Лекция 3
Основы световой
микроскопии
Световая микроскопия
- раздел микроскопии, который
основывается на законах
геометрической оптики и
волновой теории образования
изображения.
- в качестве освещения
используются естественный или
искусственные источники света.
Микроскоп и его составные части
1. Окуляр
2. Устройство смены
объективов
3. Объектив
4. Винт грубой настройки
5. Винт тонкой настройки
6. Предметный столик
7. Зеркало
8. Диафрагма и конденсор
Основные функциональные части
микроскопа
1 — осветительная
3
2 — воспроизводящая
2
3 — визуализирующая
1
Основные функциональные части
микроскопа
1. Осветительная часть
источник света (лампа и электрический блок питания) и оптикомеханическая система (коллектор, конденсор, полевая и
апертурная регулируемые/ирисовые диафрагмы).
2. Воспроизводящая часть
объектив и промежуточная оптическая система
3. Визуализирующая часть
монокулярная, бинокулярная или тринокулярная визуальная
насадка с наблюдательной системой (окулярами, которые
работают как лупа), системы дополнительного увеличения,
проекционные насадки, в том числе дискуссионные для двух и
более наблюдателей, рисовальные аппараты, системы анализа
и документирования изображения с соответствующими
адаптерными элементами.
Конструктивно-технологические
части микроскопа
• оптическая
• механическая (основание и тубусодержатель)
• электрическая
ОСВЕТИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА МИКРОСКОПА ПРОХОДЯЩЕГО
СВЕТА ВКЛЮЧАЕТ СЛЕДУЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ:
- источник света — галогенную лампу с нитью накала
определенного габаритного размера (определяет
максимальное линейное поле, которое может быть
равномерно освещено. Размер определяется
мощностью лампы, что в свою очередь связано с
габаритными размерами основания и теплообмена в
нем. Перечисленные параметры определяют класс
микроскопа по соотношению «цена — качество»;
- коллектор — оптический элемент, расположенный
вблизи источника света и предназначенный для
увеличения размера светящегося тела, что создает
световой поток, «заполняющий» осветительную
апертуру конденсора или выходной зрачок объектива.
- конденсор — оптический узел, обеспечивающий
необходимый по размеру и качеству световой поток, а
также настройку освещения в соответствии с
принципами Келера.
Световой поток, создаваемый конденсором,
обеспечивает как равномерное освещение поля на
предмете, так и световой конус, называемый
осветительной числовой апертурой, равный
числовой апертуре объектива.
Между осветительной системой, заканчивающейся
конденсором, и воспроизводящей оптической системой,
начинающейся с объектива, расположена плоскость
предмета, на которую устанавливается препарат (объект
наблюдения и исследования).
Между объективом и окуляром находится плоскость
изображения, расположенная на строго фиксированном
расстоянии, определенное понятием «длина тубуса»
микроскопа.
Заключительной в оптической схеме микроскопа проходящего
света является визуализирующая система, состоящая из
тубусной системы («система Оптовар») и окуляров.
Тубусная система — это промежуточная оптическая система,
которая обеспечивает проекцию изображения, создаваемого
объективом, рассчитанным на «бесконечность», в плоскость
изображения.
ПРИНЦИП: параллельный пучок света, выходящий из
объектива, тубусная система «превращает» в сходящийся
пучок и обеспечивает формирование изображения для
последующей проекции его с помощью окуляра на сетчатку
глаза наблюдателя.
Поколение микроскопов 60-70-х г.г. - длина тубуса была
«конечной» и определенной (160 мм), тубусная система
выполняла роль системы «Оптовар» и имела увеличение
большее или меньшее 1х.
В новых микроскопах, рассчитанных на длину тубуса
«бесконечность» - маркировка на бинокулярной насадке «∞».
В случае объективов
установленных на
бесконечность увеличение
микроскопа равно
произведению увеличений
окуляра и объектива
Принципы получения
изображения
Объектив дает действительное перевернутое
изображение предмета,
помещаемого несколько дальше
фокусного расстояния.
Это изображение увеличивается
при помощи окуляра, действующего как лупа.
