Прикладная энзимология: Учебное пособие

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ им. К. И. Скрябина»
_____________________________________________
Еремеев Н.Л., Блохин Ю.И.
ПРИКЛАДНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ
Учебное пособие
Москва 2024
УДК 577
Н.Л. Еремеев, Ю.И. Блохин Прикладная энзимология. Учебное
пособие. М.: МГАВМиБ имени К.И. Скрябина, 2024, 164 с.
В учебном пособии рассматриваются ферменты в качестве молекул, обладающих каталитической функцией, и различные варианты их практического применения.
В первой части пособия рассмотрены вопросы эффективности и специфичности действия ферментов, принципы их
международной классификации, структурная организация белковых молекул и небелковые компоненты этих биокатализаторов. Вторая часть посвящена методам выделения, очистки и
физико-химической характеризации ферментов. В третьей части
рассматривается гомогенная кинетика ферментативных реакций. Четвертая часть посвящена промышленному применению
ферментов - получение различных продуктов иллюстрируется
на примере липаз, при описании аналитических применений
подчеркиваются экологически важные аспекты методик. Там же
приведены методы получения иммобилизованных ферментов
для их многократного использования в промышленности и анализе, а так же кинетические особенности функционирования гетерогенных биокаталитических систем. Заключительная часть
посвящена ветеринарно-медицинским аспектам энзимологии –
энзимопатологии, энзимодиагностике и энзимотерапии.
Рецензенты:
Клячко Н.Л., зав. кафедрой химической энзимологии Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова, доктор хим.
наук, профессор
Литвинов О.Б., профессор кафедры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «МГАВМиБ – МВА имени К.И.Скрябина»,
доктор вет. наук, профессор
Утверждено учебно-методической комиссией факультета
биотехнологии и экологии, протокол N 4 от 20 февраля 2024 г.
2
Согласно определению Большой Медицинской Энциклопедии, энзимология – раздел биохимии, посвященный изучению
строения, механизма каталитического действия и молекулярной
структуры ферментов.
Действительно, ферменты – биологические катализаторы
белкового типа (катализатор – вещество, ускоряющее скорость
химической реакции, при этом стехиометрически в ней не расходующееся) – уникальны по свойствам ускорения многих химических превращений. Они играют ключевую роль в поддержании
функционирования (метаболизма, гомеостаза и др.) живых организмов, что достигается за счет кинетического контроля протекающих в клетках реакций. С физико-химической точки зрения
на гомеостаз именно ферменты ответственны за подавление
естественного стремления любой системы к достижению термодинамического равновесия (гибели живого организма).
В то же время интенсивное исследование ферментов позволило энзимологии выйти за относительно узкие рамки раздела
биохимии и оформиться в качестве самостоятельной области
науки. В первую очередь это связано с успехами микробиологии,
позволившей производить необходимые ферменты в достаточном количестве. В настоящее время огромное количество разнообразных соединений получают в промышленных масштабах
с использованием процессов на базе иммобилизованных ферментов. Ферментация является основой для получения различных продуктов питания. Стиральные порошки и косметические
средства для ухода за кожей и волосами с добавлением ферментов с успехом завоевывают рынок. Кормовые ферменты
позволяют повышать эффективность животноводства и птицеводства. Широко применяются современные аналитические методы на основе ферментов, такие, как иммуноферментный анализ и биосенсоры.
Именно поэтому является настолько важным изучение ферментов как химических молекул. Эффективность и специфичность действия данного класса биокатализаторов неразрывно
связаны с их трехмерной структурой. Необходимо представлять
себе источники получения ферментов, процедуры их выделения
и методы физико-химической характеризации молекул. Определение кинетических параметров ферментативных реакций под
действием тех или иных факторов позволяет подбирать опти3
мальные условия для применения ферментов на практике. Разработка методов иммобилизации биокатализаторов обеспечивает получение гетерогенных препаратов, позволяющих многократно использовать катализатор и получать конечный продукт,
не загрязненный ферментом, что особенно важно для пищевых
и фармацевтических производств. Следует подчеркнуть важность использования знаний энзимологии в медицине при диагностике заболеваний и ферментной терапии.
Настоящее пособие базируется на лекциях по курсу
«Прикладная энзимология», который преподается на кафедре
химии имени профессоров С.И.Афонского, А.Г.Малахова факультета биотехнологии и экологии Московской государственной
академии ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И.Скрябина и соответствует программе этого курса. Оно
предназначено для студентов, обучающихся по направлениям
подготовки: 06.03.01 – Биология и 19.03.01- Биотехнология, а
также для слушателей ФПК. Кроме того, пособие может быть
рекомендовано студентам других направлений подготовки ВУЗов, изучающих дисциплину «Прикладная энзимология» («Энзимология»).
4
1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ
1.1. Эффективность и специфичность действия
Каталитические функции присущи многим природным биополимерам. Известны катализаторы на основе антител (абзимы) и
нуклеиновых кислот (ДНК- и РНК-зимы). Многие белки (не ферменты, например, сывороточный альбумин) способны катализировать некоторые гидролитические реакции за счет наличия в их
молекулах нуклеофильных групп. Однако все эти катализаторы,
как правило, слабоэффективны и неспецифичны.
Уникальность ферментов в первую очередь определяется их
высокой эффективностью. Число молекул субстрата (вещество, трансформирующееся в ходе ферментативной реакции),
превращаемых одной молекулой фермента в секунду, может
достигать величин (1÷3)·105. По сравнению с реакциями, протекающими в отсутствие катализатора, скорость катализируемых
ферментами реакций может увеличиваться в 1010-1013 раз. Образно говоря, такая разница означает, что в течение одной секунды в присутствии фермента трансформируется такое количество вещества, которое в его отсутствие трансформировалось
бы за сотни тысяч лет.
Чем объясняется такая эффективность ферментов? Для протекания, например, обычной бимолекулярной реакции требуется
преодоление определенного энергетического барьера, связанного с отталкиванием электронных оболочек реагирующих веществ (рис. 1.1). Ферментативная же реакция как правило многостадийный процесс, в котором на первой стадии образуется
комплекс между ферментом и субстратом. В первом приближении образование в фермент-субстратном комплексе набора
ионных, водородных и гидрофобных связей снижает энергию
образования переходного состояния, то есть понижает энергетический барьер реакции и приводит к увеличению ее скорости.
5
[X...Y]
[E...X...Y]
X+Y
E
продукты
[E...X]
(Е + продукты)
Р и с . 1 . 1 . Диаграмма изменений стандартной свободной энергии
по координате реакции
Вторым уникальным свойством биокатализаторов является
их специфичность по отношению к субстрату (например, глюкозооксидазы к -D-глюкозе, рис. 1.2). Так, уреаза катализирует
гидролиз мочевины, но не активна по отношению к другим амидным связям, в том числе пептидным. Бутандиолдегидрогеназа
катализирует окисление 2,3-бутандиола в ацетоин (3-гидрокси-2бутанон), но совершенно не окисляет этиленгликоль, глицерин,
этанол и бутанол. Более того, окисление оптических изомеров
2,3-бутандиола происходит под действием разных ферментов –
D(-) и L(+)-бутандиолдегидрогеназ, соответственно. Пептидазы и
протеиназы, катализирующие гидролиз пептидных связей в белках и пептидах, также активны только по отношению к L-формам
аминокислот, и абсолютно нейтральны по отношению к их Dформам.
Специфичность ферментов в первую очередь определяется
их третичной (четвертичной) структурой. Пространственное
строение сорбционных центров ферментов таково, что лишь
максимально подходящий по структуре субстрат способен образовывать полный набор необходимых слабых взаимодействий в
промежуточном фермент-субстратном комплексе (аналогия
«ключ-замок»). Любое изменение структуры субстрата приводит
к образованию энергетически «неполноценного» фермент6
субстратного комплекса (или препятствует его образованию),
что приводит к невозможности последующего каталитического
акта.
H OH
H OH
H
H
O
O
HO
HO
H
OH
HO
H
HO
H
OH
H
OH
H
OH
H
-D-глюкопираноза
-D-глюкопираноза
H
H
OH
H
HO
HO
O
HO
HO
HO
H
H
HO
H
H
OH
H
OH
H
O
OH
H
-D-фруктофураноза
-D-фруктофураноза
Глюкозооксидаза, О 2
-D-глюкопираноза
глюконолактон + Н 2О 2
-D-глюкопираноза
-D-фруктофураноза
-D-фруктофураноза
Р и с . 1.2. Специфичность действия ферментов
на примере глюкозооксидазы
7
1.2. Классификация ферментов
В настоящее время в зависимости от типа катализируемой
ферментом реакции принято подразделять ферменты на семь
классов:
1. Оксидоредуктазы,
катализирующие
окислительновосстановительные реакции. Субстрат, подвергающийся окислению, рассматривается как донор водорода.
2. Трансферазы, переносящие ту или иную группу (например, метильную или гликозильную) с одного вещества (донора)
на другое (акцептор).
3. Гидролазы, катализирующие гидролитическое расщепление химических связей (акцептор – вода).
4. Лиазы, осуществляющие отщепление группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или, наоборот,
присоединение групп по двойным связям.
5. Изомеразы, катализирующие геометрические или структурные (изомерные) изменения в пределах одной молекулы.
6. Лигазы (синтетазы), осуществляющие соединение (конденсацию) двух молекул, сопряженное с гидролизом фосфатной
связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.
7. Транслоказы – ферменты, катализирующие перенос веществ через клеточную мембрану, связанное с дополнительной
ферментативной реакцией1.
Кодовый номер фермента состоит из четырех разделенных
точками чисел, предваряемых аббревиатурами КФ (Классификация ферментов) на русском и EC (Enzyme classification) на английском языке соответственно (ключ к нумерации и классификации ферментов приведен в Приложении 1). Схема образования кодового номера (шифра) заключается в следующем: первое число показывает, к какому из шести основных классов принадлежит фермент; второе указывает подкласс; третье – подподкласс; четвертое – номер фермента в его подподклассе в
историческом порядке обнаружения.
Так, для оксидоредуктаз (ЕС 1.х.х.х) второе число в индексе
указывает группу в доноре водорода, подвергающуюся окислеСедьмой класс- транслоказы - введен в классификацию ферментов в 2018 году.
1
8
нию: подкласс 1.1.х.х включает ферменты, окисляющие –(СНОН)- группу (первичные и вторичные спирты, полуацетали), подкласс 1.8.х.х – серосодержащие группы и т.п. (всего 19) Третье
число показывает тип используемого акцептора: 1.1.1.х –
НАД(Ф)+, 1.1.2.х – цитохром, 1.1.3.х – молекулярный кислород и
т.д.
Трансферазы (ЕС 2.х.х.х) делятся на 8 подклассов. Номер
подкласса (второе число шифра) обозначает переносимую группу: 2.1.х.х – одноуглеродный остаток, 2.2.х.х – альдегидную или
кето-группу и т.д. Третье число (подподкласс) в данном случае
уточняет природу переносимой группы. Так, подкласс 2.1.х.х
подразделяется на метилтрансферазы 2.1.1.х, гидроксиметил- и
формилтрансферазы 2.1.2.х и т.д.
Для гидролитических ферментов (ЕС 3.х.х.х) второе число
кодового номера шифрует природу расщепляемой связи –
подкласс 3.1.х.х включает эстеразы сложных эфиров, 3.2.х.х
включает гликозидазы и т.д. (всего 11 подклассов). Третья
цифра уточняет природу субстрата – подкласс 3.3.х.х
(действуют на простые эфирные связи) подразделяется на
подподклассы 3.3.1.х – гидролазы тиоэфиров, и 3.3.2.х –
гидролазы эфиров.
Лиазы (ЕС 4.х.х.х) разделены на 7 подклассов по типу расщепляемой связи (4.1.х.х – С-С-лиазы, 4.2.х.х – С-О-лиазы и
т.д.); третья цифра в шифре несет информацию о природе элиминируемой группы (например, СО2 в подподклассе 4.1.1.х или
Н2О в подподклассе 4.2.1.х).
Изомеразы (ЕС 5.х.х.х) классифицируются в соответствии с
типом реакции изомеризации (5.1.х.х – рацемазы и эпимеразы,
5.2.х.х – цис-транс-изомеразы и т.д., всего 6 подклассов). Подподклассы сформированы по типу субстратов (5.1.1.х – действуют на аминокислоты и их производные, 5.1.3.х – действуют
на углеводы и их производные и т.д.).
Для лигаз (ЕС 6.х.х.х) второе число в номере указывает на
тип образуемой связи: 6.1.х.х для С-О связей (ферменты, ацилирующие тРНК); 6.2.х.х для C-S связей (синтетазы ацилпроизводных СоА) и т.д. (всего 5 классов). Подподклассы фигурируют только в подклассе C-N лигаз (например, 6.3.1.х – амидсинтетазы, катализирующие реакции между кислотой и аммиаком или амином, или 6.3.2.х – пептид-синтетазы, катализирую9
щие взаимодействие между кислотной и аминогруппами аминокислот).
У транслоказ (7.х.х.х) в настоящее время выделено 6 подклассов в соответствии с природой переносимого через мембрану вещества (7.1.х.х – перенос гидрид-иона, 7.2.х.х – перенос неорганических катионов и т.д.). Подподклассы характеризуют тип
сопряженной ферментативной реакции (7.х.1.х - окислительновосстановительные реакции, 7.х.2.х – гидролиз нуклеозидтрифосфата, 7.х.3.х – гидролиз дифосфата, 7.х.4.х – декарбоксилирование).
Следует отметить, что существующая классификация не является застывшей формой, а постоянно дополняется, пересматривается и уточняется. С одной стороны, открываются новые
ферменты. С другой стороны, происходит переклассификация
известных ферментов по мере уточнения механизмов их действия. Так, например, существуют пиридоксальфосфатзависимые ферменты, катализирующие реакции элиминирования из молекулы -аминокислоты - или -заместителя с последующим присоединением на место этого заместителя другой
группы. В суммарной реакции образование конечного ненасыщенного продукта реакции не происходит, поэтому формально
такие ферменты могут быть классифицированы как алкилтрансферазы (ЕС 2.5.1.х). Однако было показано, что подобного рода замещение происходит путем двухступенчатой реакции с промежуточным образованием присоединенной к ферменту ,- (или ,-) непредельной аминокислоты. В соответствии с
правилом, согласно которому классификация определяется первой катализируемой ферментом промежуточной реакцией, правильно классифицировать эти ферменты как лиазы (например,
триптофан-синтаза ЕС 4.2.1.20 или цистатионин--синтаза ЕС
4.2.1.22). Ведение в 2018 году седьмого класса ферментов также произошло именно потому, что известные на тот момент
времени механизмы ферментативных реакций не могли объяснить тип катализа, присущий данным биокатализаторам.
10
1.3. Строение ферментов
Как и любые другие белки, ферменты представляют собой
высокомолекулярные соединения, состоящие из цепочек -Lаминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями. Традиционно говорят о 20 канонических протеиногенных аминокислотах (авторских взгляд на эту проблему изложен в Приложении 2), что и определяет огромную вариабельность аминокислотных последовательностей (порядок расположения аминокислотных остатков в полипептидных цепях от
N- к С-концу). Например, для цепи длиной в 100 аминокислот
возможное число белков с различающейся структурой равно
20100. Однако специфичность и эффективность белков обусловлена также различными формами (уровнями) их структурной
организации. Здесь принято выделять первичную структуру,
обусловленную ковалентными связями. В данном случае имеется в виду не только пептидные связи, соединяющие соседние
аминокислоты, но и дисульфидные связи (мостики), соединяющие атомы серы двух остатков цистеина. Вторичная структура
определяется специфической укладкой локальных участков полипептидной цепи в пространстве. Основные элементы такого
типа – -спирали и -складчатые листы. В -спиралях пептидная
цепь изгибается винтообразно и стабилизируется водородными
связями между амидным атомом водорода и карбонильным
атомом кислорода четвертого по счету аминокислотного остатка. Складчатые слои (-листы) образуются из расположенных
рядом друг с другом растянутых (неспиральных) участков полипептидных цепей, причем плоскости пептидных связей расположены в пространстве подобно равномерным складкам листа бумаги. Такие структуры стабилизированы межмолекулярными
водородными связями и называются антипараллельными, если
цепи ориентированы в противоположных направлениях, и параллельными, если цепи ориентированы в одном направлении.
Важную роль здесь играют -изгибы, которые направляют полипептидную цепь в требуемом направлении для образования структур и обуславливают взаиморасположение -спиралей и листов при образовании третичной структуры. Третичная
структура образуется при сворачивании полипептидной цепи в
компактную трехмерную систему. Амфифильность аминокис11
лотной цепи (наличие аминокислот с гидрофобными и гидрофильными боковыми остатками) приводит к тому, что как можно
больше гидрофобных остатков «стараются» быть экранированными от термодинамически невыгодного контакта с водной средой. На поверхности же в основном располагаются гидрофильные аминокислотные остатки. В целом такая трехмерная структура стабилизируется четырьмя типами взаимодействий – водородные связи между пептидными группами, водородные связи
между боковыми радикалами, ионные связи и гидрофобные
взаимодействия. Дисульфидные мостики также принимают активное участие в стабилизации трехмерной структуры белков.
Фолдинг (сворачивание) белковой глобулы фермента приводит к тому, что удаленные друг от друга в аминокислотной последовательности остатки становятся сближены между собой в
пространстве и формируют активный центр биокатализатора.
Он состоит из двух подцентров (доменов) – субстратсвязывающего (сорбционного), который отвечает за образование фермент-субстратного комплекса и правильную ориентацию
молекулы субстрата в активном центре, и каталитического, который, собственно, и производит акт необходимой трансформации субстрата. Таким образом, одну полипептидную цепь можно
рассматривать как один или несколько функциональных доменов, каждый из которых включает в себя один или несколько
структурных доменов. В настоящее время нестрогое определение домена включает в себя самостабилизацию и независимую
от остальной части белковой цепи укладку. Их также рассматривают как «единицы» сворачивания, поскольку они могут подвергаться фолдингу независимо друг от друга.
Следует подчеркнуть, что в нормальных условиях полипептидная цепь не свертывается произвольно с образованием статистического (хаотичного) клубка. Согласно термодинамике, для
определенной пептидной последовательности существует лишь
ограниченное число состояний, когда свободная энергия как
функция пространственного строения (то есть функция нековалентных взаимодействий между остатками полипептидной цепи)
обнаруживает минимум. Иными словами, первичная последовательность аминокислотных остатков «кодирует» набор строго
определенных типов вторичной, доменной и третичной структур
белка.
12
Четвертичной структурой называют белковые олигомеры
(комплексы), состоящие из нескольких ковалентно друг с другом
не связанных белковых глобул. Субъединицы, образующие олигомер, могут быть гомогенными (одинаковыми по составу) или
гетерогенными (различными по составу и массе). Четвертичная
структура поддерживается ионными, водородными и гидрофобными взаимодействиями. Это означает, что субъединицы могут
существовать и в мономерном состоянии, однако эффективность их действия в составе олигомера, как правило, гораздо
выше.
Следует иметь в виду тот факт, что после фолдинга белковой
глобулы ее переход в функционально активную форму зачастую
происходит в результате ограниченного протеолиза – гидролиза
определенных пептидных связей в аминокислотной последовательности. Такой механизм характерен, например, для протеолитических ферментов, которые синтезируются клеткой в виде
проферментов – зимогенов. Однако этот процесс не приводит к
переходу белка на уровень четвертичной структуры, даже несмотря на возникновение нескольких фрагментов полипептидной цепочки, поскольку все эти фрагменты соединены между
собой ковалентными дисульфидными связями.
Особый интерес для энзимологии представляют полиферментные системы, так называемые «молекулярные конвейеры»
— совокупность ферментов, организованных во времени и пространстве, катализирующих некоторые последовательные (или
последовательно-параллельные) реакции превращения метаболитов, связанные друг с другом отношениями субстрат —
продукт. Классическими примерами полиферментных систем
являются пируватдегидрогеназный комплекс и комплексы электрон-транспортной цепи, локализованные на внутренней мембране митохондрий, и осуществляющие перенос электронов от
интермедиатов цикла Креббса к кислороду.
1.4. Небелковые компоненты ферментов
Зачастую для осуществления катализа ферментам необходимо участие вспомогательных соединений – кофакторов. В
этой роли могут выступать как органические вещества относительно сложного строения, так и неорганические комплексы или
13
ионы. Кофакторы разделяют на простетические группы и коферменты. Простетическая группа по сути своей является
каталитическим центром фермента. Она координирована с белковой частью (апоферментом) ковалентно или при участии ряда
слабых взаимодействий (образованный комплекс называют холоферментом) и осуществляет весь каталитический цикл, не
покидая молекулы холофермента.
Классическими органическими простетическими группами являются флавины - рибофлавин-5’-фосфат (флавинмононуклеотид, ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД), катализирующие
редокс-реакции. Эти соединения образуют холофермент за счет
слабых взаимодействий. Липоевая кислота (липоамид, катализ
декарбоксилирования 2-кетокислот) присоединена к белку через
ковалентную связь со свободной аминогруппой лизина. С использованием аналогичной ковалентной связи формируются и
пиридоксаль-зависимые ферменты различной специфичности рацемазы, трансаминазы, декарбоксилазы.
Простетические группы в виде ионов переходных металлов
распространены среди ферментов очень широко. Комплексообразование этих ионов с белком происходит в основном за счет
координационных взаимодействий с образованием термодинамически устойчивых аддуктов. Такие биокатализаторы называют
металлоферментами. Наибольшее количество металлооксидоредуктаз содержат в активном центре Fe, как в виде собственно
ионов, так и в виде железосерных кластеров различной стехиометрии. Для катализа окислительно-восстановительных реакций
ферменты используют также V, Mn. Co, Ni, Cu, W, Se. Перенос
групп осуществляется при помощи Fe, V, Co, Ni, Cu, Mo, W. Ионы Zn, Ni, Mn принимают участие в гидролизе, а за транспорт
электронов отвечают Fe, Co, Mo.
Промежуточное место между чисто органическими и неорганическими простетическими группами занимают производные
тетрапирролов с координированным ионом переходного металла – гемы (Fe и порфириновое кольцо) и кобаламины (Co и корриновое кольцо). Гем-содержащие белки с окислительно-восстановительными функциями называют цитохромами, а кобаламины являются простетическими группами метилтрансфераз.
Кофермент вступает в более сложные взаимодействия, будучи связующим звеном между двумя ферментами и обеспечи14
вая их функционирование в качестве единой ферментативной
системы. В рамках протекания одной ферментативной реакции
кофермент можно рассматривать в качестве второго субстрата,
который регенерируется в ходе другой (сопряженной) реакции.
Коферменты в основном принимают участие в реакциях переноса. Так, переносчиками фосфатной группы в процессах трансфосфорилирования служат различные нуклеозиды и нуклеотиды (наиболее известен аденозиндифосфат, АДФ). В качестве
переносчиков водорода наиболее широко распространены в
природе никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотид-фосфат (НАДФ), Важную роль в промежуточном обмене жиров играет переносчик ацильных групп кофермент А (3’-фосфо-АДФ-пантоил--аланилцистеамин, СоА).
Следует отметить, что введение седьмого класса ферментов
в Классификацию Ферментов заставляет пересмотреть традиционное деление кофакторов на простетические группы и коферменты. Для функционирования транслоказ (а все транслоказы представляют собой мембранно-связанные белки) наличие
липидной мембраны является необходимым условием. По всей
видимости, в ближайшее время следует ожидать определенных
изменений и в традиционной биохимической классификации кофакторов.
С точки зрения биотехнологического применения ферментов
следует отметить также роль таких ионов металлов, выполняющих структурные функции. Комплексообразование с такими
ионами (чаще всего Ca) не влияют впрямую на эффективность
катализа, но существенно повышают устойчивость активной
конформации белка к неблагоприятным внешним воздействиям.
Посттрансляционное гликозилирование также заметно повышает стабильность ферментов, а в ряде случаев может влиять и на
его кинетические свойства. Таким образом, не стоит ограничивать набор небелковых компонентов ферментов исключительно
рамками кофакторов.
15
Вопросы для самоконтроля
1. Дайте определение фермента.
2. Чем определяется специфичность действия ферментов?
3. Перечислите классы ферментов.
4. Что означает четвертое число в кодовом номере фермента?
5. Назовите уровни структурной организации белка.
6. Что такое «зимоген»?
7. В чем отличие простетической группы от кофермента?
16
2. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
2.1. Предобработка биологического материала
Для определения физико-химических характеристик белков в
целом (и ферментов в частности) в первую очередь необходимо
получить их виде индивидуальных веществ. Процедура выделения начинается с перевода белков в растворенное состояние,
например, разрушение клеток и отделение клеточного дебриса
(для микроорганизмов) или гомогенизация образца и экстракция
(для организмов, органов и тканей). В зависимости от свойств
целевого фермента для его максимальной экстракции применяют буферные растворы различной природы, концентрации и величиной рН, нередко с добавлением детергентов.
Предварительное фракционирование полученных в результате белковых смесей применяется для грубого отделения
ненужных примесей. Например, в концентрированных растворах
солей растворимость белков обратно зависит от их молекулярной массы. Ступенчатое повышение концентрации сульфата
аммония (высаливание) позволяет перевести в осадок вначале
высокомолекулярные белковые фракции, а затем промежуточные. При этом после удаление соли осадок перерастворяется с
сохранением белками своих физико-химических свой и биологической активности.
На растворимость белков также оказывают влияние рН, температура и содержание органического растворителя. Именно на
варьировании этих параметров основан широко известный метод фракционирования белков плазмы крови по Кону.
Ультрафильтрация – мембранный процесс разделения веществ, основанный на фильтровании раствора под давлением
через мембрану с определенным диаметром пор. Белковые молекулы с размерами глобулы, меньшими, чем диаметр пор, проходят с раствором через мембрану, высокомолекулярная фрак17
ция остается над ней. Преимуществом ультрафильтрации является то, что все белки остаются в водной фазе (не требуется
перерастворения осадков), недостатком – относительно долгое
время проведения процедуры.
Методы предварительного фракционирования достаточно
просты, легко масштабируются и позволяют наработать достаточное количество белкового препарата для последующих стадий тонкой очистки с использованием хроматографических методик.
2.2. Хроматографические методы очистки белков
Хроматография – это процесс движения вещества в системе
двух фаз, одна из которых перемещается относительно другой.
Это перемещение увлекает вещество и обуславливает его миграцию, в ходе которой оно непрерывно перераспределяется
между двумя фазами. Скорость миграции зависит от соотношения степеней сродства вещества к подвижной и неподвижной
фазам. Если эти соотношения для компонентов исходной смеси
неодинаковы, то они мигрируют с разными скоростями и их удается физически разделить друг от друга после того, как они
пройдут достаточный для такого разделения путь.
Детектирование компонентов, выходящих из хроматографической колонки, можно осуществлять непосредственно в процессе разделения, используя физико-химические свойства разделяемых молекул (например, поглощение при определенной
длине волны, оптическую активность или показатель преломления). Кроме того, можно собрать небольшие фракции, выходящие из колонки и затем провести различные физические, химические или биологические тесты для определения интересующих фракций.
Гель-проникающая хроматография или гель-фильтрация
является одним из наиболее часто используемых методов при
разделении биомолекул. Разделение происходит в порах носителя, причем, в отличие от других видов хроматографии, не
происходит взаимодействия между материалом носителя и разделяемым веществом.
Молекулы, чей размер крупнее самых больших пор хроматографического носителя, не проникают внутрь гранул и мигриру18
ют с потоком элюента. Таким образом, они выходят в первую
очередь. Более мелкие молекулы имеют возможность проникать
в поры носителя и задерживаться там, причем, чем мельче молекулы, тем более продолжительное время они могут находиться в порах сорбента и, соответственно, элюируются позже других. Таким образом, происходит разделение молекул по их геометрическим размерам, начиная с самых крупных и заканчивая
самыми маленькими.
Метод ионообменной хроматографии основан на взаимодействии (обратимой сорбции) заряженных макромолекул образца с привитыми к носителю ионообменными группами, имеющими противоположный заряд. Носители с положительно заряженными группами называются анионообменниками, поскольку позволяют проводить обмен отрицательно заряженных
анионов. Носители с отрицательно заряженными группами
называются катионообменниками.
На первой стадии процесса (уравновешивание) колонку переводят в стартовые условия (рН, состав буфера и ионная сила), которые обеспечивают сорбцию интересующих молекул образца. На этой стадии привитые ионообменные группы носителя
насыщаются соответствующими противоионами (обычно простыми катионами или анионами, такими как ионы хлора или
натрия).
На второй стадии происходит сорбция образца, во время которой происходит замещение противоионов заряженными молекулами. Несвязавшуюся часть образца вымывают из колонки
стартовым буфером.
На третьей стадии в состав буфера водятся такие компоненты, которые нарушают взаимодействие между носителем и связавшимся образцом и молекулы образца элюируются из колонки. Для этих целей обычно используют градиентное элюирование возрастающей концентрацией соли или изменение рН (градиент концентраций создается в смесителе градиента). В процессе градиентного элюирования вначале выходят слабо связавшиеся компоненты, сильно сорбирующиеся компоненты выходят в конце процесса.
В ионообменной хроматографии можно применять два метода выделения интересующих макромолекул. Первый заключается в связывании молекул интереса на материале носителя, от19
делении примесей промывкой и градиентном элюировании связавшихся компонентов. Второй метод, наоборот, заключается в
связывании примесей, а выделяемые молекулы проходят через
колонку не сорбируясь. В большинстве случаев используют первый метод, поскольку он позволяет проводить не только более
тонкое фракционирование, но и концентрирование компонентов.
Гидрофобная хроматография основана на взаимодействии
входящих в состав белка гидрофобных аминокислот с гидрофобными группами сорбента. Хроматографическое разделение
по степени гидрофобности обычно начинается с сорбции образца на поверхность гидрофобного носителя. Поскольку гидрофобные взаимодействия усиливаются с увеличением ионной
силы раствора, образец наносится при высокой ионной силе.
Это делает гидрофобную хроматографию высокоэффективным
шагом очистки после осаждения белков сульфатом аммония или
элюирования высокими концентрациями солей при проведении
ионообменной хроматографии.
После адсорбции смеси белков при высокой ионной силе на
поверхности гидрофобного носителя, необходимо провести
селективное
элюирование
индивидуальных
белковых
компонентов. Для этого обычно применяют постепенное
снижение ионной силы элюента, при этом белки вымываются из
колонки по мере ослабления гидрофобных взаимодействий.
Гидрофобные взаимодействия можно также разрушить путем
понижения полярности среды (к примеру, добавлением
этиленгликоля) или при введении в элюирующий буфер
неионогенного поверхностно-активного вещества.
Принцип аффинной хроматографии основан на высокоспецифичном выделении одного из компонентов разделяемой смеси при его взаимодействии с селективным носителем. При разделении биомолекул специфический отбор происходит на стадии сорбции, поскольку выделяемая молекула обладает специфическим сродством к соответствующему лиганду, закрепленному на поверхности носителя.
Если на поверхность носителя в качестве аффинного лиганда прививается антитело, полученное против какого-либо белка,
то мы имеем дело с иммуноаффинным сорбентом. Соответственно, разделение белков с использованием такого сорбента
называют иммуноаффинной хроматографией. Антитела вы20
сокоспецифичны и имеют очень высокое сродство к белкамантигенам - константы диссоциации комплексов антигенантитело имеют величины 10-9-10-12 М, в то время как при обычном аффинном взаимодействии эти константы характеризуются
величинами 10-5-10-6 М. С одной стороны, это позволяет осуществлять гораздо более избирательную сорбцию, чем на сорбентах других типов. С другой стороны, для разрушения комплекса антитело-антиген приходится использовать весьма жесткие условия на стадии элюирования интересующего белка,
например, понижение рН элюента до значения 2-3. Антитела
обычно хорошо выдерживают такие достаточно жесткие условия
элюирования, что не всегда можно сказать об интересующих
белках (в особенности ферментов).
В настоящее время для выделения рекомбинантных белков
широко применяется металло-хелатная аффинная хроматография (хелаты - комплексные соединения иона металла с координированными вокруг него органическими лигандами). Ионы
металлов, иммобилизованных на поверхности носителя (Ni2+,
Zn2+, Сu2+, реже Co2+, Fe2+, Ca2+ и некоторые другие) образуют
устойчивые комплексы с имидазольной группой гистидина.
Наличие на поверхности белка нескольких близкорасположенных остатков гистидина резко усиливает его специфическую
сорбцию на хелатном носителе.
В качестве аффинной метки в белках чаще всего используют
так называемый «таг» - последовательность, состоящую из нескольких остатков гистидина (обычно 6-12), вводимую генноинженерными методами на N- или С-конец аминокислотной последовательности целевого белка. Подобная метка имеет небольшой размер, легко синтезируется в клетках и редко влияет
на такие важные характеристики белка, как специфическая активность или структура.
Очистка белков, содержащих в своей структуре таг, достаточно проста. Уже на первом этапе очистки металло-хелатная
хроматография позволяет отделить значительную часть примесных белков и достичь 90-95% чистоты выделяемого белка.
В качестве аффинных лигандов могут выступать и другие
вещества с высокой избирательностью к тому или иному белку.
В случае ферментов, к ним можно отнести специфические субстраты, ингибиторы или кофакторы, привитые на поверхность
21
хроматографического носителя. В некоторых случаях аффинными сорбентами могут выступать нерастворимые субстраты,
такие как целлюлоза для целлюлаз, крахмал для амилаз или
желатин для протеиназ.
Хроматофокусирование является частным случаем ионообменной хроматографии, при котором белки или другие биомолекулы разделяются в системе подвижной и неподвижной фаз в
соответствии с их изоэлектрическими точками. Изоэлектрическая точка белка (pI) – величина рН среды, при которой суммарный заряд белковой глобулы равен нулю. Выше pI (в более щелочной среде) белок заряжен отрицательно, ниже pI – положительно.
Хроматофокусирование использует буферный эффект заряженных групп самого ионообменника, и градиент рН формируется автоматически по мере того, как элюирующий буфер проходит через слой ионообменника. Вначале анионообменную колонку уравновешивают щелочным буфером, а элюент (полибуфер) доводят до более низкого значения рН. Полибуфер содержит большое количество разнообразных заряженных групп и его
буферная емкость равна буферной емкости ионообменника в
широком диапазоне рН. По мере прохождения полибуфера через колонку, его кислые компоненты связываются со щелочными
группами ионообменника, и рН постепенно понижается по длине
колонки, образуя плавный градиент от начала колонки к ее концу.
Если на колонку был нанесен образец, содержащий смесь
белков, то они распределятся по колонке в соответствии с рН и
изоэлектрическими точками. Белок будет двигаться до тех пор,
пока не достигнет точки, где рН будет равно его pI, после чего
его движение резко замедлится. Молекула останется связанной
до тех пор, пока рН формирующего градиента не станет ниже pI
белка. Тогда белок начнет опять продвигаться с элюирующем
буфером до тех пор, пока рН не станет выше pI, и белок вновь
свяжется с ионообменником. Этот процесс будет повторяться до
тех пор, пока белок не выйдет из колонки в соответствии с его
изоэлектрической точкой.
22
2.3. Дополнительные процедуры при выделении белков
Дополнительные процедуры при очистке белков связаны с
особенностями растворов, получаемых на различных стадиях их
выделения. Так, при дробном фракционировании грубых белковых экстрактов или после проведения ионообменной хроматографии в увеличивающемся градиенте соли получают растворы
с высокой ионной силой. Увеличение ионной силы раствора вызывает ослабление электростатических контактов и усиливает
гидрофобные взаимодействия, что негативно сказывается на
конформации белка (снижая, в частности активность ферментов). Для снижения ионной силы проводят обессоливание раствора. С этой целью можно использовать гель-проникающую
хроматографию на носителях с малым средним диаметром пор
(белок будет выходить в «проскоке», в то время как низкомолекулярные соли задержатся на колонке). Наиболее часто применяемый метод обессоливания – диализ. Белковый раствор заливают в диализный мешок и помещают в большой объем раствора с требуемой ионной силой. Полупроницаемая диализная
мембрана не пропускает высокомолекулярные вещества, но
способна пропускать низкомолекулярные. За счет диффузионного выравнивания концентраций между содержимым мешка и
внешним раствором через определенное время (обычно сутки)
концентрация солей в мешке становится равна концентрации
солей в обменном растворе. Процедура диализа используется
также и в случае необходимости изменения рН буфера и даже
для его смены. Концентрирование разбавленных белковых
растворов после хроматографии проводится с помощью ультрафильтрации. Финальная стадия выделения белка – перевод
его в сухую форму. Для этого используют лиофилизацию процесс, основанный на возгонке воды из замороженного препарата при низком давлении.
2.4. Контроль качества очистки (гель-электрофорез)
Электрофорез - движение молекул в соответствии со своим
зарядом в электрическом поле. Гель-электрофорез – метод разделения белков, в котором используется неоднородная разделяющая система с полиакриламидным гелем в качестве носите23
ля. Гель-электрофорез применяется для аналитического разделения белков и полипептидов по размерам молекул и определения их молекулярной массы, а также определения степени чистоты белков. Белковый электрофорез проводят в полиакриламидном геле (ПААГ), помещенном в вертикальную камеру. Белковые препараты наносят в верхнюю часть геля, и они перемещаются вниз под действием электрического поля, причем скорость движения молекул пропорциональна их заряду.
Полиакриламидный гель, представляющий собой продукт сополимеризации акриламида и сшивающего агента N,N’метиленбисакриламида (бис-акриламид), имеет структуру трехмерной сетки. В связи с этим в неденатурирующих условиях
отдельные молекулы исследуемых смесей распределяются в
электрическом поле не только в соответствии с их зарядом, но и
в зависимости от молекулярной массы и формы. Таким образом,
белки с различными молекулярными массами могут иметь одинаковую подвижность.
Для унификации движения белков применяют гельэлектрофорез в денатурирующих условиях. Додецилсульфат
(SDS) натрия является анионным детергентом белков, то есть
вызывает денатурацию белковой глобулы. Дополнительная обработка реакционной смеси реагентами, восстанавливающими
дисульфидные связи (2-меркаптоэтанол, дитиотрийтол (DТТ) и
т.п.), приводит к дальнейшей денатурации белков и разрушению
белок-белковых комплексов. В этом случае единственным фактором, который может повлиять на подвижность белков в полиакриламидном геле является размер белка, а точнее его молекулярная масса. Подвижность обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы белка.
Гель-электрофорез в денатурирующих условиях проводят
после каждой хроматографической стадии. Количество и интенсивность белковых полос говорит об относительной чистоте
препарата. Если на хроматограмме проявляется только одна
полоса целевого белка, можно с уверенность говорить о гомогенности (как минимум 95%-ной чистоте) полученного белка.
24
2.5. Идентификация белков
Доказательством того, что выделен именно искомый белок,
является определение его аминокислотной последовательности
(секвенирование). Одним из ранних методов - секвенирование
по Эдману – основан на способности фенилизотиоцианата взаимодействовать с N-концевой аминокислотой белка, в результате чего эта аминокислота отщепляется в виде фенилгидантиона
(соединения аминокислоты с фенилизотиоцианатом). Хроматографический анализ фенилгидантиона позволяет определить Nконцевую аминокислоту, после чего процедуру повторяют несколько раз с укороченными молекулами белка. Данный метод
весьма сложен ввиду большого количества побочных продуктов,
что не позволяет определять последовательность более чем 5-8
аминокислот с N-конца белковой молекулы. В настоящее время
для определения аминокислотной последовательности используют масс-спектрометрическое картирование продуктов протеолиза белка.
Принцип этого метода довольно прост (рис. 2.1). Белок рассматривается как нитка с нанизанными бусинами 20-ти различных цветов (аминокислотная последовательность), а специфическую протеиназу можно представить себе как ножницы, разрезающие эту нитку после бусины определенного цвета. Во главе
угла данного подхода стоит именно первичная специфичность
используемой протеазы (предпочтительность к той или иной
аминокислоте, образующей расщепляемую пептидную связь
своей карбоксильной группой, Р1-положение). Если на ранних
этапах развития протеомики в качестве расщепляющего агента
использовали исключительно трипсин (первичная специфичность к положительно заряженным аминокислотам – аргинину и
лизину), то позднее выяснилось, что он не всегда удовлетворяет
требованиям конкретного исследования. Трипсин, например,
плохо расщепляет относительно гидрофобные белки или белки
с высоким содержанием отрицательно заряженных аминокислот. В таких случаях могут быть использованы, например, химотрипсин (расщепление по гидрофобным аминокислотам – тирозин, фенилаланин, триптофан) или глутамилэндопептидаза
(расщепление по отрицательно заряженным аминокислотам аспарагиновая и глутаминовая кислоты).
25
Р и с . 2 . 1 . Схема идентификации белка МАЛДИ МС картированием
пептидных масс. Адаптировано из: MALDI MS – a practical guide
to instrumentation, methods and applications. /F.Hillencamp, P.K.Jasna, Eds.// Wiley-VCH Verlag GmbH & Co: Weinheim, 2007.
Набор масс образовавшихся продуктов протеолиза обусловлен взаиморасположением сайтов расщепления первичной последовательности и аминокислотами, находящимися между
этими сайтами. С другой стороны, возможно провести теорети26
ческое расщепление любой белковой последовательности протеиназой той или иной специфичности с получением потенциального набора масс продуктов протеолиза для данной последовательности. Белок идентифицируется как последовательность, генерирующая максимальное совпадение между экспериментальной пептидной картой масс (набор масс продуктов
протеолиза, «фингерпринт») и теоретически возможным набором масс пептидов каждого для индивидуального белка из базы
белковых последовательностей. На практике подобная идентификация осуществляется оптимизированными поисковыми алгоритмами и схемами подсчета, встроенными в легко используемые программы. Поисковая система выдает несколько возможных кандидатов, и вероятности того, что в образце содержится
именно этот белок или пептид (выдаваемая величина вероятности называется «скор» (Score)). Следует, однако, учитывать, что
в разных базах аминокислотные последовательности белков
могут быть различными.
2.6. Методы определения активности ферментов
Скорость ферментативной реакции по определению равна
скорости расходования субстрата или накоплению продукта реакции:
v
d[S] d[P ]

