На правах рукописи
ЧЖУН СИНЬ
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ
БАКТЕРИЙ Pseudomonasaeruginosa
06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология,
эпизоотология, микология с микотоксикологией
и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
МОСКВА 2015
Работа выполнена на кафедре «Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО
«Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ
ВПО «МГУПП») Министерства образования и науки РФ
Научный руководитель:
Ленченко Екатерина Михайловна,
доктор ветеринарных наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Московский государственный
университет пищевых производств»,
профессор кафедры «Ветеринарная медицина»
Официальные оппоненты:
Куликовский Александр Витальевич,
Заслуженный деятель науки РФ,
доктор ветеринарных наук, профессор
ФГБУ «Всероссийский государственный
центр качества и стандартизации
лекарственных средств для животных и
кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), Главный
научный сотрудник лаборатории
«Молекулярной биологии»
Кондакова Ирина Анатольевна,
кандидат ветеринарных наук, доцент
ФГБОУ ВПО «Рязанский государственный
агротехнологический университет имени
П.А. Костычева» (ФГБОУ ВПО «РГАТУ»),
Заведующая кафедрой «Эпизоотологии,
микробиологии и паразитологии»
Ведущая организация:
ФГАОУ ВО «Российский университет
дружбы народов» (ФГАОУ ВО «РУДН»)
Защита состоится «01» июля 2015 г. в «12.30» часов на заседании
диссертационного совета Д 212.148.09 при ФГБОУ ВПО «Московский
государственный университет пищевых производств» (109316, Москва, ул.
Талалихина, 33).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский
государственный университет пищевых производств».
Автореферат разослан
2015 г.
Автореферат размещен на официальном сайте
Министерства образования и науки РФ http://vak.ed.ru/
2015г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор ветеринарных наук, профессор
Андрианова Т.Г.
2
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
темы.
Бактерии
Pseudomonas
aeruginosa
при
инфицировании восприимчивых видов реализуют факторы вирулентности,
связанные с синтезом экзотоксинов (гемотоксин, лейкоцидин, цитотоксины) и
эндотоксина липополисахаридной природы, что обусловливает многообразие
клинических проявлений болезней, вызываемых данной группой бактерий.
Установлено, что популяции бактерий P. aeruginosa, выделенные из объектов
внешней среды, характеризуются психрофильностью, метаболической
пластичностью, ростом на обедненных средах с сохранением вирулентности
(Рубан Е.Л., 1986; Сомов Г.П., Литвин В.Ю., 1988; Куликовский А.В. и соавт.,
1990; Павлова И.Б., Ленченко Е.М., 1998; Марченко Т.В., 2006; Макаров В.В.,
2008; Шестаков А. Г., 2010; Захарченко О.Н., Плешакова В.И.,2011; Николаева
Н. В., 2011; Викторов Д.А., 2011; Пруцаков В.С., 2011; Рождественская Т.Н.,
2011; Серегин И.Г. и соавт., 2011; Баженова Е.А., 2012; Пушкарева В.И., 2014).
Экзополисахариды, продуцируемые бактериями P.aeruginosa в виде биопленок,
обладают защитным эффектом от действия активного кислорода, что приводит
к смене бактериями фенотипа в виде
перехода в мукоидную форму,
способствует изменению у таких форм способности окраски по Граму, при
снижении метаболизма наблюдается переход популяции в «некультивируемое
состояние» и этим
осложняется бактериологическая диагностика,
характеризующаяся длительностью и ретроспективностью исследования
(Мележик И.А. и соавт., 2013; Ленченко Е.М., 2014; (Grametal.,
2002;HuangMeizi. etal.,2003; ShenYing. etal.,2010;
IrohaI. R. etal.,2011;
DóraMárta, 2011; HeLanxiang, etal., 2012).
При мониторинге и сборе
информации распространенности возбудителей инфекционных болезней
наблюдается статистически достоверная тенденция роста множественной
лекарственной устойчивости бактерий (Кальницкая О.И., 2012; Панин А.Н.,
Куликовский А.В., 2014; Тарасова И.И. и соавт., 2014; АielloD. etal., 2010;
BjarnsholtT., 2011). Учитывая социальную и экономическую значимость
проблемы к
числу приоритетных задач относится изыскание
антибактериальных препаратов, эффективность которых определяется
экологической безопасностью и широким спектром действия, в том числе, по
отношению к бактериям P.aeruginosa с множественной лекарственной
устойчивостью вследствие повышенного синтеза экзополисахаридов,
формирующих биопленки, замедляющих диффузию антибактериальных
препаратов (Чеботарь И.В. и соавт., 2012; HeXianyuan, 2014). Для углубления
научных познаний малоизученных вопросов этиологической значимости
факторов вирулентности P.aeruginosa целесообразным является изучение
динамики патологических процессов на восприимчивых
лабораторных
моделях, апробация, изыскание и подборэффективных диагностических сред,
тест-систем для дифференциации бактерий, экспресс-тестов изучения
3
чувствительности к антибактериальным препаратам, что и определило
актуальность темы диссертационной работы.
Цель
работы:
изучить
дифференциально-диагностические
антагонистические,
патогенные
свойства
и
чувствительность
к
антибактериальным препаратам Pseudomonasaeruginosaдля оптимизации
количественного учета, видовой идентификации и дифференциации сходных
видов бактерий, выделенных из пищевого сырья и продуктов
Задачи исследований:
- изучить морфологию колоний бактерий Pseudomonasaeruginosa;
апробировать
и
изыскать
эффективные
дифференциальнодиагностические среды и тест-системы для оптимизации видовой
идентификации бактерий Pseudomonasaeruginosa от сходных видов
грамотрицательных бактерий;
- изучить патогенные свойства бактерий Pseudomonasaeruginosa;
- изучить антагонистические свойства бактерий Pseudomonasaeruginosa;
- изучить
чувствительность бактерий Pseudomonasaeruginosa к
антибактериальным препаратам
Научная новизна. Научно обоснована и экспериментально подтверждена
эффективность
применения
селективной
среды
«Сetrimideagar»
(специфичность – 94,8 %) для количественного учета, видовой идентификации
и дифференциации бактерийP.aeruginosa. Цитопатическое действие бактерий
Pseudomonas aeruginosa на ткани и органы птиц характеризуется сочетанием
общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими
изменениями паренхиматозных органов, признаками макрофагальных реакций,
экссудативно-инфильтративными процессами тканей и органов иммунной
системы. При изучении антагонистической активности бактерий установлено,
что биологически активные вещества, продуцируемые P.aeruginosa, угнетали
рост бактерий. При исследовании межвидового антагонизма, продуцируемые
бактериями P.aeruginosa, угнетали рост бактерий S. enteritidis– 11,3±0,1; K.
pneumonia– 11,0±0,3; C. freundii– 10,3±0,2;
Y.enterocolitica – 10,0±0,2.
Установлено, что 79,8 % культур микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa,
выделенные из пищевого сырья и продуктов, чувствительны к антибиотикам
группы β-лактам (цефоперазон, цефотаксим, цефепим, азтреонам, имипенем,
меропенем); 51,8 % – аминогликозидам (гентамицин, тобрамицин,
нетилмицин), 88,4 % – хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин,
ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин); 58,1 %
устойчивы к
хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклину.
Практическая значимость работы. На основе изучения морфологии
колоний
Pseudomonasaeruginosaмодифицирована методика подготовки
препаратов для микроскопического исследования колоний бактерий,
результаты исследований по данной методике используются в учебном
процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» по
дисциплинам: «Цитология, гистология, эмбриология»; «Эпизоотология».
4
Апробация
материалов
диссертации.
Основные
результаты
диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры
«Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (Москва, 2011-2015 гг.);
Материалы диссертации доложены на Международных научных конференциях
студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность
населения» (М., 2011; М., 2012).
