МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
«УТВЕРЖДАЮ»
Заведующий кафедрой
_биохимии, микробиологии и биотехнологии
(название кафедры)
______________ _Э,Я. Костецкий ___
(подпись)
(Ф.И.О. зав. каф.)
«__6____»июня_________________20_12___г.
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ
Основы регуляции метаболизма микроорганизмов
Специальность — 020209.65 микробиология
Форма подготовки очная
Школа естественных наук
Кафедра <биохимии, микробиологии и биотехнологии>
курс 4_______ семестр 8______
лекции _17__ (час.)
практические занятия___
семинарские занятия____
лабораторные работы ____
всего часов аудиторной нагрузки__17__ (час.)
самостоятельная работа __23_____ (час.)
зачет ______8___ семестр
экзамен_________семестр
Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного
стандарта высшего профессионального образования (№ Гос.Рег. 96 ЕН / СП от 10 марта 2000 г.).
Учебно-методический комплекс дисциплины обсужден на заседании кафедры_ биохимии, микробиологии и
биотехнологии « 6 » июня 2012 г., протокол №1 5
Заведующая (ий) кафедрой_________________________________________
Составитель: профессор Л.С.Бузолева, к.б.н. Е.А. Богатыренко_
2012____г.
Содержание УМКД:
1. Аннотация УМКД
3
2. Рабочая программа учебной дисциплины
5
3. Конспекты лекций
14
4. Материалы для самостоятельной работы студентов…………………135
5. Контрольно-измерительные материалы………………………………137
6. Список литературы ………………………………………
142
7. Глоссарий………………………………………………………………..145
2
Аннотация к учебно-методическому комплексу «Основы регуляции
метаболизма микроорганизмов»
Учебно-методический
комплекс
дисциплины
«Основы
регуляции
метаболизма микроорганизмов» разработан для студентов _4__ курса,
обучающихся по специальности 020209.65 «Микробиология» в соответствии с
требованиями ГОС по данной специальности (утверждено приказом и.о.
ректора ДВФУ от 17.04.2012 № 12-13-87).
Дисциплина «Основы регуляции метаболизма микроорганизмов» входит в
число дисциплин специализации для студентов, выбравших специальность
«Микробиология».
Общая трудоемкость освоения дисциплины составляет 40 часов. Учебным
планом предусмотрены лекционные занятия (17 часов), самостоятельная
работа студента (23 час). Дисциплина реализуется на 4 курсе в 8 семестре.
Содержательно и методически курс «Основы регуляции метаболизма
микроорганизмов» является логическим завершением таких дисциплин как
«Микробиология», «Физиология роста микроорганизмов», «Биохимия» и
«Цитология микроорганизмов». Для полноценного освоения содержания
дисциплины студенты должны обладать базовыми знаниями о микробиологии,
особенностях
строения
эукариотической
и
прокариотической
клетки,
теоретических основах общей биохимии.
Учебно-методический комплекс включает в себя:
• рабочую программу учебной дисциплины;
• конспекты лекций (развернутый план лекций, включающий проблемные
вопросы);
• контрольно-измерительные материалы;
• список литературы (в том числе интернет-ресурсов);
Достоинством данного УМКД является лекционный курс, предлагающий
комплексный подход к пониманию биохимических процессов, протекающих в
3
клетках микроорганизмов. К наиболее методически разработанным разделам
можно
отнести
раздел,
посвященный
метаболическому
разнообразию
аэробных гетеротрофных микроорганизмов.
Д.б.н., профессор кафедры биохимии, микробиологии и
биотехнологии ШЕН ДВФУ , профессор
Бузолева Л.С. , к.б.н., зав. лаб морских микроорганизмов Е.А. Богатыренко
Зав.кафедрой биохимии, микробиологии и
биотехнологии _______________ Э.Я. Костецкий
4
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
«УТВЕРЖДАЮ»
Заведующий кафедрой
_биохимии, микробиологии и биотехнологии
(название кафедры)
______________ _Э,Я. Костецкий ___
(подпись)
(Ф.И.О. зав. каф.)