dt
dt
Таким образом, задача определения скорости процесса сводится к выбору инструментального метода, позволяющего фиксировать изменение концентрации субстрата или продукта в
растворе. На практике стремятся определять накопление продукта, а не расход субстрата, поскольку при этом повышается
точность измерений.
Время и концентрации субстрата и продукта ферментативной
реакции могут быть выражены в разных единицах измерения. С
целью унификации в 1971 г. Комиссия по ферментам Международного Союза Биохимиков (IUB) ввела международную единицу
активности (IU, в русскоязычной литературе – МЕ) – количество
27
фермента, трансформирующее 1 мкмоль субстрата в минуту
при фиксированных значениях температуры и рН реакционной
среды. В системе СИ единицей активности является катал (кат)–
количество фермента, трансформирующего 1 моль субстрата в
секунду, то есть 1 МЕ = 0,000000016667 кат, а 1 кат = 60000000
МЕ. Поскольку катал является очень крупной единицей измерения, на практике для характеристики активности ферментов используют именно международные единицы активности.
Рассмотрим набор основных методов регистрации концентраций веществ, наиболее часто применяемых в энзимологии
для определения скорости ферментативных реакций.
Абсорбционная
спектрометрия
(фотометрия
в
УФ/видимом диапазоне). Электронные оболочки молекул могут
находиться в основном (минимальная энергия) и возбужденном
состоянии. Если энергия кванта электромагнитного излучения,
падающего на молекулу, совпадает с разностью энергий основного и возбужденного состояний, то может происходить поглощение этого кванта молекулой с ее переходом в возбужденное
состояние. Для электронных спектров поглощения молекулы
(переход одного из ее электронов на более высокий энергетический уровень) диапазон используемых длин волн (соответствующих энергий квантов) лежит в пределах от 190 до 700 нм. Деление на УФ- (190-400 нм) и видимую область (400-700 нм)
определяется источником излучения – лампой накаливания или
УФ лампой – которые в современных приборах переключаются
автоматически.
Если происходит поглощение света раствором вещества, то
интенсивность пошедшего через кювету луча света падает. Отношение интенсивности вышедшего из слоя светового потока I к
интенсивности вошедшего Io носит название пропускания слоя T
и зависит от концентрации вещества c и длины оптического l
пути согласно закону Бугера-Ламберта-Бера:
T 
I
  ln( cl ) .
Io
Десятичный логарифм обратной величины
называют оптической плотностью слоя D:
28
пропускания
1
D  lg( )  lc .
T
Параметр  называют коэффициентом молярного поглощения при данной длине волны. Его физический смысл – оптическая плотность раствора вещества в концентрации 1 моль/л при
длине оптического пути в 1 см, а размерность – литр/см·моль.
Поглощение света в УФ/видимом диапазоне происходит за
счет различных функциональных группировок (хромофоров).
Зависимость оптической плотности раствора вещества от длины
волны называют спектром поглощения. На практике при использовании абсорбционной спектрометрии для определения
скорости ферментативной реакции снимают спектры субстрата и
продукта, после чего выбирают длину волны, соответствующую
максимальной разнице в оптической плотности этих веществ.
Для этой длины волны и определяют разностный коэффициент
молярного поглощения вещества, за изменением концентрации
которого и следят в ходе процесса.
Если спектры субстрата и продукта сильно перекрываются
(или коэффициенты молярного поглощения данных веществ
малы), то для фотометрического метода возможно использование дополнительных реакций. В реакционную смесь при этом
добавляют избыток реагента, который взаимодействует с продуктом ферментативной реакции, образуя окрашенное вещество. Так, например, определение пируват-иона (продукта многих ферментов) проводится в присутствии 2,4-динитрофенилгидразина. Взаимодействие этих веществ приводит к образованию ярко окрашенного 2,4-динитрофенилгидразона, максимум
поглощения которого приходится на длину волны 490 нм.
Турбидиметрия. Интенсивность проходящего через кювету
луча видимого света может уменьшаться не только за счет его
поглощения растворенным веществом. Световой пучок рассеивается, проходя через суспензии, эмульсии и коллоидные растворы (эффект Тиндаля), что приводит к уменьшению пропускания слоя. На практике это означает связь измеряемой оптической плотности суспензии с ее мутностью, зависящей не только
от концентрации частиц, но и от их размера и формы. Чаще все29
го в энзимологии этот метод применяют для изучения бактериолитических ферментов, где субстратом является целая клетка.
Разрушение клеточной стенки ферментом вызывает лизис бактерии – разрыв клетки вследствие осмотического щока с высвобождением компонентов цитоплазмы. Уменьшение же числа
клеток в ходе процесса приводит к наблюдаемому снижению
оптической плотности суспензии и позволяет регистрировать
скорость реакции.
Как говорилось выше, пропускание суспензий сильно зависит
от размеров и формы частиц - для разных бактерий единица
оптической плотности соответствует концентрации 107—109 клеток/мл. Однако в сильно разбавленных суспензиях мутность
среды описывается законом Бугера-Ламберта-Бера (для клеточных суспензий, например, линейность оптической плотности от
концентрации клеток лежит в диапазоне от 0 до 0,5). Следует
отметить, что при использовании стандартного фотометра в качестве регистратора мутности среды при ферментативном лизисе клеток есть опасность наложения процесса поглощения света
высвобождающимися компонентами цитоплазмы. В этой связи
для регистрации кривых лизиса обычно применяют длинноволновое излучение (550-650 нм).
Флуориметрия. Находящаяся в возбужденном энергетическом состоянии молекула в некоторых случаях способна перейти
в основное состояние, «сбрасывая» избыток энергии в виде
кванта света. Если возбуждение произошло в результате предварительного поглощения кванта света, то такой процесс называют фотолюминесценцией или флуоресценцией. Функциональные группировки в составе молекулы, обеспечивающие
флуоресценцию, называют флуорофорами. Зависимость оптической плотности раствора вещества от длины волны в данном
случае называют спектром возбуждения, а зависимость интенсивности флуоресценции раствора вещества (числа испускаемых квантов) от длины волны излучаемого света называют
спектром испускания.
Флуоресценция характеризуется несколькими закономерностями. Закон Стокса-Ломмеля гласит, что спектр излучения в
целом и его максимум в частности всегда сдвинуты в сторону
более длинных волн по сравнению со спектром возбуждения
(поглощения). Это связано с частичными потерями энергии воз30
бужденного состояния молекулы в ходе безызлучательных процессов. С другой стороны, форма спектра испускания не зависит
от длины волны возбуждающего света (правило Каши). Иными
словами, спектр испускания возбужденного флуорофора зависит только от особенностей его флуоресценции вне зависимости
от пути его перехода в возбужденное состояние.
Очевидно, что максимальная чувствительность данного метода зависит от числа возбужденных молекул и интенсивности
испускаемого света. В этой связи обычно длина волны возбуждающего света совпадает с максимумом на спектре возбуждения, а регистрация процесса ведется на длине волны, соответствующей максимуму на спектре испускания субстрата или продукта реакции. В этих условиях и строится калибровочная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества.
Эффект резонансного переноса энергии по Ферстеру (Forster resonance energy transfer, FRET) позволил разработать
большое количество флуоресцентных субстратов для различных гидролитических ферментов. В основе FRET лежит эффект
возникновения резонанса между близкими энергетическими
уровнями находящихся недалеко друг от друга (20-50 нм) флуорофора-донора и хромофора-акцептора. Если спектр испускания
донора совпадает со спектром поглощения акцептора (перекрывание спектров, условие необходимое, не недостаточное), то
перенос энергии с возбужденного донора на акцептор происходит безызлучательно. На практике это приводит к тушению флуоресценции донора, эффективность которой падает обратно
пропорционально шестой степени расстояния между взаимодействующими группировками. Таким образом, если молекула
субстрата содержит в своем составе донор и акцептор, то флуоресценция раствора незначительна. При гидролизе такого субстрата донор и акцептор расходятся в пространстве и происходит разгорание флуоресценции.
Люминометрия. Переход молекулы в возбужденное состояние не обязательно должен быть связан с поглощением кванта
света. В реакциях ферментативного окисления некоторых субстратов (люциферинов) продукты окисления образуются в возбужденном состоянии, и их переход в основное состояние сопровождается излучением кванта света. В природе этот процесс
31
– биолюминесценцию – обеспечивают ферменты люциферазы.
Поскольку стехиометрия реакции 1:1 (один квант света на одну
молекулу трансформированного субстрата), то интенсивность
светового потока прямо пропорционально скорости реакции. В
отличие от спектрофотометров и спектрофлуориметров приборы для люминометрии (люминометры) не требуют наличия источника света.
Поляриметрия (дисперсия оптического вращения). При
прохождении через раствор оптически активного вещества плоскость поляризации плоскополяризованного света отклоняется от
исходной ориентации влево или вправо в зависимости от пространственной структуры энантиомера. Степень вращения 
(угол отклонения плоскости поляризации от исходной) зависит
от длины волны света, природы вещества, его концентрации с и
длины оптического пути l:
  [ ]cl ,
где [] – удельное вращение. Эта величина для каждого вещества определяется как выраженное в градусах вращение раствора с концентрацией 1 г/мл в кювете с длиной оптического пути 10 см. Данный метод позволяет следить за активностью ряда
изомераз.
Потенциометрия. Электродный потенциал электрохимической ячейки при нулевом токе E (электродвижущая сила, ЭДС)
зависит от активности окисляемых или восстанавливаемых
участников реакции согласно уравнению Нернста (для реакции в
сторону восстановления):
E  Eo 
RT a Ox
ln
,
zF
aR
где R – универсальная газовая постоянная, Т – температура,
F – число Фарадея, z – число электронов, участвующих в реакции, aOx и aR – активности окисленной и восстановленной форм
участников реакции соответственно, которые в разбавленных
растворах можно считать равными обычным концентрациям.
32
Именно таким образом определяют рН среды – измеряют ЭДС
электродной системы, состоящей из стеклянного электрода
(чувствительного к ионам водорода) и электрода сравнения
(стандартный электрод с известной величиной потенциала, чаще всего насыщенный каломельный или хлорсеребряный).
Если в ходе ферментативной реакции происходит изменение
величины рН среды, то регистрировать ее скорость возможно
при использовании рН-стата. Прибор представляет собой традиционный рН-метр, объединенный с титратором. При изменении заданной величины рН в растворе (уменьшение или увеличение концентрации протонов) на титратор подается сигнал для
подачи в ячейку щелочи (или кислоты) до восстановления исходного значения рН. В ходе реакции записывается количество
подаваемого реагента как функция времени, что позволяет в
дальнейшем рассчитать скорость реакции.
Амперометрия. При подаче определенного напряжения
между рабочим электродом и электродом сравнения на поверхности рабочего электрода может происходить окисление или
восстановление электрохимически активных веществ. Возникающий при этом ток I в общем случае прямо пропорционален
концентрации вещества С в растворе:
I  kC
Данный метод широко применяется для определения активности оксидоредуктаз. В первую очередь это электрод Кларка
для измерения концентрации растворенного в реакционной среде
кислорода
(субстрата
многих
окислительновосстановительных ферментативных реакций). Он представляет
собой платиновый электрод, покрытый гидрофобной мембраной.
Кислород диффундирует через мембрану к электроду и восстанавливается с переносом четырех электронов. Активность фермента определяется по скорости убыли концентрации кислорода
в растворе (снижение тока). При этом, однако, следует предотвращать поглощения измерительной ячейкой кислорода из воздуха.
Более предпочтительно амперометрическое определение
концентрации пероксида водорода, продукта реакций многих
оксидоредуктаз. Модифицированные медиаторами электронного
33
переноса электроды имеют весьма низкие пределы его обнаружения – так, покрытые берлинской лазурью электроды позволяют определять субмикромолярные концентрации пероксида водорода по току восстановления. Немаловажно, что процесс в
данном случае происходит при нулевом потенциале относительно хлорсеребряного электрода, что позволяет исключить
возможные искажения сигнала при работе в сложных биологических системах.
В ряде случаев применяются и биферментативные системы.
Так, ацетилхолинэстераза гидролизует ацетилхолин с образованием холина и ацетат-иона. В принципе, регистрировать скорость данной реакции можно потенциометрически с использованием рН-стата. Однако чувствительность этого метода, особенно в кислых средах достаточно низка. Введение в реакционную
среду холиноксидазы приводит к окислению холина до бетаина
с образованием пероксида водорода. Поскольку стехиометрия
последовательной реакции 1:1, то ток восстановления пероксида прямо пропорционален активности ацетилхолинэстеразы.
Манометрия. Во многих ферментативных реакциях принимают участие газообразные вещества как субстраты или продукты процесса – кислород в реакциях оксидоредуктаз, диоксид водорода в реакциях карбоксилаз и декарбоксилаз, азот в реакциях нитрогеназ. Манометрический метод, разработанный
О.Варбургом (O.Warburg), является одним из наиболее старых
методов определения активности ферментов. Он подходит для
детекции как убыли, так и накопления всех типов газов, и основан на измерении объема газа над реакционным раствором.
Вискозиметрия. Данный метод применяется для определения активности эндодеполимераз в реакции гидролиза полимерных субстратов (обычно гидролиз полисахаридов эндоглюканазами). Для этого используют вискозиметр Оствальда – Uобразную стеклянную трубку, в одно колено которой впаян капилляр с шариком фиксированного объема. Второе колено
представляет собой широкую трубку. Определенное количество
жидкости наливают в широкую трубку, поднимают по капилляру
до полного заполнения шарика и засекают время ее истечения
из шарика. При прочих равных условиях (диаметр капилляра,
объем шарика, температура) время истечения жидкости прямо
пропорционально вязкости  раствора. Эта величина зависит
34
как от весовой концентрации полимера, так и от его молекулярной массы. Ферментативный гидролиз полимерного субстрата в
вискозиметре уменьшает его средневесовую молекулярную
массу, то есть уменьшает вязкость раствора. Таким образом,
измерение времени истечения реакционной среды через определенные промежутки времени позволяет определять активность использованного препарата фермента.
Определение общей протеолитической активности.
Протеолитические ферменты отличаются большим разнообразием специфичности по отношению к аминокислотам, образующим гидролизуемую пептидную связь. Для определения активности большинства протеиназ применяют синтетические субстраты, соответствующие специфичности конкретного фермента. При определении общей протеолитической активности в
качестве субстрата используют модельные белки, чаще всего
гемоглобин или казеин. За ходом реакции следят по накоплению
в супернатанте низкомолекулярных продуктов гидролиза после
осаждения высокомолекулярного субстрата трихлоруксусной
кислотой (ТХУ) и последующего центрифугирования реакционной среды. Наиболее простым методом является измерение
оптической плотности при 280 нм (поглощение ароматических
остатков аминокислот), однако он очень малочувствительный.
Повышения чувствительности можно добиться с помощью ковалентно модифицированного красителями белка (например,
азоказеина), но это удорожает стоимость процедуры. В методе
Ансона измеряют восстанавливающую способность супернатанта в реакции с реактивом Фолина-Чокалтеу – окисление фенолов этим реагентом приводит к возрастанию оптической плотности в длинноволновой области (600-750 нм). Результаты выражают в единицах Ансона (AU) – количество фермента, действие
которого приводит к появлению окраски, соответствующей миллиэквиваленту тирозина (именно по нему и строится калибровочная кривая) в данных условиях проведения эксперимента.
Проблемой интерпретации результатов является то, что реактив
Фолина-Чокалтеу чувствителен не только к тирозину и триптофану, но и цистеину и гистидину.
Известны также методы прямого титрования появляющихся в
ходе протеолиза аминогрупп в реакциях с нингидрином или
2,4,6-тринитробензолсульфокислотой. Эти методы не требуют
35
осаждения реакционной смеси ТХУ, однако из-за высокого уровня фонового сигнала (белок как субстрат исходно имеет достаточно большое количество свободных аминогрупп) их чувствительность не очень высока.
Хроматография. Если оптические характеристики субстрата (субстратов) и продуктов ферментативной реакции близки
между собой, то автоматический мониторинг процесса становится невозможным. В этом случае можно воспользоваться хроматографическим разделением реакционной смеси на заранее подобранных системах (размер колонки, природа носителя, элюирующий раствор). В предварительных экспериментах требуется
построения зависимости площади выходящего с колонки пика
вещества от его содержания в наносимом на колонку растворе.
К сожалению, данный метод определения ферментативной активности весьма трудоемок – построение кинетической кривой
происходит по точкам, временной интервал между которыми
определяется временами выхода с колонки исследуемых веществ.
Вопросы ля самоконтроля.
1. Дайте определение хроматографии.
2. Чем различаются процедуры смыва белков с колонки при
анионообменной и гидрофобной хроматографии?
3. Какими методами можно обессолить раствор белка?
4. Перечислите методы определения молекулярной массы
белка.
5. Как определить изоэлектрическую точку белка?
6. Какими методами подтверждают аминокислотную последовательность выделенных белков?
7. На конкретном примере опишите физико-химический метод
определения активности ферментов
36
3. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА
Ферментативная кинетика является разделом химической кинетики, науки, изучающей механизмы и закономерности протекания химических реакций во времени в зависимости от концентраций реагирующих веществ, состава среды и внешних условий проведения эксперимента (базовые понятия и определения
химической кинетики приведены в Приложении 3). Именно кинетика является основным методическим подходом для исследования ферментов и ферментативного катализа. Количественное
описание ферментативных реакций крайне важно как в медицине, так и в биотехнологии. Нарушение гомеостаза (патологическое состояние) зачастую связано с дисбалансом скоростей
образования и расходования метаболитов, а все химические
реакции в организме контролируются ферментами. Таким образом, для приведения организма в норму требуется точное понимание того, какую реакцию и в какой степени следует ускорить
или замедлить. Аналогично, при получении тех или иных продуктов ферментативных реакций необходимо количественное
описание процесса для наиболее эффективного использования
биокатализатора. В настоящем разделе приводятся сведения о
количественном описании ферментативных реакций и факторов,
влияющих на наблюдаемую активность биокатализатора.
3.1. Стационарная кинетика ферментативных реакций.
Дифференциальная форма уравнения Михаэлиса-Ментен
Многочисленный экспериментальный материал, накопленный
к началу 20-го века, показал, что ферментативные реакции характеризуются следующими особенностями: 1) порядок реакции
по ферменту первый; 2) зависимость накопления продукта реакции (или расхода субстрата) от времени имеет протяженный
стационарный режим, где скорость реакции постоянна (рис. 3.1,
А); 3) зависимость стационарной скорости реакции от начальной
37
[P]
vo
концентрации субстрата имеет гиперболический вид, где порядок реакции меняется от первого до нулевого (рис. 3.1, Б).
tg = vo
Б
A
[S]o
время
Р и с . 3 . 1 . Зависимость накопления продукта ферментативной
реакции от времени (А) и скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата. Общий вид.
Идея о принципе биокатализа, выдвинутая в работе Леонора
Михаэлиса и Мод Ментен2, заключалась в том, что между субстратом и ферментом быстро и в равновесном режиме образуются промежуточные соединения, которые претерпевает последовательные превращения вплоть до образования конечных
продуктов реакции и регенерации активного фермента. Именно
с этой работы и отсчитывают историю ферментативной кинетики3. Действительно, в простейшем случае описание ферментативных реакций укладывается в рамки так называемой двухстадийной схемы:
(3.1).
L.Michaelis, M.L.Menten. Die kinetic der invertinwirkung. – Biochemische Zeitschrift, 1913, V.49, P.333-369.
3
K.A.Johnson. A century of enzyme kinetic analysis, 1913 to 2013. –
FEBS Lett., 2013, V.587, P.2753-2766.
2
38
Леонор Михаэлис (1875-1949)
Мод Ментен (1879-1960)
В схеме (3.1) Е – фермент, S – субстрат, KS – константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ES
KS 
[E][S]
[ES]
(3.2),
k2 – константа скорости первого порядка для реакции продуктивного распада фермент-субстратного комплекса.
Рассмотрим кинетику данной реакции при условии [S]o >> [E]o
(что является обычным условием для проведения ферментативных реакций) и примем, что равновесие на стадии образования фермент-субстратного комплекса в реакции (3.1) устанавливается намного быстрее, чем протекает сама реакция. В этом
случае скорость образования продукта реакции Р равна
v
d [P]
 k 2 [ES]
dt
(3.3),
а уравнение материального баланса по ферменту выглядит как
39
[E]o = [E] + [ES]
(3.4).
Выражая [E] через [ES] из уравнения (3.2) и подставляя эту
величину в уравнение (3.4), при помощи небольших преобразований можно выразить [ES] через [E]o, [S] и KS. Подставляя далее полученную величину в уравнение (3.3), получаем
v
k2[E]o[S]
KS  [S]
(3.5).
При изучении начальных скоростей реакций, когда расходом
субстрата можно пренебречь (то есть [S]  [S]o), имеем
v
k2[E] [S]
o
KS  [S]
o
(3.6).
o
Бриггс и Холдэйн4 проанализировали схему (3.1) с точки зрения принципа стационарных концентраций, когда равновесие
при образовании фермент-субстратного комплекса не достигается:
k2
k1
E + P
ES
E+S
(3.7).
k-1
Скорость накопления продукта реакции определяется уравнением (3.3.). Постоянство этой скорости (рис. 3.1, А) означает,
что концентрация промежуточного продукта также ES не меняется во времени, то есть
d [ES]
 k1[E][S]  (k1  k2 )[ES]  0
dt
4
(3.8).
G.E.Briggs, J.B.Haldane. A note on the kinetics of enzyme action. Biochem J., 1925, V.19, P.338-339.
40
Выразив [E] через [ES] из уравнения (3.8), подставив эту величину в уравнение (3.4) и проводя далее преобразования, аналогичные рассмотренному выше случаю, получаем
v
k2[E] [S]
o
K m  [S]
o
(3.9),
o
где Km = (k-1 + k2)/k1 – сложная величина, названная авторами
константой Михаэлиса. Видно, что уравнение (3.5) представляет собой частный случай уравнения (3.9), когда k-1 >> k2, и,
следовательно, Km = KS = k-1/k1.
Рассмотрим более сложную схему ферментативной реакции
с участием двух промежуточных соединений, равновесной первой стадией и образованием двух продуктов реакции на различных стадиях (такая трехстадийная схема описывает механизм
катализа многих ферментов):
(3.10).
В этом случае стационарная скорость образования продукта
Р2 равна
d [P] 2
 k 3 [ ES' ]
dt
(3.11).
Условием стационарности скорости реакции является уравнение
d [ ES' ]
 k 2 [ ES]  k 3 [ ES' ]  0
dt
откуда
41
(3.12),
[ ES]  [ ES' ]
k3
k2
(3.13).
Из выражения для константы диссоциации ферментсубстратного комплекса ES с учетом уравнения (3.13) следует
[E]  K S
[ES]
[ES' ] k 3
 KS
[S]
[S] k 2
(3.14).
Подставляем величины [E] и [ES] из уравнений (3.13-3.14) в
уравнение материального баланса по ферменту
[E]o = [E] + [ES] + [ES’]
(3.15),
выражаем [ES’] через начальную концентрацию фермента [E]o и
подставляем эту величину в уравнение (3.11). При учете условия [S]  [S]o получаем
v
k
кат
[E] [S]
o
K m  [S]
o
(3.16),
o
где
k кат 
k2 k3
k3
, а K m  KS
k2  k3
k2  k3
(3.17).
При наличии первоначальной обратимой стадии для ферментативной реакции с любой схемой зависимость стационарной скорости реакции от концентраций фермента и субстрата
(при условии [S]  [S]o) будет иметь общий вид уравнения (3.16),
где параметры kкат и Km представляют собой комбинации констант индивидуальных стадий процесса и могут включать в себя
концентрации других веществ, так или иначе взаимодействующих с ферментом (см. разделы 3.2 и 3.5).
42
Равенство (3.16) представляет собой дифференциальную
форму уравнения Михаэлиса-Ментен. Согласно этому уравнению, стационарная скорость ферментативной реакции имеет
первый порядок по ферменту. По субстрату порядок реакции
зависит от его концентрации. Действительно, при низких концентрациях субстрата ([S]o << Km) уравнение (3.16) трансформируется к виду уравнения простой бимолекулярной реакции
v
k кат
[ E]o [S] o
Km
где реакция имеет первый порядок по субстрату. При высоких
концентрациях субстрата ([S]o >> Km) скорость реакции определяется уравнением v = kкат[E]o = Vmax и кажущийся порядок реакции по субстрату является нулевым. Следовательно, в промежуточном интервале концентраций порядок реакции по субстрату промежуточный между первым и нулевым и зависит от соотношения [S]o/Km.
Каталитическая константа kкат имеет размерность константы скорости первого порядка (обратное время), ее физический
смысл – количество молекул субстрата, трансформируемых одной молекулой фермента в единицу времени. Произведение
kкат[E]o, имеющее размерность скорости, называют максимальной скоростью реакции Vmax, достигаемой в условиях избытка
субстрата по сравнению с величиной константы Михаэлиса.
Константа Михаэлиса имеет размерность концентрации. Ее
физический смысл – концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине от максимальной. Отношение
kкат/Km, имеющее размерность константы скорости второго порядка, называют константой эффективности ферментативной
реакции.
Прямое определение параметров уравнения МихаэлисаМентен (3.16) из набора данных ([S]o,1-vo,1, [S]o,2-vo,2…) возможно
проводить методом нелинейной регрессии. Однако на практике
для этого используют линейные анаморфозы данного уравнения. Наиболее часто применяемый метод – предложенное в
1934 г. представление уравнения (3.16) в двойных обратных ко-
43
ординатах 1/v - 1/[S]o (координаты Лайнуивера-Берка5). Как
видно из выражения
K
1
1
1

