УДК 54.062
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА КОНТРОЛЯ
«РАЗВЕТВЛЕННОГО ОЛИГОГЕКСАМЕТИЛЕНГУАНИДИН
ГИДРОХЛОРИДА» В ГЛАЗНЫХ КАПЛЯХ НА ЕГО ОСНОВЕ.
Д.О. Шаталов 1,2*+, С.А.Кедик1,2, А.В. Панов1,2, И.П. Седишев1,2,
В.В. Суслов1,2, Ю.А. Котова3, Д.В. Александрова1, И.С. Иванов1
Московский государственный университет
технологий им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
1
тонких
химических
ЗАО «Институт фармацевтических технологий», 119571, Россия,
Москва, пр. Вернадского, д.86, БМиФТ,
2
Тел/факс: +7(495)936-88-01, +7 (916)4011488. E-mail: [email protected]
ФГБУ
«Гематологический
научный
здравоохранения РФ» Москва, Россия
3
центр
министерства
*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку
В качестве эффективного препарата для терапии вирусных офтальмологических заболеваний
предложены глазные капли на основе биоцидной фармацевтической субстанции «разветвленный
олигогексаметиленгуанидин гидрохлогид». Проведена оценка возможности использования метода
Кьельдаля для количественного определения разветвленного олигогексаметиленгуанидин гидрохлорида
по содержанию азота.
It was offered eye drops based on "branched oligohexamethyleneguanidine hydrochloride" as an effective drug for
the treatment of viral ophthalmic diseases. The possibility of using the Kjeldahl method for the quantitative
determination of branched oligohexamethyleneguanidine hydrochloride was evaluated
Ключевые слова: олигогексаметиленгуанидина гидрохлорид, глазные капли, метод Кьельдаля,
определение основного вещества.
ВВЕДЕНИЕ
Патологии глаз являются серьёзными заболеваниями современного
человека. Каждые 5 секунд в мире слепнут один взрослый человек и один
ребёнок. Одними из основных причин слепоты являются глаукома и
катаракта [1-3]. С другой стороны, одной из важных причин временной
нетрудоспособности (80% от общего числа заболеваний глаз) являются
инфекционные заболевания глаз. Инфекции могут вызывать тяжёлые
осложнения, в том числе слепоту (до 30% инфекционных заболеваний) [4, 5].
В зависимости от локализации инфекционного агента, выделяют
следующие основные клинические формы глазных инфекций [6, 7]:
конъюнктивит (66.7% от общего числа воспалительных заболеваний глаз),
блефарит (23.3%), воспалительные поражения роговицы, внутреннего глаза
(4.2%), невриты (5.8%). Наиболее частыми возбудителями бактериальных
инфекций
глаз
дакриоцистит)
(конъюнктивит,
являются
изъявление
возбудители
роговицы,
Staphylococcus,
блефарит,
Streptococcus,
Pneumococcus, Pseudomonas aeruginosa [8].
Эффективность многих существующих медикаментозных средств для
лечения заболеваний глаз не всегда высока [9], поэтому актуальны поиск и
разработка новых биоцидных лекарственных препаратов, ориентированных
на решение данной проблемы.
Среди биоцидных материалов нового поколения особый интерес
вызывают олиго- и полимерные биоциды [10], в частности олиго- и
полигуанидины – вещества, содержащие в своем составе гуанидиновые
фрагменты. Обладая высокой эффективностью действия по отношению к
возбудителям вирусных инфекций и грибковых заболеваний [10], в
сочетании с низкой токсичностью для животных и человека, олиго- и
полигуанидины представляют собой перспективные компоненты препаратов
для лечения вирусных и инфекционных заболеваний. Специалистами ЗАО
«Институт Фармацевтических Технологий» была разработана технология
получения фармацевтической субстанции – разветвленного гидрохлорида
олигогексаметиленгуанидина (ОГМГ-ГХ) [11-13]:
II
II
CH2
R
CH2
I
CH2
III
NH IV
C
CH2
III
CH2
CH2
III
II
CH2
NH
I
CH2
I
CH2
CH2
I
NH
где R представляет собой
n1
III
CH2
CH2
II
II
CH2
CH2
I
NH IV
C
II
CH2
NH
CH2
III
R
CH2
I
NH
n
2
N
''
C IV
NH
CH2
III
NH
II '
CH2 III ' NH2
CH2
CH2
I
II
CH2
I
CH2
III
CH2
CH2
II
или
CH2
I
Z
II
R
CH2
NH IV NH
CH2
CH2
CH2
C
I
III
III
NH
n
3
II
CH2
CH2
I
NH
CH2
III
NH2
C
IV '
NH
На основе данной субстанции изготовлена рецептура лекарственного
средства для лечения заболеваний глаз в форме капель.