Основные положения, выносимые на защиту:
- результаты изучения морфологии колоний P.aeruginosa;
- результаты изучения
дифференциально-диагностических
свойств
бактерий P.aeruginosa;
- результаты изучения патогенных свойств P. aeruginosa;
- результаты изучения антагонистических свойств бактерий;
результаты
изучения
чувствительности
P.
aeruginosaк
антибактериальным препаратам
Публикация результатов исследований.
По материалам диссертации опубликованы 5 работ, в том числе 3 в
журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов
собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, библиографии,
приложений. Работа изложена на 127 страницах компьютерного текста,
содержит 14 таблиц, 17 рисунков. Библиографический список включает 230
источник, из них 110 иностранных авторов.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в период с 2011 по 2015 гг. на кафедре «Ветеринарная
медицина» ФГБОУ ВПО «МГУПП», часть исследований проводилась в
лаборатории «Санитарная микробиология» ФГБНУ «ВНИИВСГЭ». В опытах
были
использованы
паспортизированные
штаммы:
PseudomonasaeruginosaATCC 9027; P. fluorescens № 19; P. putida № 43;
Salmonellaenteritidis № 204; Escherichia coliK88, №727; Klebsiella pneumonia
№24; Citrobacter freundii №33/57; Enterobacter aerogenes CCM 2531;
Yersiniaenterocolitica 09, №383; Staphylococcus aureus№ 123, полученные из
коллекции ФГБУ «ВГНКИ», Государственного НИИ стандартизации и
контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. При
индикации и идентификации бактерий P. aeruginosa исследования проводили в
соответствии с ГОСТ Р 54755-2011 «Продукты пищевые. Методы выявления и
определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa» (М., 2012);
«Методические рекомендации обнаружения и идентификация Pseudomonas
aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных
жидкостях) (М., 1984). Пробы пищевых продуктов для бактериологических
исследований отбирали в количествах, предусмотренных нормативными
5
документами: ГОСТ 26668-85 (СТСЭВ 3013-81) «Продукты пищевые и
вкусовые. Методы отбора проб для микробиологического анализа»; ГОСТ
10444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения количества
мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов».
Сравнительную оценку дифференциально-диагностических сред проводили в
соответствии с «Методическими рекомендациями по организации и
проведению контроля качества питательных сред для ветеринарных
лабораторий» (М., 2011), используя среды: Хью Лейфсона –
«HughLeifsonMedium» («Merck», Germany); Мак Конки – «MacConkey аgar»;
«Хай Хром агар» («HiChromMedium») («HiMedia», India);
ЦефсулодинНовобиоцин агар – Cefsulodin-Novobiocinagar» («CNagar»); Цетримид агар –
«Cetrimideagar». Биохимические свойства бактерий изучали с использованием
сред Гиса, тест набора для «MIKRO-LA-TEST», «ОКСИ-TEST» («Lachema»,
Czech). Идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми
методами (Герхардт Ф. И соавт., 1984; Сидоров М.А. и соавт.,1995; Скородумов
Д.И. и соавт., 2005). Патогенные свойства микроорганизмов оценивали с
применением лабораторных моделей: эмбрионы уток породы "Пекинская"
(n=12); цыплят породы «Белый леггорн» (n=12); белые беспородные крысы
(n=12) общепринятыми методами (Биргер М.О., 1973). При гистохимическом
исследовании срезы окрашивали для общих целей гематоксилином и эозином,
соединительную и мышечную ткани – по Ван Гизону, на фибрин – по
Шуенинову, на жир – суданом-3, на гемосидерин – пикрофуксином, на
микроорганизмы – по Крантцу (Ленченко Е.М., 2009). Изучение
чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам проводилив
соответствии с «МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности
микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (М., 2004); ГОСТ Р 554812013 «Мясо и мясные продукты. Качественный метод определения остаточных
количеств антибиотиков и других антимикробных химиотерапевтических
веществ» (М., 2014). Гемолитическую активность микроорганизмов оценивали
на МПА с содержанием 5,0 % стерильной крови млекопитающих и птиц
(Лабинская А.С., 1984). Адгезивные свойства микроорганизмов изучали на
эритроцитах млекопитающих и птиц (Павлова И.Б., Ленченко Е.М., 2010).
Выражаем благодарность д-ру биол. наук, проф. Павловой И.Б. (ВНИВСГЭ) за
оказание консультативной помощи при изучении популяции бактерий P.
aeruginosaпри сканирующей электронной микроскопии «Hitachi-800» со
сканирующей приставкой (Japan). Для получения репрезентативной
информации морфологических исследований применяли оптический
микроскоп «H604 TrinocularUnico» (USA); стереоскопический микроскоп
«БИОМЕД МС–1 Стерео» (Россия). Экспериментальные данные подвергали
статистической обработке (Ашмарин И.П., Воробьев Л.А., 1962; Садовский
Н.В., 1975), с использованием программы «Statistika» для PCMicrosoftExcel
2007.
6
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Результаты исследований морфологии колоний
бактерий Pseudomonasaeruginosa
При культивировании бактерий P. аeruginosaна МПА, «CNagar»
«Cetrimideagar» через 18 – 48 ч при 37 °С выявило формирование S-R-M форм
колоний. S-формы колоний имели округлую форму, были прозрачными, с
ровными краями, d=2,0-5,0 мм; R-формы – плоские неправильной формы,
складчатые, непрозрачные, с шероховатыми краями, d≥3,0 мм; карликовые,
d≤1,0 мм; М-формы – мукоидные (слизистые), d=1,5 – 3,0 мм (табл. 1).
Таблица 1
Морфология колоний P. aeruginosa
Морфология колоний
S-формы: круглые, прозрачные
R-формы:
- плоские неправильной формы
-складчатые
- карликовые
М-формы: мукоидные (слизистые)
Частота встречаемости, %
«МПА»
«CN
«Cetrimide
agar»
agar»
50,1
6,2
88,0
33,4
8,4
0
6,7
3,1
0
36,5
54,2
7,2
4,8
0
0
Для изучения морфологии колоний препараты фиксировали в течение 3
мин в этиловом спирте, после подсушивания на поверхность колонии наносили
3 – 5 капель 1,0 %-ного водного раствор метиленового синего или водного
раствора кристаллвиолета в разведении 1:2000. Для сохранения естественной
архитектоники колоний препараты фиксировали парами 25,0 % раствора
глутарового альдегида в течение 30 – 40 мин, для контрастирования применяли
пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (OSO4) в течение 1–2 мин, после
обработки колонии приобретали коричневый цвет.
Для исследования колоний бактерий при сканирующей электронной
микроскопии применяли метод культивирования бактерий на мембранных
фильтрах «Владипор, №5, №2», фиксировали парами 25,0 % раствора
глутарового альдегида в течение 30-40 мин, для дополнительного
контрастирования применяли пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (OSO4) в
течение 1–2 мин, после обработки колонии приобретали темно-коричневый
цвет, что позволило подсчитывать количество колоний, в том числе очень
мелких (≤1,0 мм). При изучении морфологии популяции бактерий без
нарушения архитектоники колоний выявили морфологические изменении на
уровне популяции бактериальных клеток, что связано с диссоциацией,
частичной или полной потерей бактериями клеточной стенки, разрушением
предшественников синтеза нуклеиновых кислот и ферментативной системы.
7
При благоприятных условиях нестабильные L-формы способны реверсировать
в исходное состояние, так, через 7–10 суток реверсировавшие культуры
визуально формировали нетипичный рост мелких, уплощенных закрытых
тонкой слизистой биопленки. При нарушении структуры бактериальных
клеток и перехода популяции P. aeruginosa в гетероморфизм с различными
проявлениями L-трансформации образуются сферопласты или протопласты
округлой формы различной величины, а также нестабильные и стабильные Lформы.Разработанная методика изучения популяции бактерий без нарушения
архитектоники колонии, позволила выявить морфологические изменении на
уровне структуры бактериальных клетокP. aeruginosa, проявляющаяся
диссоциацией на S-, R-, М-формы колоний: S-формы имели типичную для вида
палочковидную форму и гладкие края колоний; у R-форм наряду с типичными
для данного вида бактериями по морфологическим критериям выявлен
гетероморфизм; М-формы представлены сливными слизистыми колониями под
массивными покровами (биопленками).