 m
v Vmax Vmax [S] o
(3.18),
график зависимости (3.16) в координатах Лайнуивера-Берка является прямой, пересекающей оси ординат и абсцисс в точках
1/Vmax и –1/Km соответственно (рис. 3.2, А).
При домножении правой и левой частей уравнения (3.18) на
[S]o получают уравнение
[S] o
[S] o
K
 m 
v
V max V max
(3.19).
Координаты [S]o/v - [S]o имеют название координат ВульфаХейнса и отрезки, отсекаемые в этих координатах экспериментальной прямой на осях ординат и абсцисс, равны Km/Vmax и -Km,
соответственно (рис. 3.2, Б).
Третья из относительно широко применяемых анаморфоз носит название уравнения Иди-Хофсти:
v  V max  K m
v
[S] o
(3.20).
В этом случае графическое построение экспериментальных
данных в координатах v – v/[S]o дает прямую с точкой пересечения ординат, равной Vmax, и тангенсом угла наклона, равным –Km
(рис. 3.2., В). Существуют и другие способы трансформации
уравнения Михаэлиса в линейную функцию, однако они не имеют широкого применения.
5
H.Lineweaver, D.Burk. The determination of enzyme dissociation
constants. – J.Am.Chem.Soc., 1934, V.56, P.658-666.
44
vo
А
1/vo
Б
[S]o/vo
В
Vmax
tg = Km/Vmax
Km/Vmax
-1/Km
1/Vmax
1/[S]o
tg  = 1/Vmax
tg  = - Km
Vmax/Km
-Km
[S]o
vo/[S]o
Р и с . 3 . 2 . Определение параметров уравнения Михаэлиса-Ментен в координатах
Лайнуивера-Берка (А), Вульфа-Хейнса (Б) и Иди-Хофсти (В).
45
Три вышеописанные линейные анаморфозы уравнения (3.16)
традиционно приводятся в учебниках по биохимии. Однако с
точки зрения кинетика-практика лучше использовать координаты
Лайнуивера-Берка. Дело в том, что любая величина в уравнении
(3.16) определяется с некоторой ошибкой измерения, зависящей
от точности используемого прибора. Даже задаваемые в эксперименте начальные концентрации веществ зависят от точности
весов и дозаторов. В этой связи применяемые в координатах
Вульфа-Хейнса и Иди-Хофсти параметры [S]o/v и v/[S]o дают (с
точки зрения математической статистики) гораздо большую
ошибку при построении графика, чем каждая из этих величин в
отдельности. Координаты Иди-Хофсти, с моей точки зрения, вообще неприменимы для анализа кинетических данных. При получении графика какой-то линейной функции необходимо задавать значения аргумента (ось «х» координат) такими, чтобы они
находились на равном расстоянии друг от друга. Координаты
Иди-Хофсти такой возможности не дают.
Следует отметить следующие моменты. Во-первых, как уже
говорилось выше, порядок ферментативной реакции по субстрату имеет промежуточный (между первым и нулевым) порядок. В
этой связи экспериментальное определение величины Km возможно только в относительно узком диапазоне концентраций
субстрата 0.1 Km << [S]o << 10 Km. Во-вторых, из экспериментальных данных по зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата возможно определить только
величину максимальной скорости реакции Vmax. Определение
точного значения величины каталитической константы требует
проведения отдельного эксперимента по титрованию истинной
концентрации активных центров фермента в используемом препарате (см. раздел 3.3). Если же такое титрование провести невозможно, рекомендуется использовать международные единицы активности – количество фермента, трансформирующего 1
мкМ субстрата в минуту при фиксированных значениях температуры и рН среды.
46
3.2. Влияние обратимых эффекторов на скорость
ферментативной реакции.
Обратимо действующий на фермент эффектор (вещество,
способное обратимо связываться с ферментом и/или ферментсубстратным комплексом и влиять на кинетические характеристики ферментативной реакции) является мощным механизмом
регуляции ферментативной активности в живых организмах. Если полагать, что стехиометрия реакции фермент-эффектор составляет 1:1, то общая кинетическая схема трансформации субстрата в присутствии эффектора (исходя из базовой двухстадийной схемы (3.1)) будет выглядеть следующим образом:
(3.21)
Анализ кинетической схемы (3.21) в условиях [S]о, [Э]о >> [E]о
приводит к следующему выражению для стационарной скорости
ферментативной реакции:
K Э   [Э]o
[ E]o [S] o
K Э  [Э]o
v
K Э   [Э]o
KS
 [S] o
K Э  [Э]o
k кат
где
47
(3.22)
k кат, каж  k кат
K Э   [Э]o
K Э  [Э]o
(3.23)
K m, каж  K S
K Э   [Э]o
K Э  [Э]o
(3.24)
и
Нижний индекс «каж» указывает на то, что определяемые в
эксперименте величины констант каталитической и Михаэлиса
зависят от концентрации эффектора в реакционной смеси. Разделение эффекторы на типы строится исключительно на их
влиянии на наблюдаемые величины кинетических параметров
kкат и Кm, как по отдельности, так и вместе. Практическое определение констант связывания эффектора с ферментом проводят анализом kкат,каж и Кm,каж, полученных из зависимостей скорости реакции от концентрации субстрата при фиксированных концентрациях эффектора.
Необходимо подчеркнуть, что в данном разделе мы будем
рассматривать именно кинетические типы действия обратимых
эффекторов безотносительно реально имеющихся взаимодействий этих веществ с теми или иными участками белковой глобулы. Дело в том, что уравнение Михаэлиса-Ментен является
достаточно универсальным и описывает процессы, протекающие по более сложным схемам, чем кинетическая схема (3.21).
Иными словами, физический смысл входящих в уравнение (3.22)
кинетических параметров зависит от кинетической схемы реакции и может быть различным.
Если в схеме (3.21) коэффициент  > 1, то суммарная скорость ферментативной реакции в присутствии эффектора увеличивается, то есть эффектор является активатором. В случае,
когда 0 <  < 1, то суммарная скорость ферментативной реакции
в присутствии эффектора уменьшается, то есть обратимый эффектор является ингибитором. При этом само ингибирование
носит неполный характер. Если же  = 0 ингибирование называют полным – именно такие случаи и приводятся в классических
учебниках по биохимии. Начнем именно с этих случаев.
48
3.2.1. Полное обратимое ингибирование
Полное конкурентное ингибирование. В данном случае ингибитор взаимодействует только со свободным ферментом:
(3.25).
Конкурентным данный тип ингибирования называют в силу
того, что, согласно схеме (3.25), субстрат и ингибитор «конкурируют» между собой за связывание с одним и тем же центром
фермента. Кинетический анализ этой схемы в условиях [S]о, [I]о
>> [E]о приводит к следующему выражению для стационарной
скорости реакции:
v
k кат [E] o [S] o
[ I]
K S (1  o )  [S] o
Ki
(3.26)
Таким образом, при определении параметров уравнения
(3.26) в присутствии фиксированных концентраций ингибитора
величина максимальной скорости реакции остается постоянной,
а экспериментально получаемая величина константы Михаэлиса
зависит от концентрации ингибитора согласно уравнению:
[ I]
K m, каж  K (1  o )
s
Ki
(3.27).
. Точки пересечения получаемой прямой с осями ординат и
абсцисс дают величины KS и -Ki соответственно.
Вид зависимостей скорости ферментативной реакции от кон49
центрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка и расчет
Ki для случая полного конкурентного ингибирования представлен на рис. 3.3.
2,5
[I]o
Km, каж
1/vo
2,0
1,5
1,0
А
KS
Ki
0,5
Б
0,0
-1,5
1/[S]o
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
[I]o
1,5
Р и с . 3 . 3 . Зависимость скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка (А) и
расчет константы ингибирования (Б) для случая полного конкурентного ингибирования.
Полное неконкурентное ингибирование. В данном случае
ингибитор способен с одинаковой эффективностью взаимодействовать как со свободной формой фермента, так и с ферментсубстратным комплексом, образуя в последнем случае каталитически неактивный тройной комплекс:
(3.28)
Неконкурентным данный тип ингибирования называют в силу
того, что, согласно схеме (3.28), субстрат и ингибитор не конкурируют за связывание с ферментом, то есть связывание происходит на разных сайтах. Кинетический анализ этой схемы в
50
условиях [S]о, [I]о >> [E]о приводит к следующему выражению для
стационарной скорости реакции:
k кат
[ E]o [S] o
[ I] o
(1 
)
Ki
v
K S  [S] o
(3.29)
Таким образом, при определении параметров уравнения
(3.29) в присутствии фиксированных концентраций ингибитора
константа Михаэлиса не меняется, а экспериментально получаемая величина kкат,каж зависит от концентрации ингибитора согласно уравнению:
k кат, каж 
k кат
[ I]
1 o
Ki
(3.30).
Константу ингибирования рассчитывают из графика в координатах 1/kкат,каж - [I]o согласно уравнению
1
k кат, каж

1
k кат
(1 
[ I] o
)
Ki
(3.31).
Точки пересечения получаемой прямой с осями ординат и
абсцисс дают величины 1/kкат и -Ki соответственно.
Вид зависимостей скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка и расчет
Ki для случая полного неконкурентного ингибирования представлен на рис. 3.4.
51
2,5
[I]o
1/vo
1/ kкат, каж
2,0
1,5
1,0
А
Ki
1/ kкат
0,5
Б
0,0
-1,5
1/[S]o
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
[I]o
1,5
Р и с . 3 . 4 . Зависимость скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка (А) и
расчет константы ингибирования (Б) для случая полного неконкурентного ингибирования.
Полное бесконкурентное ингибирование. В данном случае
ингибитор взаимодействует только с фермент-субстратным комплексом, образуя нереакционноспособный тройной комплекс
ЕSI:
(3.32)
Анализ кинетической схемы (3.12) в условиях [S]о, [I]о >> [E]о
приводит к cледующему выражению для стационарной скорости
реакции:
52
k кат
[ E] o [S] o
[ I] o
(1 
)
Ki
v
KS
 [S] o
[ I] o
(1 
)
Ki
(3.33)
Таким образом, при определении параметров уравнения
(3.33) в присутствии фиксированных концентраций ингибитора
экспериментально получаемые величины Кm,каж и kкат,каж зависят
от концентрации ингибитора, причем абсолютно одинаково. Их
отношение всегда постоянно, поэтому в координатах Лайнуивера-Берка набор получаемых прямых имеет один и тот же тангенс угла наклона (вид зависимостей скорости ферментативной
реакции от концентрации субстрата в координатах ЛайнуивераБерка для случая полного неконкурентного ингибирования представлен на рис. 3.5). Константу ингибирования рассчитывают из
графиков в координатах 1/kкат,каж - [I]o или 1/Кm,каж - [I]o аналогично
уравнению (3.31) и рис. 3.4, Б.
[I]o
1/vo
1/[S]o
Р и с . 3 . 5 . Зависимость скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка для
случая полного бесконкурентного ингибирования.
53
Смешанное полное обратимое ингибирование. Описанные
выше варианты полного обратимого ингибирования относят к
так называемым «чистым» случаям. На практике зачастую реализуются случаи, когда ингибитор способен взаимодействовать
как со свободной формой фермента, так и с ферментсубстратным комплексом, однако эффективность этих взаимодействий различна:
(3.34).
Анализ кинетической схемы (3.34) в условиях [S]о, [I]о >> [E]о
приводит к следующему выражению для стационарной скорости
реакции:
v
k
кат, каж
[E] [S]
o
K m,каж  [S]
o
(3.35),
o
где
k кат, каж 
k кат
[ I]
1  o'
Ki
1
K m, каж  K S
1
(3.36),
[ I] o
Ki
[ I] o
(3.37).
K i'
54
Таким образом, при определении параметров уравнения
(3.35) в присутствии фиксированных концентраций ингибитора
экспериментально получаемые величины Кm,каж и kкат,каж зависят
от концентрации ингибитора, причем по-разному. В данном случае константу связывания ингибитора с фермент-субстратным
комплексом Ki’ рассчитывают из графиков в координатах 1/kкат,каж
- [I]o аналогично уравнению (3.31), а константу связывания ингибитора со свободным ферментом Ki – из графиков в координатах Кm,каж/kкат,каж - [I]o аналогично уравнению (3.27).
3.2.2. Активация и неполное ингибирование
ферментативных реакций
Рассмотренные выше примеры кинетических схем (3.25),
(3.28), (3.32) и (3.34) представляют собой частные случаи общей
схемы (3.21) обратимого взаимодействия эффектора (в общем
случае - как ингибитора, так и активатора) с ферментом. В отличие от случаев полного ингибирования здесь допускается возможность образования продукта реакции в результате распада
тройного комплекса фермент-субстрат-ингибитор ES. Определить значения α, β и Ki в данном случае можно раздельным анализом зависимостей величин наблюдаемых кинетических параметров Кm,каж и kкат,каж от концентрации эффектора. Гиперболическое выражение (3.24) можно традиционным приемом трансформировать в следующую линейную форму:
1
K m, каж
KS

1
1

1

KЭ
 1  1
[Э] o
(3.38).
Согласно выражению (3.38) на графике в координатах
(Km,каж/KS – 1)-1 - [Э]o-1 экспериментальные данные должны соответствовать прямой с тангенсом угла наклона αKЭ/(α - 1), отсекающей на оси ординат отрезок, равный величине (α - 1)-1. Иными словами, из анализа зависимости Km,каж от [Э]о определяются
раздельно величины α и КЭ. Величина β определяется затем из
линеаризации и аналогичного анализа зависимости kкат,каж от [Э]о
согласно уравнению
55
1
k кат, каж
k кат

1
1

1

KЭ
 1  1
[Э ] o
(3.39).
Необходимо отметить следующий момент. Как было сказано
ранее, рассмотренные в разделе 3.2.1 случаи полного ингибирования являются частными случаями схемы (3.21). Действительно, схема (3.21) при  = 0 соответствует случаю полного
смешанного ингибирования по схеме (3.34). При    (константа диссоциации тройного комплекса фермент-субтрат-ингибитор
αKЭ  , то есть тройной комплекс просто не образуется,  в
таком случае не имеет смысла) схема (3.21) и уравнение (3.22)
трансформируются к виду (3.25) и (3.26) соответственно, то есть
к схеме и кинетическому механизму полного конкурентного ингибирования. Аналогично, при  = 1,  = 0 схема (3.21) и уравнение (3.21) трансформируются к виду (3.28) и (3.29) соответственно, то есть к схеме и кинетическому механизму полного
неконкурентного ингибирования. Однако для случая бесконкурентного ингибирования, когда величины kкат,каж и Km,каж изменяются пропорционально, а их отношение является постоянной
величиной – см. уравнение (3.33) – ситуация немного иная. Бесконкурентное ингибирование согласно схеме (3.21) достигается
при условиях  =  < 1. Таким образом, если схема (3.32) описывает упорядоченный механизм взаимодействия ингибитора с
ферментом (образование тройного комплекса ферментсубстрат-ингибитор происходит только в результате связывания
ингибитора с комплексом фермент-субстрат), то схема (3.21)
описывает неупорядоченный механизм взаимодействия ингибитора с ферментом (для образования тройного комплекса
фермент-субстрат-ингибитор неважно, ингибитор или субстрат
связывается вначале с ферментом). При этом по схеме (3.32)
тройной комплекс не способен к образованию продукте реакции,
а по схеме (3.21) тройной комплекс реакционноспособен. Иными
словами говоря, схема (3.32) не является частным случаем схемы (3.21), а представляет собой принципиально иной механизм
реакции.
56
3.2.3. Субстратное ингибирование и активация.
Аллостерические эффекты
В качестве обратимого эффектора может выступать и сам
субстрат, вторая молекула которого способна связываться с
ферментом. Общая схема такого процесса выглядит следующим
образом:
(3.40),
а уравнение для стационарной скорости процесса запишется как
[S] o
)[ E]o [S] o
K 'S
[S] 2
K S[S] o  o
K 'S
(k 2  k 3
v
(3.41),
где K’S – константа диссоциации тройного комплекса ESS:
K 'S 
[ES][S]
[ESS ]
(3.42).
Как и предыдущем случае, ингибирование и активация связаны с соотношением констант k2 и k3 – если k2 > k3, то имеет место ингибирование избытком субстрата, если же k2 < k3, то
наблюдается активация. Рассмотрим несколько предельных
случаев схемы (3.40).
57
Полное ингибирование субстратом (k3 = 0). Уравнение
(3.41) в данном случае трансформируется к виду:
v
k 2 [ E] o [S] o
k 2 [ E] o [S] o

2
[S] o
[S]
)
K S[S] o  o K S  [S] o (1 
K 'S
K 'S
(3.43).
Отсюда видно, что при относительно низких концентрациях
субстрата, когда [S]o << K’S ([S]o/K’S << 1), уравнение (3.43) приобретает вид обычного уравнения Михаэлиса-Ментен для двухстадийной ферментативной реакции. Если же [S]o >> KS, то этой
величиной можно пренебречь, и тогда
v
k 2 [ E] o [S] o
k [ E] [S]
k [ E]
 2 o o  2 o
2
[S] o
[S]
[S]
) 1 o
[S] o  o [S] o (1 
K 'S
K 'S
K 'S
(3.44),
то есть при дальнейшем увеличении концентрации субстрата
скорость ферментативной реакции будет уменьшаться.
Кинетический анализ подобных зависимостей проводят раздельно для низких и высоких концентраций субстрата. Область
низких концентраций, которая описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, обрабатывается, например, в координатах Лайнуивера-Берка, что позволяет получить значения Vmax и KS. При
высоких концентрациях субстрата (уравнение (3.44)) представление экспериментальных данных в координатах 1/v – [S]o позволяет определить величины Vmax и K’S. Совпадение значений
Vmax, полученных при низких и высоких концентрациях субстрата, является доказательством применимости данной схемы для
формального описания кинетики изучаемой ферментативной
реакции. Пример экспериментальных данных реакции с полным
субстратным ингибированием и их обработкой приведен на
рис.3.6.
58
400
Vo, усл. ед.
300
200
100
0
100
200
300
400
500
600
А
[S]o, мкМ
0,014
0,012
1/Vo, усл. ед.
-1
0,04
1/Vo, усл. ед.
-1
0,03
- 1/KS
0,02
0,010
0,008
0,006
0,004
- K'S
0,01
0,0
0,2
0,4
0,6
1/[S]o, мкМ
0,8
-1
1,0
1,2
-200
Б
0,002
0
200
[S]o, мкМ
400
600
В
Р и с . 3 . 6 . Зависимость скорости реакции гидролиза пирофосфата
марганца (II) неорганической пирофосфатазой E.coli от концентрации субстрата (А) и обработка экспериментальных данных в области низких (Б) и высоких (В) концентраций субстрата.6
Рассчитано по: Ю.П.Вайнонен, Е.В.Родина, Н.Н.Воробьева,
С.А.Курилова, Т.И.Назарова, С.М.Аваева. Особенности гидролиза органического и неорганического субстрата неорганической
пирофосфатазой Escherichia coli в присутствии различных металлов-активаторов. - Известия Академии Наук, Сер.хим., 2001,
№ 10, с. 1793-1799.
59
6
Полная активация субстратом (k2 = 0). Уравнение (3.41) в
данном случае трансформируется к виду:
[S] o
)[ E]o [S] o
K 'S
k 3 [ E]o [S] o2
v

[S]o2
K 'S ( K S[S] o )  [S] o2
K S[S] o 
K 'S
(k 3
(3.45).
Как видно из уравнения (3.45), при насыщающих концентрациях субстрата скорость реакции выходит на предельное значение Vmax. Однако при низких концентрациях ([S]o << KS) зависимость скорости реакции от концентрации субстрата приобретает
квадратичный характер. Это приводит к характерному «сигмоидальному» виду получаемых зависимостей. Наблюдаемая константа Михаэлиса при этом зависит от концентрации субстрата,
поэтому для таких случаев говорят о концентрации субстрата,
при которой скорость реакции равна половине максимальной
([S]0,5).
Аллостерические эффекты. Исходно понятие «аллостерический»7 было введено для эффекторов, существенно отличных по структуре от субстрата. Предполагалось, что структурный аналог субстрата («изостерический» эффектор) реагирует
именно по центру связывания субстрата в ферменте, в то время
как аллостерический эффектор связывается в другом (аллостерическом) центре связывания. Возникающие в результате конформационные изменения белковой глобулы меняют и конформацию активного центра фермента, вызывая эффект активации
или ингибирования. В настоящее время термин «аллостерический» стали применять ко всем ферментам, обладающим кооперативными свойствами. Под кооперативностью при этом понимают явление, при котором взаимодействие молекулы некоторого лиганда (эффектора) с ферментом влияет на связывание
последующих молекул (обычно данный эффект характерен для
7
J.Monod, F.Jacob. Teleonomic mechanisms in cellular metabolism,
growth, and differentiation. - Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.,
1961, v.26, p.389-401
60
белков с четвертичной структурой). Различают гомотропный
(влияние лиганда на связывание того же лиганда) и гетеротропный (влияние лиганда на связывание другого лиганда)
кооперативные эффекты. Гомотропные эффекты, приводящие к
увеличению сродства фермента к присоединению последующих
молекул лиганда, называют положительной кооперативностью. Наоборот, отрицательной кооперативностью, или антикооперативностью, называют эффекты ухудшения связывания
последующих молекул лиганда с ферментом после взаимодействия белка с первой молекулой лиганда. Следует подчеркнуть,
что для всех достаточно хорошо изученных кооперативных
ферментов действительно обнаружены аллостерические эффекторы, однако фермент, подвергающийся аллостерическому
ингибированию или активации, может и не обладать кооперативными свойствами. Рассмотренные выше случаи субстратного
ингибирования (уравнение (3.44)) и активации (уравнение
(№.45)) представляют собой классические случаи отрицательной и положительной кооперативности соответственно.
Субстратная активация обычно выражается в S-образной зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Для
описания кинетики действия таких ферментов применяют уравнение Хилла. Вывод его основан на предположении о кооперативном характере связывания нескольких молекул субстрата с
ферментом без учета промежуточных комплексов согласно схеме:
(3.46).
Вывод самого уравнения скорости проводят аналогично описанному выше методу для схемы (3.1), и в результате получают:
v
Vmax [S] on
K  [S] on
(3.47).
Параметр n называется коэффициентом Хилла (в биохимии
он часто обозначается знаком «h») и определяют обработкой
61
зависимости скорости реакции от концентрации субстрата методом нелинейной регрессии. Следует отметить ряд моментов,
связанных с использованием уравнения Хилла. Во-первых, константа K (схема (3.46), уравнение (3.47)) не имеет смысла константы Михаэлиса. Ее размерность n зависит от числа связавшихся молекул субстрата. Во-вторых, коэффициент Хилла практически никогда не бывает целочисленным – это связано с
наличием на практике промежуточных фермент-субстратных
комплексов (ES1, ES2…ESn-1), которые не учитываются при выводе уравнения Хилла, но делают константу К зависимой от
концентрации субстрата (см. уравнение (3.43)).
Влияние обратимых эффекторов на аллостерические ферменты выражается в изменении коэффициента Хилла на зависимостях скорости реакции от концентрации субстрата - ингибиторы увеличивают его значение, а активаторы уменьшают. Схематичное изображение влияния обратимых эффекторов на аллостерические ферменты приведено на рис.3.7.
1,0
0,8
1
0,6
2
V
[S]0,5
3
0,4
0,2
0,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
[S]o
Р и с . 3 . 7 . Зависимость скорости реакции аллостерического фермента от концентрации субстрата (кривая 2) и влияние не нее активатора (кривая 1) и ингибитора (кривая 3).
62
ХХХ
Изучение механизмов действия обратимых ингибиторов и
определение констант их взаимодействия с ферментом играет
важную роль в предклиническом изучении потенциальных лекарственных препаратов. Большое количество лекарств представляют собой ингибиторы тех или иных ферментов. На практике в качестве меры ингибирующей способности соединения
используют величину [I]50. Это значение соответствует концентрации ингибитора, при которой скорость ферментативной реакции снижается в два раза. Если рассчитать связь между величинами [I]50 и Ki, то легко увидеть, что только для неконкурентного
типа ингибирования реализуется равенство между ними: [I]50 =
Ki. В других случаях значение [I]50 зависит от концентрации субстрата – для конкурентного ингибитора с ростом концентрации
субстрата эффективность ингибирования снижается, а для бесконкурентного, наоборот, растет. Таким образом, при определении требуемой дозы лекарственного препарата на основе конкурентных или бесконкурентных ингибиторов необходимо учитывать и концентрацию эндогенного субстрата целевого фермента-мишени.
Несколько слов к вопросу о соответствии кинетического типа
ингибирования молекулярному механизму комплексообразования эффектора с ферментом. Часто для простоты и образности
восприятия эффектов ингибирования эти понятия отождествляются. Так, например, при конкурентном типе ингибирования говорят о конкуренции субстрата и эффектора (ингибитора) за
связывание на сорбционном участке активного центра фермента, а в случаях неконкурентного типа ингибирования делается
заключение о взаимодействии ингибитора с функциональными
группами каталитического участка активного центра фермента.
Однако связывание эффектора может происходить достаточно
далеко от активного центр, но вызывать конформационные изменения в белке, выражающиеся в изменении его активности.
Такой вариант, например, реализуется в природе для достаточно большого количества аллостерических ферментов. Возникновение стерических затруднений для входа субстрата в сорбционный центр, связанных с появлением неподалеку от него
крупной молекулы, также будут проявляться в кинетическом ви63
де конкурентного ингибирования. Именно на таком принципе
основан метод гомогенного иммуноанализа EMIT (enzyme
multiplied immunoassay technique), в котором фиксируется изменении активности ферментной метки в конъюгате ферментантиген в результате стерического исключения доступности молекулы субстрата к активному центру фермента при комплексообразовании конъюгата с антителами.
Необходимо также учитывать и тот факт, что различающиеся
между собой схемы реакций могут приводить к одному и тому же
кинетическому эффекту. Этот момент обсуждался выше на примере бесконкурентного ингибирования при сравнении схем
(3.21) и (3.32). Аналогичный пример можно привести и для полного субстратного ингибирования. Если предположить, что субстрат способен к димеризации и этот димер является конкурентным ингибитором фермента согласно схеме
(3.48),
то кинетический анализ в данном случае приведет к уравнению
((3.44).
3.3. Инактиваторы ферментов
Инактиваторами фермента называют вещества, вызывающие потерю активности в результате образования ковалентных
связей с функциональными группами активного центра белка. В
результате регенерации свободного фермента не происходит и
он, таким образом, как катализатор исключается «из обращения». В простейшем случае бимолекулярной реакции схема реакции выглядит следующим образом:
64
(3.49),
где kин – константа скорости второго порядка. Соответствующее
схеме (3.49) уравнение скорости записывается в виде
d [ EI]
d [E]