Одной из важнейших характеристик фармацевтических препаратов
является содержание основного вещества. В опубликованных ранее
материалах [14] освещалась проблема определения содержания основного
действующего вещества в используемой фармацевтической субстанции
известными
методами
[15],
в
результате
чего
был
разработан
альтернативный рефрактометрический метод анализа ОГМГ-ГХ. Данный
метод позволяет определить вещество в концентрациях 20 – 40%, что делает
его неприменимым для анализа рецептур глазных капель на основе ОГМГГХ, которые содержат его в намного меньших концентрациях (от 0.05%).
Одним
из
наиболее
известных
и
распространенных
методов
количественного определения азота в органических соединениях, к которым
относится и ОГМГ-ГХ, является метод Кьельдаля [16]. Данный метод
позволяет с высокой точностью определять малые концентрации азота в
органических веществах, где азот связан с углеродом или водородом. В
связи
с
этим,
целью
данной
работы
была
оценка
возможности
использования метода Кьельдаля для количественного определения
сравнительно низких концентраций разветвленного ОГМГ-ГХ в глазных
каплях на его основе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Основным объектом исследования был разработанный состав глазных
капель на основе ОГМГ-ГХ для лечения инфекционных заболеваний глаз.
Состав
содержит
ОГМГ-ГХ
вспомогательные
вещества:
в
количестве
1.0
мг/мл,
фосфатный
буферный
а
также
раствор,
гидроксипропилметилцелюлозу и воду для инъекций.
Для анализа использовали дигестор DKL 8 (VELP Scientifica) с
набором колб для сжигания, полуавтоматический дистиллятор UDK 139
(VELP Scientifica) и прибор для титрования: Titroprocessor, Model 686,
Metrohm. Определение количества азота в препарате проводили в
соответствии со стандартной методикой [16].
Исходя
из
того,
что
количество
анализируемого
вещества
пропорционально содержанию в нем азота, коэффициент пересчета К для
ОГМГ-ГХ составляет:
K
177
4.2143
42
(1)
где 177 – эквивалентная масса мономерного звена ОГМГ-ГХ, г/экв;
42 – эквивалентная масса трех атомов азота в звене ОГМГ-ГХ, г/экв.
Содержание ОГМГ-ГХ (С) в препарате (мг/мл) определяли по формуле:
С
W
*K
А
(2)
где А – объем пробы глазных капель, мл;
К – коэффициент пересчета для ОГМГ-ГХ;
W - количество азота в мг.
Валидацию и оценку результатов проводили по параметрам и
критериям указанным в руководстве [17]; соответствующие требования
приведены в табл.1:
Таблица 1. Требования предъявляемые к валидации способа
количественного определения ОГМГ-ГХ по азоту
с помощью метода Къельдаля
Параметр валидации
Линейность
Критерии приемлемости
Коэффициент корреляции ≥ 0.990
Фактор отклика: среднее значение 97.5-102.5%.
Правильность
Коэффициент вариации ≤2.0%.
Доверительный интервал должен включать
100% значение
Прецизионность по
Серия 1: коэффициент вариации ≤ 1.5
параметру повторяемости
(количество измерений n≥6)
Правильность оценивали методом добавок [17]: к пробе, содержащей
навеску 70% ОГМГ-ГХ от его содержания в препарате, и вспомогательные
вещества в применяемых концентрациях, добавляют навеску субстанции,
доводя концентрации анализируемого образца до 80%, 100% и 120%.
Общий объём одной пробы при этом составлял 100 мл.
Для оценки прецизионности использовали шесть проб лекарственного
препарата, объемом 10 мл каждая.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Линейность
методики
[17]
оценивали
путем
установления
зависимости между концентрацией анализируемого вещества и объемом
титранта, израсходованным при определении азота методом Къельдаля.
Результаты соответствующего исследовании представлены в табл.2.
