УДК 543.6
Тонкослойная жидкостная хроматография в анализе метопролола, валсартана и
клопидогрела
© Васильева Мария Владимировна, Кураева+ Юлия Геннадьевна, Онучак* Людмила
Артемовна, Зотова Алена Анатольевна
Кафедра физической химии и хроматографии. ФГБОУ ВПО «Самарский
государственный университет». Ул. Ак. Павлова, 1. г. Самара, 443011. Россия.
Тел.: (846) 334-54-47. E-mail: [email protected]
Ключевые слова: метопролол, валсартан, клопидогрел, тонкослойная хроматография.
Аннотация
Методом тонкослойной хроматографии в нормально-фазовом и обращено-фазовом режимах
изучено хроматографическое поведение сердечно-сосудистых препаратов (метопролол, валсартан и
клопидогрел) при варьировании природы и концентрации компонентов подвижной фазы. Выявленные
закономерности использованы для выбора оптимальных условий определения основных действующих
веществ и примесей в готовых лекарственных формах.
Введение
Тонкослойная хроматография (TCХ) является высокочувствительным, экспрессным и не
требующим применения сложного аналитического оборудования методом, который, наряду с
высокоэффективной жидкостной хроматографией, предлагается в отечественной и зарубежной
фармакопеях для определения подлинности и чистоты лекарственных препаратов. Для многих
препаратов, применяемых для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, в Российской
фармокопее [1] отсутствуют фармстатьи, в частности для таких широко применяемых
препаратов, как метопролол, валсартан и клопидогрел.
Метопролол ((±)-1-[4-(2-метоксиэтил)фенокси]-3-[(1-метилэтил)амино]-2-пропанол) селективный блокатор β-адренорецепторов, применяется при лечении ишемической болезни
сердца, артериальной гипертензии и аритмии:
Валсартан (N-[[2'-(1Н-тетразол-5-ил)[1,1'-бифенил]-4-ил]метил]-N-валерил-L-валин) антигипертензивное средство, является специфическим антагонистом рецепторов ангиотензина
II, применяется при лечении гипертонической болезни:
Клопидогрел
(метил-(+)-(S)-α-(О-хлорфенил)-6,7-дигидротиено[3.2-c]пиридин-5(4Н)ацетат) — лекарственный препарат, снижающий склонность тромбоцитов к агрегации,
относится к классу антиагрегантов. Применяется для профилактики тромбообразования у
больных ишемической болезнью сердца (после инфаркта миокарда), при атеросклерозе
мозговых и периферических сосудов [5]:
1
Целью работы являлась оценка возможностей методов нормально-фазовой и обращеннофазовой ТСХ для определения чистоты и подлинности лекарственных средств на основе
метопролола, валсартана и клопидогрела.
Экспериментальная часть
Объекты исследования: стандарты метопролола, валсартана, клопидогрела и примеси A
клопидогрела (все USP), фармацевтические препараты: таблетки «Валсартан, 160 мг» (KRKAРУС, Россия), «Метопролол 50 мг» (АстраЗенека, Швеция), «Клопидогрел, 75 мг» (KRKAРУС, Россия).
Растворы стандартов готовили растворением навески (10 мг метопролола и
клопидогрела, 5 мг варсартана) в 10 мл подходящего растворителя (вода, этанол, метанол для
метопролола, валсартана, клопидогрела соответственно). После фильтрования 1 мл
полученного раствора разбавляли растворителем в мерной колбе на 25 мл. Полученный раствор
дегазировали на ультразвуковой бане в течение 8 мин.
Для анализа готовых лекарственных форм измельчали 10 таблеток препарата и брали
навеску, соответствующую содержанию основного препарата в стандарте. Навеску растворяли
в 10 мл подходящего растворителя, а дальше действовали по алгоритму приготовления
растворов стандартов.