3. 2. Результаты изучения дифференциально-диагностических свойств
бактерий Pseudomonasaeruginosa
Для подбора эффективных дифференциально-диагностических сред
изучали ростобеспечивающие, ингибирующие свойства, специфичность сред:
«HughLeifsonMedium»;«MacConkey аgar»; «HiChromMedium»; «CNagar» и
«Cetrimideagar» культивировали
24 – 48 ч при 37 °С. При оценки
ростообеспечивающих свойств сред взвесь микроорганизмов, содержащих
около 1000 бактериальных клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. Л. А.
Тарасевича), высевали по 0,1 мл на поверхность сред, среднее количество
колоний P. aeruginosa составило 64,15±1,35 – 81,33±1,63; энтеробактерий
42,17±1,37 – 90,17±1,47 (табл. 2).
Таблица 2
Сравнительная оценка ростообеспечивающих свойств сред (М±m)
Бактерии
P. aeruginosa
S. enteritidis
E. coli
K. pneumoniae
Y. enterocolitica
Количествовыросшихколоний, КОЕ
«Hugh
«Mac Conkey «Hi Chrom
Leifson
аgar»
Medium»
Medium»
81,33±1,63
64,15±1,35
84,15±1,35
90,17±1,47
69,15±2,15
80,17±1,44
70,0 ±1,41
72,15±1,10
75,0 ±1,41
79,67±0,89
77,66±0,69
79,67±0,89
62,17±1,37
54,13±1,37
42,17±1,37
8
«CN
agar»
Cetrimide
agar»
74,15±1,35
-
86,25±2,31
-
-
-
-
70,17±1,27
-
-
-
C. freundii
78,0 ±1,12
-
76,0 ±1,1
-
76,0 ±1,21
-
73,25±1,3
Примечание: числитель – «+»; знаменатель – «-»
При оценке ингибирующих свойств сред в опытах со смешанной
суспензией микроорганизмов установлено, что на среде «Cetrimideagar»
среднее количество колоний P. аeruginosa и
C. freundiiсоставило:
41,2±2,1/39,2±3,7 (табл. 3).
Таблица 3
Сравнительная оценка ингибирующих свойств сред (M±m)
Среда
Количество колоний микроорганизмов КОЕ
P. аeruginosa
P. fluorescens
«Hi Chrom
Medium»
«Cetrimide
agar»
41,3±2,6
39,4±1,7
42,3±3,7
–
P. аeruginosa P. аeruginosa
P.putida
S.enteritidis
P. аeruginosa
Е.coli
P. аeruginosa
C. freundii
39,10±2,67
41,17±2,40
47,3±3,3
–
45,7±2,13
47,6±3,5
41,60±1,96
–
40,3±3,4
35,4±2,7
41,2±2,1
39,2±3,7
33,2±3,9
37,23±1,20
47,3±3,3
–
Условные обозначения: «–» нет роста микроорганизмов
Для
оценки
специфичности
сред
(отношение
количества
идентифицированных культур микроорганизмов от общего числа типичных для
вида
колоний)
проводили
опыты
со
смешанными
суспензиями
микроорганизмов P. aeruginosa, S. enteritidis, E. coli, K. pneumonia, Y.
enterocolitica, C. freundiiсодержащими 1 млрд. бакт. клеток в 1 мл (стандарт
мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Суспензии культур микроорганизмов в
объеме по 30 мл вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты («NascoWHIRLPAK», Germany), содержащие по одной куриной голени, выдерживали при
комнатной температуре в течение 15 мин, периодически встряхивая. Затем
голени переносили в полиэтиленовые пакеты, содержащие по 50 мл пептонной
воды и выдерживали в течение 15 мин. Для выделения чистой культуры
микроорганизмов суспензию из пакетов высевали по 0,1 мл на поверхность
дифференциально-диагностических сред, культивировали при 37 °С 24 ч. При
видовой
идентификации
типичных
для
семейства
Pseudomonaceaeизолированных колоний, исследовали морфологические и
тинкториальные свойства микроорганизмов. При оптической микроскопии в
мазках, окрашенных по Граму P. aeruginosa были представлены
грамотрицательными бактериями, длиной 0,5 – 1,4 мкм и шириной 0,2 – 0,4
мкм. При наличии грамотрицательных палочек аэробные (расщепление
глюкозы путем окисления с образованием кислоты без газа – окислительноферментативный
тест
Хью-Лейфсона),
оксидазаположительные,
каталазаположительные культуры микроорганизмов пересевали в пробирки со
скошенным МПА для изучения ферментативных свойств. Культуры
9
микроорганизмов P. aeruginosa– восстанавливали нитрат в нитрит, обладали
протеолитической активностью (разжижали желатин и свернутую кровяную
сыворотку, гидролизовали казеин), свертывали лакмусовое молоко и
расщепляли сгусток, не ферментировали мальтозу, не образовали индол,
сероводород.
При культивировании микроорганизмов на средах «HughLeifsonMedium»,
«MacConkey аgar» и «CNagar» за счет наличия достаточно часто
встречающегося фермента (лактоза, глюкоза, маннит), специфичность сред для
идентификации псевдомонад относительно невысокая от 21,4 до 66,6%, не
позволяло дифференцировать P.aeruginosaот сходных видов бактерий. Для
дифференциации бактерий рода Pseudomonas специфичность среды
«HiChromMedium» выше по сравнению с предыдущими средами 80,0 % за
счет выявления специфического фермента «β-глюкозидаза» и «βгалактозидаза», P. аeruginosa, S. enteritidisи C. freundiiне продуцировали данные
ферменты, формировали бесцветные колонии; K. pneumoniae, Y. enterocolitica
продуцировали фермент «β-глюкозидаза», формировали сини-зеленые колонии,
а E. coli продуцировали фермент «β-галактозидаза», формировали фиолетовые
колонии.
Для видовой идентификации эффективной является селективная среда
«Cetrimideagar» (специфичность 94,8 %) за счет наличия цетримида
(этилтриметиламмоний-бромид) –
четвертичное аммониевое соединение,
подавляется рост сопутствующих бактерий (табл. 4).
Таблица 4
Изучение эффективности схемы бактериологического исследования
на наличие микроорганизмов рода Pseudomonas
Среды
«Hugh Leifson
Medium»
«Mac Conkey аgar»
«CN agar»
«Hi Chrom Medium»
«Cetrimide agar»
Количество
типичных колоний
14
12
12
15
20
Количество культур
микроорганизмов
Всего
%
3
21,4
4
8
12
19
33,3
66,6
80,0
94,8
Следующей задачей исследований явилось изучение контаминации
бактериями пищевых продуктов к определенному объему (0,1 мл) разведения
исследуемых образцов в ступке добавляли 10 мл стерильного 0,9 %-ного
раствора NaCl, затем тщательно размешивали и выдерживали 10-15 мин при
комнатной температуре для осаждения крупных частиц, из основного
разведения делали ряд последующих разведений, используя три способа:
способ I – серийные разведения в 0,9 % NaCl; способ II – серийные разведения
10
в 0,7 % МПА; способ III – посев на тест-пластины «Petrifilm». Из исследуемых
образцов готовили серию десятичных разведений в пробирках, содержащих 9
мл 0,9 % NaCl, затем при относительно переносимом объеме (0,1 мл) из
соответствующих последних разведений проводили посев на поверхность
питательных сред в чашки Петри – способ I. После автоклавирования (121 °С,
15 мин) 0,7 % раствор МПА разливали в пробирки по 9,0 мл, из исследуемых
образцов готовили серию десятичных разведений, затем из соответствующих
разведений производили посев каплями по 0,1 мл пипеткой вместимостью 1 мл,
в одну чашку Петри наносили до 6 капель различных десятичных разведений
образцов, так чтобы капли не сливались, каждая капля соответствовала посеву
0,1 мл суспензии на поверхности одной чашки – способ II. Производили посев
1 мл соответствующих последних разведений для определения КМАФАнМ
под верхнюю пленку в центр пластин «PetrifilmAerobicPlateCount», БГКП –
«PetrifilmE. coli / ColiformCountPlate» – способ III. Количество
микроорганизмов определяли через 18 ч культивирования при 37 °С по
количеству колоний, выросших на питательной среде с пересчетом на
количество посеянного материала и степень разведения культуры по формуле:
x = а x 10n, где x – КОЕ микроорганизмов; a – количество выросших колоний; n
– степень разведения. Установлено, что КМАФАнМ пищевых продуктов,
определенное тремя
способами, существенно не отличалось, однако
применение в качестве раствора для разведения 0,7 % раствора МПА и тестпластин «Petrifilm» позволило сократить расход питательных сред, стерильной
бактериологической посуды и времени проведения анализа (табл. 5).