Таблица 2. Линейность количественного определения ОГМГ-ГХ
по азоту с помощью метода Къельдаля
Концентрация ОГМГ- Концентрация ОГМГ-ГХ
Объем 0.05 М
Гх в образце, %
в модельной смеси, мг/мл
раствора Н2SO4, мл
80
0.80
1.39
80
0.81
1.41
90
0.89
1.55
90
0.90
1.57
100
1.00
1.74
100
1.01
1.76
110
1.11
1.90
110
1.10
1.85
120
1.20
2.05
120
1.21
2.00
Статистические характеристики
Результаты
Уравнение прямой
y=1.5045x+0.209
Наклон a
1.5045
Отрезок на оси ординат b
0.209
Коэффициент корреляции r
0.992
Рассчитанное значение
коэффициента корреляции удовлетворяет
критерию приемлемости, что подтверждает линейность метода.
Для определения правильности проводили девять испытаний (табл.3)
с образцами содержащими ОГМГ-ГХ, в соответствии с требуемым
уровнем
концентраций.
характеристик
Полученные
соответствуют
значения
предъявленным
статистических
требованиям,
что
удовлетворяет критерию правильности.
Прецизионность
(повторяемости),
определяли
результаты
по
представлены
параметру
в
табл.4.
сходимости
Коэффициент
вариации составляет 1.0%; поскольку для удовлетворения параметру
повторяемости его значение должно составлять ≤ 1.5% (при n≥ 6),
разработанная методика данному критерию удовлетворяет.
Таблица 3. Правильность количественного определения ОГМГ-ГХ
по азоту с помощью метода Къельдаля.
Концентрация
ОГМГ-Гх
в образце, %
80
Навеска
Объем
Содержание
ОГМГ-ГХ, 0.05 М раствора
ОГМГ-ГХ, мг
Отклик
мг
Н2SO4, мл
определенное
заданное
80.2
13.937
79.0
80.2
98.5
80.0
13.972
79.2
80.0
99.0
80.1
13.853
78.5
80.1
98.0
100
99.8
17.413
99.4
99.8
99.6
100.2
17.510
100.0
100.2
99.8
100.2
17.350
99.0
100.2
98.8
120
119.6
20,897
118.9
119.6
100.3
120.3
20.967
120.3
120.3
100.0
120.0
20.407
117.0
120.0
97.5
Статистические характеристики
Результаты, %
Среднее значение
99.05
Стандартное отклонение
0.95
Коэффициент вариации
0.95
Верхняя граница доверительного интервала (P=95%)
100.25
Нижняя граница доверительного интервала (P=95%)
97.85
Таблица 4. Повторяемость количественного определения ОГМГ-ГХ
по азоту с помощью метода Къельдаля
Обозначение
Объем 0.05 М раствора
проб в анализе
Н2SO4, мл
1
2.32
2
2.36
3
2.29
4
2.33
6
2.30
Статистические характеристики
Наименьшая концентрация, мг/мл
Наибольшая концентрация, мг/мл
Средняя концентрация, мг/мл
Стандартное отклонение, мг/мл
Коэффициент вариации, %
Содержание ОГМГ-ГХ
в препарате мг/мл
1.06016
1.07368
1.05252
1.07604
1.0584
Результаты
1.05252
1.07604
1.06416
0.01
1.0%
Доверительный интервал (P=95%), мг/мл
+ 0,41
Выводы
Проведена
валидация количественного определения ОГМГ-ГХ по
азоту с помощью метода Къельдаля, по параметрам линейность и
правильность, а также прецизионность по параметру сходимости
(повторяемости). Проведенные исследования показывают возможность
использования метода Кьельдаля для стандартизации глазных капель на
основе
фармацевтической
субстанции
«разветвленный
олигогексаметиленгуанидин гидрохлогид» по параметру «определение
основного вещества».
Список литературы
1. Баргинов
Н.А.
Проблемы
катарактогеноза
Офтальмологический журнал -2000. - № 6. - C.98-102.
2. Волков Г.Г. Глаукома при псевдо нормальном
врачей// М. Медицина, 2001.- 300с.
обзор
лит.//
давлении. Рук. Для
3. Здравоохранение в России. 2009: Стат. Сб.-М.: Росстат, 2009 .- 365с
4. Майчук
Ю.Ф.