«__6____»_июня________________2012____г.
РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ
Основы регуляции метаболизма микроорганизмов
Специальность — 020209.65 микробиология
Форма подготовки очная
Школа естественных наук
Кафедра <биохимии, микробиологии и биотехнологии>
курс 4_______ семестр 8______
лекции _17__ (час.)
практические занятия___
семинарские занятия____
лабораторные работы ____
всего часов аудиторной нагрузки__17__ (час.)
самостоятельная работа __23_____ (час.)
зачет ______8___ семестр
экзамен_________семестр
Рабочая программа учебной дисциплины составлена в соответствии с требованиями государственного
образовательного стандарта высшего профессионального образования (№ Гос.Рег. 96 ЕН / СП от 10 марта
2000 г.).
Рабочая программа учебной дисциплины обсуждена на заседании кафедры биохимии, микробиологии и
биотехнологии « 6 » июня 2012 г., протокол № 15
Заведующая (ий) кафедрой_________________________________________
2011____г.
Составитель: Л.С.Бузолева___________________________________________________
5
Оборотная сторона титульного листа РПУД
1.
Рабочая программа пересмотрена на заседании кафедры:
Протокол от «_______» ________________20____г. №______________
Заведующий кафедрой ___________________________
(подпись)
2.
____________________
(И.О. Фамилия)
Рабочая программа пересмотрена на заседании кафедры:
Протокол от «________» ________________201_____г. №______________
Заведующий кафедрой ___________________________
(подпись)
____________________
(И.О. Фамилия)
6
ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА
Программа курса «Основы регуляции метаболизма микроорганизмов»
составлена в соответствии с требованиями государственного образовательного
стандарта высшего профессионального образования.
Цель курса - ориентация студентов в понимании сущности процессов
обмена,
свойственных
субстраты.
микроорганизмам,
Рассматриваются
большинства
видов
биохимические
как
бактерий,
реакции,
разлагающих
процессы
так
и
характерные
обмена
разнообразные
типичные
специфические
для
для
важнейшие
определенных
видов
микроорганизмов.
Преподавание курса связано с другими курсами государственного
образовательного стандарта: "Физиология роста микроорганизмов",
"Цитология", "Биохимия", «Микробиология».
По завершению обучения по дисциплине студент должен:
- овладеть системой знаний о закономерностях процессов анаболизма и
катаболизма, происходящих в микробной клетке;
- иметь представление об основных путях энергетического обмена
и биосинтеза у аэробных и анаэробных бактерий;
- разбираться в особенностях ферментативного, хемолитотрофного и
фототрофного типов метаболизма;
- уметь
анализировать
пути разложения микроорганизмами
природных веществ
I.
СОДЕРЖАНИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ ЧАСТИ (17 часов)
1. ПИТАНИЕ БАКТЕРИЙ (2часа)
Главные и минорные биоэлементы, необходимые для жизнеобеспечения
бактериальной
клетки.
Два
основных
механизма
синтеза
АТФ
(фосфорилирование при переносе электронов, фосфорилирование на уровне
субстрата. Основные типы энергетического обмена в зависимости от
питательных веществ как источников энергии (фототрофия, хемотрофия).
Потребности бактерий в факторах роста.
7
2. СИНТЕЗ
АТФ
ПРИ АЭРОБНОМ
РОСТЕ
НА СРЕДАХ С
ГЛЮКОЗОЙ (2 часа)
Транспорт глюкозы в клетки на примере E.coli. Метаболический путь
Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. Окисление ацетил-СоА в цикле трикарбоновых
кислот. Образование АТФ в дыхательной цепи. Компоненты дыхательной
цепи.
Фосфорилирование
при
переносе
электронов.
Разобщители
и
3. БИОСИНТЕЗ РАЗЛИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ГЛЮКОЗЫ
У
ингибиторы. Значение пироксид-дисмутазы.