 k ин [ E][I]
dt
dt
(3.50).
В аналитическом виде решение уравнения (3.50) имеет
сложный нелинейный вид, однако можно выделить два простых
предельных случая – режим титрования числа активных центров фермента и режим псевдопервого порядка.
В режиме титрования числа активных центров фермента
мы имеем избыток фермента по сравнению с ингибитором. Тогда при полном протекании реакции весь ингибитор перейдет в
фермент-ингибиторный комплекс. Из уравнения материального
баланса следует, что в этом случае
[I]o = [EI] = [E]o – [E]
(3.51)
Поскольку концентрация фермента прямо пропорциональна его
активности ([E]o ~ [А]o, [E] ~ [А]), то зависимость остаточной активности А от исходной концентрации инактиватора [I]o представляет собой прямую линию, отсекающую на оси абсцисс концентрацию активных центров фермента в эксперименте (рис.
3.8).
Второй предельный случай необратимого ингибирования –
режим псевдопервого порядка. При большом избытке ингибитора в реакции (3.49) можно пренебречь его расходом (то есть
принять [I]t  [I]o; где [I]o – начальная концентрация ингибитора).
Тогда уравнение (3.50) трансформируется к виду:

d [E]
 k ин [ E][I]o
dt
(3.52)
65
и решение последнего:
ln(
[E]
)   k ин [I] o t  k эфф t
[ E] o
(3.53)
Активность, А
[A]o
[I]o
[E]o
Рис. 3.8. Определение концентрации активных центров ферментов
в режиме титрования.
Из ур-ния (3.53) видно, что построение экспериментальных
данных в координатах ln([А]t/[А]о) – t (поскольку измеряемая
ферментативная активность прямо пропорциональна концентрации свободного фермента в растворе) позволяет определить
эффективные константы инактивации (тангенсы углов наклона
прямых), зависящие от концентрации инактиватора (рис. 3.9, А).
Истинную константу инактивации находят при построении
найденных значений эффективных констант от концентрации
необратимого ингибитора в смеси как тангенс угла наклона полученной прямой (рис. 3.9, Б).
66
- kэфф = - kин[I]o
0,0
ln(At/Ao)
4
-0,5
3
-1,0
-1,5
2
1
A
-2,0
Б
-2,5
Время
[I]o
Р и с . 3 . 9 . Определение эффективных констант инактивации фермента при различных концентрациях необратимого ингибитора (А,
1-4) и определение истинной константы инактивации (Б).
С другой стороны, при фиксированном времени (t = const) реакции фермента с ингибитором ln(At=const/Ao) = - K[I]o, где K = kинt.
Отсюда следует, что для необратимых ингибиторов ферментов
экспериментальные данные возможно линеаризовать в координатах ln(At=const/Ao) от [I]o. Таким образом, построив калибровочный график и измеряя At=const при инкубации фермента с неизвестной пробой, становится возможным определение концентрации ингибитора в данной пробе. На этом принципе основаны
многочисленные методики ингибиторного анализа (определение
концентраций инактиваторов в образцах почв, воды, пищевых
продуктах, биологических жидкостях и т.д.).
3.4. Интегральная форма уравнения Михаэлиса-Ментен
Как было показано ранее (см. раздел 3.1), уравнение Михаэлиса-Ментен в дифференциальной форме справедливо только
при условии [S]  [S]o, то есть когда расходом субстрата можно
пренебречь. В этом случае в эксперименте наблюдается длительный промежуток прямой пропорциональности накопления
продукта реакции (расхода субстрата) от времени (рис. 3.10, А),
то есть реакция протекает в стационарном режиме. В то же время очень часто скорость реакции заметно уменьшается в ходе
протекания, что приводит к нелинейным закономерностям (рис.
3.10, Б).
67
[P]
[P]
Б
A
время
время
Р и с . 3 . 1 0 . Зависимость накопления продукта ферментативной
реакции от времени в стационарном (А) и нестационарном (Б) режимах. Общий вид.
Чаще всего подобный вид экспериментальных зависимостей
связан с заметным расходованием субстрата, когда дифференциальная форма уравнения Михаэлиса-Ментен (3.16) неприменима. В противном случае его необходимо записывать с учетом
не начальных, а текущих концентраций субстрата (уравнение
(3.54)).
v
V [S]
d [S]
 max
dt
K m  [S]
(3.54).
Интегрируя уравнение (3.54) и подставляя величину [P] из
уравнения материального баланса по субстрату ([P] = [S]o – [S]),
получаем интегральную форму уравнения МихаэлисаМентен:
 [S] o 

[ P ]  Vmax t  K m ln

 [S] o  [P] 
(3.55)
Наиболее известный способ приведения уравнения (3.55) к
линейному виду – метод Уокера-Шмидта – заключается в делении правой и левой частей этого уравнения на t. В этом случае
имеем:
68
 [S]o 
[P]
K

 Vmax  m ln

t
t
 [S]o  [P] 
(3.56),
и зависимость в координатах [P]/t от 1/t.{ln([S]o/([S]o-[P]))} будет
иметь вид прямой линии с тангенсом угла наклона, равным –Km,
отсекающей на оси ординат отрезок, численно равный величине
Vmax (рис. 3.11).
[P]/t
Vmax
tg = -Km
1/t*ln{[S]o/([S]o - [P])}
Р и с . 3 . 1 1 . Определение параметров уравнения МихаэлисаМентен по методу Уокера-Шмидта.
Другой метод обработки интегрального уравнения скорости
реакции, не требующий знания абсолютных значений параметров реакции (начальной концентрации субстрата, начального
времени реакции, абсолютной концентрации продукта реакции и
т.п.) предложен Березиным и Клесовым. Рассмотрим кривую
накопления продукта реакции (рис. 3.12), где величина D – изменение характеристик системы, удобных для регистрации (оптическая плотность, электропроводность и т.д.). В общем случае
[P] = (D-Do), где  - коэффициент пересчета, а Do и D – значения, соответствующие начальному и текущему моменту времени.
69
D
D'1
D'2 D'3
Dmax
D3
D2

D1


Do
t1
t2
t3
t'1
t'2
t'3
время
Р и с . 3 . 1 2 . Кинетическая кривая накопления продукта ферментативной реакции. D – физический параметр, удобный для регистрации кинетики.
Тогда уравнение (3.55) можно записать в виде
t1 
α(D 1  D o ) K m
D  Do

ln max
Vmax
Vmax D max  D1
(3.57)
Для момента времени t’1, равного t1 + , справедливо
t1'  t1   
α(D 1'  D o ) K m
D  Do

ln max
Vmax
Vmax
D max  D1'
(3.58)
Аналогичные пары уравнений будет верны и для других пар
временных точек (t2 и t’2, t3 и t’3 и т.д., рис. 3.12), отличающихся
на одну и ту же величину . Вычитая уравнение (3.57) из уравнения (3.58), получаем
70

α(D1'  D1 ) K m
D  D1

ln max
Vmax
Vmax D max  D1'
(3.59),
или, в более общем виде
D1'  D1 
Vmax  K m
D  D1

ln max
α
α
D max  D1'
(3.60).
Таким образом, при построении экспериментальных данных в
координатах D’i-Di от ln{(Dmax-Di)/Dmax-D’I)} получаем прямую с
тангенсом угла наклона –Km/ и точкой пересечения на оси ординат Vmax*/ (рис. 3.13).
D'i - Di
Vmax*
tg = -Km/
ln{(Dmax - Di)/(Dmax - D'i)}
Р и с . 3 . 1 3 . Определение параметров уравнения МихаэлисаМентен по методу Березина-Клесова.
По сравнению с методом Уокера-Шмидта данный метод не
требует знания абсолютной начальной концентрации субстрата
– ее заменяет величина [P]max, которая и равна [S]o. Обработку
одной и той же кривой можно проводить несколько раз с использованием разных временных интервалов , что существенно
повышает точность определяемых параметров уравнения Михаэлиса-Ментен. С другой стороны, необходимым условием для
применения метода Березина-Клесова является полная уверенность в реальном достижении конечной величины параметра
71
Dmax (то есть полного окончания реакции), что требует достаточно долгого времени для получения экспериментальных зависимостей. Помимо всего вышесказанного, этим методом невозможно обрабатывать экспериментальные точки, полученные
через нерегулярные временные интервалы, что не является
проблемой для метода Уокера-Шмидта.
Наличие в реакционной смеси обратимого ингибитора ферментативной реакции будет влиять на экспериментально определяемые методами интегральной кинетики величины Km и Vmax.
Однако обработка полученных данных аналогично приемам,
разобранным в предыдущих разделах, позволяет определить
тип ингибирования и рассчитать величины констант ингибирования.
Следует откровенно признать, что, не смотря на кажущуюся
простоту, интегральные методы обработки экспериментальных
данных сильно уступают в точности методам стационарной кинетики. Кроме того, имеются частные случаи, которые любопытны с точки зрения кинетики, но сильно осложняют применимость
этих методов на практике. К подобным случаям следует отнести
ингибирование продуктом реакции.
Конкурентное ингибирование фермента продуктом ферментативной реакции можно выразить следующей схемой:
Km
E+S
KP
k2
E+P
ES
(3.61)
EP .
Кинетический анализ схемы (3.61) в рамках интегрального
подхода приводит к уравнению
 [S] 
K m 1  o 
K P   [S] o 
[P]
V


 max 
ln
Km
t
[S]

[P]


K
o


1
t 1  m 
KP
KP 

(3.62).
Из рассмотрения уравнения (3.62) видно, что в том случае,
когда сродство продукта реакции к ферменту больше, чем срод72
ство субстрата (KP < Km), оба члена в правой части приобретают
знаки, противоположные по сравнению с уравнением (3.56). Таким образом, построение данных по методам интегральной кинетики даст физически бессмысленные (отрицательные) величины максимальной скорости реакции и константы Михаэлиса.
При этом довольно большое число ферментативных реакций
происходит с образованием продуктов-ингибиторов (в качестве
примера приведем лишь реакции, протекающие с накоплением
или расходованием протонов – в этом случае в безбуферной
среде будет происходить сдвиг величины рН, которая, как уже
рассматривалось выше, сильно влияет на активность фермента). Это означает, что при наличии полной кинетической кривой,
применение интегральных методов обработки экспериментальных данных не всегда гарантирует положительный результат.
Следует учитывать и возможную инактивацию фермента в ходе
реакции, что тоже может приводить к нелинейной кинетике
накопления продукта реакции от времени. Однако при наличии
опыта работы и известного желания всегда возможно предложить план экспериментов с последовательным учетом возможных кинетических осложнений для того, чтобы выделить влияние каждого из факторов, влияющих на получаемые экспериментальные данные.
3.5. Влияние рН на скорость ферментативных реакций 8.
8
Следует отметить, что само понятие «водородный показатель»
было введено в химию С.П.Л.Серенсеном при изучении влияния
среды на активность ферментов. Свои результаты он опубликовал одновременно в Германии и Франции: Sørensen, S. P. L.
Enzymstudien. II: Mitteilung. Über die Messung und die Bedeutung
der Wasserstoffionenkoncentration bei enzymatischen Prozessen, Biochemische Zeitschrift, 1909, v.21, p.131—304. Sørensen, S. P. L.
Enzymstudier II. Om Maalingen og Betydningen af Brintionkoncentrationen ved enzymatiske Processer. - Meddelelser fra Carlsberg
Laboratoriet, 1909, v.8, p.1-153.
73
Многие аминокислоты, «строительные кирпичи» белковых
молекул, обладают функциональными группами, способными к
ионизации (аминогруппы, карбоксильные группы и т.п.). Возможность участия данной группы в катализе с очевидностью зависит
от ее ионного состояния. Оптимальный для катализа баланс заряженных и незаряженных групп определяет величину рНоптимума данного фермента – значение рН, при котором
наблюдается максимальная активность биокатализатора. Рассмотрим простейший случай влияния рН среды на кинетику
двухстадийной реакции (схема (3.63)).
Символы E, EH, EH2 и т.д. описывают состояния ионизации
групп, участвующих в ферментативной реакции. Равновесные
константы протонирования (диссоциации) для ферментсубстратного комплекса обозначены апострофами, подстрочники «a» и «b» относятся к стадиям протонирования в кислой (от
англ. acid) и в щелочной (от англ. base) области.
K'S
EH2 + S
H+
EH2S
k2
KS
Kb
EH + P
EHS
EH + S
H+
K'a
H+
Ka
H+
(3.63)
K'b
K''S
ES
E+S
Вывод уравнения скорости ферментативной реакции ведется
в предположении о том, что все равновесные процессы в схеме
(3.63) протекают значительно быстрее самого химического превращения субстрата. Такое допущение разумно, поскольку скорость обмена протонов обычно очень высока. Кинетические параметры уравнения Михаэлиса-Ментен (кажущиеся константы
каталитическая и Михаэлиса) запишутся в этом случае, как
k2
k кат, каж 
1

[H ] K b'
 
K a'
[H ]
(3.64)
74
и
[H  ] K b
1
 
Ka
[H ]
K m, каж  K S

[H ] K b'
1
 
K a'
[H ]
(3.65).
По аналогии с действием обратимых эффекторов можно сказать, что увеличение концентрации протонов (уменьшение рН
среды) будет приводить вначале к «активации» фермента (первая стадия протонирования (Kb, Kb’) исходно непротонированной
формы фермента Е в схеме (3.63)). Дальнейшее изменение рН
будет приводить ко второй стадии протонирования фермента
(Ka, Ka’), где наблюдается эффект «ингибирования». Суммарно
вид зависимости активности фермента от рН реакционной среды будет иметь вид колоколообразной кривой. Максимум кривой
(собственно рН-оптимум) для большинства ферментов лежит в
физиологическом интервале значений рН среды (5-9), но пепсин, например, проявляет максимальную активность при рН = 2,
а аргиназа – при рН = 10.
Графический анализ зависимости kкат,каж от рН позволяет
найти величины отрицательного десятичного логарифма констант диссоциации ионогенных групп фермент-субстратного
комплекса (рK’a и рK’b), а аналогичный анализ рН-зависимости
эффективной константы скорости второго порядка kкат,каж/Km,каж
приводит к значениям рК диссоциации ионогенных групп свободного фермента. Рассмотрим более подробно принцип такого
анализа на примере зависимости kкат,каж от рН (рис. 3.14).
При низких концентрациях протонов (в щелочной области)
[H+] << K’a и [H+] << K’b, то есть [H+]/K’a << 1, K’b/[H+] >> 1. Тогда
уравнение (3.63) трансформируется к виду kкат,каж = k2[H+]/K’b.
После логарифмирования получаем прямолинейную зависимость lg(kкат,каж) от pH (lg(kкат,каж) = lgk2 - lgK’b – pH) с тангенсом
угла наклона, равным единице (прямая 1 на рис. 3.14). Аналогичные рассуждения для кислой области (высокая концентрация
протонов, [H+] >> K’a и [H+] >> K’b, то есть [H+]/K’a >> 1, K’b/[H+] <<
75
1) позволяют получить уравнение lg(kкат,каж) = lgk2 + lgK’a + pH
(прямая 2 на рис. 3.14). Наконец, для нейтральной области, где
[H+] << K’a ([H+]/K’a << 1), а [H+] >> K’b (K’b/[H+] << 1) можно записать lg(kкат,каж) = lgk2 (прямая 3 на рис. 3.14). В точках пересечения двух различных функций их аргументы равны между собой.
Приравнивая аргументы прямых 1 и 3 на рисунке 3. 14 в точке их
пересечения, получим рН = рK’b. Аналогичным образом для точки пересечения прямых 2 и 3 имеем рН = рK’а. В предположении
о том, что связывание субстрата не влияет на константу ионизации (pK = pK’), величина рН-оптимума определяется как полусумма этих величин: рНоптимум = 1/2(pK + pK’).
-0,4
3
-0,6
lg(kкат,каж)
-0,8
1
2
-1,0
-1,2
-1,4
pK'a
pK'b
-1,6
3
4
5
6
7
8
9
10
pH
Р и с . 3.14. Схематичное изображение графического определения
величин рК фермент-субстратного комплекса.
Следует отметить, что на практике наблюдаемая картина зависимости активности фермента от рН обычно бывает гораздо
более сложной – в состав активного центра могут входить много
ионизующихся групп, ионизации может подвергаться субстрат
ферментативной реакции и т.д. Даже в простейшем рассмотренном здесь случае графический метод определения величин
76
рK ионогенных групп дает только достаточно грубую оценку их
значений, которые можно использовать как начальные приближения для дальнейшего анализа зависимости методом нелинейной регрессии.
3.6. Влияние температуры на скорость ферментативной
реакции
Влияние температуры на кинетическое поведение ферментов
практически невозможно описать в строгом физико-химическом
виде. Согласно закону Вант-Гоффа, влияние температуры на
константу равновесия химической реакции выражается уравнением
d ln K
H

dT
RT 2
(3.66)
или
d ln K
H
R
1
d 
T 
(3.67)
где Н – энтальпия равновесного процесса, R – универсальная
газовая постоянная, Т – абсолютная температура. Видно, что
график зависимости в координатах lnK – 1/T должен иметь вид
прямой с тангенсом угла наклона -Н/R (рис. 3.15, А). Зная величину энтальпии Н и свободную энергию G равновесного
процесса при данной температуре (G = -RTlnK), можно найти
величину энтропии процесса
S 
H  G
T
(3.68)
Зависимость константы скорости химической реакции от температуры в простейшем виде определяется полуэмпирическим
77
уравнением Аррениуса. В современном виде это уравнение записывается как