Таблица 5
Результаты изучения количества микроорганизмов (КОЕ/ед.об)
Исследуемые пробы
Число КОЕ/ед.об
Объем среды, мл
Способы исследований
Голень куриная
Фарш из мяса птицы
Субпродукты птицы
Фарш из свинины
Фарш из говядины
Мясо рыбы
Креветки
I
32х103
72х103
38х104
84х105
90х105
26х103
31 х 103
II
36х103
76х103
40х104
81 х105
83 х105
22х105
28 х 103
III
31х103
87 х103
35х104
78х105
86 х105
25х103
32 х 103
I
120
120
120
120
120
120
120
II
40
40
40
40
40
40
40
III
-
Примечание: I – 0,9 % NaCl; II – 0,7 % МПА; III – тест-пластины «Petrifilm»
Для идентификации изолятов, выделенных при изучении контаминации
бактериями пищевых продуктов, исследуемые пробы (мясо птицы, фарш из
мяса птицы, субпродукты, фарш свинины, фарш говядины, мясо рыбы,
креветок) m=25,0 г, помещали в среду обогащения (Триптон – соевый бульон
или сердечно-мозговой бульон) в соотношении 1:9 (масса/объем) и
11
культивировали при 37º С 18 – 24 ч. Из среды обогащения делали высев на
дифференциально-диагностические питательные среды: «HiChromMedium»
«Cetrimideagar» и культивировали при 37º С 18 – 48 ч. При первичной
идентификации установлено, что из пищевого сырья и продуктов выделены 43
культур микроорганизмов, из которых 27 культур были отнесены к семейству
Pseudomonaceae, 16 – семейству Enterobactericeae(табл. 6).
Таблица 6
Результаты изучения видового состава бактерий, выделенных
из пищевого сырья и продуктов
Исследуемые
пробы
Голень куриная
Фарш из мясаптицы
Субпродуктыптицы
Фаршизсвинины
Фаршизговядины
Рыба
Креветки
Всего
Количественный и видовой состав бактерий
КМАФАнМ
Pseudomonas
Enterobactericeae
Абс.
%
Абс.
%
3
31±0,11 х10
1
2,3
82±0,06 х103
3
7,0
2
4,7
4
36±0,09 х10
2
4,7
4
9,3
84±0,21х105
5
11,6
5
11,6
5
90±0,15х10
5
11,6
4
9,3
3
23±0,22х10
7
16,3
1
2,3
31±0,12х103
4
9,3
27
62,8
16
37,2
На
основе
сравнительной
оценке
и
подборе
эффективной
дифференциально-диагностических сред при индикации и идентификации
бактерий, выделенных из пищевого сырья и продуктов, при первичной
идентификации установлена эффективность среды «HiChromMedium»
(специфичность – 80,0 %), для количественного
учета и видовой
идентификации бактерий P.aeruginosaустановлена эффективность селективной
среды «Сetrimideagar», специфичность идентификации – 94,8 %. При изучении
видового состава бактерий, из 43 культур микроорганизмов, выделенных из
пищевого сырья и продуктов к виду P.aeruginosaотносились 19 (44, 3 %)
культур микроорганизмов; P. fluorescens5 (11,6 %); P. putida 3 (7,0 %);C.
freundii 4 (9,3%); E. aerogenes4 (9,3 %), P. mirabilis5 (11,6 %), E. tarda3 (7,0 %).
3. 3. Результаты изучения патогенных свойств
бактерий Pseudomonas aeruginosa
Для оценки патогенных свойств бактерии Pseudomonas aeruginosa
культивировали в жидкой среде Хоттингера при 37°С в течение 24 ч, затем
центрифугировали при 6000 об\мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость
использовали для определения наличия токсинов – опыт (контроль – жидкая
среда Хоттингера) в тестах: «кожнореактивный фактор», «эдематозный тест»,
«эмбрионы птиц», «проницаемость сосудов». При оценке наличия токсина в
тесте «кожнореактивный фактор» исследуемый материал в объеме 0,1 мл
12
вводили внутрикожно в участки депиляции кожи беспородным белым крысам,
через 24 ч учитывали результаты изменений кожного покрова (положительный
результат – показатель коэффициента толщины кожи (мм), К≥1,6). Установлено,
что показатели коэффициента средних величин толщины кожи колебались в
пределах от 1,5±1,8 до 1,9±1,1.
Для изучения наличия токсинов на лабораторной модели «эдематозный
тест» 0,1 мл надосадочной жидкости вводили в плантарную поверхность
лапок белых беспородных мышей, учет результатов проводили через 24 ч,
сравнивая массу лапок зараженных и контрольных животных.
При оценке наличия токсинов с применением модели «эмбрионы птиц»
0,2 мл исследуемой жидкости вводили в аллантоисную оболочку 14-суточных
эмбрионов уток «Пекинская» и помещали в термостат при 37 °С. При учете
жизнеспособности эмбрионов в овоскопе установили, что через 24 ч после
заражения летальность эмбрионов составила 100,0 %. Динамика развития
патологических процессов сопровождалась развитием признаков септицемии,
при наличии бактериальной эмболии и нарушения кровообращения в тканях и
органах дыхательной, сердечно-сосудистой системы, наблюдали обширные
кровоизлияния
в
зародышевых
оболочках,
наличие
гиперемии,
гемоциркуляторных изменений в тканях и органах сердечно-сосудистой и
дыхательной системы, развитие перикардита, серозно-фибринозного
аэросаккулита,
перигепатита,
катарально-фибринозного
энтероколита,
гиперплазии селезенки.
При витальном исследовании продукции токсинов с применением
лабораторной модели «проницаемость сосудов» исследуемую жидкость
вводили интраназально 5-суточным цыплятам породы «Белый леггорн», через
24 ч внутривенно вводили раствор красителя «синего Эванса», не
проникающего через неповрежденный эндотелий кровеносных сосудов,
результаты оценивали, сравнивая разность массы легких опытных и
контрольных животных – тест «проницаемость сосудов». При наличии
токсинов бактерий коэффициент проницаемости кровеносных сосудов (К)
колебался в пределах от 0,051±0,15 до 1,024±0,14 (табл. 7).