ESCERICHIA COLI И ДРУГИХ СУБСТРАТОВ (2 часа)
Состав макромолекул клеток E.coli. Ассимиляция аммиака. Ассимиляционное
восстановление сульфата. Биосинтез аминокислот. Образование пентозофосфатов
и NADPH2. Синтез РНК и ДНК. Биосинтез липидов. Образование углеводов.
Синтез полимеров (липиды, периодические макромолекулы, информационные
макромолекулы).
Анаплеротическая
последовательность.
метаболизма при использовании в качестве
Особенности
субстратов фруктозы, лактозы,
ацетата, пирувата и малата.
4.
МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ
РАЗНООБРАЗИЕ
АЭРОБНЫХ
ГЕТЕРОТРОФОВ (2 часа)
Различные механизмы поглощения субстратов (пассивная диффузия, облегченная
диффузия, активный транспорт). Путь Энтнера-Дудорова. Расщепление сахаров в
пентозофосфатном
цикле.
Метилглиоксалевый
шунт.
Разнообразие
энергетического метаболизма. Диссимиляционное восстановление нитрата.
Анаплеротические последовательности. Биосинтез гликогена, полиоксимасляной
кислоты, полифосфатов.
5.
КАТАБОЛИЧЕСКАЯ
АКТИВНОСТЬ
АЭРОБНЫХ
ГЕТЕРОТРОФОВ (2 часа)
Расщепление полимеров экзоферментами. Рост на аминокислотах. Рост на
органических кислотах. Рост на алифатических углеводородах. Рост на
ароматических соединениях (орто-расщепление или 3-оксоадипатный путь, метарасщепление.
Рост
на
С1-соединениях.
Облигатные
метилотрофы.
8
Факультативные метилотрофы. Неполные окисления.
6. РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА У БАКТЕРИЙ (2 часа).
Регуляция синтеза ферментов путем индукции и репрессии (индукция ферментов,
катаболитная репрессия, репрессия конечным продуктом, синтез ферментов
центральных
метаболических
путей).
Регуляция
активности
ферментов.
Ингибирование по типу обратной связи. Свойства аллостерических ферментов.
Аллостерическая регуляция центральных метаболических путей. Ковалентная
модификация ферментов.
7. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ БРОЖЕНИЯ (3 часа)
Спиртовое
брожение.
Гомоферментативное
и
Эффект
Пастера.
гетероферментативное
Молочнокислое
брожение.
молочнокислое
брожение.
Брожение, вызываемое бифидобактериями. Образование диацетила и ацетоина.
Маслянокислое и ацетон-бутаноловое брожение. Ферредоксин и пируват, путь
образования бутирата. Образование ацетона и бутанола. Этанол-ацетатное
брожение. Особенности биосинтетического метаболизма клостридий. Смешанное
и бутандиоловое брожение. Пируват-формиат-лиаза. – ацетолактат-синтаза.
Формиат-водород-лиаза.
Пропионовокислое
и
янтарнокислое
брожение.
Сульфатредукция (десульфатация). Брожение азотсодержащих соединений.
8. ХЕМОЛИТОТРОФНЫЙ И ФОТОТРОФНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ (2
часа)
Физиологические группы хемолитотрофов. Получение энергии и генерирование
восстановительных эквивалентов. Факультативные и облигатные хемолитотрофы.
Окисление окиси углерода. Ассимиляция СО2. Фототрофный метаболизм.
Реакции
фотосинтезирующего
аппарата.
Обратный
перенос
электронов.
Углеродный метаболизм. Фотообразование молекулярного водорода. Фотосинтез
у галобактерий.
II.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ (23 часа)
1. Знакомство с периодическими изданиями по биохимии микробов.
2. Знакомство с научной и научно-популярной литературой
освещающих
9
вопросы метаболизма микроорганизмов
3. Отбор
методик
изучения
особенностей
метаболизма
разных
видов
микроорганизмов.