Использовали пластины для нормально-фазовой (Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ, dp = 5-8 мкм,
полимерная подложка) и обращенно-фазовой (Merck TLS aluminium sheets RP-18 F254) ТСХ.
Применяли денситометрическое детектирование хроматографических зон исследуемых
препаратов. Изображения пластин получали с помощью фотоаппарата Canon Power Shot S5 IS в
УФ диапазоне длин волн (254 нм, 365 нм). Хроматографирование проводили восходящим
методом при комнатной температуре в стандартных камерах с предварительным насыщением
газовой фазы и сорбента парами элюента.
Хроматографические характеристики – фактор задержки Rf, число теоретических
тарелок N, асимметрия пика А определяли с помощью программного комплекса Sorbfil
Videodensitometr TLC Quantitative Evaluation (Ver 1.7.0.216) фирмы «Сорбполимер» (г.
Краснодар, Россия).
Физико-химические характеристики соединений – молекулярная масса (Mr),
гидрофобность (логарифм константы распределения между водой и октанолом-1, log P), и
дипольный момент (μ) – представлены в таблице 1
Таблица 1*. Физико-химические характеристики молекул исследованных лекарственных
веществ
Название
Mr
log P
µ, D
Метопролол
267.37
1.79
2.64
Клопидогрел
321.82
3.07
1.96
Валсартан
435.53
4.92
4.55
Расчет физико-химических свойств молекул сердечно-сосудистых препаратов проводили с
помощью программы «HyperChem» v.7.52.
*
Результаты и обсуждение
Обращенно-фазовая ТСХ
Для определения подлинности и чистоты большого количества лекарственных
препаратов отечественная фармакопея предлагает метод обращенно-фазовой ТСХ.
Достоинствами метода, помимо точности и экспрессности, является использование
2
малотоксичных водно-ацетонитрильных смесей. Для исследуемых препаратов фармстатьи с
применением обращено-фазовой ТСХ отсутствуют.
Для исследования хроматографического поведения метопролола, валсартана и
клопидогрела использовали элюенты на основе ацетонитрила и фосфатного буфера (40:60 %
об.) при варьировании значения рН. Зависимости фактора задержки Rf от рН фосфатного
буфера для всех исследованных стандартов представлены на рисунке 1.
Rf
1
3
0.8
0.6
2
0.4
1
0.2
0
2
3
4
5
рН
Рис.1. Зависимости фактора задержки Rf метопролола (1), клопидогрела (2) и валсартана (3) от
рН фосфатного буфера в подвижной фазе «фосфатный буфер – ацетонитрил» 60 : 40 % об.
Из представленного рисунка видно, что у исследованных лекарственных препаратов
фактор задержки в обращенно-фазовом режиме возрастает с ростом молекулярной массы, что
обусловлено усилением дисперсионных взаимодействий с неполярной неподвижной фазой.
Увеличение рН элюента приводит к возрастанию удерживания всех соединений. При этом
наиболее сильно данный эффект проявляется для метопролола, в молекуле которого имеется
аминогруппа, способная к протонированию. В сильнокислой среде, по-видимому,
протонированная форма слабо удерживается. При повышении рН элюента метопролол в
молекулярном виде сильнее адсорбируется на неполярном адсорбенте. Молекула валсартана
способна как протонироваться, так и переходить в анион за счет диссоциации карбоксильной
группы.
На основе полученных данных в качестве оптимального предложено значение pH
фосфатного буфера равное 3,6. Данный состав обеспечивает приемлемые значения Rf, а пики
при этом характеризуются низкими значениями ассиметрии. Значения Rf, а также число
теоретических тарелок и ассиметрия пиков при pH=3,6 фосфатного буфера представлены в
таблице 2.