Таблица 7
Результаты изучения токсигенных P. aeruginosa
Лабораторная модель
«Кожнореактивный
фактор» (мм)
«Эдематозный тест» (мг)
«Эмбрионы
птиц»
(баллы)
P. aeruginosa
1,9±1,1
Контроль
1,5±1,8
250,0
1,5-2,0
175,0
0,0
13
«Проницаемость
сосудов» (К)
1,024±0,14
0,051±0,15
На начальном этапе экспериментальных исследований (24-32 ч после
введения токсина) отмечали признаки скопления значительного количества
серозно-геморрагического экссудата в просвете желудочно-кишечного тракта,
сочетание общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими
изменениями собственного слоя слизистой оболочки, лимфоидной
инфильтрацией
ворсинок
тонкого
отдела
кишечника,
скоплением
плазматических клеток и экссудативно-инфильтративными процессами тканей
и органов иммунной, сердечно-сосудистой, дыхательной системы,
лейкоцитарной
инфильтрацией
и
пролиферацией
фибробластов
перибронхиальной и периваскулярной рыхлой волокнистой соединительной
ткани. Через 48–96 ч после воздействия токсинов динамика патологических
процессов характеризовалась кровоподтеками кожных покровов, фибринозным
перикардитом, фибринозным аэросаккулитом, катарально-фибринозным
энтеритом, перигепатитом, кровоизлияниями в почках, гиперплазией селезенки,
множественной бактериальной эмболией кровеносных сосудов тканей и
органов сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной, выделительной,
иммунной систем, в паренхиматозных органах выявлялись многочисленные
некротические очажки, инфильтрированные лейкоцитами, наблюдали
нарушение сосудистой проницаемости сердца, легких, печени, почек,
застойную гиперемию селезенки.
В органах пищеварительной системы выявляли наличие волокон фибрина,
точечные, пятнистые и полосчатые кровоизлияния в слизистой оболочке
тонкого и толстого отделов кишечника. В тонком отделе кишечника
бокаловидные клетки были переполнены светло-розовым секретом, наблюдали
слизистую дистрофию, некроз и отторжение каемчатых эпителиоцитов. На всем
протяжении кишечника наблюдалась гиперемия слизистой оболочки,
инфильтрация рыхлой волокнистой соединительной ткани лимфоцитами,
гистиоцитами и псевдоэозинофилами. Печень имела тусклый цвет, пульпа
органа на разрезе дряблой консистенции, выявляли дискомплексацию балочной
структуры долек, кровенаполнение центральной вены и синусоидных капилляров,
гепатоциты были увеличенными с признаками белковой и жировой дистрофии. В
почках выявляли признаки застойного геморрагического инфаркта, в паренхиме
органа выявлены
микроабсцессы, гиперемия сосудов с лейкоцитарной
инфильтрацией некротических участков, некроз эпителия канальцев нефронов
почек.
Цитопатическое действие бактерий Pseudomonas aeruginosa на ткани и
органы птиц характеризовалось преобладанием процессов, развивающихся по
типу реакции гиперчувствительности замедленного типа, сочетанием общей
сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями
паренхиматозных органов, признаками макрофагальных реакций с
14
последующим заполнением мозгового вещества лимфоидных фолликулов
псевдоэозинофильными
лейкоцитами,
экссудативно-инфильтративными
процессами тканей и органов иммунной системы. В тимусе отмечали признаки
расстройства кровообращения, атрофические процессы, акцидентальную
трансформацию, характеризующуюся уменьшением долек, исчезновением
коркового вещества, перемещением лимфоцитов в мозговое вещество и
формированием кист.
3. 4. Результаты изучения антагонистических свойств
бактерий Pseudomonas aeruginosa
Для изучения антагонистических свойств бактерий применяли методы
перпендикулярных штрихов, агаровых блочков, мембранных фильтров, лунок,
тестирования в жидкой питательной среде, агаровой пленки. При использовании
метода перпендикулярных штрихов возможно учитывать БАВ штаммов,
продуцирующих соединения небольшой молекулярной массы, которые
диффундируют в толще агарового слоя и, следовательно, дают более обширные
зоны задержки роста тест-культуры, недостаток методики применение одной
среды для продуцента антибиотического вещества, и тест-организм, не всегда
одинаково благоприятной как для продуцента и образования антибиотика, так и
для роста тест-организмов. При исследовании антагонистической активности
микроорганизмов
методом
агаровых
блочков
можно
определять
антагонистическую активность чистых и смешанных культур микроорганизмов,
к недостаткам метода можно отнести подтекание жидкости с культурой из
лунки в щель между агаром и дном чашки, что ведет к недостоверному
результату. Избежать подтекания можно путем формирования лунки, не
доходящей до дна чашки, используя при заливке чашки агаровой средой
соответствующие шаблон. При использовании методики мембранных фильтров
культуру изучаемого микроорганизма в количестве 0,5 мкл и концентрации 107108 кл/мл наносили в виде капли в центр мембранного фильтра, помещенного на
поверхность плотной питательной среды, и культивировали при оптимальных
для данного микроорганизма условиях. Затем мембранные фильтры удаляли с
поверхности плотной питательной среды и на то же место помещали новые
мембранные фильтры, на поверхность которых наносили взвесь исследуемых
тест-штаммов патогенных бактерий в той же концентрации. Контролем служил
рост культур, не подвергшихся воздействию БАВ. После воздействия
биологически активных веществ на поверхностях мембранных фильтров
выявлялся рост культуры бактерий в виде пятен различной плотности и
величины. При использовании методики тестирования в жидких питательных
средах тест-культуру культивировали в оптимальной жидкой питательной среде,
к которой добавлена бесклеточная культуральная жидкость исследуемого
штамма-антагониста. При оценке антагонистической активности учитывали
угнетение роста тест-штамма в сравнении с контролем (параллельная культура
15
тест-штамма без добавления бесклеточной культуральной жидкости
исследуемой культуры), определяя КОЕ микроорганизмов, метаболитическую
активность – по характерному для тест-штамма признаку. Из числа
апробированных методов изучения антагонистической активности на плотных
питательных средах наиболее результативным являлась методика с
применением мембранных фильтров, для исследования антагонистической
активности в жидкости – метод «агаровой пленки», позволяющие определять
антагонистическую активность микроорганизмов, относящихся к разным
систематическим группам, сократить расход питательных сред, стерильной
бактериологической посуды и времени проведения анализа. При исследовании
межвидового антагонизма результаты исследований
существенно не
отличались, продуцируемые бактериями P.aeruginosa, угнетали рост бактерий S.
enteritidis; K. pneumonia; C. freundii; Y.enterocolitica от 10,0±0,2 до 11,3±0,1 (табл.
7).
Таблица 7
Результаты изучения антагонистических свойств P. аeruginosa
Вид бактерий
S. enteritidis
K. pneumonia
C. freundii
Y.enterocolitica
Зоны задержки роста, мм
1
2
3
11,0
12,0
11,0
10,0
11,0
12,0
12,0
9,0
10,0
11,0
10,0
9,0
M±m
11,3±0,1
11,0±0,3
10,3±0,2
10,0±0,2
t
10,68
10,29
12,87
10,39
td
2,4
0,82
1,9
3,7
Примечание: t - доверительный коэффициент; td –коэффициент достоверности различий средних величин
3.5. Результаты изучения чувствительности бактерий
Pseudomonasaeruginosa к антибактериальным препаратам
3.5.1. Результаты изучения чувствительности к антибиотикам
При изучении чувствительности к антибактериальным препаратам (АБП)
микроорганизмов, выделенных из сырья и пищевых продуктов, применяли
методы диффузии в агар; серийные разведения. Бактериальную суспензию из
18-часовой культуры, выращенной на МПА, готовили в 3-5 мл изотонического
раствора 0,9 % NaCl по оптическому стандарту мутности "McFarland" 0,5. Для
учета чувствительности к антибактериальным препаратам учитывали диаметр
зон задержки роста бактерий, при изучении чувствительности к антибиотикам
Pseudomonasaeruginosa применяли тест «HexaDisc» – набор из 6 одиночных
дисков, радиально прикрепленных к центру.