4. Подготовка реферата.
5. Подготовка вопросов к зачету.
Темы для рефератов
Экстремальные галлофилы
Метанобразующие бактерии
Экстремальные термофилы
Аммонификаторы
Бактерии, разрушающие целлюлозу
Метилотрофы
Некультивируемые формы бактерий
L-формы микроорганизмов и их значение в медицине
Пигменты фотосинтезирующих эубактерий
Маслянокислое, молочночнокислое брожение в промышленном производстве
Карбаксидобактерии
Водородные бактерии
III.
ВОПРОСЫ К ЗАЧЕТУ
1. Механизмы синтеза АТФ у микроорганизмов
2. основные источники энергии у бактерий
3. Потребности бактерий в факторах роста
4. Транспорт глюкозы в клетки E.coli
5. Метаболический путь Эмдена-Мейергофа-Парнаса
6. Дыхание. Компоненты электрон-транспортной цепи.
7. Особенности ассимиляции аммиака у E.coli
8. Ассимиляционное восстановление сульфата.
9. Биосинтез аминокислот
10.Образование пентозофосфатов и NADPH2
11.Биосинтез нуклеиновых кислот
10
12.Биосинтез липидов
13.Образование углеводов
14.Синтез полимеров и мономеров
15.Запасающие вещества бактерий
16.Аэробный рост E.coli на субстратах, отличных от глюкозы
17.Метоболическое разнообразие аэробных гетеротрофов. Сравнительный анализ путей
субстратного фосфорилирования .
18.Механизмы питания у бактерий.
19. Катаболическая активность аэробных гетеротрофов
20.Расщепление полимеров микроорганизмами
21.Рост на аминокислотах
22.Рост на органических кислотах
23.Рост бактерий на алифатических углеводородах и ароматических соединениях и
24. Рост на С1-соединениях
25.Регуляция синтеза ферментов путем индукции и репрессии
26.Регуляция активности ферментов
27.Брожение. Типы брожения у бактерий.
28.Спиртовое брожение
29.Молочно-кислое брожение
30.Маслянокислое брожение
31.Пропионовокислое брожение
32.Метановое и ацетатное брожение
33.Хемолитотрофный метаболизм
34.Фототрофный метаболизм
35. Бактерии гетеротрофы и автотрофы
36.Фиксация молекулярного азота
IV. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Основная
11
1. Лысак В.В. Микробиология. М.: Изд-во БГУ, 2007. 430 с.
2. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. Экология
микроорганизмов. - М.: Издательский центр "Академия", 2004. 272 с.
3. Современная микробиология. Прокариоты. Том 1. / Под ред. Й. Ленгелера, Г.
Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005. 656 с.
Дополнительная
1. Заварзин Г.А. Литотрофные микроорганизмы. М.: Наука, 1972. С.106 – 161
2. Заварзин Г.А. Водородные бактерии и карбаксидобактерии М.: Наука, 1978.
206 с.
3. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их
использования. М.: Наука, 1975. 389 с.
4. Кондратьева Е.Н. Фотосинтезирующие бактерии и бактериальный
фотосинтез. М.: Наука, 1972.
5. Кондратьева Е.Н. Хемолитотрофы и метилотрофы. М.: Изд-во МГУ, 1983.
176 с.
6. Малашенко Ю.Р., Романовская В.А., Троценко Ю.А. Метанокисляющие
микроорганизмы М.: Наука, 1978. 197 с.
Список образовательных интернет-ресурсов
основные
http://www.biologie.unihamburg.de/bonline/e04/04.htm
http://bookfi.org/book/1472796
http://bookfi.org/book/1335261
Растительные клетки и ткани. Сборник статей по
цитологии и гистологии растений. Иллюстрации
и микрофотографии различных тканей и
процессов.
Мямин В. Е. Биохимия и физиология
микроорганизмов. – Мн.: БГУ, 2009. – 56 с
Структура бактериальных сообществ почв
Автор: Добровольская Т.Г.
