Конструирование плазмиды: практическое занятие по геномному редактированию

Практическое занятие № 7
Конструирование плазмиды, несущей элементы геномного редактирования
Теоретические сведения
В генной инженерии очень широко применяется метод, при котором чужеродный
генетический материал переносится в клетки-реципиенты с помощью плазмид —
кольцевых молекул ДНК прокариотических клеток. Плазмиды используют в качестве
векторов — молекул, способных переносить ген от одной клетки к другой.
Этот метод включает следующие этапы:
1) Получение гена, который необходимо перенести в клетку-реципиент, путем
синтеза или амплификации.
2) Перенос гена в плазмидный вектор.
3) Трансформация клеток-реципиентов полученным плазмидным вектором.
4) Скрининг трансформантов и отбор тех, что получили плазмиду, несущую
целевой ген.
Плазмидный вектор, содержащий необходимые элементы для трансляции
клонируемой ДНК в полипептидную цепь, называется экспрессионным.
В структуре экспрессионной плазмиды можно вы делить следующие основные
элементы (рис. 1):
1. Сайт инициации репликации.
2. Селективный маркер.
3. Экспрессионная кассета:
 промотор (с регуляторным оператором)
 сайт связывания рибосом
 множественный клонирующий сайт (полилинкер)
 последовательность терминации транскрипции
4. Дополнительные последовательности.
Рис. 1. Основные элементы экспрессионной плазмиды
Для амплификации целевого гена и последующего переноса его в экспрессионную
плазмиду используют праймеры – синтетические олигонуклеотиды, которые
комплементарны (или частично комплементарны) фрагментам ДНК, ограничивающим
целевой ген. К праймерам предъявляют следующие требования:
1. Используются парами – прямой и обратный праймер. Один из них
комплементарен 3’-концу смысловой цепи, а второй комплементарен 3’-концу
антисмысловой (транскрибируемой) цепи.
2. Оптимальная длина праймера — от 16 до 25 нуклеотидов, при этом он не должен
содержать более четырёх одинаковых оснований подряд.
3. Количество пар GC должно лежать в пределах 40-60%.
4. Температура плавления праймеров должна лежать в пределах 55-70 °С и
различаться для пары праймеров не более чем на 5 °С. Она рассчитывается по следующей
формуле:
Tm = 4 × (G + C) + 2 × (A + T)
5. Праймеры не должны содержать последовательности, которые могут
формировать вторичные структуры в виде шпилек. Избегайте само- и
взаимокомплементарности между 3’-концами (чтобы не образовывались праймердимеры).
6. Помимо части, комплементарной участку гена, праймер может содержать другие
последовательности, позволяющие в дальнейшем работать с амплифицируемым геном. К
таким последовательностям относятся, например, сайты рестрикции и аффинные тэги для
упрощения очистки экспрессируемого белка.
Дизайн праймеров можно осуществлять вручную или с помощью онлайн
инструментов. Одним из таких инструментов является онлайн-ресурс Primer-BLAST,
интегрированный в базу данных NCBI.
Дизайн праймеров
1. В базе данных NCBI необходимо найти нуклеотидную последовательность ДНК
гена, с которым вы планируете работать и определить в ней открытую рамку считывания,
которая должна начинаться старт-кодоном, обычно соответствующим метионину (ATG в
смысловой цепи) и заканчиваться стоп-кодоном. В базах данных представлены
последовательности смысловой цепи, вторую цепь, транскрибируемую, нужно составить
самостоятельно или с помощью специальных онлайн (BLAST) и офлайн (GeneRuner)
инструментов.
2. Для дизайна прямого праймера необходимо составить последовательность из 1020 нуклеотидов, комплементарную участку начала гена на транскрибируемой цепи. В
дальнейшем эту последовательность можно дополнить сайтом рестрикции.
3. Для дизайна обратного праймера необходимо составить последовательность из
10-20 нуклеотидов, комплементарную участку конца гена на смысловой цепи. В
дальнейшем эту последовательность можно дополнить сайтом рестрикции и аффинным
тэгом.
4. После составления полной последовательности праймеров (с учетом сайтов
рестрикции, аффинных тэгов и т.д.) необходимо рассчитать их температуры плавления и
убедиться, что они лежат в пределах 55-70 °С и различатюся для пары праймеров не более
чем на 5 °С.
5. Необходимо убедиться, что праймеры не формируют вторичные структуры (не
содержат палиндромные последовательности более 2-3 нуклеотидов подряд).