Терапия
инфекционных
заболеваний
Офтальмологический журнал, 1996. - № 4. - C.193-202
глаз//
5. Майчук Ю.Ф. Неизвестная эпидемия: герпес// Glaxo Wellcome.
Смоленск, 1997. - C. 62 - 74.
6. Майчук Ю.Ф. Лекарственная терапия бактериальных конъюнктивитов
и кератитов// Consilium medicum, 2005. - Т.4. - №.3. - C. 24-29.
7. Timothy L. Besifloxacin: a novel anti-infective for the treatment of bacterial
conjunctivitis / Timothy L. [et al.] // Clinical Ophthalmology, - 2010 – Vol.
4. - P. 215 – 225.
8. Sun X. Microbiological analysis of chronic dacryocystitis / Sun X. et al.//
Ophthal Physiol Optics, - 2005 - V. 25. - N3. - P.261–263
9. Белоусов Ю.Б. Антибиотикотерапия сегодня / Белоусов Ю.Б / /Вопросы
врачебной практики, 2010. - № 9 . C. 54-57.
10. Cornelia Pasberg-Gauhl. A need for new generation antibiotics against
MRSA resistant bacteria.// Drug discovery today: Technologies. 2014.
Vol.11. pp 109-116
11. Кедик С.А., Седишев И.П., Панов А.В., Жаворонок Е.С., Ха Кам Ань
Разветвленные олигомеры на основе производного гуанидина и
содержащее их дезинфицирующее средство. Пат. РФ 2443684 С1. –
A61L2/16, 13.12.2010 – 27.02.2012.
12. Кедик С. А., Панов А. В., Сакаева И. В., Седишев И. П., Черта Ю. В.
Дезинфицирующее средство, содержащее разветвленные олигомеры на
основе производного гуанидина, и его применение в водоочистке. Пат.
РФ 2461611 С1.– C07C279/00, 21.06.2011-20.09.2012.3.
13. Кедик С.А., Бочарова О.А., Ха Кам Ань, Панов А.В., Седишев И.П.,
Жаворонок Е.С., Тимофеева Т.И., Суслов В.В., Бексаев С.Г. Структура
и
молекулярно-массовые
характеристики
гидрохлоридов
олигогексаметиленгуанидинов// Химико-фармацевтический журнал.
2010. Т.44, №10. – С.40-45.
14. Кедик С.А., Шаталов Д.О., Еремин Д.В., Седишев И.П., Суслов В.В.,
Панов А.В. Альтернативный метод определения разветвленного
олигогексаметиленгуанидин гидрохлорида// Тезисы докладов V
молодежная научно-техническая конференция«наукоемкие химические
технологии-2013» Москва МИТХТ 2013 С 54.
15. Воинцева И.И., Гембицкий П.А. Полигуанидины – дезинфекционные
средства и полифункциональные добавки. - М: ЛКМ-пресс. 2009. С.36-48.
16. Государственная фармакопея ХІІ издания. Т.1. М: Научный центр
экспертизы средств медицинского применения, 2008. – С.101.
17. Береговых В.В. Валидация аналитических методик для производителей
лекарств// - М.: Литтерра, 2008 с 66-126
UDC 54.062
Development and validation of the method to control eye drops
based on "branched oligohexamethyleneguanidine hydrochloride".
D.O. Shatalov 1,2*+, S.A.Kedik 1,2, A.V. Panov 1,2, I.P. Sedishev 1,2,
V.V. Suslov1,2, J.A. Kotova3, D.V. Aleksandrova1, I.S. Ivanov1
1
M.V. Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies
2
CJSC "Institute of Pharmaceutical Technologies", Moscow, Russia
It was offered eye drops based on "branched oligohexamethyleneguanidine hydrochloride" as an effective drug for
the treatment of viral ophthalmic diseases. The possibility of using the Kjeldahl method for the quantitative
determination of branched oligohexamethyleneguanidine hydrochloride was evaluated
Ключевые слова: олигогексаметиленгуанидина гидрохлорид, глазные капли, метод Кьельдаля,
определение основного вещества.
Keywords: oligohexamethyleneguanidine hydrochloride, eye drops, the quantitative determination of the basic
substance
Address for correspondence: [email protected] (Shatalov Denis Olegovich)