Год издания: 2002
Место издания: ИКЦ «АКАДЕМКНИГА» Москва
Количество страниц: 281
дополнительные
12
1. Варфоломеев С. Д. Химическая энзимология. М.: Изд-во «Академия»,
2005. 480 с.
http://www.kodges.ru/medik/naukmed/71891-ximicheskayayenzimologiya.html
2. Современная микробиология. Прокариоты. Том 1. / Под ред. Й. Ленгелера, Г.
Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005. 656 с.
http://www.twirpx.com/file/866273/
V.
ТЕХНИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ
1. Схемы метаболических путей анаболизма, катаболизма для демонстрации с
использованием мультимедийного проектора
2. Таблицы, рисунки, схемы (плакаты)
3.Оборудование и помещение микробиологической лаборатории
13
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
КОНСПЕКТЫ ЛЕКЦИЙ
по дисциплине «Основы регуляции метаболизма микроорганизмов»
Специальность — 020209.65 микробиология
г. Владивосток
2012
14
I.
СОДЕРЖАНИЕ ДИСЦИПЛИНЫ
1. ПИТАНИЕ БАКТЕРИЙ (2часа)
Главные и минорные биоэлементы, необходимые для жизнеобеспечения
бактериальной
клетки.
Два
основных
механизма
синтеза
АТФ
(фосфорилирование при переносе электронов, фосфорилирование на уровне
субстрата. Основные типы энергетического обмена в зависимости от
питательных веществ как источников энергии (фототрофия, хемотрофия).
Потребности бактерий в факторах роста.
Всем
микроорганизмам
для
осуществления
процессов
питания,
дыхания, размножения необходимы питательные вещества. В качестве
питательных веществ и источников энергии микроорганизмы используют
различные органические и неорганические соединения, для нормальной
жизнедеятельности им требуются также микроэлементы и факторы роста.
Процесс питания микроорганизмов имеет ряд особенностей: во-первых,
поступление питательных веществ происходит через всю поверхность клетки;
во-вторых,
микробная
клетка
обладает
исключительной
быстротой
метаболических реакций; в-третьих, микроорганизмы способны довольно
быстро
адаптироваться
Разнообразие
условий
к
изменяющимся
существования
условиям
среды
микроорганизмов
обитания.
обусловливает
различные типы питания. Типы питания определяются по характеру усвоения
углерода и азота. Источником других органогенов - водорода и кислорода
служит вода. Вода необходима микроорганизмам и для растворения
питательных веществ, так как они могут проникать в клетку только в
растворенном виде.
По усвоению углерода микроорганизмы делят на два типа: автотрофы и
гетеротрофы. Автотрофы (от греч. autos - сам, trophe - питание) способны
синтезировать сложные органические вещества из простых неорганических
соединений. Они могут использовать в качестве источника углерода
углекислоту и другие неорганические соединения углерода. Автотрофами
15
являются многие почвенные бактерии (нитрифицирующие, серобактерии и
др.). Гетеротрофы (от греч. heteros - другой, trophe - питание) для своего роста
и развития нуждаются в готовых органических соединениях. Они могут
усваивать углерод из углеводов (чаще всего глюкозы), многоатомных спиртов,
органических кислот, аминокислот и других органических веществ.
Гетеротрофы представляют обширную группу микроорганизмов, среди
которых различают сапрофитов и паразитов. Сапрофиты (от греч. sapros гнилой, phyton-- растение) получают готовые органические соединения от
отмерших ©рганизмов. Они играют важную роль в разложении мертвых
органических остатков, например бактерии гниения и др. Паразиты (от греч.
parasitos--нахлебник) живут и размножаются за счет органических веществ
живой клетки растений, животных или человека. К таким микроорганизмам
относятся риккетсии, вирусы и некоторые простейшие (см. главу 11). По
способности усваивать азот микроорганизмы делятся также на две группы:
аминоавтотрофы и аминогетеротрофы. Аминоавтотрофы для синтеза белка
клетки используют молекулярный азот воздуха (клубеньковые бактерии,
азотобактер) или усваивают его из аммонийных солей. Аминогетеротрофы
получают азот из органических соединений - аминокислот, сложных белков. К
ним относят все патогенные микроорганизмы и большинство сапрофитов.