Получаемое изображение рассматривают
на расстоянии наилучшего видения.
Таким образом, в отличие от лупы, микроскоп имеет, как минимум, две ступени увеличения.
Принципиальная
оптическая схема
микроскопа
Увеличение микроскопа :
Г =250 t / F1 F2, где
t – оптическая длина
тубуса, т.е. расстояние
между ближайшими друг к
другу фокусами
объектива и окуляра,
250 – это расстояние
наилучшего видения,
F –фокусные расстояния
объектива и окуляра
соответственно.
Теория получения изображения
Аббе
полное изображение объекта,
воспроизводимое с помощью
микроскопа, получается в процессе
наложения двух изображений,
которые сформированы за счет
явлений дифракции (первичное
изображение) и интерференции
(вторичное изображение) светового
потока, прошедшего через объект.
Теория получения изображения
Аббе
интерференция
рассеяние
Источник
образец
света
объектив
В т.ч. за счет дифракции
Плоскость
первичного
изображения
Это
первичное
изображение
Основные формулы микроскопии
• Увеличение объектива. При конечной длине тубуса
(например, 160 мм) увеличение объектива является
исходным и определяется следующим образом:
Гоб = Д.Т. /Fo6=160/Fo6,
где Д.Т. — механическая длина тубуса,
Fоб — фокусное расстояние объектива.
• Определяющим для расчета увеличения объектива,
скорректированного на «бесконечность», является
фокусное расстояние тубусной линзы или системы и
фокусное расстояние самого объектива: Гоб = Fт.л. / Fоб ,
где Fт.л. — фокусное расстояние тубусной линзы
(выполняется если фокусное расстояние вспомогательной
линзы равно 250 мм).
• Увеличение окуляра определяется по формуле:
ГoK = 250/Fок
где 250 — расстояние наилучшего видения в мм,
Fok — фокусное расстояние окуляра.
• Общее увеличение микроскопа определяется
произведением увеличений объектива и окуляра. Если
между ними расположена одна или несколько
увеличивающих систем, то общее увеличение микроскопа
равно произведению значений увеличений всех оптических
систем, включая промежуточные.
• Поле на предмете – реальная
рассматриваемая область препарата.
Поле на предмете рассчитывается с
учетом линейного поля окуляра и
увеличения объектива, а также
дополнительных оптических
элементов, которые имеют увеличение
и расположены до окуляра внутри
микроскопа.
Числовая апертура
•
Апертура (лат. apertura — отверстие) — в
оптике действующее отверстие оптической
системы, определяемое размерами линз или
диафрагмами.
•
Апертурный угол — угол между крайним лучом
конического светового пучка, входящего в
систему и оптической осью системы
•
Числовая апертура — равна произведению
показателя преломления среды между
предметом и объективом на синус апертурного
угла. Именно эта величина наиболее полно
определяет одновременно светосилу,
разрешающую способность и угловое поле
зрения объектива. Для увеличения числовой
апертуры объективов в микроскопии
пространство между объективом и покровным
стеклом заполняют иммерсионной жидкостью.
А = n sin(θ/2)
Влияние числовой апертуры на
качество изображения
Объектив с
достаточной
апертурой (видны
отдельные клетки)
Объектив с низкой
апертурой
(недостаточная
апертура объектива )
Числовая апертура определяет ряд важнейших свойств микроскопа: яркость
изображения, «проникающую» и «отображающую» способности.
Чем больше числовая апертура, тем более мелкие подробности в
состоянии воспроизводить объектив.
Числовая апертура и полезное
увеличение микроскопа
Полезное увеличение микроскопа должно быть не более
1000 числовых апертур объектива и не менее 500:
500Аоб < Гм < 1000 Аоб, где
Аоб — числовая апертура объектива.
При большем увеличении изображение становится
нечетким и малоконтрастным, с пониженной
разрешающей способностью;
при меньшем увеличении — изображение объекта,
несмотря на четкость и повышенный контраст,
становится настолько мелким, что элементы объекта
практически неразличимы.
В повседневной практике обычно используют увеличение
порядка 630—900 х.