Учет результатов определения чувствительности P.aeruginosa к АБП
проводили, определяя пограничные значения диаметров зон задержки роста и
минимальную подавляющую концентрацию – МПК. При изучении
16
чувствительности
микроорганизмов к АБП методом диффузии в агар
установлено, что Pseudomonasaeruginosa были чувствительными к группе βлактамных АБП (цефоперазон, цефотаксим, цефепим, азтреонам, имипенем,
меропенем – 21,10±0,8–24,20±0,9); аминогликозидам (тобрамицин, гентамицин,
нетилмицин – 18,25±0,6 – 23,18±1,3); хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин,
ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин) – (19,00±0,6 – 23,00±1,3);
устойчивыми к хлорамфениколу – 10,20±0,8, тетрациклину – 10,23±0,9,
доксициклин – 12,0±0,6 (табл.8).
Таблица8
Результаты изучения чувствительности Pseudomonasaeruginosa к
антибиотикам методом диффузии в агар
Антибиотики
β-лактамы
Цефоперазон
Цефотаксим
Цефтриаксон
Цефтазидим
Цефепим
Азтреонам
Имипенем
Меропенем
Аминогликозиды
Гентамицин
Тобрамицин
Нетилмицин
Амикацин
Хинолоны
Норфлоксацин
Пефлоксацин
Офлоксацин
Ципрофлоксацин
Левофлоксацин
Ломефлоксацин
Другиепрепараты
Хлорамфеникол
Тетрациклин
Доксициклин
Зона задержки роста микроорганизмов, мм
P. aeruginosa
Е.сoli
S. aureus
21,10±0,8
24,20±0,9
10,20±0,8
16,40±0,7
22,25±0,8
23,18±1,3
21,26±1,0
22,14±0,5
22,20±0,9
22,15±1,1
22,13±0,8
20,21±0,9
16,18±1,2
24,24±1,3
18,13±0,9
17,25±0,5
18,20±0,9
17,10±1,1
17,15±0,7
19,20±0,6
17,18±1,3
22,14±1,2
17,23±0,7
18,21±0,4
18,25±0,6
23,18±1,3
22,14±0,5
15,26±1,0
20,14±0,8
19,00±0,5
15,00±0,4
22,20±0,4
19,10±0,7
18,22±0,5
15,00±0,4
12,17±0,2
20,00±0,4
22,00± 0,5
10,00±0,8
22,00±1,1
19,00±0,6
23,00±1,3
18,00±0,4
22,00±0,3
20,10±0,4
33,30±0,3
25,20±0,4
26,00±0,5
19,10±0,3
23,20±0,2
18,40±0,2
24,20±0,3
11,20±0,5
20,10±0,5
10,20±0,8
10,23±0,9
12,0±0,6
21,20±0,3
11,00±0,4
19,00±0,3
20,24±0,3
21,00±0,4
17,20±0,3
17
Таблица 9
Чувствительность к антибиотикам «Гексадиски Pseudo 6»
№ культуры
микроорганизмов
Аk
C
Ca
Cf
G
I
1. P. аeruginosa(КГ)
2. P. аeruginosa(ФП)
3. P. аeruginosa(ФП)
4. P. аeruginosa(ФП)
5. P. аeruginosa(СП)
6. P. аeruginosa(СП)
7. P. аeruginosa(ФС)
8. P. аeruginosa(ФС)
9. P. аeruginosa(ФС)
10. P. аeruginosa(ФГ)
11. P. аeruginosa(ФГ)
12. P. аeruginosa(ФГ)
13. P. аeruginosa(ФГ)
14. P. аeruginosa(ФГ)
15. P. аeruginosa(Р)
16. P. аeruginosa(Р)
17. P. аeruginosa(Р)
18. P. аeruginosa(К)
19. P. аeruginosa(К)
15,3±0,6
12,2±0,6
15,0±0,6
18,2±0,5
16,9±0,6
18,6±0,5
16,5±0,6
15,3±0,6
16,1±0,7
16,9±0,7
16,7±0,6
16,1±0,7
16,7±0,6
21,3±0,8
15.6±0,6
16,4±0,7
20,1±0,8
16,6±0,6
15,4±0,7
21,3±0,8
14,2±0,8
13,5±0,7
20,9±0,7
19,8±0,6
20,6±0,7
16,5±0,8
21,3±0,8
11,7±0,8
22,9±0,9
21,9±0,8
20,6±0,8
21,9±0,8
17,7±0,9
21,7±0,8
22,1±0,8
22,5±0,9
22,3±0,9
22,6±0,9
14,3±0,3
15,1±0,3
13,9±0,2
14,2±0,2
13,6±0,1
12,1±0,1
13,6±0,3
17,1±0,4
16,2±0,3
16,9±0,4
15,8±0,3
11,0±0,3
15,8±0,3
16,7±0,4
15,9±0,3
13,3±0,4
16,8±0,4
14,1±0,3
16,7±0,4
22,8±0,9
22,6±0,9
15,7±0,8
20,5±0,7
21,3±0,8
15,9±0,7
22,9±0,9
23,1±0,9
23,3±0,9
24,4±0,4
23,4±0,9
23,1±0,9
23,4±0,9
12,5±0,8
23,3±0,9
10,1±1,0
23,8±1,0
23,7±1,0
23,5±1,0
15,3±0,3
13,1±0,3
12,9±0,2
15,2±0,2
10,6±0,1
13,1±0,1
15,6±0,3
17,1±0,4
16,2±0,3
13,9±0,4
15,8±0,3
16,0±0,3
13,8±0,3
16,7±0,4
10,9±0,3
16,3±0,4
14,8±0,4
16,1±0,3
14,7±0,4
22,0±0,8
15,8±0,8
21,0±0,7
20,8±0,7
15,5±0,8
20,7±0,7
22,5±0,9
22,2±0,8
23,1±0,9
23,9±1,0
22.7±0,9
15,5±0,9
22.7±0,9
22,3±0,5
22,7±0,9
23,1±0,9
22,4±0,9
23,1±0,7
14,4±0,9
Аk – амикацин; C –цефепим; Ca – цефтазидим; Cf – ципрофлоксацин; G – гентамцин; I – имипенем
При изучении чувствительности микроорганизмов P. aeruginosa к АБП
методом серийных разведений 0,7% МПА разливали в пробирки по 0,5 мл.
Рабочий раствор АБП в количестве 0,5 мл при помощи микропипетки со
стерильным наконечником вносили в 1-ю пробирку, содержащую 0,5 мл 0,7%
МПА, тщательно перемешивали, переносили 0,5 мл раствора АБП в 0,7% МПА
во 2-ю пробирку. Процедуру повторяли для приготовления ряда необходимых
разведений. Из последней пробирки 0,5 мл раствора удаляли. Для инокуляции
использовали взвесь микроорганизмов, содержащую 106 КОЕ/мл. В каждую
пробирку, содержащую 0,5 мл соответствующего разведения АБП, вносили
0,5 мл взвеси микроорганизмов, затем производили посев каплями на
поверхность МПА, в одну чашку Петри наносили до 6 капель различных
десятичных разведений АБП. Чашки культивировали при 37ºС в течение 24 ч.
Антибиотикорезистентность микроорганизмов определяли с помощью
методики «Оценка минимальной ингибирующей концентрации ("МИК")». При
отсутствии роста в минимальной и максимальной концентрациях антибиотика
микроорганизмы считали чувствительными к препарату. При наличии роста
при
минимальной
концентрации
антибиотика
чувствительность
микроорганизма к препарату считали умеренно чувствительными. Если рост
наблюдался при минимальной и максимальной концентрациях антибиотика,
18
микроорганизмы считали устойчивыми к препарату. Минимальной
ингибирующей концентрацией считали минимальную концентрацию
антибиотика, которая ингибирует рост микроорганизмов. При изучении
чувствительности к АБП методом серийных разведений установлено, что
наибольшую чувствительность P. аeruginosa выделенных из фарша птицы к
цефтазидиму (МИК 4,0 – мг/г), цефепиму (МИК 4,0 – мг/г), меропенем (МИК
1,0 – мг/г), гентамицину (МИК 8,0 – мг/г); ципрофлоксацину (МИК 0,125 –
мг/г); умеренно чувствительные к амикацину (МИК 32,0 – мг/г) (табл. 10).