По источникам энергии среди микроорганизмов различают фототрофы,
использующие для биосинтетических реакций энергию солнечного света
(пурпурные серобактерии) и хемотрофы, которые получают энергию за счет
окисления неорганических веществ (нитрифицирующие бактерии и др.) и
органических соединений (большинство бактерий, в том числе и патогенные
для человека виды). Однако резкой границы между типами питания микробов
провести нельзя, так как есть такие виды микроорганизмов, которые могут
переходить от гетеротрофного типа питания к автотрофному, и наоборот.
В настоящее время для характеристики типов питания введена новая
терминология: гетеротрофы называют органотрофами, а автотрофы
-
литотрофами (от греч. litos - камень), так как подобные микроорганизмы
16
способны расти в чисто минеральной среде. Факторы роста. Микроорганизмы
для своего роста и размножения нуждаются в особых веществах, которые сами
синтезировать не могут и должны получать их в готовом виде. Эти вещества
называют факторами роста, и нужны они микробным клеткам в небольших
количествах. К ним относят различные витамины, некоторые аминокислоты
(необходимые для синтеза белка), пуриновые и пиримидиновые основания
(идущие на построение нуклеиновых кислот) и др. Многие факторы роста
входят в состав различных ферментов и играют роль катализаторов в
биохимических
процессах.
Знание
потребностей
микроорганизмов
в
питательных веществах и факторах роста очень важно, в частности, для
создания питательных сред, применяемых для их выращивания. Транспорт
питательных веществ. Питательные вещества могут проникать в цитоплазму
микробных клеток только в виде небольших молекул и в растворенном
виде.Биологически значимые элементы (в противоположность биологически
инертным элементам) — химические элементы, необходимые живым
организмам для обеспечения нормальной жизнедеятельности. Биологически
значимые элементы классифицируют на макроэлементы (содержание которых
в живых организмах составляет больше 0,01 %) и микроэлементы (содержание
менее 0,001 %).
Биогенные элементы:
Кислород — 65%
Углерод — 18%
Водород — 10%
Азот — 3%
Эти
макроэлементы
называют
биогенными
(органогенными)
элементами или макронутриентами (англ. macronutrient). Из макронутриентов
преимущественно построены такие органические вещества, как белки, жиры,
углеводы и нуклеиновые кислоты. Для обозначения макронутриентов иногда
используют акроним CHNO, состоящий из обозначений соответствующих
химических элементов в таблице Менделеева.
17
Другие макроэлементы:
Калий
Кальций
Магний
Натрий
Сера
Фосфор
Хлор
Микроэлементы.
Термин
«микроэлементы»
получил
особое
распространение в медицинской, биологической и сельскохозяйственной
научной литературе в середине XX века. В частности, для агрономов стало
очевидным, что даже достаточное количество «макроэлементов» в удобрениях
(троица NPK — азот, фосфор, калий) не обеспечивает нормального развития
растений.
Микроэлементами называются элементы, содержание которых в
организме мало, но они участвуют в биохимических процессах и необходимы
живым организмам. Поддержание постоянства внутренней среды (гомеостаза)
организма предусматривает в первую очередь поддержание качественного и
количественного содержания минеральных веществ в тканях органов на
физиологическом уровне.
По современным данным более 30 микроэлементов считаются
необходимыми для жизнедеятельности растений, животных и человека. Среди
них (в алфавитном порядке):
Бром
Железо
Йод
Кобальт
Марганец
Медь
Молибден
18
Селен
Фтор
Хром
Цинк
Чем меньше концентрация соединений в организме, тем труднее
установить биологическую роль элемента, идентифицировать соединения, в
образовании которых он принимает участие. К числу несомненно важных
относят ванадий, кремний и др.