Ea
k  k o e RT
(3.69),
tg = -H/R
lnk
lnK
где ko – предэкспоненциальный множитель, а Еa – энергия активации. Таким образом, в координатах lnk – 1/T зависимость
представляет собой прямую линию с тангенсом угла наклона –
Ea/R (рис. 3.15, Б).
tg = -Ea/R
Б
А
1/T
1/T
Р и с . 3.15. Температурная зависимость (А) константы равновесия
в координатах Вант-Гоффа и (Б) константы скорости реакции в
координатах Аррениуса.
Зачастую уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса применяют к
температурным зависимостям ферментативных реакций. Следует, однако, четко понимать, что в данном случае определяемые величины констант являются эффективными и представляют собой сложные комбинации констант индивидуальных стадий ферментативного процесса. Именно поэтому на широком
температурном интервале подобные графики имеют четко
наблюдаемые изломы. Объяснения такому поведению бывают
разные – смена скорость-лимитирующей стадии, конформационный переход белковой глобулы в состояние с иной активностью и т.п.
Таким образом, определяемые в координатах Вант-Гоффа и
Аррениуса параметры не являются в чистом виде термодинамическими величинами энтальпии или энергии активации и более
78
корректно говорить о температурном коэффициенте анализируемого параметра. В среднем скорость ферментативной реакции
возрастает в 2-4 раза при повышении температуры на 10 градусов.
Итак, с ростом температуры абсолютные значения констант
равновесия увеличиваются (рис. 16, А). Таким образом, рост
температуры должен приводить к ухудшению, например, связывания фермента с субстратом. Кроме того, сдвигаться в более
кислый диапазон значений рН будут и константы ионизации
фермента, что приводит к сдвигу величины рН-оптимума ферментативной реакции в кислую область. Таким образом, при переходе к повышенным температурам следует в первую очередь
определить рН-зависимость активности фермента.
Увеличение кинетических констант с ростом температуры
(рис. 3.15, Б) может неоднозначно сказываться на наблюдаемой
кинетике ферментативных реакций. С одной стороны, рост константы каталитической обуславливает увеличение начальной
скорости реакции. Однако одновременно с этим увеличивается
и скорость термической инактивации фермента за счет необратимого конформационного «разворачивания» белковой глобулы
(денатурации). В простейшем случае эту реакцию можно схемы
мономолекулярной реакции:
(3.70),
где kin – константа скорости первого порядка. Именно наложением двух разнонаправленных эффектов (возрастание скорости
ферментативной реакции и скорости инактивации фермента с
ростом температуры) обусловлено наличие так называемого
«температурного оптимума» фермента. Принцип определения
температурного оптимума заключается в том, что реакцию при
фиксированных начальных концентрациях реагентов и одном и
том же значении рН проводят в течение определенного времени
при различных температурах, после чего строится зависимость
количества образовавшегося продукта за произвольно выбранное фиксированное время ([P]t=const). Быстрая инактивация фермента при повышенных температурах приводит к остановке ре79
акции (рис. 3.16, А), в результате чего такие зависимости имеют
колоколообразную форму (рис. 3.17, Б). Температуру, при которой достигается максимум величины [P]t=const, и называют температурным оптимумом фермента. Как видно из рис. 3.16, Б, эта
величина весьма условна и зависит от времени проведения реакции – чем больше это время, тем ниже температура оптимума.
Именно поэтому абсолютно неверным является часто встречающееся в литературе утверждение, что температурный оптимум
– это температура, при которой фермент проявляет максимальную активность.
Р и с . 3.16. Зависимость накопления продукта ферментативной
реакции от времени при различных температурах (А) и «температурный оптимум фермента» при различных временах проведения
процесса. Общий вид.
Условность величины температурного оптимума связана еще
и с постоянным значением рН среды, в которой ведутся эксперименты. Как говорилось выше, рост температуры приводит к
сдвигу рН-оптимума фермента в более кислую область. В разделе 3.5 мы обсуждали, что рН-оптимум определяется оптимальным для катализа балансом заряженных и незаряженных
групп белка – в этих условиях каталитически активная конформация белка наиболее устойчива к тепловой денатурации. Таким образом, сдвиг рН-оптимума с ростом температуры приводит к увеличению скорости его инактивации. Тем не менее, при
корректной постановке экспериментов данные процессы можно
изучать раздельно.
80
3.7. Регуляция активности ферментов в живой природе
В природе для регуляции активности ферментов используются практически все рассмотренные в настоящем разделе случаи. Так, например, влияние концентрации субстрата можно
проиллюстрировать на примере потребления пищи. Продолжительное голодание вызывает слабость и неприятные ощущения
в желудке (пищеварительные ферменты есть, но их природные
субстраты отсутствуют). С другой стороны, агрессивное переедание (слишком высокие концентрации субстратов) «переводит» ферментативные процессы в режим «максимальной скорости» (нулевой порядок реакции по субстрату). В итоге большая
часть пищи остается непереваренной, что также приводит к неприятным последствиям (тяжесть в желудке, метеоризм, тошнота и т.п.). К патологическим последствиям приводит и авитаминоз, поскольку многие витамины являются структурными элементами кофакторов, необходимых для успешного функционирования большого числа ферментов.
Влияние рН среды также можно увидеть на примере пищеварительных протеиназ, ферментов, расщепляющих белки до
аминокислот. В кислой среде желудка начинает работать пепсин
(рН-оптимум в районе 4,0). По мере перехода пищи в кишечник и
соответствующего увеличения рН активность пепсина резко
уменьшается и в процесс пищеварения включаются ферменты с
рН-оптимумом в районе нейтрального (трипсин, химотрипсин).
Другим примером контроля активности ферментов под действием рН является карбоангидраза, катализирующая обратимую реакцию разложения угольной кислоты на углекислый газ и
воду:
В слабощелочной среде тканевых капилляров карбоангидраза сдвигает равновесие этой реакции в правую сторону, переводя образующийся в результате тканевого дыхания углекислый
газ в бикарбонат (протоны связываются гемоглобином). Бикар81
бонат-ионы доставляются в легкие, где, в более кислых легочных капиллярах, карбоангидраза сдвигает равновесие в сторону
образования углекислого газа, который затем и удаляется из
организма.
Можно указать и на компенсаторные механизмы, связанные с
увеличением активности ферментов при росте температуры.
Так, мембранно-связанная Na,K-аденозинтрифосфатаза демонстрирует четкий перегиб на графике Аррениуса, который хорошо
коррелирует с температурой плавления липидной мембраны.
Таким образом, фазовый переход (плавление) липидной мембраны приводит к изменению конформации и резкому понижению температурного коэффициента фермента, что предотвращает его гиперактивность.
Важную роль в процессах регуляции активности ферментов
играют обратимые эффекторы. Так, протеинкиназа А представляет собой гетероолигомер, состоящий их двух каталитических и двух регуляторных субъединиц, и не проявляющий ферментативной активности. цАМФ, связываясь с регуляторными
субъединицами белка, вызывает диссоциацию неактивного тетрамера с высвобождением каталитических субъединиц, включая
тем самым процессы фосфорилирования белков. Поскольку
диссоциация является обратимой реакцией, то после разрушения цАМФ протеинкиназа А вновь собирается в исходный неактивный тетрамер и фосфорилирование прекращается.
Регуляция ферментативной активности через образование
или разрушение ковалентных связей может быть обратимой или
необратимой. Необратимая ковалентная активация представляет собой появление активного фермента в результате ограниченного протеолиза его неактивного предшественника – зимогена. Активный центр в зимогене стерически закрыт для доступа
субстрата концевым полипептидом или некоторой петлей аминокислотной последовательности белка. Гидролиз пептидной
связи между двумя конкретными аминокислотами приводит к
появлению фермента в его активной форме. Так, для образования активного трипсина, протеиназы желудочно-кишечного тракта, требуется отщепление гексапептида Val-(Asp)4-Lys с N-конца
трипсиногена (реакция происходит под действием энтеропептидазы, возможен также автокаталитический механизм активации
82
трипсиногена самим трипсином). В то же время плазмин образуется при расщеплении активаторами плазминогена связи
Arg561-Val562 и превращением одноцепочечного плазминогена
в двухцепочечный активный фермент.
Классическим примером обратимой ковалентной регуляции
являются реакции фосфорилирования-дефосфорилирования
белков. Так, активная гликогенсинтаза переводится в неактивное состояние фосфорилированием серина активного центра
фермента (процесс осуществляет киназа гликогенсинтазы 3).
Обратная реакция (активация гликогенсинтазы дефосфорилированием активного центра) катализируется протеинфосфатазой 1. В то же время гликогенфосфорилаза активна в фосфорилированной форме (тетрамер) и гораздо менее активна в димерной дефосфорилированной форме, что связано с конформационными изменениями фермента в ходе ковалентной модификации. Упаковка дефосфорилированных субъединиц такова,
что двадцатичленный полипептид на N-конце молекулы заглублен в белковую глобулу за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженными остатками полипептида и отрицательно заряженными остатками глобулы. В этом состоянии активный центр фермента довольно сильно искажен.
Фосфорилирование Ser14 под действием киназы фосфорилазы
нарушает это взаимодействие и «выталкивает» N-концевой домен из кислой области белка. Отрицательно заряженная фосфатная группа в свою очередь электростатически взаимодействует с боковыми цепями нескольких остатков аргинина, что
приводит к тетрамеризации белка и повышению его активности.
Довольно часто приводимый пример кинетической стабилизации ферментативной активности в живой природе – так называемый механизм обратной петли (обратной связи). Если мы
имеем цепь последовательных реакций, то скорость накопления
продукта конечной стадии будет лимитироваться скоростью самой медленной – скорость-лимитирующей - стадии в цепи (для
простоты примем, что это самая первая стадия процесса).
Механизм обратной связи заключается в том, что конечный
продукт последовательной реакции является ингибитором скорость-лимитирующей стадии. В этом случае возможные ускорения суммарного процесса будут тормозиться ингибирующим
83
действием конечного продукта на самую медленную стадию реакции и снижать тем самым эффективность работы всей цепи.
Образование белковых гетероолигомеров также способствует в ряде случаев изменению каталитических свойств ферментов. Плазмин (Пл) – фермент, расщепляющий фибриновые
сгустки (тромбы) в кровотоке – вырабатывается в виде зимогена
и не способен к автоактивации. Активация плазминогена (Пг)
происходит под действием специфических протеиназ (Акт). В
случае прямых активаторов (урокиназа, тканевый активатор
плазминогена) реакция протекает по классической трехстадийной схеме:
В случае же активаторов непрямого действия (стафилокиназа, стрептокиназа) димеры активатор/плазмин довольно устойчивы и способны к каталитической активации плазминогена в
плазмин. Более того, в случае стрептокиназы плазминоген активируется даже комплексом стрептокиназа/плазминоген!9
Механизм быстрого повышения ферментативной активности
в локальной области организма основан на каскадных ферментативных реакциях, примером которых является реакция
тромбообразования. Тромбы образуются в результате ограниченного протеолиза фибриногена в фибрин-мономер ферментом тромбином. Далее фибрин-мономер полимеризуется, захватывает в свою сетку форменные элементы крови, и образует
«пробку», предотвращающую кровопотерю. Самопроизвольное
тромбообразование при этом имеет очень негативные последствия для организма, поэтому в крови тромбин присутствует в
виде неактивного зимогена – протромбина, а большое количество белковых ингибиторов тромбина (антитромбины) связывает
спонтанно активированный тромбин в неактивные комплексы.
Р.Б.Айсина,
Л.И.Мухаметова,
Д.А.Гулин,
К.Б.Гершкович,
С.Д.Варфоломеев. Стрептокиназа и стафилокиназа: различия
кинетики и механизма взаимодействия с плазминогеном, ингибиторами и фибрином. – Биоорг. химия, 2015, Т.41, № 5, с. 565578.
84
9
При повреждении внешних тканей из поврежденных клеток выделяется тканевый тромбопластин, который «запускает» последовательный каскад активации зимогенов – VII-го и X-го факторов свертывания крови; активный Х-тый фактор и активирует
протромбин.
Концентрация продукта ферментативной реакции прямо пропорциональна времени. Однако если этим продуктом является
другой фермент, то концентрация продукта второй реакции будет пропорциональна уже квадрату времени. В общем случае
накопление конечного продукта ферментативного каскада будет
пропорциональна времени в степени n, где n – число стадий
процесса. Таким образом, использование каскадного механизма
активации протромбина позволяет быстро создать высокие концентрации тромбина (превышающие емкость антитромбинов в
крови) в области повреждения ткани и сформировать защитный
тромб.
Вопросы для самоконтроля.
1. Каковы физический смысл и размерность параметров
уравнения Михаэлиса-Ментен.
2. Какие способы расчета параметров уравнения МихаэлисаМентен вы знаете?
3. К какому типу ингибирования можно отнести ингибирование фермента избытком субстрата?
4. Как отличить необратимый ингибитор от обратимого?.
5. Как определить кинетические параметры ферментативной
реакции в условиях переменной концентрации субстрата?
6. Опишите схему эксперимента для нахождения температурного оптимума фермента.
85
4. ПРОМЫШЛЕННАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ
Сам термин «энзимология» появился в середине 19-го века в
результате дискуссии микробиологов и химиков о природе спиртового брожения – одного из первых биотехнологических процессов, используемых человечеством. Микробиологи (в первую
очередь под давлением авторитета Л.Пастера) считали, что образующийся спирт является продуктом жизнедеятельности некоторых живых организмов, который они называли fermentum, то
есть «закваска» (лат.). Химики отстаивали точку зрения о том,
что внутри клеток имеются конкретные вещества белковой природы, ответственные за протекание данного процесса. В 1867
году В.Кюн предложил для этих веществ название «энзим»,
скомбинировав греческие «en» («в») и «zyme» («закваска»). В
конце 19-го века Э.Бухнер подтвердил справедливость мнения
ученых-химиков, показав возможность сбраживания сахара бесклеточными экстрактами дрожжей (Нобелевская премия по химии 1907 г. «за биохимические исследования внеклеточной
ферментации и выделение зимазы»).
Успехи микробиологии и генной инженерии позволяют в
настоящее время получать рекомбинантные ферменты требуемой специфичности в больших количествах и использовать их в
промышленных масштабах. В первую очередь ферменты востребованы в пищевой промышленности. Огромную нишу занимают и ферментные препараты для производства так называемых «умных» стиральных порошков. Природные биокатализаторы активно применяются в косметической, целлюлозобумажной, текстильной и кожевенной промышленности. Некоторые отрасли животноводства (например, свиноводство и птицеводство) широко используют ферментные препараты для повышения усвояемости кормов. Реакции тонкого органического и
энантиоселективного синтеза весьма востребованы при получении лекарственных препаратов. Отдельно следует упомянуть
86
аналитические возможности ферментов как для определения
концентраций тех или иных веществ, так и в качестве меток при
проведении различных биоаналитических процедур.
4.1. Липазы в промышленных технологиях
Пищевая биотехнология с использованием целых клеток позволяет получать продукты с богатыми вкусовыми качествами в
силу большого количества различных веществ, производимых
живыми организмами. В то же время при получении конкретных
химических веществ такое разнообразие продуктов является
отрицательным фактором, поскольку снижает выход целевого
вещества и усложняют процессы его очистки. В этой связи логика развития подобных производств требует перехода от исходного биокатализатора-микроорганизма к ферменту, непосредственно катализирующему требуемую реакцию трансформации
исходных веществ в конечный продукт. Так, получение Lаспарагиновой кислоты первоначально осуществлялось при помощи клеток E.coli. В настоящее время этот процесс осуществляется с использованием иммобилизованной аспартазы.
Приведем две цитаты из научной литературы. «В промышленном применении наиболее значимыми ферментами являются гидролазы (амилазы, протеиназы, липазы) Липазы применяются максимально широко ввиду их высокой каталитической активности, стабильности и способности катализировать большое
количество самых разнообразных реакций.» 10 «Продукты промышленных процессов с использованием липаз составляют 40%
всех веществ, получаемых при помощи ферментов.»11
10
D.G.Filho, A.G.Silva, C.Z.Guidini. Lipases: sources, immobilization
methods and industrial applications. – Appl.Microbiol.Biotechnol.,
2019, V.103, p.7399-7423.
11 M.Bilal, C.D.Fernandes, T.Mehmood, F.Nadeem, Q.Tabassam,
L.F.R.Ferreira. Immobilized lipases-based nano-biocatalytic systems
– A versatile platform with Incredible biotechnological potential. –
Int.J.Biol.Macromol., 2021, V.175, p.108-122.
87
Эти высказывания подтверждаются данными таблицы 4.1, в
которой приведены наиболее крупнотоннажные производства
продуктов на основе ферментов. При этом три из восьми процессов проводится при помощи липаз. В этой связи имеет смысл
более подробно остановится на липазах, их свойствах и их использовании в промышленности. Однако в начале несколько
слов о производствах с использованием других ферментов.
Гидролиз крахмала α-амилазой с последующей изомеризацией глюкозы во фруктозу под действием глюкозоизомеразы
приводит к получению сиропов с высоким содержанием фруктозы. Под коммерческим названием «патока» этот продукт широко
используются в пищевой промышленности в качестве подсластителя (фруктоза в 1,25 раза слаще глюкозы и в 1,5 раза слаще
сахара).
Лактоза (молочный сахар, дисахарид β-D-галактопиранозил(1,4)-β-D-глюкопираноза) содержится в молоке и расщепляется в
желудочно-кишечном тракте ферментом лактазой. Отсутствие у
человека этого фермента вызывает так называемую непереносимость лактозы – энзимопатию, вызывающую диарею, вздутие
живота, тошноту и рвоту после употребления молочных продуктов. Предварительный гидролиз лактозы позволяет получать
«обезлактоженные» молочные продукты, которые могут употреблять в пищу люди с такой проблемой.
Пенициллин G ацилаза катализирует образование 6аминопенициллановой кислоты (6-АПК) снятием в мягких условиях бензильной группировки с природного бензилпенициллина
(пенициллина G). Последующее ацилирование свободной аминогруппы 6-АПК дает возможность синтеза новых антибиотиков
пенициллинового ряда.
Процесс получения L-аспарагиновой кислоты из фумаровой
кислоты при помощи аспартазы непосредственно связан с выработкой аспартама при помощи термолизина. Аспартам – метиловый эфир L-аспартил-L-фенилаланина – вещество, в 200
раз слаще сахара и применятся при производстве диабетических продуктов.
88
Таблица 4.1. Наиболее крупнотоннажные производства с использованием ферментов (согласно R.DiCosmo, J.McAuliffe,
A.J.Poulose, G.Bohlmann. Industrial use of immobilized enzymes. Chem. Soc. Rev., 2013, V.42, N 15, p.6434-6474).
Фермент
Класс
Процесс
Объем
продукции
(тонн/год)
107
*Лактаза
Получение сиропов с
высоким содержанием фруктозы из крахмальных гидролизатов
3.1.1.3
Утилизация маслосодержащих
отходов
производства
3.2.1.108 Гидролиз лактозы
Липаза
3.1.1.3
Производство биодизельного топлива
104
*Пенициллин G
ацилаза
3.5.1.11
Получение
тиков
антибио-
104
*Аспартаза
4.3.1.1
104
*Термолизин
Получение
Lаспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты
3.4.24.27 Синтез аспартама
Липаза
3.1.1.3
*α-Амилаза
3.2.1.1
Глюкозоизомераза 5.3.1.5
Липаза
105
105
104
Разделение хираль- 103
ных спиртов
*Процессу посвящен отдельный раздел в: Р.Шмид. Наглядная
биотехнология и генетическая инженерия. – М.: Лаборатория
знаний, 2020. – 324 с.
Вернемся к использованию липаз. Физиологическая роль липазы (ЕС 3.1.1.3, систематическое название триацилглицерол:ацилгидролаза) в любом организме – это гидролиз природных триглицеридов (жиров и масел). В зависимости от источника
89
липазы проявляют различную специфичность по отношению к
длине жирной кислоты в триглицериде, а также различную региоселективность – неспецифичные липазы гидролизуют все
три сложноэфирные связи, в то время как sn-1,3-специфичные
гидролизуют в триглицериде только связи у крайних атомов углерода и не способны гидролизовать сложноэфирную связь у
центрального атома.
По своей трехмерной структуре липазы относятся к ,гидролазам, содержащим 8 -листов и 6 -спиралей. Каталитическая триада липаз - Ser/His/(Asp/Glu) - аналогична другим сериновым гидролазам. Помимо своих природных субстратов липазы способны гидролизовать большой спектр сложных эфиров
карбоновых кислот с весьма различной структурой ацильной и
спиртовой частей.
Гидролитические свойства липаз находят применение в
фармацевтической промышленности при создании пищеварительных ферментных препаратов (подробнее см. в разделе 5).
Сама по себе липаза, как пищевая добавка Е1104 используется
в пищевой промышленности для ароматизации продуктов питания в хлебопечении, сыроделии, производстве сыровяленых
колбас. Одним из компонентов пищевой добавки 471 (пищевой
эмульгатор) являются моноацилглицериды, получаемые гидролизом триглицеридов sn-1,3-специфичными липазами.
В непищевых областях гидролитические свойства липаз позволяют переводить исходно гидрофобные природные триглицериды в более растворимые продукты, то есть избавляться от
жиров и масел. Так, стиральные порошки с добавкой липаз более эффективно удаляют с тканей жировые пятна. Косметические средства для ухода за кожей и волосами на основе липаз
способствуют очищению кожи от жировых отложений в мягких
условиях. Необходимость обезжиривания шкур и бумажной
пульпы обуславливает применение липаз в кожевенной и бумажной промышленности. Утилизация маслосодержащих отходов производства при помощи липаз (таблица 4.1.) является гораздо более эффективным и экологически чистым процессом по
сравнению с традиционно используемым кислотным гидролизом
- в 2001 году компания Novozyme за технологию обезжиривания
хлопкового волокна получила премию Presidential Green Chemis90
try Challenge Award от Environmental Protection Agency США (в
21-м веке в США ежегодно вручается одна такая премия за
внедрение технологий, максимально снижающих антропогенную
нагрузку на окружающую среду).
При переходе к средам на основе органических растворителей с низким содержанием воды гидролитические реакции липаз
обращаются в синтетические (таблица 4.2).
Таблица 4.2. Реакции липаз в средах с низким содержанием воды.
Этерификация
R1COOH + R2OH = R1COOR2 + H2O
Трансэтерификация – алкоголиз
R1COOR2 + R3OH = R1COOR3 + R2OH
Трансэтерификация – ацидолиз
R1COOR2 + R3COOH = R3COOR2 + R1COOH
Интерэтерификация
R1COOR2 + R3COOR4 = R1COOR4 + R3COOR2
Аминолиз
R1COOR2 + R3NH2  R1CONHR3 + R2OH
Этерификация приводит к образованию сложных эфиров
карбоновых кислот. Многие сложные эфиры достаточно простой
структуры в низких концентрациях обладают характерным запахом (например, изоамилацетат – грушевый запах, метилантранилат – апельсиновый запах, этилвалерат – запах зеленых яблок и т.д.) и применяются как ароматизаторы в пищевой промышленности, косметики, производстве освежающих и ароматизирующих средств. Глицериды феруловой кислоты эффективно
поглощают ультрафиолетовые лучи и являются основой кремов
от загара. В производстве косметических средств широко используются неионные ПАВ на основе сахаров и полиолов (такие,
как фруктозобутират или сорбитолмоностеарат), не раздражающие кожу ввиду отсутствия диссоциирующих групп. В тех же
91
косметических кремах сложные эфиры «длинных» жирных кислот и спиртов (миристилмиристат, децикокоат и т.п.) с успехом
заменили вазелиновые масла – продукты нефтепереработки.
Внедрение этой технологии компанией Eastmen Chemical Co.
было отмечено присуждением Presidential Green Chemistry Challenge Award за 2009 год.
Наиболее крупномасштабная выработка продукта в результате алкоголиза производится в процессе получении биодизельного топлива (таблица 4.1). Метанолиз природных растительных масел дает в результате метиловые эфиры жирных
кислот, которые по своему составу являются аналогами традиционного дизельного топлива. Особое внимание этому процессу
уделяет Европейский Союз, поскольку растительные масла –
продукт возобновляемый, и расширение использования биодизельного топлива позволяет снижать потребности в нефтепродуктах и самой сырой нефти.
Маргарин – продукт гидрирования непредельных жирных
кислот в растительных маслах, что обеспечивает повышение
температуры плавления триглицеридов. Однако в ходе гидрирования в жирных кислотах появляются двойные связи, находящиеся в транс-конфигурации (в природных маслах все двойные
связи присутствуют в цис-конфигурации). В свою очередь, присутствие в продуктах питания транс-изомеров жирных кислот
резко повышает риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний. Ацидолиз подсолнечного масла смесью стеариновой
и пальмитиновой кислот позволяет получать свободный от
транс-изомеров маргарин (Presidential Green Chemistry Challenge Award за 2005 год, компании ADM и Novozyme).
Интерэтерификацией пальмового масла тристеарином
(SSS) с помощью sn-1,3-специфичных липаз получают искусственное масло какао. Основной компонент триглицеридов какао имеет состав SOS, а в пальмовом масле преобладает триглицерид РОР (О – остаток олеиновой кислоты, S – остаток стеариновой кислоты, Р – остаток пальмитиновой кислоты). Конечный продукт, таким образом, содержит определенное количество триглицерида SOS. Аминолиз используется для получения
N-ацилированных аминокислот -ПАВ для косметической промышленности.
92
Отдельно следует выделить способность липаз к кинетическому разделению хиральных веществ, что в настоящее
время широко применяется при производстве лекарственных
препаратов (таблица 4.1). Химический синтез обычно приводит к
рацемической смеси стереоизомеров продукта реакции. Физические свойства энантиомеров одинаковы, однако биологическая активность часто сильно различается (например, ибупрофен, нестероидный противовоспалительный препарат, активен
только в виде S-(+)-изомера). Этот факт требует выделения активного начала в чистом виде и разделение энантиомеров традиционно поводится жидкостной хроматографией на хиральных
сорбентах или хиральной модификацией подвижной фазы, что
является весьма дорогостоящей процедурой. Смысл кинетического разделения стереоизомеров заключается в том, что в параллельных реакциях отношение концентраций конечных продуктов определяется отношением соответствующих констант
скоростей реакций (см. Приложение 3). При гидролизе сложных
эфиров или этерификации рацемической смеси энантиомеров
фермент предпочтительно взаимодействует с одним из изомеров. В результате один из компонентов рацемической смеси
накапливается в основном в виде эфира, а второй – в виде кислоты или спирта. Это позволяет использовать для хроматографического разделения продуктов реакции достаточно простые
сорбенты. На основе подбора липазы требуемой специфичности
разработаны и применяются технологии кинетического разделения рацематов оптических изомеров для получения индивидуальных веществ с чистотой 98-98%.
4.2. Ферменты в анализе
Специфичность взаимодействия фермента, субстрата и эффектора (даже в составе сложных, в том числе биологических
смесей) является основой аналитических применений ферментов в различных областях деятельности человека. Нам известно, как скорость реакции зависит от концентраций реагирующих
веществ (см. раздел 3). Таким образом, при помощи построенных заранее калибровочных зависимостей возможно определение концентраций тех или иных компонентов системы.
93
Так, зафиксировав концентрацию субстрата в реакционной
среде и условия проведения эксперимента, такие, как рН и температура, можно определять активность (концентрацию)
фермента. В первую очередь такой анализ крайне важен с диагностической точки зрения. Отклонение активности фермента в
крови от нормальных значений является биохимическим указателем на потенциально протекающие в организме патологические процессы (более подробно см. раздел 5). Однако определение активности биокатализатора является также абсолютно
необходимым моментом при проведении любых промышленных
биотехнологических процессов. В фармацевтической промышленности удельная активность фермента является основной
характеристикой лекарственных ферментных препаратов.
При фиксировании условий проведения эксперимента и исходной концентрации фермента можно определять концентрацию субстрата в пробах. Например, концентрации важнейших
метаболитов в биологических жидкостях проводят именно таким
образом. В качестве примеров можно привести определение
содержания глюкозы (глюкозооксидаза), пирувата (аланинаминотранфераза), лактата (лактатоксидаза), мочевины (уреаза) в
крови и моче пациентов. Для неинвазивного анализа концентраций метаболитов предлагается их анализ в поте или конденсате
выдыхаемой жидкости.
Способ определения бактериальных загрязнений основан на
биолюминесцентной реакции окисления люциферина – субстрата фермента люциферазы – в присутствии АТФ. В ходе ферментативной реакции молекула продукта окисления переходит в
возбужденную форму и возвращается в основное состояние с
испусканием кванта света. Для трансформации одной молекулы
субстрата требуется одна молекула АТФ, таким образом, интенсивность люминесценции пробы прямо пропорциональна концентрации АТФ. Сами по себе эти пробы могут представлять
собой образцы воды из водоемов, жидкие продукты питания
(молоко), смывы с поверхностей оборудования пищевой промышленности или медицинских учреждений и т.п. Их обрабатывают для достижения полного лизиса бактериальных клеток,
добавляют фиксированные количества люциферазы и люциферина и определяют концентрацию АТФ. Количество живых бак94
терий (колониеобразующих единиц, КОЕ) рассчитывают по заранее построенной зависимости числа КОЕ от концентрации
АТФ.
Если зафиксировать условия проведения эксперимента и исходные концентрации фермента и субстрата, то в пробах можно
определять концентрации обратимых ингибиторов (см. раздел 3.2). К основным значимым для анализа обратимым ингибиторам ферментов следует отнести ионы тяжелых металлов
(экология, контроль качества продуктов питания), а также антибиотики. Широкое распространение антибиотиков в животноводстве и птицеводстве обуславливает риск их накопления в человеке в ходе потребления пищи. Существуют предельно допустимые нормы содержания антибиотиков в различных продуктах
и контроль их концентрации зачастую ведется при помощи ферментов.
Определение остаточной активности фермента при его инкубации с необратимым инактиватором (см. раздел 3.3) довольно широко применяется в экологии и контроле качества продуктов питания при анализе содержания таких групп веществ, как
инсектициды, фунгициды и пестициды. Как и антибиотики, эти
вещества способны накапливаться в организме человека, поступая туда по пищевой цепочке, зачастую обладая при этом
кумулятивным эффектом. В этой связи контроль их содержания
в продуктах питания являются весьма важной задачей, обеспечивающей вопросы общей безопасности человеческой жизни.
Ферментные «метки» используются также для качественного и количественного выявления биоспецифических взаимодействий при проведении гетерогенного иммуно- и ДНК-анализа.
Классическим примером иммуноферментной аналитической методики является так называемый сэндвич-метод. Антитела фиксируются на некоторой поверхности (обычно в лунках полистирольного планшета). После связывания антигена из пробы и последующей промывки в лунку добавляют антитела к другому
эпитопу того же антигена, химически связанные (конъюгированные) с ферментом. Активность фермента в такой системе прямо
пропорциональна количеству образовавшихся тройных комплексов, откуда и рассчитывают концентрацию антигена в исходной
пробе. Чрезвычайно низкие пределы регистрации ферментов в
95
растворе (известны усилительные каскадные системы, позволяющие регистрировать наличие всего лишь нескольких сотен
молекул ферментов в 1 мл раствора) позволяют понижать предел обнаружения антигена, то есть достоверно определять минимальные концентрации вещества.
В одном из вариантов определения ДНК в пробах используются два синтетических олигонуклеотида. Один (исходный) комплементарен определяемому участку ДНК и фиксирован в лунке
планшета в известном количестве. Второй также комплементарен первому, но содержит на своем конце конъюгированный
фермент. После образования в лунке дуплексов с ДНК пробы и
последующей отмывки в лунку добавляют избыток меченого
ферментом олигонуклеотида. Определение активности фермента в данной системе показывает количество оставшихся свободными исходных олигонуклеотидов, количество ДНК в пробе
рассчитывают по разности.
4.3. Методы иммобилизации ферментов
Иммобилизация фермента – это переведение биокатализатора в гетерогенную фазу по отношению к раствору субстрата. В
промышленности иммобилизация позволяет пространственно
разделить фермент и реагенты, что обуславливает возможность
легкого отделения катализатора от реакционной смеси. Таким
образом, продукт не содержит примесей фермента, а сам иммобилизованный препарат может быть многократно использован в
циклах биотехнологического процесса. В аналитических процедурах с использованием ферментов широко используются биосенсоры – приборы, где фермент «закреплен» на поверхности
преобразователя (оптического, электрохимического и т.п.),
трансформирующего изменение концентраций веществ в ходе
ферментативной реакции в электрический сигнал, отображаемый электроникой. Таким образом, методы получения иммобилизованных ферментов является важной частью промышленного применения ферментов.
Можно выделить три базовых способа получения препарата
иммобилизованного фермента: физическое включение, адсорбция и ковалентная иммобилизация, которые различаются по
96
энергии взаимодействия между молекулой белка и носителем
(рис. 4.1).
А
Б
В
Г
Р и с . 4 . 1 . Методы иммобилизации ферментов: (А) – включение в
контейнер; (Б) – включение в гель; (В) – сорбция в объеме и/или
на поверхности носителя; (Г) – ковалентное связывание в объеме
и/или на поверхности носителя.
Физическое включение в контейнеры (рис. 4.1, а), или гели
(рис. 4.1, б), не подразумевает какого-либо взаимодействия компонентов системы. Фермент удерживается носителем за счет
97
стерических факторов – непроницаемой для белка оболочкой
контейнера или порами матрицы геля, препятствующих ввиду
своих малых размеров выходу крупных молекул белка в раствор. Иммобилизация адсорбцией (рис. 4.1, в) основана на
слабых (электростатических, гидрофобных и т.п.) взаимодействиях ферментов и носителя. И, наконец, получение препаратов образованием химической связи между матрицей и белком,
называют ковалентной иммобилизацией (рис. 4.1, г). Рассмотрим более подробно указанные выше способы.
4.3.1. Физическое включение.
Включение в контейнеры. В зависимости от технологии
получения, контейнеры с полупроницаемой оболочкой могут
иметь различные размеры. Так, при микрокапсулировании их
размер колеблется от десятков до сотен микрометров. Суть этого метода заключается в создании эмульсии водного раствора
фермента в несмешивающемся с водой органическом растворителе – размеры получаемых контейнеров определяются размерами водных капель. Полимерная оболочка образуется, например, в результате межфазной поликонденсации диамина,
вводимого в водную фазу, и дихлорангидрида, вводимого в органическую фазу (чаще всего используют пару гексаметилендиамин-себацилхлорид). Небольшая часть белка участвует своими
свободными аминогруппами, поперечно сшивая линейные нити
образующегося найлонового полимера и упрочняя тем самым
мембрану. При диаметре пор оболочки менее 10 нм толщина
стенок таких микрокапсул составляет не более 100 нм, что обуславливает их не очень высокую механическую прочность. Более толстые стенки микрокапсул (сотни нанометров) могут быть
получены методом межфазной коацервации, когда водный
раствор фермента эмульгируют в органическом растворе уже
готового нерастворимого в воде полимера. Полупроницаемая
оболочка в данном случае образуется за счет осаждения органорастворимого полимера на границе раздела фаз вода/органический растворитель - наиболее часто для этого используют различные производные целлюлозы (этилцеллюлоза,
нитроцеллюлоза и т.п.). Наиболее толстые оболочки (до микрометра) получают методом двойного эмульгирования. Здесь
98
вначале готовят водную эмульсию раствора фермента в органическом растворе полимера, как и в предыдущем случае. Готовую эмульсию вновь диспергируют в воде. В результате получают водную эмульсию из капель органического раствора полимера, содержащих внутри себя капли исходного водного раствора фермента. Через определенное время органический слой
затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с
включенным в них белком. Данный метод позволяет широко варьировать свойства мембраны микрокапсул, используя различные пленкообразующие полимеры (полифенилсиоксаны, полистирол, поливинилхлорид, поликарбонаты и т.п.).
Липосомы представляют собой сферические контейнеры
размерами 50-1000 нм, внутренний объем которых изолирован
от внешнего раствора одним или несколькими липидными
бислoями. Молекулы липидов в бислое ориентированы таким
образом, что их полярные «головы» обращены наружу (в сторону водной фазы), а гидрофобные цепочки жирных кислот обращены внутрь и ориентированы практически параллельно друг
другу. Размеры и физико-химические свойства липосом определяются методом их получения и природой используемых липидов. Например, при диспергировании раствора липида в органическом растворителе в водном растворе фермента и отгонке
растворителя в токе инертного газа происходит самопроизвольное образование бислойных фермент-содержащих липосом
размерами до 200 нм. В другом варианте раствор фермента
вносят в колбу, на стенках которой имеется тонкая пленка липида (саму пленку получают упариванием раствор липида в органическом растворителе), встряхивают и выдерживают в течение
некоторого времени. В данном случае происходит самосборка
крупных мультиламеллярных липосом. Для приготовления липосом наиболее часто используются фосфолипиды (фосфатидилхолин, кардиолипин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин), холестерин, смеси липидов.
В тройных системах вода/синтетическое поверхностноактивное вещество (ПАВ)/несмешивающийся с водой органический растворитель в зависимости от соотношения компонентов
могут реализовываться различные способы упаковки молекул
ПАВ. Одним из вариантов упаковки (при малом содержании воды) являются обращенные мицеллы – наноразмерная (1-100
99
нм) эмульсия воды в масле. Молекулы ПАВ в данном случае
образуют оболочку водной среды, располагаясь гидрофильными
группами в водную фазу, а гидрофобными – в органический растворитель. Образование такой надмолекулярной структуры происходит спонтанно и быстро (от секунд до нескольких минут при
простом встряхивании смеси), при этом если белок растворен в
водной фазе, то он автоматически включается во внутреннюю
полость мицеллы. Получаемые агрегаты имеют высокую степень структурированности (минимальные различия в диаметре,
молекулярном весе агрегатов или в плотности упаковки) и являются термодинамически стабильными (не меняют свои геометрические характеристики в течение довольно долгого времени).
Размер обращенных мицелл легко контролируется исходным
составом реакционной смеси – достаточно менять соотношение
концентраций ПАВ и воды в органическом растворителе. Увеличение концентрации ПАВ в системе приводит к уменьшению
размеров мицелл, увеличение концентрации воды влечет за собой увеличение размеров внутренней полости мицеллы. В качестве органических растворителей в подобных системах можно
использовать углеводороды (например, октан или бензол), высшие спирты, хлороформ и т.д. В качестве ПАВ применяют различные производные типа Brij, Tween или Triton или натуральные фосфолипиды (индивидуально или в смесях).
Избежать использования органических растворителей при
формировании контейнеров позволяет техника формирования
полиэлектролитных капсул при помощи послойной адсорбции
полиэлектролитов (в англоязычной литературе «layer-bylayer»). В основе метода лежит электростатическое взаимодействие заряженной подложки с противоположно заряженными
цепями полимера, которое достигается погружением подложки в
раствор полиэлектролита. Первая стадия адсорбции приводит к
образованию монослоя полимера и перезарядке поверхности.
После промывания и удаления избытка первого полиэлектролита подложку погружают в раствор противоположно заряженного
полиэлектролита, что приводит к формированию второго полиэлектролитного слоя и новой перезарядке поверхности. Чередующаяся многократная адсорбция обеспечивает образование
стабильных полиэлектролитных мультислоев с различными
свойствами, которые определяются порядком нанесения слоев и
100
их числом, а также природой используемых синтетических и
природных полимеров. Формирование подобных конструкций на
сферических микро- и наночастицах с последующим растворением твердого ядра приводит к образованию полых капсул,
толщина полиэлектролитной оболочки которых (от 1 до 100 нм)
зависит от числа нанесенных полимерных слоев. Ферменты
вводят в систему на стадии образования ядра - особую популярность в последнее время приобрел ватерит, полиморфная
модификация карбоната кальция. Сферические микрочастицы
ватерита образуются при простом смешении солей хлорида
кальция и карбоната натрия и эффективно включают в себя
имеющиеся в растворе белки. После образования полиэлектролитной оболочки ватеритное ядро легко растворяется в результате подкисления раствора ниже рН 7.0 или добавления этилендиаминтетрауксусной кислоты. В качестве полиэлектролитов
наиболее часто используют синтетические полистиролсульфонат и полиаллиамин, а также природные декстрансульфат и хитозан.
Включение в гели. Принцип данного подхода состоит в том,
что молекулы фермента включаются в матрицу из полимерных
цепей (гель). Размеры пор геля меньше размеров молекулы
белка, ввиду чего он не может покинуть носитель. Для получения подобных препаратов иммобилизованных ферментов используют два основных метода – образование полимерной сетки из мономеров и гелеобразование готовых полимеров.
При радикальной полимеризации фермент помещают в
водный раствор мономера, содержащего двойную связь, и проводят полимеризацию. Чаще всего в качестве мономера применяют акриламид и его различные производные (акриловая кислота, метакриловая кислота, метилметакрилат и т.п.) – в этом
случае получаемые в результате полимеризации гели содержат
до 90% воды, то есть практически не влияют на микроокружение
молекулы иммобилизованного фермента. Можно отметить также
и другие мономеры, используемые для этой цели, например,
винилкапролактам, 2-этил-N-винилимидазол и т.д. При этом для
успешного формирования трехмерной сетки необходимо наличие в реакционной смеси некоторого количества бифункционального (содержащего в молекуле две двойные связи) агента,
который обеспечивает сшивание полимерных цепей между со101
бой. В то же время золь-гель технология - поликонденсация
монокремниевой кислоты Si(OH)4 в поликремниевую - не требует наличия сшивающего агента. Золь кремниевой кислоты, полученный гидролизом кремнийорганического соединения (чаще
всего тетраметоксисилана), в течение нескольких часов самопроизвольно формирует гель, представляющий собой трехмерную сетку из атомов кремния, соединенных кислородными мостиками (силикагель). В настоящее время изучаются также возможности использования по аналогичной технологии гелей на
основе циркония.
Гидрофильные полимерные сетки могут быть получены и при
использовании уже готовых полимеров. Так, ряд природных
(например, агар-агар и желатин) и синтетических (поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль) полимеров обладают свойством
гелеобразования при охлаждении их горячих водных растворов. Раствор фермента вводят при температуре начала гелеобразования, в результате при дальнейшем охлаждении образуется гель, содержащий фермент. Техника ионного сшивания
применяется при иммобилизации ферментов в альгинатные гели. Полимерные цепи альгината (природный линейный полисахарид из бурых водорослей, состоит из соединенных -1,4гликозидными связями остатков -D-маннуроната и -Lгулуроната) взаимодействуют между собой за счет мостиковых
электростатических взаимодействий с двухвалентными катионами – на практике чаще всего используют ионы кальция. Ковалентное сшивание полимерных цепей в гелеобразную сетку
можно проиллюстрировать иммобилизацией ферментов в фотополимеризующиеся смолы - растворимые полимеры, содержащие функциональные светочувствительные группы. Раствор
такого полимера и фермента облучают светом (обычно в ультрафиолетовом диапазоне), активированные фоточувствительные группы образуют между собой ковалентные связи, что и
приводит к образованию трехмерной полимерной сетки.
Следует отметить, что при любом варианте включения ферментов в гели конечным продуктом является гелевый блок. Для
применения в технологическом процессе этот продукт необходимо тем или иным способом механически измельчить. Однако
проведение процедуры иммобилизации в описанных выше
эмульсиях воды в органическом растворителе или системе об102
ращенных мицелл позволяет получать препарат иммобилизованного фермента в виде сферических частиц, размер которых
определяется размером водных капель в исходной системе.
4.3.2. Адсорбция.
Иммобилизация адсорбцией является наиболее простым
способом получения иммобилизованных препаратов ферментов
с методической точки зрения. Суспензия носителя в водном растворе биокатализатора перемешивается в течение времени,
требующегося для установления равновесия между свободным
и адсорбированным ферментом. Далее следует стадия отмывки
от несвязавшегося белка и препарат готов к использованию.
Сорбция фермента на носителе обеспечивается слабыми
взаимодействиями - в большинстве случаев используются электростатические взаимодействия и водородные связи между
носителем и заряженными поверхностными группами белка.
Спектр носителей в этом случае весьма широк. Из неорганических носителей можно отметить оксиды металлов (алюминия,
титана, железа и т.д.), нерастворимые в воде соли (например,
фосфат и карбонат кальция), силикагель, пористое стекло, керамику. Для удешевления конечной стоимости иммобилизованного препарата в качестве носителей применяют природные минералы, такие, как кремнезем, диатомит, кизельгур, гидроксилапатит, алюмосиликаты (глины). Среди органических носителей
наибольшее распространение имеют различные полисахариды
и ионообменные смолы.
В ряде случаев более целесообразно использовать гидрофобные взаимодействия носителя и белка. Так, естественные
субстраты липаз – жиры и масла – практически нерастворимы в
воде и присутствуют в природе в виде эмульсий. В этой связи
белковые глобулы липаз имеют весьма обширные гидрофобные
области, позволяющие ферменту сорбироваться на каплях органической эмульсии и эффективно гидролизовать субстрат.
Гидрофобизация поверхности пористого стекла показала прямую пропорциональность между количеством адсорбированного
фермента и контактным углом воды на этой поверхности. А
сорбция липаз на полистирол является практически необратимой.
103
Наконец, можно отметить и использование координационных взаимодействий для получения препаратов иммобилизованных ферментов. Как отмечалось выше, в рекомбинантные
белки зачастую вводят His-tag для упрощения их очистки с помощью металло-хелатной хроматографии (см. раздел 2.2).
Именно сорбенты для металло-хелатной хроматографии предлагаются в качестве носителей для иммобилизации рекомбинантных биокатализаторов.
Основным недостатком адсорбционной иммобилизации
ферментов является то, что адсорбция – это равновесный процесс. В растворе всегда устанавливается равновесие между адсорбированным и растворенным ферментом, которое определяется равновесной константой десорбции. Иными словами говоря, при каждом цикле использования препарата иммобилизованного адсорбцией фермента какая-то часть белка будет выходить в реакционный раствор, что приводит как к загрязнению
конечного продукта, так и уменьшению активности самого препарата. Однако данные недостатки не всегда перевешивают достоинства данного метода – простота методик получения иммобилизованного фермента и дешевизна сорбентов, выступающих
в роли носителей.
4.3.3. Ковалентная иммобилизация.
Методы ковалентной иммобилизации ферментов в каждом
конкретном случае определяются химической природой реакционно-способных группировок носителя и белка. Боковые радикалы многих протеиногенных аминокислот содержат функциональные группы, которые дают возможность образования ковалентной связи с теми или иными химическими агентами. В их
числе тиольные (цистеин), карбоксильные (глутаминовая и аспарагиновая кислоты, С-концевая), гидроксильные (серин, треонин и тирозин), гуанидиновые (аргинин), имидазольные (гистидин) и аминогруппы (лизин, N-концевая). Носитель же предварительно модифицируют таким образом, чтобы условия реакции
иммобилизации были по возможности мягкими и не вызывали
сильной денатурации белка.
Исходно активированные носители по типу взаимодействия с
белками можно условно разделить на специфические (реаги104
рующие только с конкретными функциональными группами белка) и неспецифические (образующие ковалентную связь с широким набором белковых группировок). К наиболее неспецифическим носителям относятся полимеры, модифицированные
арилазидными остатками. При фотохимическом распаде таких
соединений под действием УФ-света выделяется молекула азота и образуются нитреновые радикалы, реагирующие практически с любой химической связью.
Проблемой использования таких носителей является необходимость достаточно плотного контакта белка и полимера, то
есть проведение фотохимической реакции в высушенном состоянии реакционной смеси – в противном случае образующиеся
радикалы буду предпочтительно взаимодействовать с молекулами растворителя. Кроме того, жесткое облучение ферментов
вызывает их необратимую инактивацию.
Носители, содержащие концевые алифатические эпоксидные
группировки, эффективно связываются с тио-, амино- и гидроксильными группами белков.
В зависимости от рН среды подобное алкилирование можно
направить преимущественно на амино- или на оксигруппы. По
аналогичному механизму с белками взаимодействуют носители,
модифицированные концевыми имино- или тиооксидными группировками.
105
К неспецифическим методам иммобилизации ферментов
следует отнести и активацию носителей хлористым циануром
(2,4,6-трихлор-1,3,5-триазин). Замещение атомов хлора в этом
соединении происходит в присутствии соединений с HО-, HSили H2N-группами.
Удобным является то, что первый атом хлора эффективно
реагирует при температурах 0-10оС, а второй – при 20-50оС
(третий атом, реагирующий при 80-100оС, при иммобилизации
ферментов не используется). Такое различие в реакционной
способности атомов хлора позволяет разделять стадии модификации носителя и связывания белка.
Специфические методы иммобилизации используют химические реакции, нацеленные на конкретные функциональные
группировки, например, на аминогруппы остатков лизина. Так,
наиболее простым способом фиксирования белка на носителе
является образование азометиновых связей (оснований Шиффа) в реакции конденсации амино- и альдегидсодержащих соединений.
106
В щелочных средах (pH > 8) эта реакция протекает количественно и достаточно быстро, однако в кислых условиях (рН < 6)
основания Шиффа гидролизуются до исходных веществ. В этой
связи на практике используется последующее восстановление
азометиновой связи до устойчивого вторичного амина (чаще
всего для этой цели применяют боргидрид натрия).
Весьма простым способом получения альдегидсодержащих
носителей является перйодатное окисление природных полисахаридов (целлюлоза и ее производные, декстраны и т.п., для
примера на схеме приведено окисление -D-глюкозы).
Подобному же окислению может быть подвергнут углеводный
фрагмент гликопротеина (многие ферменты гликозилированы),
после чего по аналогичной схеме белок фиксируется на матрице, содержащей аминогруппы.
Для введения альдегидных групп в аминосодержащие носители применяют диальдегиды (обычно глутаровый альдегид
СНО-(СН2)3-СНО). Реакция диальдегида с матрицей переводит
аминогруппы носителя в альдегидные, на второй стадии к активированному носителю добавляют белок. Таким образом,
диальдегид представляет собой мостик между аминогруппами
матрицы и белка.
107
Однако тот же самый глутаровый альдегид способен также
сшивать аминогруппы между молекулами белка. Этот принцип
положен в основу получения так называемых иммобилизованных препаратов ферментов без носителя – поперечносшитых агрегатов ферментов (cross-linked enzyme aggregates,
CLEAs). Высоленные высокой ионной силой или добавлением
органического растворителя белки обрабатывают глутаровым
альдегидом с получением нерастворимых иммобилизованных
ферментных препаратов в отсутствие матрицы.
Активация бромцианом различных полиолов (как синтетических полимеров, так и природных полисахаридов в первую очередь) широко применяется на практике. При взаимодействии
бромциана с гидроксильными группами носителя через исходные цианаты образуются имидокарбонатные группы (побочная
реакция гидролиза дает неактивный карбамат). Реакция цианатов и имидокарбонатов с -аминогруппами лизина белка фиксирует фермент на матрице как производное изомочевины или Nзамещенного карбамата.
Хлорангидриды карбоновых кислот эффективно ацилируют
аминогруппы белков при рН > 7, однако весьма быстро гидролизуются в этих условиях. Тем не менее, они применяются для
исходной модификации белка, то есть для введения на поверх108
ность глобулы тех или иных заместителей. В частности, модификация фермента акрилоилхлоридом позволяет получать препарат белка, содержащий в своей структуре двойные связи. При
радикальной полимеризации такие белки не просто включаются
в образующийся гель, а ковалентно включаются в него, выступая при этом в качестве дополнительного бифунционального
сшивающего агента.
Классический способ пептидного синтеза (образования пептидной связи) заключается в активации карбоксильных групп
карбодиимидами. На первой стадии образуется производное Оацилизомочевины:
На второй стадии происходит взаимодействие с аминокомпонентой:
Другой вариант активации карбоксильных групп для пептидного синтеза с использованием изоксазолиевых солей был
предложен Р.Вудвордом (широко известен реактив Вудворда N-этил-5-фенилизоксазолий-3’-сульфонат). Реактив Вудворда
вступает в реакцию с карбоксильной группой по следующей
схеме:
109
Полученный сложный енольный эфир эффективно реагирует
с аминокомпонентой, образуя пептидную (амидную) связь:
Как видно из приведенных выше схем, как карбодиимиды, так
и изоксазилиевые соли выступают в качестве конденсирующих
агентов между карбоксильными и аминогруппами. Таким образом, активация карбоксильных групп ферментов этими соединениями приводит к образованию белковых внутри- и межмолекулярных связей. В этой связи такие методы применяются для
предварительной активации носителей с поверхностными карбоксильными группами с последующей иммобилизации белков.
Наконец, сульфгидрильные (тиольные) группы остатков
цистеина в присутствии тиол-содержащих носителей спонтанно
окисляются растворенным в воде кислородом, образуя дисульфидные связи.
Конечно, свободные сульфгидрильные группы в белках
встречаются достаточно редко – в основном остатки цистеина
задействованы в поддержании третичной структуры через обра110
зующиеся дисульфидные мостики. Однако перед иммобилизацией фермента есть возможность восстановить его дисульфидные связи подходящим восстановителем (меркаптоэтанол,
дитиотрейтол и т.п.). При этом, правда, реокисление тиольных
групп по окончании иммобилизации может приводить к образованию «неправильных» дисульфидных мостиков в белке, что
сопровождается потерей каталитической активности иммобилизованного фермента. С другой стороны, на поверхность белка
можно предварительно ввести дополнительные SH-группы ацилированием его аминогрупп реагентами, содержащими защищенную сульфгидрильную группу (например, тиолактоном гомоцистеина).
4.4. Особенности кинетического поведения
иммобилизованных ферментов
В гетерогенно-каталитических системах массообмен между
раствором субстрата и иммобилизованным биокатализатором
играет важную роль. Массоперенос в любой среде совершается за счет двух различных процессов – конвекции (перемешивания) и молекулярной диффузии (направленный перенос
вещества под действием градиента его концентрации).
Теория диффузии веществ в водных растворах базируется на гипотезе о том, что скорость переноса диффундирующего
вещества через сечение единичной площади J прямо пропорционально градиенту концентрации вещества [C] в направлении,
нормальном к плоскости сечения. Математически она описывается уравнениями, которые были предложены А.Фиком12 на основе анализа экспериментальных данных - соответствующие
уравнения получили название законов Фика. Первый закон Фика
описывает молекулярную диффузию вещества в отсутствие
взаимодействий диффундирующих частиц между собой или со
средой:

J  D  grad[C]
(4.1).
A.Fick. Ueber diffusion. – Annalen der Physik, 1855, Bd.94, p. 5986.
111
12
Для одномерной диффузии это уравнение можно записать в
упрощенном виде:

J  D
[C]
x
(4.2).
Второй закон Фика получают при рассмотрении баланса
диффузионных потоков в бесконечно малом объеме при нестационарном режиме процесса. Он описывает изменение концентрации диффундирующего вещества во времени в данной точке
пространства:
[C]
 div (D  grad[C ])
t
(4.3),
или, в упрощенном виде (при одномерной диффузии)
2
[C] 
[C]
 [C ]

(D
)D
2
t
x
x
x
(4.4).
Таким образом, под коэффициентом диффузии D понимают
коэффициент пропорциональности между потоком вещества и
градиентом концентрации этого вещества. Размерность коэффициента диффузии – длина2/время. При использовании системы СИ коэффициенты диффузии измеряются в м2/с, хотя в литературе довольно часто используется размерность см2/с.
Внешнедиффузионные эффекты в ферментативной кинетике. Рассмотрим гетерогенную систему, в которой субстрат
ферментативной реакции находится в растворе, а сам биокатализатор закреплен на поверхности некоторой частицы. В этих
условиях фундаментальную роль играют свойства жидкости на
поверхности раздела фаз. Качественные представления о закономерностях гетерогенных реакций были сформулированы
В.Нернстом. Согласно им вблизи поверхности твердого тела
существует неперемешиваемый слой, внутри которого жидкость
считается неподвижной и перенос вещества к поверхности
твердого тела осуществляется только за счет молекулярной
112
диффузии. Перемешивание раствора (конвекция) приводит к
тому, что концентрация вещества за пределами неперемешиваемого слоя постоянна. Протекание реакции на поверхности
твердой частицы будет приводить к тому, что концентрация вещества вблизи поверхности станет меньше, чем в исходном
объеме раствора. Схематично профиль изменения концентрации вещества в рамках модели Нернста представлен на рис.4.2.
Р ис . 4 . 2. Профиль изменения концентрации вещества в рамках
модели Нернста для планарной диффузии. [S]o – концентрация
вещества в растворе, [S]l – концентрация вещества на поверхности
мембраны, l – толщина неперемешиваемого слоя жидкости.
Какие осложнения при работе с иммобилизованными ферментами могут возникать в данном случае? Для стационарной
диффузии через плоский слой единичной площади при постоянном коэффициенте диффузии решение уравнения (4.2) приводит к простейшему выражению для потока диффундирующего
вещества:
J   DS
[S]o  [S]l
l
(4.5).
113
Здесь l – толщина неперемешиваемого слоя, [S]o и [S]l – концентрации субстрата в объеме раствора и на поверхности твердой
частицы, Ds – коэффициент диффузии субстрата.
Ферментативная реакция на поверхности описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, где концентрация субстрата равна
[S]l:
v
V max [S]l
K m  [S]l
(4.6).
В стационарном состоянии скорость диффузии субстрата и
наблюдаемая скорость ферментативной реакции равны между
собой (J = -v, поскольку диффузионный процесс направлен на
увеличение концентрации [S]l, а ферментативная реакция – на
ее уменьшение), таким образом
Ds
[S]o  [S]l V max [S]l

l
K m  [S]l
(4.7).
Наиболее простое решение уравнения (4.7) получают в случае
ферментативной кинетики первого порядка, когда [S]l<<Km (небольшая концентрация субстрата в растворе, большая скорость
ферментативной реакции или толщина неперемешиваемого
слоя, малый коэффициент диффузии). При этих условиях
h s ([S]o  [S]l ) 
V max
[S]l
Km
(4.8)
(hs = Ds/l – коэффициент массопереноса субстрата), откуда концентрация субстрата на границе раздела фаз
[S]l 
h s [S]o
V max
hs 
Km
(4.9)
114
а экспериментально наблюдаемая скорость ферментативного
процесса (то есть накопление продукта реакции в растворе)
v
'
V max
[S]l  k ' [S]o
Km
(4.10)
Эффективная константа скорости первого порядка k’ определяется уравнением
V max
1
Km
k'

1
K

V 
 m
 h s  max 
K m  h s V max

hs
(4.11)
Как видно из уравнения (4.11), если hs>>Vmax/Km (то есть массоперенос идет быстрее каталитической реакции), то k’ = Vmax/Km и
реакция протекает в кинетическом режиме (v’ = vкин, определяемой по уравнению (4.6)). Напротив, если hs<<Vmax/Km (химическая реакция идет много быстрее, чем диффузия), то k’ = hs и
наблюдаемая реакция является диффузионно контролируемой
(v’ = vдиф, определяемой по уравнению (4.5)). Точное решение
уравнения (4.7) относительно [S]l и его последующий анализ показывает, что необходимым и достаточным условием работы
фермента в диффузионном режиме является соотношение
θ
V max l
[S]o D s
 1
(4.12)
На практике наличие внешнедиффузионных затруднений может сильно осложнить интерпретацию кинетических данных при
работе с препаратами иммобилизованных ферментов. В кинетическом режиме справедливо уравнение (4.6), реакция будет
описываться обычным уравнением Михаэлиса-Ментен, и в координатах Лайнуивера-Берка мы получаем привычную прямолинейную зависимость скорости реакции от концентрации суб115
страта в растворе (рис.4.3, кривая 1). Если же реакция диффузионно-контролируемая (выполняется соотношение (4.12)), то
зависимость наблюдаемой скорости от концентрации субстрата
будет подчиняться уравнению (4.5). Иными словами, в координатах Лайнуивера-Берка такая зависимость будет представлять
собой прямую, идущую из начала координат (рис.4.3, кривая 2).
1/V
2
1
1/[S]o
Р и с . 4 . 3 . Зависимость скорости реакции иммобилизованного
фермента от концентрации субстрата в координатах ЛайнуивераБерка при работе в кинетической (1) и диффузионной (2) областях.
Практический пример влияния внешнедиффузионных затруднений на наблюдаемую кинетику действия иммобилизованного фермента приведен на рис.4.4. На зависимости скорости
реакции от концентрации субстрата в координатах ЛайнуивераБерка (рис.4.4, А) четко выделяются два участка, соответствующие диффузионному (при низких концентрациях субстрата) и
кинетическому (при высоких концентрациях субстрата) режимам
функционирования иммобилизованного лизоцима. В той же работе продемонстрирован еще один эффект влияния внешней
диффузии на ферментативную реакцию – наблюдаемое изменение рН-профиля действия фермента (рис.4.4., Б). В кинетическом режиме, когда наблюдаемая скорость процесса определяется ферментативной реакцией (уравнение (4.6)), фиксируется
традиционная для функционирования ферментов колоколообразная рН-зависимость (рис.4.4, Б, кривая 1). Однако коэффициент диффузии веществ очень слабо зависит величины рН
116
среды. Поэтому при работе в диффузионном режиме (скорость
процесса зависит именно от величины коэффициента диффузии
субстрата) наблюдаемый рН-профиль «размывается» и практически пропадает (рис.4.4, Б, кривая 2).
V, усл.ед
1
2
7,5
А
8,0
8,5
9,0
pH
Б
Р и с . 4 . 4 . Скорость лизиса клеток Microcoocus luteus иммобилизованным на агарозе лизоцимом. (А) Зависимость скорости реакции
от концентрации субстрата (клеток) в координатах ЛайнуивераБерка. (Б) рН-зависимость лизиса клеток Microcoocus luteus иммобилизованным на агарозе лизоцимом в кинетическом (1) и диффузионном
(2)
режимах.
(Адаптировано
из:
A.P.Levashov,
D.A.Matolygina, E.D.Ovchinnikova, I.Yu.Adamova, D.A.Gasanova,
S.A.Smirnov, V.A.Nelub, N.G.Belogurova, V.I.Tishkov, N.L.Eremeev,
A.V.Levashov. The bacteriolytic activity of native and covalently immobilized lysozyme against Gram-positive and Gram-negative bacteria is
differentially affected by charged amino acids and glycine. – FEBS
Open Bio, 2019, v.9, N 3, p.510-518).
Перевод ферментативной реакции из диффузионного режима в кинетический на практике осуществляют при помощи улучшения гидродинамики системы. Толщина неперемешиваемого
слоя l уменьшается при увеличении интенсивности перемешивания гетерогенной реакционной среды или скорости прокачки
раствора субстрата в колонках (капиллярах). В большинстве
случаев улучшение гидродинамики системы позволяет практически устранить внешнедиффузионные эффекты при работе с
иммобилизованными ферментами.
117
Внутридиффузионные эффекты в ферментативной кинетике. Проанализируем кинетические закономерности протекания ферментативных процессов, осложненных массопереносом субстрата внутри твердой фазы в предположении, что
внешнедиффузионные эффекты отсутствуют. Рассмотрим частицу, находящуюся в растворе субстрата и в которой фермент
распределен по всему ее объему. В этом случае для протекания
реакции необходимо, чтобы субстрат не только достиг поверхности данной частицы, но и продиффундировал внутрь. Процессы диффузии и катализа (в отличие от внешнедиффузионных
затруднений) идут в частице одновременно, поэтому при математическом рассмотрении подобных моделей учитываются скорости обеих реакций:
[S]l  [S]l 
 [S]l 




t
 t  диф  t  кин
(4.13)
где [S]l – концентрация субстрата в данной точке внутри частицы
с иммобилизованным биокатализатором.
Если диффузия описывается законом Фика (то есть коэффициент диффузии субстрата D внутри носителя не зависит от
концентрации диффундирующего вещества и одинаков по всему
объему частицы), то скорость изменения концентрации субстрата за счет диффузии можно записать как
 [S]l 
 D S [S] l


 t  диф
(4.14)
где  – оператор Лапласа. В ряде частных случаев (плоская
мембрана, стержень, сфера) задача становится одномерной и
уравнение (4.14) упрощается:
  2 [S]l n [S]l 
 [S]l 

D


S
  2  x  x 
 t  диф
 x

118
(4.15)
Здесь n принимает значение, равное нулю для мембраны, единицы для стержня и двойки для сферы, а x является координатой по толщине в случае мембраны или по радиусу для стержня
и сферы.
В той же точке частицы протекает ферментативный процесс
трансформации субстрата
V ' [S]l
 [S]l 
  max


K m'  [S]l
 t  кин
(4.16)
Предположим, что V’max и K’m (максимальная скорость реакции и
константа Михаэлиса иммобилизованного фермента) постоянны
по всему объему частицы и не меняются в результате образования продуктов реакции. Тогда при достижении стационарного
режима скорости диффузионного и кинетического процессов
будут равны между собой и в самом простом случае (для плоской мембраны) можно записать
DS
'
[S]l
 2 [S] Vmax

2
'
x
K m  [S]l
(4.17)
Из уравнения (4.17) видно, что осложненные внутренним
массопереносом субстрата ферментативные процессы могут
протекать в нескольких различных режимах. Первый крайний
случай – кинетический режим – реализуется тогда, когда скорость химической реакции крайне мала. Тогда градиент концентрации субстрата (движущая сила массопереноса) незначителен, субстрат успевает «доставляться» во внутренние области
частицы и его концентрация [S]l практически постоянна в объеме
носителя. Наблюдаемая скорость процесса (изменение концентрации продукта в растворе) в данном случае определяется исключительно каталитическими свойствами иммобилизованного
фермента. В диффузионном режиме (когда скорость ферментативной трансформации субстрата очень велика) весь субстрат
будет расходоваться в приповерхностных слоях частицы и биокатализатор, находящийся в глубинных областях носителя,
функционировать не будет. Наблюдаемая скорость реакции за119
висит не от количества фермента внутри частицы, а от диффузионных параметров субстрата.
Чтобы понять, в каком именно режиме работает иммобилизованный фермент, удобно использовать так называемый фактор
эффективности реакции
 = Vнабл/Vo
(4.18)
где Vo – скорость ферментативного процесса в отсутствие внутридиффузионных затруднений (когда концентрация субстрата
во всем объеме частицы постоянна). Понятно, что при  = 1 реакция протекает в кинетическом режиме, а при  << 1 – в диффузионном.
В 1939 году, при решении проблем гетерогенного катализа,
В.Тиле показал13, что фактор эффективности  можно представить как функцию безразмерного модуля 
 = tg()/
(4.19)
Безразмерный модуль , зависящий от коэффициента диффузии, константы скорости и размера частицы катализатора, получил название модуля Тиле (следует отметить, что аналогичные
результаты независимо от работы Тиле были опубликованы в
том же году советским ученым Я.Б.Зельдовичем 14). Для гетерогенных ферментативных процессов модуль Тиле имеет вид
a
'
Vmax
(4.20)
K m' D S
В данном уравнении параметр а отражает геометрические характеристики частицы катализатора – толщину для мембраны
или радиус для сферы. Если модуль Тиле  >> 1, то реакция
13
W.Thiele. Relation between catalytic activity and size of particle. –
Ind.Eng.Chem., 1939, v.31, N 7, p.916-920.
14 Я.Б.Зельдович. К теории реакции на пористом или порошкообразном материале. – Ж.физ.химии, 1939, т.13, № 2, с.163-168.
120
протекает в диффузионном режиме, если же  << 1, то режим
протекания реакции кинетический.
Из уравнения (4.20) ясно видны экспериментальные возможности уменьшения абсолютной величины модуля Тиле, то есть
пути перевода ферментативной реакции из диффузионного режима в кинетический. Это в первую очередь уменьшение локальной концентрации иммобилизованного биокатализатора (то
есть снижение величины V’max). На рис.4.5, например, приведены данные по зависимости наблюдаемой скорости гидролиза пнитрофенилфосфата щелочной фосфатазой, включенной в частицы поли-N-изопропилакриламидного геля, от исходной концентрации фермента в растворе при проведении иммобилизации15. Как видно, в области концентраций 2.58·10-7 М наблюдаемая активность препарата слабо зависит от концентрации щелочной фосфатазы (диффузионный режим реакции). При дальнейшем уменьшении концентрации биокатализатора данная зависимость прямолинейно стремится в начало координат (кинетический режим реакции).
Применение «плохих» субстратов (субстратов с невысокими
k’кат и большими K’m) также способствует переводу ферментативного процесса в кинетический режим. Однако этот момент
имеет исключительно теоретическое значение. Если речь идет о
промышленных биотехнологических процессах, то есть получении конкретного продукта, то кинетические параметры субстрата
изменить невозможно.
Изменение размеров частиц носителя с иммобилизованным
внутри него ферментом является на практике наиболее простейшим приемом определения области функционирования
биокатализатора. Если удельная активность (скорость реакции,
отнесенная к объему катализатора) не зависит от размера используемых частиц, это означает работу в кинетическом режиме. Если же исходно катализатор функционирует в диффузионной области, то уменьшение размера частиц носителя будет
Адаптировано из: Н.Л.Еремеев, Л.В.Сиголаева, П.А.Симаков,
Н.Ф.Казанская. - Температурное поведение равновесных и кинетических констант ферментативных реакций при фазовом переходе в термочувствительной матрице. - Биохимия, 1995, т.60, N
8, с.1307-1317.
121
15
Агеля, мМ/мин*г суспензии геля
приводить к увеличению удельной активности иммобилизованного фермента. Именно с этим и связано интенсивное развитие
исследований по получению наноразмерных носителей для
применения в промышленности.16
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0
2
4
6
8
7
[E]·10 , M
Р и с . 4 . 5 . Зависимость наблюдаемой скорости гидролиза
п-нитрофенилфосфата щелочной фосфатазой, включенной в частицы поли-N-изопропилакриламидного геля, от исходной концентрации фермента в растворе при проведении иммобилизации.
Диффузионный режим работы иммобилизованного фермента
в ряде случаев приводит к наблюдаемому эффекту увеличения
стабильности препарата. Безусловно, многоточечное сорбционное или ковалентное связывание белка с носителем предотвращает его денатурацию, фиксируя трехмерную конформацию
глобулы. Однако длительное сохранение активности наблюдалось и для препаратов, полученных методами физического
16
M.Razzaghi, A.Homaei, F.Vianello, T.Azad, T.Sharma, A.K.Nadda,
R.Stevanato, M.Bilal, H.M.N.Iqbal. Industrial applications of immobilized nano-byocatalysts. – Bioproc.Biosyst.Eng., 2022, v.45, p.237256.
122
включения, когда взаимодействие фермента с носителем отсутствует. Как уже говорилось выше, высокая концентрация иммобилизованного биокатализатора переводит систему в диффузионный режим, где наблюдаемая активность препарата слабо
зависит от концентрации фермента (см. рис.4.5). Таким образом,
иммобилизованный белок может инактивироваться с той же скоростью, что и в растворе, но это не будет сказываться на активности препарата до тех пор, пока система работает в диффузионном режиме. Только тогда, когда концентрация фермента в
препарате уменьшится настолько, что система перейдет в кинетический режим, можно будет наблюдать реальную инактивацию
фермента. Схематически этот феномен продемонстрирован на
рис.4.6.
Р и с . 4 . 6 . Схематическое представление зависимости остаточной
активности нативного (●) и иммобилизованного (о) фермента от
времени.
Даже в отсутствие внешне- и внутридиффузионных затруднений матрица может оказывать влияние на кинетику действия
иммобилизованного фермента. Это связано с тем, что в эксперименте исследователи обычно могут измерять только макрохарактеристики реакции на основе анализа наблюдаемых активностей биокатализатора, задавая экспериментально некоторые
123
исходные концентрации веществ в растворе и, соответственно,
в растворе же измеряя скорости убыли субстрата или накопления продукта ферментативной реакции от времени. Однако
определяемые активности, помимо всего прочего, зависят еще и
от эффектов распределения субстратов, продуктов, заряженных ионов и т.д. между раствором и фазой носителя. Подобные
эффекты после достижение равновесия в системе описываются
коэффициентом распределения P
P = Cl/Co
(4.21)
где Cl и Co – соответственно концентрация какого-либо компонента системы внутри частицы катализатора (локальная) и в
растворе (внешняя). Рассмотрим некоторые примеры влияния
эффектов распределения на кинетику действия иммобилизованных ферментов на примере электростатических взаимодействий между носителем и растворенными веществами.
Если используемая матрица в условиях эксперимента заряжена и обладает некоторым электростатическим потенциалом
, то концентрация протонов внутри нее будет отличаться от
концентрации протонов в растворе согласно уравнению Больцмана:
- eψ
[H]  [ H] e kT

l

o
(4.22)
Здесь [H]l+ и [H]o+ - концентрации водородных ионов в носителе
биокатализатора и в растворе соответственно, е – заряд электрона, k – константа Больцмана, T – абсолютная температура.
Подставляя уравнение (4.22) в уравнение (4.21), получаем:
PH 
[H] l
[H]

o
e
 e kT

(4.23)
и, отсюда
124
pH  pH l  pH o  0,43
e
kT
(4.24)
Таким образом, отрицательно заряженный носитель (полианионная матрица) будет концентрировать протоны и локальная
величина рНl в носителе (при которой работает иммобилизованный фермент) становится более кислой, чем в растворе. Для
достижения рН-оптимума иммобилизованного фермента в таком
носителе необходима более щелочная внешняя реакционная
среда, то есть происходит кажущийся сдвиг рН-оптимума действия препарата в более щелочную область. Для положительно
заряженного носителя (поликатионная матрица) ситуация обратная, локальная величина рНl в носителе становится более
щелочной и есть происходит кажущийся сдвиг рН-оптимума
действия препарата в более кислую область. Экспериментальная иллюстрация данных рассуждений приведена на рис.4.7.
Субстрат иммобилизованного в носителе фермента также
может обладать зарядом. Наличие электростатических взаимодействий между субстратом и носителем должно менять локальную концентрацию субстрата в рабочей зоне фермента. По
аналогии с уравнением (4.22) запишем
- zeψ
[S] l  [S] o e kT
(4.25)
где [S]l и [S]o - локальная и внешняя концентрация субстрата соответственно, z – заряд молекулы. Видно, что в случае одинаковых зарядов матрицы и субстрата концентрация субстрата на
поверхности частицы носителя будет понижена по сравнению с
концентрацией субстрата во внешнем растворе. Наоборот, если
субстрат и носитель заряжены разноименно, то локальная концентрация субстрата в приповерхностном слое матрицы будет
больше, чем в растворе. Скорость ферментативного процесса
внутри частицы, согласно уравнению (4.16), определяется именно локальной концентрацией субстрата, то есть
125
100
80
A, %
1
2
60
3
40
20
0
4
5
6
7
8
9
10
pH
Р и с . 4 . 7 . рН-зависимости гидролиза этилового эфира N-ацетил-Lтирозина нативным химотрипсином (кривая 2) и препаратами
фермента, иммобилизованного в поликатионную (полиорнитил,
кривая 1) и полианионную (сополимер этилена и малеиновой кислоты, кривая 3) матрицы17.
zeΨ
V [S] e kT
V '  max o
zeΨ