Разрешающая способность
микроскопа
Числовая апертура объектива,
конденсор и длины волны света,
которым освещается препарат,
определяют разрешающую
способность микроскопа минимальное расстояние, на котором
оптика микроскопа может различить
раздельно две близко расположенные
точки.
Предел разрешения оптических
приборов
Предел разрешения в оптических приборах
определяется
волновыми свойствами света.
По дифракционной теории образования
изображения в световом микроскопе Аббе
нельзя видеть объекты меньше
полудлины волны и нельзя получить
изображение меньше полудлины волны
Таким образом, предел разрешения световых
микроскопов 0,2 мкм
Объективы. Классификация объективов
• Объективы микроскопа - оптические системы,
предназначенные для построения
микроскопического изображения в плоскости
изображения с соответствующим увеличением,
разрешением элементов, точностью
воспроизведения по форме и цвету объекта
исследования.
• Объектив состоит из фронтальной и последующей
частей. Фронтальная линза (или система линз)
обращена к препарату и является основной при
построении изображения соответствующего
качества, определяет рабочее расстояние и
числовую апертуру объектива.
•
Последующая часть обеспечивает требуемое
увеличение, фокусное расстояние и качество
изображения, а также определяет высоту
объектива и длину тубуса микроскопа.
Аберрации объективов
• Аберрации оптической системы - несовершенство
изображения, которое вызывается отклонением лучей
света от пути, по которому они должны были бы
следовать в идеальной (абсолютной) оптической
системе.
• Свет от всякого точечного источника, пройдя через
идеальный объектив, должен был бы формировать
бесконечно малую точку на плоскости матрицы или
плёнки. На деле этого, естественно, не происходит, и
точка превращается в пятно рассеяния.
• Различают монохроматические аберрации, присущие
лучам света с любой длиной волны, и хроматические,
зависящие от длины волны, т.е. от цвета.
Ход световых лучей в идеальной линзе
Ход лучей при сферической аберрации
лучи света, проходящие через линзу вблизи её края,
преломляются сильнее, чем лучи, проходящие через центр,
точка фокусируется в виде размытого по краям пятна,
и всё изображение оказывается нерезким.
Коматическая аберрация или кома возникает,
когда лучи света проходят через линзу под
углом к оптической оси.
В результате изображение точечных
источников света приобретает по краям кадра
вид ассиметричных пятен каплеобразной (или
кометообразной) формы.
Астигматизм - ассиметричное растягивание
пятна нерезкости. Астигматизм заметен по
краям изображения, но не в его центре.
Меридиональный фокус.
При попытке достичь компромисса
мы получаем универсально нерезкое
изображение.
Сагиттальный фокус.
Исходное изображение без
астигматизма.
Для исправления астигматической разности меридионального и
сагиттального фокусов требуется не менее трёх элементов (обычно
два выпуклых и один вогнутый).
Классификация объективов
По принципу расчетного качества изображения
Ахроматические объективы – для применения в
спектральном диапазоне 486—656 нм. Исправление любой
аберрации (ахроматизация) выполнено для 2-х длин волн.
• устранены сферическая аберрация, хроматическая
аберрация, астигматизм. Изображение объекта имеет
несколько синевато-красноватый оттенок.
Апохроматические объективы - имеют расширенную
спектральную область, и ахроматизация выполняется для
3-х длин волн. При этом, кроме хроматизма положения,
сферической аберрации, комы и астигматизма,
достаточно хорошо исправляются также вторичный
спектр и сферохроматическая аберрация, благодаря
введению в схему линз из кристаллов и специальных
стекол. По сравнению с ахроматами, эти объективы
обычно имеют повышенные числовые апертуры, дают
четкое изображение и точно передают цвет объекта.
Микрофлюары - современные объективы, обладающие
промежуточным качеством изображения —
полуапохроматы.
Планобъективы - для исправления
кривизна изображения по полю, что
обеспечивает резкое изображение
объекта по всему полю наблюдения.
Планобъективы обычно применяются при
фотографировании.