Применение сайтов рестрикции
Для выбора сайтов рестрикции, по которым ген будет вставлен в плазмиду,
необходимо:
1. Изучить карту плазмиды и проанализировать, какие сайты рестрикции
содержатся в полилинкере. Выбрать два сайта, позволяющие правильно сориентировать
ген относительно плазмиды. На карте плазмиды (рис. 2) всегда стрелкой показано
направление транскрипции, предположим, что вектор, в который вы планируете
клонировать ген (вставку) по направлению транскрипции имеет следующие сайты
рестрикции: EcoRI и XhoI. Чтобы правильно сориентировать ген ниже промотора, нужно
добавить сайт EcoRI в обратный праймер после стоп-кодона, и XhoI в прямой праймер до
старт-кодона. Сайты рестрикции для некоторых рестриктаз представлены в таблице 1.
Более полный перечеь вы сможете найти в базе данных REBASE.
2. Убедиться, что сам ген-вставка не содержит сайтов рестрикции для выбранных
рестриктаз, чтобы избежать его разрезания. Сделать это можно с помощью инструмента
BLAST, найдя там последовательность целевого гена и осуществив поиск подходящих
рестриктаз. Среди них не должно быть рестриктаз, выбранных вами для клонирования
гена. В качестве альтернативы онлайн инструментам можно использовать любой
текстовый редактор, в котором вы в нулеотидной последовательности гена сможете
осуществить поиск сайтов рестрикции выбранных рестриктаз. Их быть не должно.
Рис. 2. Карта плазмиды pET23b
Таблица 1
Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности
Применение аффинных тэгов
В настоящее время разработано большое количество по следовательностей,
предназначенных для обеспечения аффинной хроматографии белков (табл. 2). Среди них
есть как полипептиды природного происхождения, так и полностью синтетические
последовательности. Общими характеристиками для различных аффинных тэгов
являются:
1. Возможность эффективной одностадийной очистки рекомбинантного белка.
2. Минимальное воздействие на третичную структуру и биологическую активность
целевого белка.
3. Возможность легкого и специфичного удаления для получения нативного
целевого белка.
4. Простой и точный способ детектирования меченного рекомбинантного белка в
процессе очистки.
5. Возможность применения для широкого круга разных белков.
Для включения аффинного тэга в состав праймера необходимо:
1. Выбрать тип тэга по табл. 2
2. По таблице генетического кода составить последовательность, кодирующую
выбранный тэг. Например, для His-тэга это будет 5’ЦАЦЦАЦЦАЦЦАЦЦАЦЦАЦ3’
3. По полученной последовательности мРНК определить соответствующую ей
последовательность
ДНК
транскрибируемой
цепи.
Для
His-тэга
это
3’ГТГГТГГТГГТГГТГГТГ5’
4. Включить полученную последовательность в праймер, комплементарный
смысловой цепи между кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту и стоп-кодоном.
Таблица 2
Аффинные тэги
Задача
Необходимо клонировать ген бациллярной липазы в плазмиду pET23b. Изучив
последовательность гена (представлена смысловая цепь), подберите прямой и обратный
праймер, включив в их состав сайты рестрикции, по которым ген будет вставлен в
плазмиду, а также аффинный тэг для облегчения последующей хроматографической
очистки экспрессируемого белка. Запишите последовательности полученных праймеров и
температуры их плавления.
Последовательность гена:
ATGTTTGCAATCATCTCTGCAGGAATTGCCCCCGGCATCGCGTTATTAAGTTATTTTTATTTAAAAGATC
AGTATGATAATGAACCTGTACATATGGTGCTACGGTCGTTTTTTCTCGGGGTTGTTCTTGTATTTCCCAT
CATGTTTATCCAGTATGTACTTGAAAAAGAGAATGTAGGAGGCGGAAGCTTTTTCGTTTCTTTTTTATCT
TCGGGGTTTTTGGAGGAATCATTAAAATGGTTTATACTGATGATCAGTGTTTACCCGCACGCCCACTTTG
ATGAGCATTATGACGGGATTGTGTACGGTGCAAGTGTATCACTCGGTTTTGCAACCCTCGAAAATATTCT
TTATTTAATTGGCCACGGCGTGGAGCATGCGTTTGTCAGGGCGCTGCTGCCTGTTTCATGCCATGCCTTG
ATTGGCGTTATAATGGGATTTTACCTTGGAAAAGCCCGTTTTTCCGCTGATAAGGCGCGTGTAAAGTGGC
TTACTCTTTCTTTAGTTGTCCCATCCCTTTTGCATGGATCATATGATTTTATCCTAACAGCGCTTAGCAA
TTGGATTTATTATATGCTTCCATTTATGGTATTTTTATGGTGGTTTGGTTTGCGTAAAGCGAAAAAAGCC
CGTTCCGTTAATATGATGCAAGTATAG