K  [S] e kT

m
(4.26)
o
откуда
zeΨ
K ' m  K m e kT
(4.27)
Рассчитано по: L.Goldstein. Environmental effects on enzyme
catalysis/ A kinetic study of polyanionic and polycationic derivatives
of chymotrypsin. - Biochemistry, 1972, v.11, p.4072-4084.
126
17
Таким образом, из уравнения (4.27) видно, что если матрица и
субстрат заряжены одноименно, то наблюдаемая константа Михаэлиса для иммобилизованного препарата фермента будет
больше истинной константы Михаэлиса, характерной для данного фермента при проведении аналогичной реакции в растворе.
Напротив, если заряды матрицы и субстрата противоположны
по знаку, то в эксперименте с иммобилизованным ферментом
будет наблюдаться кажущееся «повышение» сродства фермента к субстрату по сравнению с раствором. Рис.4.8 подтверждает
данные выводы. Действительно, при гидролизе положительно
заряженного N-бензоил-L-аргининамида трипсином, включенным в отрицательно заряженную матрицу (сополимер этилена и
малеиновой кислоты), наблюдаемая скорость реакции намного
выше, нежели для той же реакции в растворе, и величина константы Михаэлиса для иммобилизованного фермента практически на порядок меньше по сравнению с нативным биокатализатором.
1,0
2
V/Vmax
0,8
1
0,6
0,4
0,2
0,0
0
10
20
30
40
[S]o, mM
Р и с . 4 . 8 . Зависимость относительной скорости ферментативной
реакции гидролиза положительно заряженного субстрата - Nбензоил-L-аргининамида - трипсином в растворе (кривая 1) и препаратом фермента, иммобилизованного в полианионной матрице
(сополимер этилена и малеиновой кислоты, кривая 2).18
Рассчитано по: L.Goldstein, Y.Levin, E.Katchalski. A waterinsoluble polyanionic derivative of trypsin. II. Effect of the polyelectrolyte carrier on the kinetic behavior of the bound trypsin. – Biochemistry, 1964, v.3, p.1913-1919.
127
18
Вопросы для самоконтроля.
1. Приведите примеры ферментов, использующихся в пищевой промышленности.
2. Перечислите наиболее крупнотоннажные производства на
основе ферментов.
3. На основе каких аналитических процедур с использованием ферментов производится экологический мониторинг почвы и
воды.
4. В каких областях максимально широко используются аналитические процедуры с использованием ферментов.
5. Какие базовые методы иммобилизации ферментов вы знаете?
6. Чем внешнедиффузионный режим работы иммобилизованного фермента отличается от внутридиффузионного?.
7. Приведите примеры влияния эффектов распределения
веществ между раствором и гетерогенной фазой на кинетическое поведение иммобилизованного фермента.
128
5. Ветеринарно-медицинская энзимология.
Ветеринарно-медицинская энзимология традиционно делится
на три раздела энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия.
5.1. Энзимопатология.
Энзимопатология – это наука, изучающая энзимопатии, то
есть патологические состояния, вызванные снижением (или
полным отсутствием) активности того или иного фермента. Первичные (наследственные) энзимопатии связаны с дефектными
генами ферментов, которые получает ребенок от родителей.
Вторичные (приобретенные) энзимопатии обусловлены снижением или полным прекращением синтеза белка, вызванным
различными факторами в ходе жизненного цикла. По типу нарушений метаболизма энзимопатии делят на патологии липидного
и углеводного обмена, обмена аминокислот, нуклеиновых оснований и стероидов, обмена в соединительной ткани, дефекты
желудочно-кишечного тракта и т.д.
В результате снижения ферментативной активности уменьшается концентрация продуктов метаболического пути, в котором данный фермент участвует. Одновременно возрастает концентрация субстратов-предшественников, в связи с чем активизируются побочные реакции, в которых эти субстраты участвуют. Уменьшение концентрации продуктов, увеличение концентрации субстратов-предшественников и продуктов их побочных
реакций – каждый из этих факторов в отдельности и в различных комбинациях и определяет наблюдаемую клиническую картину болезни.
Недостаточное образование продуктов. Классическим
примером энзимопатологии, связанной со снижением концентрации продуктов метаболического пути, является альбинизм группа патологий, характеризующихся нарушениями пигментации кожи, волос, радужной оболочки глаза. Пигментация кожи
определяется высокомолекулярными пигментами – меланина129
ми, которые синтезируются в специализированных клетках (меланоцитах). Начальной стадией синтеза меланинов является
окисление тирозина ферментом тирозиназой с образованием
диоксифенилаланина (ДОФА). Продукты полимеризация последнего в виде хинонной формы и представляют собой меланины. В большинстве случаев альбинизм связан именно с мутациями гена тирозиназы. Наиболее тяжелая форма болезни (глазокожная 1А) обусловлена так называемой nonsense-мутацией
гена alb-OCA1, при которой синтеза тирозиназы не происходит.
При других мутациях данного гена (их описано уже около пятидесяти) фермент синтезируется, но активность его понижена и
зависит от конкретной мутации. В ряде случаев болезнь проявляется только в виде слегка более светлого оттенка кожи и волос.
Другим примером такого рода патологий является гемофилия, болезнь, связанная с нарушением коагуляции (системы
свертывания крови). Система свертывания крови представляет
собой каскад реакций, в каждой из которых путем ограниченного
протеолиза образуются активные компоненты следующих стадий. Конечный результат процесса – протеолиз фибриногена
тромбином с образованием фибринопептидов, которые затем
образуют нити фибрина (собственно тромб, стягивающий рану).
Активация тромбина из протромбина проходит под действием
«активатора протромбина» - комплекса активированного фактора Xa и фосфолипопротеина Va. Для активации фактора Х в
свою очередь необходим комплекс факторов VIIIa и IXa. Примерно в 85% случаев гемофилия вызывается наследственной
недостаточностью синтеза факторов VIII (гемофилия А) и IХ (гемофилия В) и проявляется в частых кровотечениях и кровоизлияниях в результате травм. Особенностью заболевания является
то, что она характерна практически исключительно для мужчин.
Дело в том, что гены, кодирующие данные белки (Xq28 для FVIII
и Xq27 для FIX), локализованы в Х-хромосоме. У женщин даже
при наличии мутации в одной из Х-хромосом вторая обеспечивает достаточный уровень факторов свертывания крови. Известны лишь единичные случаи женской гемофилии при наследовании гена одновременно от отца (больной гемофилией) и
матери (носителя гена).
130
Накопление субстрата-предшественника. Увеличение концентрации субстрата-предшественника является причиной многих энзимопатологий липидного обмена. Катаболизм сфинголипидов и гликолипидов (важных компонентов плазматических
мембран) протекает в лизосомах, наиболее интенсивно – в мозге и богатых макрофагами печени и селезенке. В результате
нарушения этого процесса в клетках накапливаются нерасщепленные липиды, приводя к поражению важных для жизни органов. Болезнь Гоше, например, связана с лизосомальным ферментом -глюкозилцереброзидазой, расщепляющей глюкозилцереброзид на церамид и глюкозу. При малой активности фермента нерасщепленный субстрат накапливается в макрофагах и
моноцитах («нагруженные» липидами клетки называют клетками
Гоше). При этом увеличиваются селезенка и печень, костные
нарушения связаны с разрастаниями патологических клеток в
костном мозге, отмечается отставание в физическом и умственном развитии. Болезнь Нимана-Пика объединяет группу заболеваний, причиной которых является дефицит сфингомиелиназы, в норме гидролизующей сфингомиелин. Отложения сфингомиелина приводит к поражению внутренних органов центральной нервной системы. GM2-ганглиозидозы связаны с недостаточной активностью гексозаминидазы А (фермент отщепляет
остаток N-ацетил-D-гексозамина от GM2-ганглиозидов), что приводит к накоплению нерасщепленных липидов в клетках головного и спинного мозга с прогрессирующим их разрушением. Сам
фермент представляет собой / гетеродимер и для проявления
активности требует наличия белка-активатора GM2А. В этой
связи в настоящее время различают три варианта данного заболевания, не различающиеся клинически, но имеющие разные
генетические причины. Болезнь Тея-Сакса связана с мутацией
гена HEXA (кодирует -субъединицу), при болезни Сандхоффа
мутация находится в гене HEXB (кодирует -субъединицу).
Нарушения в гене GM2, кодирующим белок-активатор GM2A,
вызывает GM2-ганглиозидоз, АБ вариант.
С повышением концентрации субстрата дефектного фермента связан также синдром Криглера-Найяра. Билирубин (несвязанный, непрямой) является продуктом расщепления гема гемсодержащих белков. Этот желчный пигмент плохо растворим в
воде и способен легко встраиваться в липидную клеточную
131
мембрану. Проникая в митохондрии, он разобщает в них дыхание и окислительное фосфорилирование, что отрицательно сказывается на состоянии нервной системы. Первым симптомом
повышения концентрации билирубина в крови является развитие желтухи. При дальнейшем повышении концентрации соединение начинает проникать в головной мозг, приводя к повреждению базальных ядер. В норме непрямой билирубин связывается
с альбуминами крови, транспортируется в печень и конъюгируется с глюкуроновой кислотой под действием УДФглюкоронидазы. В результате образуется прямой (связанный)
билирубин – малотоксичный водорастворимый продукт, выводимый в дальнейшем из организма с калом и мочой. Мутации в
гене UGT1A1, кодирующем УДФ-глюкоронидазу, приводят к недостаточной активности фермента (2-й тип) или полному ее отсутствию (1-й тип). Синдром Криглера-Найяра 1-го типа характеризуется стремительным течением – первые признаки в виде
желтухи появляются через несколько часов после рождения, а
смерть наступает в течение 1-2 лет. При синдроме КриглераНайяра 2-го типа активность фермента составляет 20-30% от
нормы, что позволяет при правильно назначенных терапевтических мероприятиях продлить жизнь больным и даже избежать
нарушений центральной нервной системы.
Накопление продуктов побочных реакций субстрата. Фенилкетонурия является одной из наиболее распространенных
патологий обмена аминокислот. Фенилаланин в организме окисляется до тирозина фенилаланингидроксилазой (ФАГ), при этом
существует реакция его переаминирования в фенилпировиноградную кислоту (равновесие здесь сильно сдвинуто в сторону
фенилаланина). Отсутствие активности ФАГ приводит к повышению концентрации фенилаланина в организме. Как следствие, увеличивается и концентрация фенилпирувата, вызывающего токсическое повреждение нервной системы (в отсутствие
лечения достаточно быстро достигается степень имбецильности). Рекомендованная процедура лечения – пожизненная диета
с очень низким содержанием фенилаланина.
К этому же типу энзимопатий можно отнести и упоминавшуюся ранее (см. раздел 4.1) непереносимость лактозы, вызываемую низким уровнем синтеза пищеварительного фермента лак132
тазы. Патология может иметь как наследственный, так и приобретенный характер.
Накопление субстрата-предшественника и продуктов его
побочных реакций. Галактоземия. Основной путь метаболизма галактозы (входящей в состав лактозы, основного углевода
молока) включает ряд последовательных реакций. Вначале она
фосфорилируется в галактозо-1-фосфат под действием галактокиназы. Далее галактозо-1-фосфатуридилтрансфераза катализирует образование УДФ-галактозы, которая затем изомеризуется в УДФ-глюкозу УДФ-галакто-4-эпимеразой.
При этом имеются не очень значимые в норме пути трансформации галактозы, например, галактодегидрогеназа окисляет
галактозу в галактоновую кислоту, а альдозоредуктаза восстанавливает галактозу в галактитол. Недостаток любого из трех
ферментов основного пути метаболизма галактозы в первую
очередь приводит к повышению ее концентрации в крови, что
снижает печеночную продукцию глюкозы (гипогликемия). Галактитол, накапливаясь в хрусталике глаза, способствует образованию катаракты. При дефиците активности галактозо-1фосфатуридилтрансферазы (классическая галактеземия I типа) возрастает и концентрация галактозо-1-фосфата, обладающего ингибирующей активностью по отношению к другим ферментам углеводного обмена и вызывает торможение транспорта
аминокислот в почках и кишечнике. Лечение данного заболевания состоит в исключении из диеты продуктов, содержащих галактозу, в первую очередь молока и молочных продуктов.
Отрицательные свойства некоторых мутаций в генах ферментов могут проявляться только при определенных условиях.
Так, бутирилхолинэстераза человека (БуХЭ) участвует в процессах метаболизма широкого круга антибиотиков, в том числе
гидролизует используемый в медицине миорелаксант сукцинилхолин. Известно несколько изоформ фермента, отличающихся
различными единичными заменами в аминокислотной последовательности белка. Никакого влияния на качество жизни людей
в обычных условиях эти замены не оказывают. Однако мутация
Asp98Gly многократно снижает связывающую способность БуХЭ
по отношению к положительно заряженным субстратам. Люди с
таким генотипом аномально реагируют на введение миорелак133
санта – 2-5-часовая асфикция (на фоне 3-5-минутной в норме) и
продолжительный паралич.
5.2. Энзимодиагностика
Энзимодиагностика занимается изучением активности ферментов в биологических средах с диагностической целью. В
обычной медицинской и ветеринарной практике для этого используют плазму или сыворотку крови. В специализированных
клиниках такой анализ может проводиться в лимфе, спинномозговой жидкости, тканях, и т.п.
Энзимопатологии связаны с недостаточной активностью тех
или иных конкретных ферментов, и определение их активности
крайне важно для назначения правильного лечения болезни. В
норме же в крови человека присутствует достаточно большое
количество ферментов и в ходе различных заболеваний их активность может как повышаться, так и понижаться.
Присутствующие в крови ферменты можно условно разделить на две группы – секреторные (функциональные) и внутриклеточные (нефунциональные). К первой группе относятся ферменты, которые выполняют свои физиологические функции
непосредственно в крови. К ним относятся, например, ферменты
регуляции сосудистого тонуса (ренин-ангиотензиновая и калликреин-кининовая системы), систем свертывания крови, фибринолиза и комплемента. Такие белки синтезируются в определенных органах (в большинстве своем в печени) и секретируются в кровь. Ко второй группе относятся белки, выполняющие
свои функции исключительно внутри клеток тех или иных органов (в крови их субстраты отсутствуют). В кровь они попадают в
результате нормального клеточного обновления и их концентрация (активность) поддерживается на определенном уровне балансом скоростей высвобождения из клеток и выведения из кровотока. Основной причиной повышения активности нефункциональных ферментов в крови является повреждение клеток тех
органов, где данные белки в основном локализованы. Таким образом, результаты биохимического анализа крови может указать
на потенциальное развитие определенного заболевания.
В простейший биохимический анализ крови всегда входит
определение активности аланин- и аспартатаминотрансфераз
134
(АЛТ и АСТ, соответственно). Повышение их активности свидетельствует о протекании некоторых патологических процессов в
печени, сердечной мышце, скелетной мускулатуре. Однако в
разных органах эти ферменты присутствуют в разных количествах. Если АЛТ в основном локализована в печени, то АСТ - в
сердечной мышце. В этой связи помимо абсолютных значений
активностей данных ферментов используют еще и так называемых коэффициент де Ритиса – отношение активности АСТ к
АЛТ. В норме этот коэффициент составляет 0,911,75. Снижение этого показателя (на фоне суммарного увеличения активности ферментов) говорит о проблемах с печенью, а повышение –
о проблемах с сердцем. Снижение активности АЛТ наблюдают
при инфекциях мочеполовой системы или дефиците пиридоксальфосфата в питании.
Активность щелочной фосфатазы возрастает при заболеваниях печени (желтухах) и разрушении костных тканей (миеломная болезнь, старение организма).
Увеличение активности -амилазы фиксируют при перитонитах, панкреатитах (поджелудочная железа), сахарном диабете,
почечной недостаточности. Снижается ее активность при тиреотоксикозе, токсикозе беременных, инфаркте миокарда.
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) является маркером поздней диагностики инфаркта миокарда. Ее наличие позволяет отличить
инфаркт от клинически сходного с ним приступа стенокардии.
Активность ЛДГ в крови возрастает также при патологиях в работе печени, почек, а также при разрушении мышечной ткани.
Еще одним маркером инфаркта миокарда является креатинфосфокиназа (КФК), также преимущественно локализованная в
сердечной и скелетных мышцах.
Активность -глутамилтрансферазы (ГГТ) повышается при
заболеваниях печени и желчных протоков. ГГТ может использоваться для выявления хронического употребления алкоголя (ее
уровень повышен у 75% людей, страдающих алкоголизмом).
Биохимические исследования никогда не выполняются изолированно и зависят от предварительного диагноза. Так, при
панкреатите рекомендуют исследование уровней не только
ферментов поджелудочной железы – липазы, эластазы, панкреатической амилазы, но и глюкозы и общего билирубина. Функции желчных протоков определяют по уровню билирубина (об135
щего, прямого и непрямого). Однако в расчет принимаются также желчные кислоты, альбумин, общий белок, а также активности АЛТ, АСТ, ГГТ, щелочной фосфатазы и -амилазы.
Дополнительную информацию о заболевании можно получить при изучении изоферментого состава определенного фермента. Изоферменты - это различные изоформы одного и того
же фермента, существующие в одном организме, но продуцируемые различными органами и, вследствие этого несколько различающиеся по своему составу. Все изоферменты одного и того
же фермента выполняют одну и ту же каталитическую функцию,
но могут значительно различаться по степени каталитической
активности, по особенностям регуляции или другим свойствам.
Например, панкреатическая амилаза отличается по первичной
структуре и свойствам от амилазы слюнных желёз, кишечника и
других органов. Это послужило основой для разработки и применения более надёжного метода диагностики острого панкреатита путём определения не общей амилазы плазмы крови, а
именно панкреатической изоамилазы.
Изоферменты четвертичной структуры состоят из нескольких
субъединиц, которые обычно занимают эквивалентное (равноценное) положение в олигомере. При этом сами субъединицы,
продуцируемые в различных органах, зачастую отличаются друг
от друга по молекулярной массе. В этой связи олигомеры разного состава будут иметь различные массы. Их можно разделить
методом электрофореза в неденатурирующих условиях и измерить соотношение активностей полученных фракций. Именно
соотношение концентраций (активностей) изоферментов является одним из мощных факторов диагностики тех или иных заболеваний.
Так, упомянутая выше креатинфосфокиназа (КФК) представляет собой димер, однако мономеры, вырабатываемые мозгом
(В-мономеры, от английского brain, мозг) отличаются от мономеров, экспрессирующихся в скелетных мышцах (М-мономеры, от
английского muscle, мышца). Образование различных димеров
приводит к существованию трех изоформ КФК: КФК-1 (ВВ), специфичной только для мозга; КФК-2 (МВ), составляющей примерно 35% общей активности КФК в сердечной мышце; КФК-3 (ММ),
вырабатываемый сердечной и скелетными мышцами. В норме
100% активности КФК в крови приходится на долю КФК-3, однако
136
повреждение сердечной мышцы в результате инфаркта миокарда приводит к появлению в кровотоке КФК-2 (начиная с 3-6 ч после инфаркта и достигая максимума на 12-24 ч). Таким образом,
наличие в крови изоформы КФК-2 на фоне общего повышения
активности фермента позволяет отличить именно инфаркт от
потенциальных патологий скелетных мышц.
Аналогичная ситуация и в случае с лактатдегидрогеназой
(ЛДГ). ЛДГ функционирует в форме тетрамера, однако мономеры сердечной мышцы (Н-мономеры, от английского heart, сердце), немного отличаются от мономеров печени и скелетных
мышц (М-мономеры). В этой связи известно пять изоформ ЛДГ –
Н4, Н3М, Н2М2, НМ3 и М4 (ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5 соответственно). В тканях с преимущественно аэробным обменом веществ (сердце, мозг, почки) наибольшей активностью обладают
ЛДГ1 и ЛДГ2. В тканях с выраженным анаэробным обменом (печень, скелетные мышцы) преобладают ЛДГ4 и ЛДГ5. Следовательно, при повреждении какого-либо органа в крови будет повышаться доля той изоформы, которая характерна для данного
органа. Например, при инфаркте миокарда в крови повышается
активность ЛДГ1 и ЛДГ2, а при остром гепатите - ЛДГ4 и ЛДГ5.
5.3. Энзимотерапия
Энзимотерапия – направление, занимающееся использованием ферментов в качестве лекарственных средств. Ее традиционно разделяют на заместительную (использование ферментов в случае их недостаточности) и комплексную (применение
ферментов в сочетании с другой терапией).
Заместительная терапия в основном используется при недостатке пищеварительных ферментов. Причиной тому могут служить как разные заболевания желудочно-кишечного тракта, так
и уменьшение эффективности работы поджелудочной железы с
возрастом. Препараты на основе пепсина, например, используют гипо- и анацидных гастритах, Возрастная недостаточность
секреции пищеварительных соков компенсируется приемом
комплексных препаратов, содержащих основные пищеварительных ферменты – протеиназы для расщепления белков, амилазы
для расщепления полисахаридов и липазы для гидролиза триглицеридов (жиров и масел). Число фирменных названий таких
137
препаратов весьма велико, но в большинстве своем они готовятся на основе экстракта из поджелудочной железы свиней и
крупного рогатого скота – различия заключаются только в соотношении активностей входящих в состав ферментов. Имеется
также ряд препаратов на основе сока папайи, где высока активность амилаз, но содержание липаз незначительно. Эти же препараты показаны и здоровым людям перед ситуациями, связанными с единичным обильным приемом пищи.
Протеолитические ферменты применяют для очистки раневых поверхностей и абсцессах легких. Эти ферменты эффективно расщепляют омертвевшие участки тканей, вязкие секреты
и эссудаты. По отношению к здоровым тканям они безопасны в
связи с наличием в них специфичных и неспецифичных ингибиторов. Чтобы увеличить (пролонгировать) время жизни фермента, изготовляют повязочные материалы с сорбированными на
ткани белками. Медленная десорбция белка на рану значительно увеличивает срок действия препарата. Трипсин и химотрипсин выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого
скота, террилитин продуцируется плесневым грибом Аspergillus
terriсоlа.
Коллагеназа расщепляет коллагеновые волокна, не входящие в состав коллагеновых фибрилл. В этой связи нормальная
кожа не затрагивается, а «плохой» коллаген (шрамы, рубцы)
подвергается распаду.
Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кислоту («цементирующее» вещество соединительной ткани), что повышает тканевую проницаемость, размягчает и уплощает рубцы, предупреждает формирование контрактур. Препараты на основе гиалуронидазы применяют для рассасывания рубцов после ожогов
и операций.
Ряд антисептических средств для наружного и местного применения (гели, кремы, антисептические жидкости, таблетки для
рассасывания) изготавливаются на основе бактериолитических ферментов (лизинов) – ферментов, способных лизировать
(разрушать) пептидогликан клеточной стенки бактерий. Полисахаридная часть пептидогликана представляет собой цепи муреина (полисахарид из строго чередующихся остатков Nацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных -(1-4)-связью). Карбоксильные группы остатков N138
ацетилмурамовой кислоты образуют амидную связь с тетрапептидами одинакового строения, состав которых зависит от типа
бактерии. Трехмерная структура пептидогликана образуется за
счет межпептидных мостиков, чаще всего между конечным (четвертым) аминокислотным остатком одного пептида и третьим
остатком другого. Эти остатки могут быть связаны между собой
непосредственно, либо через короткие пептиды. Таким образом,
пептидогликан является по сути своей одной гигантской молекулой, предотвращающей осмотической шок бактерий. Ферментативный гидролиз тех или иных ковалентных связей пептидогликана приводит к нарушению его прочности и, как следствие, вызывает лизис бактерий. В этой связи к лизинам относятся гидролазы различной специфичности – гликозидазы, амидазы, пептидазы. Наиболее широко известен куриный лизоцим (мукопептид-N-ацилмурамоилгидролаза), катализирующий гидролиз 1,4-связей между остатками N-ацетилмурамовой кислоты и Nацетилглюкозамина в муреине. Амидазная активность (отщепление тетрапептидов от N-ацетилмурамовой кислоты) присуща
секретируемому бактериями Lysobacter sp. литическому комплексу белков (лизоамидаза). Пептидазы, гидролизующие пептидные мостики, характерны для бактериофагов. Эти ферменты
являются частью жизненного цикла фагов и имеют узкую специфичность по отношению к пептидогликану бактерии-хозяина.
В последние два десятилетия они интенсивно изучаются и рассматриваются ныне как альтернатива традиционным антибиотикам, что подчеркивается используемым для них в литературе
термином «enzybiotics»19. Тем не менее, в настоящее время
зарегистрирован только лизин Staphefect SA.100 - препараты на
его основе предлагаются лечения поверхностных дерматозов,
вызванных S.aureus. Для профилактики вирусных заболеваний
предлагаются препараты на основе ДНК-азы.
Тромболитические препараты представляют собой активаторы плазминогена – находящегося в крови неактивного предшественника плазмина, фермента, лизирующего тромбы. На прак19
R.M.Danis-Wlodarczyk, D.J.Wozniak, S.T.Abedon. Treating bacterial infections with bacteriophage-based enzybiotics: in vivo, in vitro
and clinical applications. – Antibiotics (Basel), 2021, v.10(12): 1497.
139
тике представлены препараты как бактериального происхождения – на базе стрептокиназы и стафилокиназы, так и рекомбинантные ферменты человека - тканевый активатор плазминогена, урокиназа и проурокиназа.
Препараты на основе аспарагиназы являются неотъемлемой частью комбинированной противоопухолевой терапии лимфобластного лейкоза. Фермент катализирует гидролиз Lаспарагина с образованием L-аспарагиновой кислоты. В опухолевых клетках, в отличие от клеток нормальных тканей, отсутствует активность фермента аспарагинсинтетазы, синтезирующей L-аспарагин из L-аспарагиновой кислоты. При снижении
концентрации аспарагина в крови нормальные клетки восполняют его уровень за счет внутриклеточного синтеза, лейкозные
клетки испытывают его недостаток, что приводит к их гибели.
Таким образом, аспарагиназа вызывает избирательную регрессию опухолевой ткани.
Рекомбинантные человеческие ферменты в ряде случаев
помогают поддерживать относительно нормальное состояние
пациентов с наследственными энзимопатиями. Так, препарат,
содержащий рекомбинантную -D-глюкоцереброзидазу, применяется при лечении упоминавшейся выше болезни Гоше (см.
раздел 5.1). Болезнь Помпе (накопление гликогена в лизосомах,
связанное
с
наследственной
недостаточностью
-1,4глюкозидазы) также лечится препаратом на основе рекомбинантного человеческого фермента. Следует, однако, отметить,
что рекомбинантные ферменты весьма и весьма дороги. Так,
годовой курс лечения болезни Помпе обходится от 100 до 300
тысяч долларов в зависимости от возраста и веса пациента.
Вопросы для самоконтроля.
1. По каким принципам делят энзимопатологии на группы.
2. Приведите пример энзимопатологии липидного обмена.
3. Изоферменты и их роль в энзимодиагностике.
4. Приведите примеры ферментов-маркеров инфаркта миокарда.
5. Какие ферменты используются для профилактики бактериальных заражений?
6. Механизм противоопухолевого действии аспарагиназы.
140
ПРИЛОЖЕНИЕ I
Ключ к номенклатуре ферментов
(«Рекомендации Комитета по номенклатуре Международного Союза по Биохимии и Молекулярной Биологии (NCIUBMB)», состояние на сентябрь 2023 г., http://www.enzymedatabase.org)
1. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ.
1.1. Действуют на СН-ОН группу доноров.
1.1.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.1.2. Акцептором служит цитохром.
1.1.3. Акцептором служит кислород.
1.1.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.1.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.1.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.1.9. Акцептором служит медь-содержащий белок.
1.1.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.1.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.2. Действуют на альдегидную или кетонную группу доноров.
1.2.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.2.2. Акцептором служит цитохром.
1.2.3. Акцептором служит кислород.
1.2.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.2.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.2.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.2.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.3. Действуют на СН-СН группу доноров.
1.3.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.3.2. Акцептором служит цитохром.
1.3.3. Акцептором служит кислород.
1.3.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.3.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.3.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.3.8. Акцептором служит флавин.
1.3.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.3.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.4. Действуют на СН-NН2 группу доноров.
1.4.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.4.2. Акцептором служит цитохром.
1.4.3. Акцептором служит кислород.
1.4.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
141
1.4.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.4.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.4.9. Акцептором служит медь-содержащий белок.
1.4.99. Используют другие, известные акцепторы.
1.5. Действуют на СН-NН группу доноров.
1.5.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.5.3. Акцептором служит кислород.
1.5.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.5.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.5.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.5.8. Акцептором служит флавин или флавопротеин.
1.5.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.5.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.6. Действуют на NADH или NADPH.
1.6.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.6.2. Акцептором служит гемопротеин.
1.6.3. Акцептором служит кислород.
1.6.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.6.6. Акцептором служит азотистая группировка.
1.6.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.7. Действуют на другие азотистые соединения в качестве
доноров.
1.7.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.7.2. Акцептором служит цитохром.
1.7.3. Акцептором служит кислород.
1.7.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.7.6. Акцептором служит азотистая группировка.
1.7.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.7.9. Акцептором служит медь-содержащий белок.
1.7.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.8. Действуют на серосодержащие группы доноров.
1.8.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.8.2. Акцептором служит цитохром.
1.8.3. Акцептором служит кислород.
1.8.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.8.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.8.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.8.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.8.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.8.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.9. Действуют на группу гемадоноров.
1.9.3. Акцептором служит кислород.
1.9.6. Акцептором служит азотистая группировка.
1.9.98. Используют другие, известные акцепторы.
142
1.9.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.10. Действуют на дифенолы и родственные им соединения в
качестве доноров.
1.10.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.10.2. Акцептором служит цитохром.
1.10.3. Акцептором служит кислород.
1.10.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.10.9. Акцептором служит медь-содержащий белок.
1.10.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.11. Действуют на пероксид водорода в качестве акцептора.
1.11.1. Пероксидазы.
1.11.2. Пероксигеназы.
1.12. Действуют на водород в качестве донора.
1.12.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.12.2. Акцептором служит цитохром.
1.12.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.12.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.12.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.12.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.12.99. Используют неизвестные акцепторы
1.13. Действуют на одиночный донор с включением в него
молекулярного кислорода (оксигеназы).
1.13.11. Включают два атома кислорода.
1.13.12.
Включают
один
атом
кислорода
(«внутренние»
монооксигеназы или «внутренние» оксидазы со смешанной функцией).
1.13.99. Разные (требуют дальнейшего изучения).
1.14. Действуют на пару доноров, катализируя включение или
восстановление молекулярного кислорода.
1.14.11. С 2-оксоглутаратом в качестве одного из доноров и включением одного атома кислорода в состав каждого из доноров.
1.14.12. С NADН или NADPН в качестве одного из доноров и включением двух атомов кислорода в состав другого донора.
1.14.13. С NADН или NADPН в качестве одного из доноров и включением одного атома кислорода в состав другого донора.
1.14.14. С восстановленным флавином или флавопротеидом в качестве одного из доноров и с включением одного атома кислорода в состав другого донора.
1.14.15. С восстановленным железо-серным белком в качестве одного из доноров и с включением одного атома кислорода в состав другого донора.
1.14.16. С восстановленным птеридином в качестве одного из доноров и с включением одного атома кислорода в состав другого донора.
1.14.17. С восстановленным аскорбатом в качестве одного из доноров и с включением одного атома кислорода в состав другого донора.
143
1.14.18. С другими соединениями в качестве одного из доноров и с
включением одного атома кислорода в состав другого донора.
1.14.19. С окислением пары доноров и переводом молекулярного
кислорода в две молекулы воды.
1.14.20. С 2-оксоглутаратом в качестве одного из доноров и дегидрированием второго.
1.14.21. С NADН или NADPН в качестве одного из доноров и дегидрированием второго.
1.14.99. Разные (требуют дальнейшего изучения).
1.15. Действуют на перекисные радикалы в качестве акцептора.
1.15.1. Акцептором служит супероксид.
1.16. Окисляют ионы металлов.
1.16.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.16.3. Акцептором служит кислород.
1.16.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.16.8. Акцептором служит флавин.
1.16.9. Акцептором служит медь-содержащий белок.
1.16.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.16.99. Используют неизвестные акцепторы
1.17. Действуют на СН или СН2 группы.
1.17.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.17.2. Акцептором служит цитохром.
1.17.3. Акцептором служит кислород.
1.17.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.17.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.17.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.17.8. Акцептором служит флавин или флавопротеин.
1.17.9. Акцептором служит медь-содержащий белок.
1.17.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.17.99. Используют неизвестные акцепторы
1.18. Действуют на железосеропротеиды в качестве донора.
1.18.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.18.6. Акцептором служит N2.
1.19. Действуют на восстановленный флаводоксин в качестве
донора.
1.19.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.19.6. Акцептором служит N2.
1.20. Действуют на фосфор- или мышьяксодержащие группы
доноров.
1.20.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.20.2. Акцептором служит цитохром.
1.20.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.20.9. Акцептором служит медь-содержащий белок.
1.20.98. Используют другие, известные акцепторы.
144
1.20.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.21. Действуют на X-H и Y-H, образуя связь X-Y.
1.21.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.21.3. Акцептором служит кислород.
1.21.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.21.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.21.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.22. Действуют на галоген в доноре.
1.22.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.23. Восстанавливают С-О-С группу как акцептор.
1.23.1. Донором служит NAD+ или NADP+.
1.23.5. Акцептором служит хинон или родственное ему соединение.
1.97. Другие оксидоредуктазы.
2. ТРАНСФЕРАЗЫ.
2.1. Переносят одноуглеродные остатки.
2.1.1. Метилтрансферазы.
2.1.2.
Трансферазы
гидроксиметильных,
формильных
и
родственных групп.
2.1.3. Карбоксил – и карбамоилтрансферазы.
2.1.4. Амидинотрансферазы.
2.1.5. Метилентрансферазы.
2.2. Переносят альдегидные и кетонные остатки.
2.3. Переносят ацильные остатки.
2.3.1. Ацилтрансферазы.
2.3.2. Аминоацилтрансферазы.
2.3.3. Ацильная группа при переносе трансформируется в
алкильную.
2.4. Переносят гликозильные остатки.
2.4.1. Гексозилтрансферазы.
2.4.2. Пентозилтрансферазы.
2.4.3. Сиалилтрансферазы.
2.4.99. Переносят другие гликозильные группы.
2.5. Переносят алкильные (отличающиеся от метильных) или
арильные группы.
2.6. Переносят азотистые группы.
2.6.1. Аминотрансферазы.
2.6.3. Оксиминотрансферазы.
2.6.99. Переносят другие азотистые группы.
2.7. Переносят группы, содержащие фосфор.
2.7.1. Фосфотрансферазы со спиртовой группой в качестве
акцептора.
2.7.2. Фосфотрансферазы с карбоксильной группой в качестве
акцептора.
145
2.7.3. Фосфотрансферазы с азотистой группой в качестве акцептора.
2.7.4. Фосфотрансферазы с фосфатной группой в качестве
акцептора.
2.7.6. Дифосфотрансферазы.
2.7.7. Нуклеотидилтрансферазы.
2.7.8. Трансферазы других замещенных фосфатных группировок.
2.7.9. Фосфотрансферазы со спареннымы акцепторами.
2.7.10. Протеин-тирозин киназы.
2.7.11. Протеин-серин/треонин киназы.
2.7.12. Киназы двойной специфичности (действуют на остатки
Ser/Thr и Tyr).
2.7.13. Протеин-гистидин киназы.
2.7.14. Протеин-аргинин киназы.
2.7.99. Другие протеин киназы.
2.8. Переносят группы, содержащие серу.
2.8.1. Сульфидтрансферазы.
2.8.2. Сульфотрансферазы.
2.8.3. СоА-трансферазы.
2.8.4. Переносят тиоалкильные группы.
2.8.5. Тиосульфотрансферазы.
2.9. Переносят группы, содержащие селен.
2.10. Переносят грыппы, содержащие молибден или вольфрам.
3. ГИДРОЛАЗЫ.
3.1. Действуют на сложноэфирные связи.
3.1.1. Гидролазы эфиров карбоновых кислот.
3.1.2. Гидролазы тиоловых эфиров.
3.1.3. Гидролазы фосфомоноэфиров.
3.1.4. Гидролазы фосфодиэфиров.
3.1.5. Гидролазы моноэфиров трифосфорных кислот.
3.1.6. Гидролазы эфиров серной кислот.
3.1.7. Гидролазы дифосфомоноэфиров.
3.1.8. Гидролазы фосфотриэфиров.
3.1.11. Экзодезоксирибонуклеазы, образующие 5’-фосфомоноэфиры.
3.1.12. Экзодезоксирибонуклеазы, образующие 3’-фосфомоноэфиры.
3.1.13. Экзорибонуклеазы, образующие 5’-фосфомоноэфиры.
3.1.14. Экзорибонуклеазы, образующие 3’-фосфомоноэфиры.
3.1.15. Экзонуклеазы, действующие как на рибо-, так и на дезоксирибонуклеиновые кислоты с образованием 5’-фосфомоноэфиров.
3.1.16. Экзонуклеазы, действующие как на рибо-, так и на дезоксирибонуклеиновые кислоты с образованием 3’-фосфомоноэфиров.
146
3.1.21. Эндодезоксирибонуклеазы, образующие 5’-фосфомоноэфиры.
3.1.22.
Эндодезоксирибонуклеазы,
образующие
3’фосфомоноэфиры.
3.1.25. Эндодезоксирибонуклеазы сайт-специфичные: специфичны к
измененным основаниям.
3.1.26. Эндорибонуклеазы, образующие 5’-фосфомоноэфиры.
3.1.27. Эндорибонуклеазы, образующие 3’-фосфомоноэфиры.
3.1.30. Эндорибонуклеазы, действующие как на рибо-, так и на дезоксирибонуклеиновые кислоты с образованием 5’-фосфомоноэфиров.
3.1.31. Эндорибонуклеазы, действующие как на рибо-, так и на дезоксирибонуклеиновые кислоты с образованием 3’-фосфомоноэфиров.
3.2. Гликозилазы.
3.2.1. Гликозидазы (гидролизуют O- и S-гликозильные соединения).
3.2.2. Гидролизуют N-гликозильные соединения.
3.3. Действуют на простые эфирные связи.
3.3.1. Гидролазы тио- и триалкилсульфоэфиров.
3.3.2. Гидролазы простых эфиров.
3.4. Действуют на пептидные связи (пептид-гидролазы).
3.4.11. Аминопептидгидролазы.
3.4.13. Дипептид-гидролазы.
3.4.14. Дипептидилпептид- и трипептидилпептид-гидролазы.
3.4.15. Пептидилдипептид-гидролазы.
3.4.16. Сериновые карбоксипептидазы.
3.4.17. Металлокарбоксипептидазы.
3.4.18. Цистеиновые карбоксипептидазы.
3.4.19. Омега карбоксипептидазы.
3.4.21. Сериновые эндопептидазы.
3.4.22. Цистеиновые эндопептидазы.
3.4.23. Аспартильные эндопептидазы.
3.4.24. Металлоэндопептидазы.
3.4.25. Треониновые эндопептидазы.
3.4.26. Глутаминовые эндопептидазы.
3.4.99. Эндопептидазы с неизвестным механизмом катализа.
3.5. Действуют на C-N-связи, отличающиеся от пептидных
связей.
3.5.1. В линейных амидах.
3.5.2. В циклических амидах.
3.5.3. В линейных амидинах.
3.5.4. В циклических амидинах.
3.5.5. В нитрилах.
3.5.99. В других соединениях.
3.6. Действуют на ангидриды кислот.
3.6.1. В фосфорсодержащих ангидридах.
147
3.6.2. В сульфонилсодержащих ангидридах.
3.6.3.
Действуют
на
ангидриды
кислот;
катализируют
трансмембранный перенос веществ.
3.6.4. Действуют на ангидриды кислот; обеспечивают клеточное и
внутриклеточное движение.
3.6.5.
Действуют
на
GTP;
обеспечивают
клеточное
и
внутриклеточное движение.
3.7. Действуют на С-С-связи.
3.7.1. В кетосоединениях.
3.8. Действуют на галоидные связи.
3.8.1. В С-галоидных соединениях.
3.8.2. В Р-галоидных соединениях.
3.9. Действуют на P-N-связи.
3.10. Действуют на S-N-связи.
3.11. Действуют на C-P-связи.
3.12. Действуют на S-S-связи.
3.13. Действуют на C-S-связи.
3.13.1. Действуют на C-S-связи.
3.13.2. Тиоэфир- и тиоалкилсульфогидролазы.
4. ЛИАЗЫ.
4.1. Углерод-углерод лиазы.
4.1.1. Карбокси-лиазы.
4.1.2. Альдегид-лиазы.
4.1.3. Лиазы оксокислот.
4.1.99. Прочие углерод-углерод лиазы.
4.2. Углерод-кислород лиазы.
4.2.1. Гидро-лиазы.
4.2.2. Действуют на полисахариды.
4.2.3. Действуют на фосфатсодержащие соединения.
4.2.99. Прочие углерод-кислород лиазы.
4.3. Углерод-азот лиазы.
4.3.1. Аммиак-лиазы.
4.3.2. Действуют на амидины, амиды и т.п.
4.3.3. Амин-лиазы.
4.3.99. Прочие углерод-азот лиазы.
4.4. Углерод-сера лиазы.
4.5. Углерод-галоид лиазы.
4.6. Фосфор-кислород лиазы.
4.7. Углерод-фосфор лиазы.
4.8. Азот-кислород лиазы.
4.98. АРФ-независимые хелатазы.
4.99. Прочие лиазы.
148
5. ИЗОМЕРАЗЫ.
5.1. Рацемазы и эпимеразы.
5.1.1. Действуют на аминокислоты и их производные.
5.1.2. Действуют на гидроксикислоты и их производные.
5.1.3. Действуют на углеводы и их производные.
5.1.99. Действуют на прочие соединения.
5.2. Цис-транс-изомеразы.
5.3. Внутримолекулярные оксидоредуктазы.
5.3.1. Взаимопревращают альдозы и кетозы.
5.3.2. Катализируют взаимопревращения кетонных и енольных
групп.
5.3.3. Перемещают С=С-связи.
5.3.4. Перемещают S-S-связи.
5.3.99. Другие внутримолекулярные оксидоредуктазы.
5.4. Внутримолекулярные трансферазы.
5.4.1. Перемещают ацильные группы.
5.4.2. Перемещают фосфоэфирные группы.
5.4.3. Перемещают аминогруппы.
5.4.4. Перемещают гидроксильные группы.
5.4.99. Перемещают другие группы.
5.5. Внутримолекулярные лиазы.
5.6. Изомеразы, изменяющие конформацию макромолекул.
5.6.1. Изменяют конформацию полипептидов.
5.6.2. Изменяют конформацию нуклеиновых кислот.
5.99. Прочие изомеразы.
6. ЛИГАЗЫ (СИНТЕТАЗЫ).
6.1. Образуют С-О-связи.
6.1.1. Лигазы, образующие аминоацил-тРНК и родственные соединения.
6.1.2. Кислота-спирт лигазы.
6.1.3. Циклолигазы.
6.2. Образуют С-S-связи.
6.2.1. Кислота-тиол лигазы.
6.2.2. Амид-тиол лигазы.
6.3. Образуют С-N-связи.
6.3.1. Кислота-аммиак (или амин) лигазы (амид-синтетазы).
6.3.2. Кислота-аминокислота лигазы (пептид-синтетазы).
6.3.3. Цикло-лигазы.
6.3.4. Прочие C-N-лигазы.
6.3.5. C-N-лигазы с глутамином в роли амидо-N-донора.
6.4. Образуют С-С-связи.
6.5. Образуют фосфоэфирные связи.
6.6. Образуют связи азот-металл.
149
6.7. Образуют N-N-связи.
7. ТРАНЛОКАЗЫ.
7.1. Катализируют перенос протона.
7.1.1. Связан с окислительно-восстановительной реакцией.
7.1.2. Связан с гидролизом нуклеозидтрифостфата.
7.1.3. Связан с гидролизом дифосфата.
7.2. Катализируют перенос неорганического катиона.
7.2.1. Связан с окислительно-восстановительной реакцией.
7.2.2. Связан с гидролизом нуклеозидтрифостфата.
7.2.4. Связан с декарбоксилированем.
7.3. Катализируют перенос неорганических анионов и их хелатов.
7.4. Катализируют перенос аминокислот и пептидов.
7.5. Катализируют перенос углеводов и их производных.
7.6. Катализируют перенос других соединений.
150
ПРИЛОЖЕНИЕ II
ПРОТЕИНОГЕННЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ
Процесс синтеза полипептидной цепи белка коротко можно
сформулировать следующим образом. Информация о составе
белка передается с ДНК на рибосому при помощи мРНК. Триплеты нуклеотидов кодируют определенные аминокислоты в
аминокислотной последовательности белка, либо остановку
синтеза белка на рибосоме (стоп-кодон). При элонгации (собственно синтез) соответствующая аминоацилированная тРНК
связывается с аминоацил-сайтом рибосомы, рибосома катализирует образование пептидной связи данной аминокислоты с
находящемся в ней пептидом, после чего перемещается по
мРНК на один триплет и продолжает работу. Терминация (остановка синтеза белка) происходит при достижении рибосомой
одного из стоп-кодонов.
В 1968 году Нобелевскую премию по физиологии и медицине
получили Роберт Холли (Robert Holley), Хар Гобинд Корана (Har
Gobind Khorana) и Маршалл Ниренберг (Marshall Nirenberg) «за
расшифровку генетического кода и его роли в синтезе белков».
Были соотнесены между собой 20 аминокислот и триплеты нуклеотидов, их кодирующие в эукариотах. Эти 20 аминокислот и
получили название «протеиногенные».
Собственно аминокислот в белках намного больше (разные
авторы приводят цифры от 100 до 300). Это окисленные (оксипролин, оксилизин), фосфорилированные, гликозилированные и
т.д. остатки аминокислот в белках, однако все процессы модификации протекают после синтеза белка и их называют посттрансляционными модификациями.
Традиционно в биохимических учебниках оперируют именно
с 20-ю протеиногенными аминокислотами. Однако развитие
биохимии показало, что таких аминокислот по крайней мере 22.
Не углубляясь в обсуждение пирролизина (присутствующего в
белках у метаногенных архей), хотелось бы остановиться на селеноцистеине.
Селеноцистеин (сокращенно Sec) – аналог цистеина с заменой атома серы на селен. Кодируется он стоп-кодоном UGA, если в последовательности мРНК присутствует определенного
151
рода шпилька, называемая последовательностью вставки
селеноцистеина (SECIS element). тРНКSec изначально связывается с серином (хотя она гораздо крупнее стандартной тРНКSer).
Кислород серина в Ser-тРНКSeс замещается на селен селенцистеинсинтазой. Образовавшаяся Seс-тРНКSeс доставляется в
рибосому, транслирующую селенопротеин, в комплексе с альтернативным трансляционным фактором. Далее, после включения Sec в состав пептидной цепи, элонгация (дальнейший синтез аминокислотной последовательности) продолжается. Поскольку у эукариот элемент SECIS располагается в 3’нетранслируемой области, транслируемый белок может включать в себя несколько аминокислотных остатков селеноцистеина.
Селен способен менять степень окисления и в составе многих окислительно-восстановительных ферментов Sec выполняет
роль активного центра. Здесь в первую очередь необходимо отметить глутатионпероксидазу, играющую важнейшую роль при
защите организма человека от окислительного стресса (у человека известно уже более 25 селенопротеинов). В этой связи
ученые, работающие в области энзимологии и биологической
неорганической химии, абсолютно обоснованно считают селеноцистеин 21-й протеиногенной аминокислотой.
152
ПРИЛОЖЕНИЕ III
БАЗОВЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ЗАКОНОМЕРНОСТИ
ХИМИЧЕСКОЙ КИНЕТИКИ
Химическая кинетика - наука, изучающая механизмы и закономерности протекания химических реакций во времени в зависимости от концентраций реагирующих веществ, состава среды
и внешних условий проведения эксперимента.
III.1. Простые и сложные реакции
По имеющимся в настоящий момент представлениям, химические реакции делятся на простые и сложные. Простые реакции представляют собой совокупность однотипных элементарных актов трансформации исходных веществ в продукты реакции, например,
АВ
А+ВС
АВ+С
В зависимости от числа вступающих в реакцию атомов (молекул) простые реакции подразделяют на мономолекулярные,
бимолекулярные и тримолекулярные. Уже тримолекулярные
реакции встречаются крайне редко, а одновременное взаимодействие более чем трех частиц практически невозможно.
Сложные реакции представляют собой совокупность нескольких простых реакций.
Если реакция протекает как от исходных веществ к продуктам, так и наоборот (через одни и те же вещества, но в обратном порядке), то она называется обратимой:
АВА
Если же протекание реакции в обе стороны проходит через
разные вещества, или через те же вещества, но в другом порядке, то такая реакция называется циклической:
АВСА
Параллельными реакциями называются такие, при которых
одно и то же исходное вещество одновременно участвует в нескольких простых реакциях:
АВ
153
АС
Химические реакции, в которых продукты одной реакции являются исходными веществами другой, называют последовательными:
АВС
Каскадными, или цепными, называют последовательнопараллельные реакции, в которых на каждом этапе происходит
увеличение числа молекул, участвующих в реакции:
А  2В  4А  8В
Наконец, реакции, включающие в себя большое число простых реакций разного типа, называют смешанными.
III.2. Скорость и порядок химической реакции
Скорость химической реакции определяется как количество
вещества, трансформирующегося (образующегося или расходующегося) в единицу времени в единице объема системы.
Иными словами, если мы имеем зависимость количества вещества A (или его концентрации) от времени, то скорость реакции v
в момент времени t будет представлять собой производную этой
зависимости dA/dt в данной временной точке. При этом для исходных веществ реакции скорость отрицательна (вещество расходуется), а для продуктов реакции она положительна (вещество накапливается в смеси).
Основной закон химической кинетики («закон действия
масс») вытекает из большого числа экспериментальных данных
и гласит: скорость реакции в каждый момент времени пропорциональна текущей концентрации реагирующих веществ, возведенных в некоторые степени. Математическая
формулировка основного закона будет выглядеть следующим
образом:
v  k[A] A [B] B ...[?] ?
n
n
n
(III.1).
Величина ni называется порядком реакции по веществу i.
Сумма порядков реакции по всем реагирующим веществам
называется общим порядком реакции.
Σni = общий порядок реакции
154
(III.2).
Для простых реакций показатели степеней ni в уравнении
(III.1) совпадают со стехиометрическими коэффициентами (то
есть являются целочисленными). Для сложных реакций частный
порядок может быть дробным, переменным, положительным,
отрицательным (в случае, если вещество является ингибитором). Коэффициент пропорциональности k называют константой
скорости реакции и по физическому смыслу он равен скорости
реакции при концентрациях реагирующих веществ, равных 1 М
(в этом случае v = k).
Практическое определение порядка реакции по данному веществу осуществляют следующим образом. В серии экспериментов при фиксированных концентрациях других веществ меняют концентрацию исследуемого вещества и измеряют
начальную скорость реакции, то есть скорость реакции при t,
стремящемся к нулю. В этом случае
vo  
d [ A] o
 k [ A] ao
dt
(III.3)
поскольку концентрации других веществ постоянны и входят,
таким образом, в константу скорости реакции. При логарифмировании правой и левой частей уравнения (III.3) получаем
log(vo )  log(k )  a log([A] o )
(III.4).
Отсюда следует, что построение экспериментальных данных
в координатах log(vo)/log([A]o) даст прямую с тангенсом угла
наклона, равному порядку реакции по веществу А, пересекающую ось ординат в точке, численно равной логарифму константы реакции k (рис. III.1).
Аналогичные серии экспериментов проводят и для других
участвующих в реакции веществ, после чего возможно определение кинетического порядка всей реакции и величины ее константы.
155
log(vo)
tg  = a
log k
log([A o])
Рис.III.1. Определение порядка реакции по веществу А из анализа начальных скоростей реакции.
Иногда в ходе реакции концентрации одного или нескольких
веществ остаются постоянными или приблизительно постоянными – каталитические реакции (концентрация катализатора
постоянна) или большой избыток одного из реагирующих веществ. Тогда соответствующие концентрационные множители
можно включить в константу и кажущийся порядок реакции
уменьшается. В таких случаях говорят о реакциях псевдо n-го
порядка, где n теперь – сумма показателей степеней при изменяющихся концентрациях. Например, расщепление сахарозы на
мономеры (инверсия) катализируется ионами водорода и резко
ускоряется в кислых средах. Формально реакцию можно записать как
С12Н22О11 + Н2О + Н+  2 С6Н12О6 + Н+
(III.5),
а соответствующее уравнение для скорости