Аденозинтрифосфа́т (сокр. АТФ, англ. АТР) — нуклеотид, играет
исключительно важную роль в обмене энергии и веществ в организмах; в
первую очередь соединение известно как универсальный источник энергии
для всех биохимических процессов, протекающих в живых системах. АТФ
был открыт в 1929 году Карлом Ломанном, а в 1941 году Фриц Липман
показал, что АТФ является основным переносчиком энергии в клетке.
В организме АТФ синтезируется путём фосфорилирования АДФ:
АДФ + H3PO4 + энергия → АТФ + H2O.
Фосфорилирование АДФ возможно двумя способами: субстратное
фосфорилирование и окислительное фосфорилирование (используя энергию
окисляющихся веществ). Основная масса АТФ образуется на мембранах
митохондрий в ходе окислительного фосфорилирования H-зависимой АТФсинтазой.
Субстратное
фосфорилирование
АТФ
не
требует
участия
мембранных ферментов, оно происходит в процессе гликолиза или путём
переноса фосфатной группы с других макроэргических соединений.
Реакции фосфорилирования АДФ и последующего использования АТФ
в качестве источника энергии образуют циклический процесс, составляющий
суть энергетического обмена. В организме АТФ является одним из самых
часто обновляемых веществ, так у человека продолжительность жизни одной
молекулы АТФ менее 1 мин. В течение суток одна молекула АТФ проходит в
среднем 2000—3000 циклов ресинтеза (человеческий организм синтезирует
около 40 кг АТФ в день), то есть запаса АТФ в организме практически не
19
создаётся, и для нормальной жизнедеятельности необходимо постоянно
синтезировать новые молекулы АТФ.
Окислительное фосфорилирование — один из важнейших компонентов
клеточного дыхания, приводящего к получению энергии в виде АТФ.
Субстратами
окислительного
фосфорилирования
служат
продукты
расщепления органических соединений — белки, жиры и углеводы. Процесс
окислительного фосфорилирования проходит на кристах митохондрий.
Однако чаще всего в качестве субстрата используются углеводы. Так, клетки
головного мозга не способны использовать для питания никакой другой
субстрат, кроме углеводов. Предварительно сложные углеводы расщепляются
до простых, вплоть до образования глюкозы. Глюкоза является универсальным
субстратом
в
процессе
клеточного
дыхания.
Окисление
глюкозы
подразделяется на 3 этапа: гликолиз; окислительное декарбоксилирование и
цикл Кребса; окислительное фосфорилирование.
Факторы
роста
—
это
естественные
соединения,
способные
стимулировать рост, пролиферацию и/или дифференцировку живых клеток.
Как правило, это пептидные или стероидные гормоны. Факторы роста
функционируют как сигнальные молекулы для взаимодействия между
клетками.
Примерами
являются
цитокины
и
гормоны,
связываемые
специфическими клеточными рецепторами. Итальянский нейробиолог Рита
Леви-Монтальчини за открытие факторов роста, в частности, фактора роста
нервов, получила вместе с Стэнли Коэном Нобелевскую премию по
физиологии и медицине 1986 года. Другими широко известными факторами
роста являются эритропоэтин и инсулиноподобный фактор роста.
Для питания, роста и размножения бактерий необходимы особые
вещества, названные факторами роста. Если бактерии не могут эти вещества
синтезировать, они должны их получать из среды в готовом виде. Отсутствие
или дефицит фактора роста в среде приостанавливает рост и размножение
микроорганизмов.
20
Факторы роста микробов, объединенные биологическим понятием
стимуляторов, являются соединениями, различными по своей химической
природе.
К
ним
относятся
витамины,
аминокислоты,
пуриновые
и
пиримидиновые основания. Требовательность микроорганизмов к наличию в
среде факторов роста весьма разнообразна.
