4 (ОКБЭМ) вызывает гибель спор P. l. larvae (A.S. Michael, 1964, А.М. Смирнов, 1972, 1987). Однако, производственные испытания по обработке сотов ОЭ (450 мг/л при 38 и 50% относительной 26 влажности, экспозиции 90 минут) дали противоречивые результаты (H. Shimanuki, T. Lehnert, 1968; H. Shimanuki et al., 1969). Использование для этих целей полиэтиленовой пленки признано неудачным: газ проходит через пластик (T.A. Robinson et al., 1972). Лучшие результаты с газом получены в специальных термических камерах (H. Shimanuki et al., 1972). Эффективность получена при дозе ОЭ 1,5 кг/м3 при 25, относительной влажности 50-60% и экспозиции 6 часов; ОКБЭМ 2 кг/м3 при температуре 18-25 и относительной влажностью 50-98% в течение 24 часов; в вакуумной камере и под газонепроницаемой пленкой ПК-4. Перед использованием соты с пергой проветривают 4 суток, а сушь - 2 суток (А.М. Смирнов, 1972, 1987). Обработка ОКБЭМ возможно только на крупных пасеках, удаленных 30-40 метров от жилых помещений и оборудованных специальной бетонированной площадкой, она требует для своего проведения подготовленного специалиста и спецодежду. Окись этилена высоко токсична для человека (R.A. Morse, H. Shimanuki, 1990) и её остатки канцерогенны (A. Matheson, 1992); остатки бромистого метила в воске (сотах) требует лабораторного определения (А.М. Смирнов, 1972). Лучшие результаты стерилизации сотов, инвентаря и оборудования могут быть получены физическими методами. Гамма-облучение в дозах 1 мрад обеспечивает 99,9994% эффективность обеззараживания сотов. Точно также эффективно облучение сотов 3 Мрад электронами высокой скорости (3000 кV). Обработки корпусов ульев, заполненных инфицированными сотами, проводили на установке дважды (суммарно 6 Мрад) (F.L.W. Ratnieks, 1992). Стоимость обработки 20 пакетов с рамками равна 22,02 долларов, или 0,80 доллар за рамку. В США имеется 39 таких установок и обработка возможна только больших партий с крупных пасек (E.L.W. Ratnieks, 1995). Обработка гамма облучением освоена в Австралии. Цена обработки двух ульев с дном и крышками составила 4 австралийских доллара. Во время вспышки американского гнильца было спасено 1400 ульев и сотов общей стоимостью 31655 австралийских доллара при затратах на обработку и транспортировку 8992 австралийских доллара. (M.A.Z. Hornitky, B. White, 1983). Стерилизация меда с эффективностью 99% при сохранении его основных показателей и увеличении антибиотической активности с 1,67 до 2,67 получена при облучении потоком электронов 10 Мев на линейном ускорителе "Электроника 10-10" (10 квт) в дозе 10 кГр (W. Migdal et al., 2000). Воск стерилизуют на воскозаводах в автоклавах при 121 30 мин (R. Kostecki, M. Jelinski, 1977), при 119 несколько минут и последующего выдерживания 30 минут при 80°С (H. Hansen, B. Rasmussen, 1990). В нашей стране приняты более жесткие режимы 127, 1,5 атмосферы в течение 2-х часов (А.М. Смирнов, 1987). Карантин с неблагополучной пасекой окружающей ее зоны снимают через 1 год после ликвидации заболевания, устанавливаемой осмотром всех семей, и подтвержденными отрицательными двукратными результатами 27 лабораторных исследований меда, взрослых пчел и при подозрении расплода. Время наблюдений за семьями в очаге заболеваний колеблется в различных странах: в Словакии 1 год, в Венгрии 60 дней, в Польше 4-6 недель. МЭБ рекомендует наблюдать за семьями пчел в течение 45 дней, не считая периода зимовки.