d [C12 H 22 O11 ]
 k [C12 H 22 O11 ][H 2 O][H  ]
dt
156
(III.6),
и говорить о третьем порядке реакции. Однако концентрация
катализатора – ионов водорода – в ходе реакции не изменяется,
а концентрация воды в воде – 55.(5) М – намного больше концентраций растворенных в ней веществ. Таким образом, реально изменяется только концентрация сахарозы, то есть в эксперименте реакция оказывается псевдопервого порядка.
III.3. Обратимые реакции.
Схема обратимой мономолекулярной реакции может быть
записана в виде
Абсолютно понятно, что по истечении определенного времени скорости прямой и обратной уравняются, то есть
k1[A]р = k-1[B]р
(III.7)
Такое состояние системы называется равновесным (реакция
идет и в одну, и в другую сторону, но равновесная концентрация
веществ не меняется) и характеризуется константой равновесия, равной отношению констант прямой и обратной реакции.
Обратимые реакции играют важную роль в биохимии. В качестве примеров можно привести образование ферментсубстратных комплексов при ферментативных процессах, взаимодействия антиген-антитело, дупликация ДНК, лигандрецепторные взаимодействия и т.д. Характерной чертой таких
реакций является равновесие между скоростями образования и
распада комплекса между парой тех или иных реагентов. Схему
таких реакций принято представлять в виде
157
и константой равновесия часто называют константу диссоциации комплекса:
Kd 
k 1 [ A ] р [ B] р

k1
[ AB ] р
(III.8)
Как видно из уравнения (III.8), константа диссоциации имеет
размерность концентрации. Понятно, что чем меньше ее абсолютная величина, тем большая часть реагирующих компонентов
находится в виде комплекса. Иными словами, чем меньше величина константы диссоциации, тем более специфическим является взаимодействие реагирующих веществ.
В ряде случаев для характеристики обратимых взаимодействий в литературе используют константу ассоциации (Ka), являющуюся обратной величиной по отношению к константе диссоциации:
Ka 
(III.9)
1
k
 1
K d k 1
Размерность константы ассоциации – обратная концентрация, и возрастание ее абсолютной величины обозначает увеличение специфичности взаимодействий.
III.4. Параллельные реакции.
В параллельных реакциях одно и то же вещество образует
разные продукты (для простоты рассмотрим две параллельные
мономолекулярные реакции):
158
Изменение концентраций продуктов во времени записывается следующим образом:
[ B]  [ A ] o
k1
( k  k )t
[1  e 1 2 ]
k1  k 2
(III.10)
[C]  [ A ] o
k2
( k  k )t
[1  e 1 2 ]
k1  k 2
(III.11)
Отношение уравнений (III.10) и (III.11) представляет собой
простое выражение
[B]/[C] = k1/k2
Иными словами говоря, в любой момент времени отношение
концентраций двух продуктов будет одинаковым и определяется
отношением констант скоростей реакций. Именно этот факт на
практике используется для кинетического разделения оптически
активных изомеров биологически активных веществ при помощи
ферментов (см раздел 4.1).
III.5. Последовательные реакции.
Простейшую схему последовательной мономолекуярной реакции можно записать как
Изменение концентраций реагирующих веществ во времени
описываются следующим образом:
d[A]
  k1[A]
dt
159
 k [A] 
[ B]   1 o  e  k1t  e  k 2t
 ( k1  k 2 ) 


 [A] o 
( k 2  k1  k1e  k 2t  k 2 e  k1t )
[C]  
k

k
1 
 2
Анализируя полученные уравнения при изменении t от нуля
(начальный момент реакции) до бесконечности (окончание реакции) можно сказать следующее (рис.III.2). Концентрация вещества А монотонно убывает от величины [A]o до нуля. Концентрация вещества С возрастает от нуля до [C] = [A]o, но эта зависимость имеет сигмоидальный (S-образный) характер. Концентрация вещества В возрастает в начальный момент времени, проходит через максимум и затем падает до нуля. Можно
показать, что время достижения максимума концентрации вещества В (t[B],max = (1/(k2-k1))ln(k2/k1)) совпадает с точкой перегиба на
кривой для вещества С.
Концентрация
A
C
B
Время
Рис.III.2. Схематичное изменение концентраций исходного вещества А, промежуточного вещества В и конечного продукта С в
ходе последовательной реакции.
160
Следует подчеркнуть один момент. Если максимальная концентрация промежуточного вещества В зависит только от соотношения констант реакций q = k2/k1 (чем оно больше, тем меньше [B]max), то время достижения максимума зависит также от
разницы абсолютных значений констант. Уменьшение абсолютной разницы констант (k2-k1) при сохранении постоянства их отношения k2/k1 приводит к увеличению времени достижения [B]max
и «растягиванию» его во времени. Это означает, что концентрация промежуточного вещества В относительно долгое время
находится на уровне, близком к максимальному (рис.III.3). В
этом квазистационарном состоянии скорость образования вещества В приблизительно равна скорости его расходования и
скорость изменения его концентрации (то есть производная по
времени) может считаться равной нулю на протяжении относительно длительного временного промежутка. Именно на этой
основе был разработан важный, хотя и приблизительный, метод
кинетического рассмотрения сложных реакций – метод стационарных концентраций (см. раздел 3.1)..
0,18
3
Концентрация, доли
0,16
0,14
0,12
0,10
2
0,08
1
0,06
0,04
0,02
0,00
0
20
40
60
80
Время, с
Рис.III.3. Изменение концентрации промежуточного вещества В
в ходе последовательной реакции при q = 4. 1 – k1 = 0,05, k2 = 0,2 c1; 2 – k = 0,01, k = 0,04 c-1; 3 – k = 0,005, k – 0,02 c-1.
1
2
1
2
161
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии
ферментативного катализа. – М.: Высшая школа, 1977, 280 с.
2. Бертини И., Грей Г. Стифель Э. Валентино Дж. Биологическая
неорганическая химия пер. с англ., в 2-х т.). – М.: БИНОМ. Лаборатория
знаний, 2013.
3. Биохимия (под ред.
ГЭОТАР-МЕД, 2004, 784 с..
Северина
Е.С.).Учебник.
–
М.:
4. Биссвангер Х. Практическая энзимология (пер. с англ.) – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010, 328 с.
5. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология. Учебник. –
М.: Научный мир, 2019, 543 с..
6. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты (пер. с англ., в 3-х т.). – М.:
Мир, 1982.
7. Еремеев Н.Л., Зайцев С.Ю. Особенности кинетического
поведения
иммобилизованных
ферментов.
Учебнометодическое
пособие
(гриф
УМО).
–
М.:МГАВМиБ
им.К.И.Скрябина, 2007, 44 с.
8. Еремеев Н.Л., Зайцев С.Ю. Энзимология. Учебнометодическое пособие (гриф УМО). - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ
им.К.И.Скрябина, 2008, 34 с.
9. Еремеев Н.Л., Зайцев С.Ю. Кинетика и термодинамика
ферментатиных реакций. Учебное пособие (гриф УМО). - М.:
ФГОУ ВПО МГАВМиБ им.К.И.Скрябина, 2008, 43 с.
10. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия (пер. с англ.).
– М.: Лаборатория знаний, 2020, 509 с.
11. Лысенко Л.А., Немова Н.Н., Канцерова Н.П. Протеолитическая
регуляция биологических процессов. – Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2011, 482 с.
12. Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера (пер. с
англ., в 3- т) – М.: Лаборатория знаний, 2017.
13. Плакунов В.К. Основы энзимологии. Учебник. – М.: Логос,
2001, 127 с.
14. Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия (пер. с нем.). – М.: Лаборатория знаний, 2020, 324 с.
15. Хиггинс К. Расшифровка клинический лабораторных анализов (пер. с англ.) – М.: Лаборатория знаний, 2021, 592 с.
162
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Общие сведения о ферментах……………………………………..
1.1. Эффективность и специфичность действия…………………..
1.2. Классификация ферментов……………………………………….
1.3. Строение ферментов………………………………………………
1.4. Небелковые компоненты ферментов…………………………...
Вопросы для самоконтроля……………………………………………
2. Выделение, очистка и физико-химическая характеризация
ферментов………………………………………………………………….
2.1. Предобработка биологического материала……………………
2.2. Хроматографические методы очистки белков………………...
2.3. Дополнительные процедуры при выделении белков………...
2.4. Контроль качества очистки (гель-электрофорез)……………..
2.5. Идентификация белков……………………………………………
2.6. Методы определения активности ферментов…………………
Вопросы для самоконтроля……………………………………………
3. Ферментативная кинетика…………………………………………..
3.1. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Дифференциальная форма уравнения Михаэлиса-Ментен………
3.2. Влияние обратимых эффекторов на скорость ферментативной реакции………………………………………………..
3.2.1. Полное обратимое ингибирование………………………….
3.2.2. Активация и неполное ингибирование ферментативных
реакций………………………………………………………………………
3.2.3. Субстратное ингибирование и активация. Аллостерические эффекты………………………………………………
3.3. Инактиваторы ферментов………………………………………...
3.4. Интегральная форма уравнения Михаэлиса-Ментен………..
3.5. Влияние рН на скорость ферментативных реакций………….
3.6. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции…………………………………………………………………….
3.7. Регуляция активности ферментов в живой природе…………
Вопросы для самоконтроля……………………………………………
4. Промышленная энзимология………………………………………
4.1. Липазы в промышленных технологиях…………………………
4.2. Ферменты в анализе……………………………………………….
4.3. Методы иммобилизации ферментов……………………………
4.3.1. Физическое включение………………………………………..
4.3.2. Адсорбция……………………………………………………….
4.3.3. Ковалентная иммобилизация………………………………..
4.4. Особенности кинетического поведения иммобилизованных
ферментов…………………………………………………………………..
Вопросы для самоконтроля……………………………………………
163
5
5
8
11
13
16
17
17
18
23
23
25
27
36
37
37
47
49
55
57
64
67
73
77
81
85
86
87
93
96
98
103
104
111
128
5. Ветеринарно-медицинская энзимология………….…………….
5.1. Энзимопатология…………………………………………………..
5.2. Энзимодиагностика………………………………………………...
5.3. Энзимотерапия……………………………………………………..
Вопросы для самоконтроля……………………………………………
Приложение I. Ключ к номенклатуре ферментов……………………
Приложение II. Протеиногенные аминокислоты…………………….
Приложение III. Базовые определения и закономерности химической кинетики………………………………………………….…………
Библиографический список…………………………………………….
164
129
129
134
137
140
141
151
153
162