Таблица 10
Результаты изучения чувствительности P. аeruginosaк антибиотикам
методом серийных разведений
Антибиотики
Цефтазидим
Цефепим
Имипенем
Меропенем
Гентамицин
Амикацин
Ципрофлоксацин
P. аeruginosa*
P. аeruginosa**
P. аeruginosa ***
МИК
мг/г
МИК
мг/г
МИК min, мг/г
min,
1,0
2,0
1,0
0,5
1,0
1,0
0,063
4,0
4,0
1,0
1,0
4,0
32,0
0.125
min,
2,0
4,0
1,0
1,0
2,0
32,0
0.125
Примечание: * – референтный штамм; **– фарш птиц; ***– рыбы
Для обнаружения остаточных количеств антибиотиков в сырье и пищевых
продуктах использовали тест-систему «Premi ® Test», основанный на высокой
чувствительности бактерий BacillussStearothermophilus к антибактериальным
препаратам.
Ампулы
«Premi ® Test» содержат твердую агаровую
питательную среду, стандартное количество спор указанных бактерий и
цветной индикатор бромкрезол, при культивировании при 64°С споры
прорастают. Из исследуемых проб (n=25), используя пресс, выдавливали около
250 мкл сока. В ампулы «Premi ® Test» добавляли 100 мкл исследуемых
образцов и оставляли на 20 минут при комнатной температуре для
предварительной диффузии; промыли пробирку деминерализованной водой,
осторожно отбирали воду из ампулы, закрывали пробирку фольгой,
предварительно доводили температуру нагревательного блока до 64°С,
поместили пробирку в инкубатор на 3 часа, затем извлекали пробирку из
нагревательного блока и помещали пробирку в сканер «Premi®Scan». Учет
результатов проводили по изменении цвета индикатора; «+» результат – при
отсутствии в анализируемом образце АБП в концентрации, превышающей
минимально обнаруживаемую, рост бактерий подавляется, кислотность среды
остается близкой к нейтральной, бромокрезол придает содержимому ампулы
фиолетовый цвет; «-» результат – при отсутствии в анализируемом образце
АБП происходит размножение бактерий и выделение кислоты, в результате
индикатор бромокрезол приобретает желтый цвет. При изучении наличия
19
АБП количество положительных результатов от 40,0 до 80,0 % .
При изучении чувствительности к антибактериальным препаратам
установлено, что 79,8 % культур микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa,
выделенные из пищевого сырья и продуктов, были чувствительными к
антибиотикам группы β-лактам (цефоперазон, цефотаксим, цефепим,
азтреонам, имипенем, меропенем); 51,8 % – аминогликозидам (гентамицин,
тобрамицин, нетилмицин), 88,4 % – хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин,
ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин); 58,1 % были устойчивы к
хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклину.
3. 5. 2. Результаты изучения антибактериальной активности
экстрактов растений и желчи
При изучении антибактериальной активности экстрактов растений
установлено, что антибактериальной активностью по отношению к бактериям
P. аeruginosa обладали Коптис китайский (Coptis chinensis), Шлемник
байкальский (Scutellariabaicalensis Georgi), зоны задержки роста составили от
9,0±0,59 до 11,5±0,97; по отношению к изученным видам энтеробактерий
обладали Японская жимолость (Honeysuckle aqueous), Коптис китайский,
Шлемник байкальский, Чай Пуэр (Camelliasinensis var. assamica), зоны
задержки роста от 9,0±0,64 до 13,0±1,1(табл.11).
Таблица 11
Результаты изучения антибактериальной активности
лекарственных растений, мм (М±m)
Культуры
Зоны задержки роста (мм) (М ± m)
микроорганизмов Японская
Коптис
жимолость
китайский
P. аeruginosa
11,5±0,97
E. coli
10,0±0,83
13,0±1,1
C. freundii
9,2±0,75
12,0±1,0
Y. enterocolitica
9,0± 0,64
11,0±0,91
Шлемник
байкальский
9,0±0,59
11,0±0,91
10,0±0,83
9,0±0,75
Чай Пуэр
10,0±0,83
10,0±0,83
9,5±0,79
При сочетанном действии антибиотиков и экстрактов растения Коптис
китайский зоны задержки роста P. аeruginosa составили от 19,50±1,54 до
25,50±2,12.
Для изучения чувствительности бактерий к действию растворов
медицинской консервированной желчи (ООО «Самсон-Мед», Санкт-Петербург)
использовали метод диффузии в агар, для этого суспензию бактерий наносили
пипеткой на поверхность чашки Петри с МПА в объеме 1,0 мл, равномерно
распределяли по поверхности шпателем. Чашки подсушивали при комнатной
температуре в течение 10-15 мин. Затем в чашках Петри на поверхностях МПА
пробойником делали отверстия (лунки), в которые вносили 1,0 – 4,0 % -ные
20
растворы желчи, культивировали при 37 ºС в течение 48 ч. При изучении
чувствительности P. aeruginosa к действию растворов желчи установлено, что
зоны задержки роста бактерий составили от 11,8 до 15,0 мм. При анализе
результатов бактериостатического действия желчи уровень резистентности
представителей изученных видов бактерий уменьшался в ряду: псевдомонады,
клебсиеллы, протеи, сальмонеллы, эшерихии, цитробактеры, иерсинии.
Для изучения антиадгезивных активности желчи к бактериям использовали
методику, позволяющую сохранять естественную архитектонику при
взаимодействии бактерий с клетками крови. В опыте использовали суспензию
эритроцитов концентрацией 109 кл/мл в физиологическом растворе и суточную
бульонную культуру бактерий в концентрации 109кл/мл при воздействии желчи.
Для изучении процессов адгезии P. аeruginosa к эритроцитам с использованием
оптической микроскопии, подсчитывали адгезированные бактерии на 25
эритроцитах для определения среднего показателя адгезии (СПА).
Экспериментальными исследованиями установлена антиадгезивная активность
1,0 – 4,0 % растворов желчи при экспозиции 2 часа снижали коэффициент
адгезии бактерий в 4 раза.
3. 5. 3. Результаты изучения чувствительности
Pseudomonasaeruginosa к препарату «Дезант»
При исследовании чувствительности к дезинфицирующим препаратам
микроорганизмов использовали методы диффузии в агар; серийные разведения;
для контроля качества дезинфицирующих препаратов применяли пластины
«Дип-слайд»
(«Oxoid»,
Англия).
Для
изучения
чувствительности
микроорганизмов, выделенных из сырья и пищевых продуктов, использовали
препарат «Дезант», содержащего 1,6,3,8-диметано-1,3,6,8-тетраазациклодекан –
ЧАС по активному действующему веществу. На первом этапе исследования
оценку чувствительности бактерий к указанному препарату проводили методом
диффузии в агар. Поверхность агара контаминировали суточными культурами
тест-микроорганизмов, в плотной питательной среде пробойником делали
отверстия (лунки), в которые заливали дезинфицирующее средство в различных
концентрациях (2,0 %, 2,5 %, 3,0 %). Чашки Петри культивировали при 37 °С в
течение 2 суток. Результаты учитывали по наличию или отсутствию зон
задержки роста культур микроорганизмов вокруг лунок после культивирования.
На основании результатов исследований установлено, что зоны задержки роста
микроорганизмов P. aeruginosaс 3% препаратом «Дезант» P. аeruginosa от
11,20±1,89 до 13,90±2,33 (табл. 13).