Таблица 2. Факторы задержки Rf соединений, асимметрия пиков А и число
теоретических тарелок N (пластины Merck TLS aluminiumsheets RP-18 F254, элюент «фосфатный
буфер(рН=3.60) –ацетонитрил» состава 60 :40 % об.*
№
Определяемое вещество
Rf
A
N
1
Метопролол
0.31
1.69
373
2
Валсартан
0.84
1.87
520
3
Клопидогрел
0.45
1.56
390
4
Примесь клопидогрела А
0.76
0.95
4790
*
Значения Rf рассчитаны с точностью ±0.03.
В выбранных условиях проведен анализ готовых лекарственых форм исследуемых
препаратов. На рисунке 2 представлены изображение пластины и хроматограмма метопролола,
3
полученные методом обращенно-фазовой ТСХ с использованием подвижной фазы «фосфатный
буфер (рН=3.6) – ацетонитрил» состава 60 : 40 % об.
Рис. 2. Изображение пластины и хроматограмма метопролола (лекарственная форма – таблетки
50 мг): пластины Merck TLS aluminium sheets RP-18 F254, элюент – фосфатный буфер (рН=3.6) –
ацетонитрил» (60 : 40 % об.).
Получаемый пик на хроматограмме (рис. 2) симметричен и узок, что предполагает
возможность количественного анализа.
Изображение пластины и хроматограмма клопидогрела представлена на рисунке 3.
Рис. 3. Изображение пластины и хроматограмма клопидогрела (лекарственная форма – таблетки
75 мг): пластины Merck TLS aluminium sheets RP-18 F254, элюент – фосфатный буфер (рН=3.6) –
ацетонитрил» (60 : 40 % об.); 1 – клопидогрел, 2 – клопидогрела примесь А.
Из рис. 3 видно, хроматограмма клопидогрела обнаруживает пик, соответствующий
примеси А со значением Rf, превышающим Rf основного компонента. Следует отметить, что
при визуальном детектировании в УФ свете пятно, соответствующее примеси А, фиксируется
крайне проблематично. Использование видиоденситометра позволяет проводить не только
качественное, но и количественное определение примеси А.
Таким образом, подобран элюент, пригодный для определения всех исследуемых
препаратов и не требующий труднодоступных реагентов.
4
Нормально-фазовая ТСХ
При изучении возможностей применения нормально-фазовой ТСХ для определения
исследуемых препаратов использовали элюенты, близкие по составу к элюентам,
предложенным в нормативных документах для других сердечно-сосудистых лекарственных
препаратов. В качестве исходного состава элюента на основе литературных данных была
выбрана смесь «толуол - ледяная уксусная кислота - метанол», при этом объемное содержание
толуола и уксусной кислоты поддерживали постоянным (75 частей толуола и 25 частей
уксусной кислоты), а содержание метанола варьировали. Полученные значения фактора
задержки Rf от концентрации метанола, представлены на рисунке 4.
Rf
1
3
0.8
2
0.6
0.4
1
0.2
0
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
С (метанол) , % об.
Рис. 4. Зависимости фактора задержки Rf валсартана - 1 метопролола - 2, и клопидогрела- 3 от
концентрации метанола в подвижной фазе «толуол - ледяная уксусная кислота - метанол».
Из рисунка 4 видно, что при малом содержании метанола в элюенте удерживание
возрастает в ряду валсартан → метопролол → клопидогрел, что соответствует уменьшению
полярности молекул. При увеличении содержания метанола порядок удерживания изменяется,
что обусловлено усилением межмолекулярных взаимодействий в более полярном элюенте.
Путем варьирования состава трехкомпонентного элюента установлено, что подходящим
элюентом для определения клопидогрела является элюент «толуол - ледяная уксусная кислота метанол» состава 75:25:5, а для определения валсартана и метопролола элюент «дихлорметан :
метанол : гидроксид аммония» состава 70:10:0,8, так как при использовании этих элюентов на
хроматограммах регистрируются достаточно узкие пики с малой асимметрией, а значения Rf
находятся в допустимых пределах (0.2 < Rf < 0.8) [7]. Полученные значения представлены в
таблице 3.