Экономичные объективы - объективы с
улучшенным качеством изображения по
полю для рутинных и рабочих
микроскопов: ахростигматы (фирма
LEICA), СР-ахроматы и ахропланы (фирма
CARL ZEISS), стигмахроматы (фирма
ЛОМО).
Классификация объективов
По параметрическим признакам
1.
2.
3.
4.
5.
6.
объективы с конечной длиной тубуса и объективы,
скорректированные на бесконечность;
объективы малых (до 10х); средних (до 50х) и больших
(более 50х) увеличений, а также объективы со
сверхбольшим увеличением (свыше 100 х);
объективы малых (до 0,25), средних (до 0,65) и больших
(более 0,65) числовых апертур, а также объективы с
увеличенными (по сравнению с обычными) числовыми
апертурами;
объективы с увеличенными рабочими расстояниями, а
также с большими и сверхбольшими рабочими
расстояниями;
объективы нормального линейного поля (до 18 мм);
широкопольные объективы (до 22,5 мм);
сверхширокопольные объективы (более 22,5 мм);
объективы стандартные (45 мм, 33 мм) и нестандартные
по высоте.
Классификация объективов
По обеспечению методов исследования и
контрастирования
1. объективы, работающие с покровным и без
покровного стекла;
2. объективы проходящего и отраженного
света; люминесцентные объективы;
поляризационные объективы; фазовые
объективы; объективы DIC; эпиобъективы;
3. иммерсионные и безиммерсионные
объективы.
Окуляры. Классификация
окуляров
Окуляры - оптические системы, предназначенные
для построения микроскопического изображения на
сетчатке глаза наблюдателя.
В общем виде окуляры состоят из двух групп линз:
глазной — ближайшей к глазу наблюдателя — и
полевой — ближайшей к плоскости, в которой
объектив строит изображение рассматриваемого
объекта.
Окуляры классифицируются по тем же группам
признаков, что и объективы
Классификация окуляров
•
окуляры компенсационного (К) и
безкомпенсационного действия;
•
окуляры обычные и плоского поля (PL);
•
окуляры широкоугольные (с окулярным
числом более 180); сверхширокоугольные (с
окулярным числом более 225);
•
окуляры с вынесенным зрачком для работы
в очках и без;
•
окуляры для наблюдения, проекционные,
фотоокуляры, гамалы;
•
окуляры с внутренней наводкой и без нее.
Классификация конденсоров
1.
2.
3.
4.
5.
конденсоры по качеству изображения и типу
оптической коррекции делятся на
неахроматические, ахроматические,
апланатические и ахроматическиеапланатические;
конденсоры малой числовой апертурой (до 0,30),
средней числовой апертуры (до 0,75), большой
числовой апертуры (свыше 0,75);
конденсоры с обычным, большим и сверхбольшим
рабочим расстоянием;
обычные и специальные конденсоры для
различных методов исследования и
контрастирования;
по конструкции конденсора — единая, с
откидным элементом, со свинчивающимся
фронтальным элементом.
Специальные виды конденсоров
• Конденсор Аббе — не исправленный по качеству изображения
конденсор, состоящий из 2-х неахроматических линз: одной —
двояковыпуклой, другой — плосковыпуклой, обращенной к
объекту наблюдения (плоская сторона этой линзы направлена
вверх). Апертура конденсора А= 1,20. Имеет ирисовую
диафрагму.
• Апланатический конденсор — конденсор, состоящий из трех
линз, расположенных следующим образом: верхняя линза —
плосковыпуклая (плоская сторона направлена к объективу),
далее следуют вогнуто-выпуклая и двояковыпуклая линзы.
Исправлен в отношении сферической аберрации и комы.
Апертура конденсора А = 1,40. Имеет ирисовую диафрагму.
• Ахроматический конденсор — конденсор, полностью
исправленный в отношении хроматической и сферической
аберрации.
• Конденсор темного поля — конденсор, предназначенный для
получения эффекта темного поля. Может быть специальным
или переделан из обычного светлопольного конденсора путем
установки в плоскости ирисовой диафрагмы конденсора
непрозрачного диска определенного размера.