21
Таблица 13
Результаты изучения чувствительности бактерий
к препарату «Дезант» методом диффузии в агар
Культуры
микроорганизмов
(источник выделения)
P. аeruginosa1
P. аeruginosa2
P. аeruginosa3
P. аeruginosa4
P. аeruginosa5
Зона задержки роста микроорганизмов, мм
Концентрация препарата, %
2,0
2,5
3,0
10,70±2,31
11,00±1,76
13,90±2,33
10,30±1,83
10,80±2,30
11,20±1,89
10,90±2,17
13,80±3,10
12,20±2,44
12,20±2,55
12,10±1,78
11,30±1,34
13,40±2,11
12,00±1,74
13,60±1,85
Примечание: 1– референтный; 2 – фарш птиц; 3 – фарш свинины; 4 – фарш говядины; 5– рыбы
При оценке чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему
препарату «Дезант», наряду с общепринятым методом диффузии в агар, нами
были апробированы тест-пластины «Дип-слайд», предназначенные для
бактериологического исследования поверхностей. Для бактериологического
исследования применяли пластины «Дип-слайд» из полимера, находящиеся в
стерильной прозрачной пластиковой пробирке (контейнер). Дифференциальнодиагностические среды, размещенные на пластине, позволяли провести
бактериологическое исследование материала с учетом цели исследования и
биологии микроорганизмов, уменьшить объем питательных сред и количество
бактериологической
посуды.
«Дип-слайды»
содержали
следующие
питательные среды: Цетримидный агар («Cetrimide agar») – селективный агар с
цетримидом для выделения P. aeruginosa в различных образцах; Мак Конки
(«MacConkey») – среда для выделения и дифференциации колиформных
бактерий. При исследовании полимерную пластину слайда, покрытую плотной
питательной средой, плотно прижимали к поверхности, помещали в контейнер
и культивировали при 37 ° С 18-24 ч. Изучение степени контаминации P.
аeruginosaпищевых
продуктов
проводили
методом
отпечатков
с
использованием стерильных ватных тампонов. Для посева с использованием
стерильных ватных тампонов, перед проведением исследования тампон
увлажняли стерильным 0,1% водным раствором пептона или изотоническим
раствором хлорида натрия. Смыв с объекта, тщательно раскатывали ватным
тампоном по поверхности агара на «Дип-слайде». Для посева методом
отпечатка поверхность слайда с питательной средой плотно прижимали к
исследуемой поверхности. После посева слайд помещали в контейнер с плотно
закрывающейся крышкой, культивировали при 18–24 ч 37 °С. Подсчитывали
выросшие колонии микроорганизмов на поверхности питательной среды,
определяли КМАФАнМ и учитывали степень контаминации бактериями
поверхностей. Определение микроорганизмов основано на анализе морфологии
и цвета образуемых колоний (при низкой концентрации бактерий посевы
культивировали в течение 2 суток, затем оценивали морфологию). Метод
22
индикации и идентификации псевдомонад с использованием пластин «Дипслайдов» позволял сократить время проведения эксперимента (поскольку посев
на несколько сред происходит одновременно), расход питательных среды и
расходные материалы на этапе первичного посева, облегчал транспортировку
проб в лабораторию. «Дип-слайды» возможно использовать для проведения
контроля качества дезинфекции, так как метод прост в исполнении,
информативен, за счет комбинаций дифференциально-диагностических
питательных сред, которые позволяли одновременно определить количество
мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов
(КМАФАнМ), псевдомонады и энтеробактерии.
ВЫВОДЫ
1. Установлена изменчивость
морфологии колоний
P.aeruginosa,
проявляющаяся диссоциацией на S-, R-, М-формы колоний: S-формы имели
типичную для вида палочковидную форму и гладкие края колоний; у R-форм
наряду с типичными для данного вида бактериями по морфологическим
критериям выявлен гетероморфизм; М-формы представлены сливными
слизистыми колониями под массивными покровами (биопленками).
2. На основе сравнительной оценки и подборе эффективных
дифференциально-диагностических селективных сред и тест-систем при
идентификации бактерий, выделенных из пищевого сырья и продуктов,
выделено и идентифицировано 43 культуры микроорганизмов, в том числе 19
(44, 3 %) P.aeruginosa; 5 (11,6 %) P. fluorescens; 3 (7,0 %) P. putida;4 (9,3%) C.
freundii; 4 (9,3 %) E. aerogenes, 5 (11,6 %) P. mirabilis, 3 (7,0 %) E. tarda.
3. Цитопатическое действие бактерий Pseudomonasaeruginosa на ткани и
органы птиц характеризовалось преобладанием процессов, развивающихся по
типу реакции гиперчувствительности замедленного типа, сочетанием общей
сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями
паренхиматозных органов, признаками макрофагальных реакций
с
последующим заполнением мозгового вещества лимфоидных фолликулов
псевдоэозинофильными
лейкоцитами,
экссудативно-инфильтративными
процессами тканей и органов иммунной системы.
4.
С
применением
модифицированного
метода
изучения
антагонистической активности бактерий установлено, что биологически
активные вещества, продуцируемые бактериями P.aeruginosa, угнетали рост
бактерий: S. enteritidis– 11,3±0,1; K. pneumonia– 11,0±0,3; C. freundii– 10,3±0,2;
Y.enterocolitica – 10,0±0,2.
5. При изучении чувствительности к антибактериальным препаратам
установлено, что 79,8 % культур микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa,
выделенные из пищевого сырья и продуктов, были чувствительными к
антибиотикам группы β-лактам (цефоперазон, цефотаксим, цефепим,
азтреонам, имипенем, меропенем); 51,8 % – аминогликозидам (гентамицин,
23
тобрамицин, нетилмицин), 88,4 % – хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин,
ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин); 58,1 % были устойчивы к
хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклину.
6. При изучении антибактериальной
активности установлена
антиадгезивная активность лекарственных растений (Коптис китайский;
Шлемник байкальский; Японская жимолость; Чай Пуэр) и 1,0–4,0 % растворов
желчи.
7. Исследование контаминированных бактериями P. aeruginosa
жидкостей и поверхностей эффективно при применении пластин «Дип-слайд»,
т.к. позволяет сократить на этапе первичного посева время проведения
эксперимента, расход питательных сред и расходные материалы на этапе
первичного посева, за счет комбинаций дифференциально-диагностических
питательных сред для количественного учета и дифференциации псевдомонад
от сходных видов бактерий.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
На основе изучения морфологии Pseudomonasaeruginosaмодифицирована
методика подготовки препаратов для
исследования популяционной
изменчивости бактерий без нарушения естественной архитектоники колоний.
Для дифференциации бактерий P.aeruginosa от сходных видов бактерий
рекомендуется использовать среду «HiChromMedium» (специфичность
идентификации – 80,0 %), для количественного учета и видовой
идентификации бактерийP. aeruginosa – схему бактериологического
исследования с применением среды «Сetrimideagar», специфичность
идентификации – 94,8 %.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
1. Чжун Синь. Сравнительная характеристика дифференциальнодиагностических сред и тест-систем для индикации и идентификации
патогенных бактерий // Живые системы и биологическая безопасность
населения: Материалы IX международной научной конференции студентов и
молодых ученых. – М.: МГУПП, 2011. – С.281-283.
2. Чжун Синь. Оценка чувствительности к антибиотикам и
дезинфицирующим препаратам бактерий, выделенных при желудочнокишечных болезнях птиц // Живые системы и биологическая безопасность
населения: Материалы X международной научной конференции студентов и
молодых ученых. – М.: МГУПП, 2012. – С.221-223.
24
3. Ленченко
Е.М.
Чувствительность
микроорганизмов
к
дезинфицирующим средствам / Е.М. Ленченко, Чжун Синь, И.И. Тарасова, Д.С.
Зверев //Аграрная наука. – 2013. – № 8. С. 27-28.
4. Ленченко Е.М. Чувствительность к антибактериальным препаратам
энтеробактерий, выделенных при желудочно-кишечных болезнях животных //
Е.М. Ленченко, Чжун Синь, Е.А. Мансурова //Аграрная наука. – 2014. – №9. С.
30-32.
5. Тарасова И.И. Механизм формирования резистентности к
дезинфектантам// И.И. Тарасова, Е.М. Ленченко, Чжун Синь, И.Ю.
Московкина, Р.Н. Мельник // Ветеринария и кормление. – 2014. – №6. С. 47-48.
25