Таблица 3. Факторы задержки Rf, асимметрия пиков A и число теоретических тарелок N
(пластины с силикагелем Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ) *
Определяемое
Элюент
Rf
А
N
№
вещество
Метопролол
дихлорметан : метанол : гидроксид 0.67
1.79
349
1
аммония» (70:10:0,8)
Валсартан
дихлорметан : метанол : гидроксид 0.43
1.56
408
2
аммония» (70:10:0,8)
Клопидогрел
«толуол - ледяная уксусная кислота - 0.78
1.66
215
3
метанол» (75:25:5)
Значения Rf рассчитаны с точностью ±0.03.
*
В выбранных условиях проведен анализ таблетированных форм исследуемых
лекарственных средств. На рис. 5 представлены изображение пластины и хроматограмма
5
клопидогрела, полученная в условиях нормально-фазовой ТСХ с использованием подвижной
фазы «толуол - ледяная уксусная кислота - метанол» (75:25:5).
Рис. 5. Изображение пластины и хроматограмма клопидогрела (лекарственная форма – таблетки
75 мг): пластины Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ (10×10 см) с силикагелем на полимерной подложке; элюент –
«толуол - ледяная уксусная кислота - метанол» (75:25:5).
На рис. 6 представлены изображения пластины и хроматограмма валсартана, полученная
в условиях нормально-фазовой ТСХ с использованием подвижной фазы «дихлорметан :
метанол : гидроксид аммония» (70:10:0,8).
Рис. 5. Изображение пластины и хроматограмма валсартана (лекарственная форма – таблетки
160 мг): пластины Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ (10×10 см) с силикагелем на полимерной подложке, элюент –
«дихлорметан : метанол : гидроксид аммония» (70:10:0,8).
Полученные пики достаточно симметричны, что облегчает количественное определение
действующих веществ в готовых лекарственных формах при условии предварительного
извлечения основного компонента с помощью подходящего экстрагента.
Заключение
1.
Предложены методики определения трех сердечно-сосудистых лекарственных
препаратов в таблетках методами нормально-фазовой и обращенно-фазовой ТСХ.
2.
Для определения метопролола, валсартана, клопидогрела и примеси А
клопидогрела в субстанциях и готовых лекарственных формах методом обращенно-фазовой
6
ТСХ с денситометрическим детектированием может использоваться элюент «фосфатный буфер
(рН=3.60) – ацетонитрил» состава 60 : 40 % об.,
3.
Для определения клопидогрела методом нормально-фазовой ТСХ с
денситометрическим детектированием предложено использовать элюент «толуол - ледяная
уксусная кислота - метанол» состава 75 : 25:5. Для определения метопролола и валсартана
методом нормально-фазовой ТСХ с денситометрическим детектированием предложено
использовать элюент «толуол - ледяная уксусная кислота - метанол» состава 75 : 25:5
Работа выполнена при поддержке гранта №4.110.2014/К в рамках выполнения
госзадания министерства образования и науки РФ.
Литература
[1] Государственная Фармакопея Российской Федерации XII издание. Т. 1. М: Научный
центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. 696 с.
[2] United States Pharmacopeia. The United States Pharmacopeial Convention, 2009. 1792 с.
[3] British Pharmacopeia, CD 1988 v.2.0, System Sumulation Ltd. 1998
[4] European Pharmacopeia 7.0, European Pharmacopoeia Commission, 2011, EDQM, 2 v.
[5] Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. Т.1. – М.: ООО «Издательство
Новая Волна», 2002. – 540с.
[6] Фармстатья предприятия «Бисопролол-ПРАНА»
[7] Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография, М., 1981, 427с.
TLC analysis in the metoprolol, valsartan and clopidogrel
© Vasilyeva Maria V., Kuraeva+ Yuliya G., Onuchak* Ludmila A., Zotova Alena A.
7