Витамины как факторы роста. Никотиновая кислота или ее амид
является фактором роста для многих микроорганизмов — дифтерийной
палочки, золотистого стафилококка, дизентерийных бактерий и др. Она входит
в
состав
коферментов
никотин
амиддинуклеотида
и
никотин
амиддинуклеотидфосфата, которые являются переносчиками водорода и
необходимы для осуществления в клетках окислительно-восстановительных
реакций. Гемин — составная часть гемоглобина представляет собой
железопорфирин. Он входит в структуру некоторых дыхательных ферментов
(цитохром, цитохромоксидаза, каталаза, иероксидаза). Пантотеновая кислота
— фактор роста и размножения для многих бактерий пропионовокислых,
стрептококков, пневмококков, дифтерийной палочки и др. Она действует на
рост некоторых бактерий при концентрации порядка 0,0002 мкг в 1 мл среды.
Пантотеновая кислота участвует в синтезе коэнзима А, который играет важную
роль
в
ходе
клеточных
реакций
с
участием
уксусной
кислоты
(ацетилирование), в частности в образовании жирных кислот, фосфолипидов,
холина и пр. Тиамин представляет собой сложное соединение, в которое
входят пиримидин и тиазол. Биологическое значение тиамина определяется
тем, что он входит в состав тиаминниро фосфата
кокарбоксилазы,
играющего
важную
роль
в
— кофермента
углеводном
обмене
и
обеспечивающего декарбоксилирование а кетокислот.
Рибофлавин (витамин Вг) как фактор роста необходим для некоторых
молочнокислых бактерий, столбнячной палочки (CI. tetani), возбудителя
газовой гангрены (CI. perfringens), гемолитического стрептококка (Str.
haemolyticus) и др.
21
Биологическое
значение
рибофлавина
как
фактора
роста
обусловливается его участием в окислительно восстановительных процессах.
Пиридокеин и его производные пиридоксаль и пиридоксамин играют важную
роль в обмене и декарбоксилированип аминокислот.
2. СИНТЕЗ
АТФ
ПРИ АЭРОБНОМ
РОСТЕ
НА СРЕДАХ С
ГЛЮКОЗОЙ (2 часа)
Транспорт глюкозы в клетки на примере E.coli. Метаболический путь
Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. Окисление ацетил-СоА в цикле трикарбоновых
кислот. Образование АТФ в дыхательной цепи. Компоненты дыхательной
цепи.
Фосфорилирование
при
переносе
электронов.
Разобщители
и
ингибиторы. Значение пероксид-дисмутазы.
Гликолиз (фосфотриозный путь, или шунт Эмбдена — Мейерхофа, или
путь
Эмбдена-Мейергофа-Парнаса)
—
ферментативный
процесс
последовательного расщепления глюкозы в клетках, сопровождающийся
синтезом АТФ. Гликолиз при аэробных условиях ведёт к образованию
пировиноградной кислоты (пирувата), гликолиз в анаэробных условиях ведёт к
образованию молочной кислоты (лактата). Гликолиз является основным путём
катаболизма глюкозы в организме животных.
Первой реакцией гликолиза является фосфорилирование молекулы
глюкозы, происходящее при участии тканеспецифичного
фермента гексокиназы с затратой энергии 1 молекулы АТФ; образуется
активная форма глюкозы — глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф):
22
В следующей реакции (2) ферментом фосфоглюкоизомеразой Г-6-Ф
превращается во фруктозо-6-фосфат (Ф-6-Ф):
Энергия для этой реакции не требуется, и реакция является полностью
обратимой. На данном этапе в процесс гликолиза может также включаться
путём фосфорилирования и фруктоза.
Далее почти сразу друг за другом следуют две реакции: необратимое
фосфорилирование
фруктозо-6-фосфата
(3)
и
обратимое
альдольное
расщепление образовавшегося фруктозо-1,6-бифосфата (Ф-1,6-бФ) на две
триозы (4).
Фосфорилирование
затратой
энергии
ещё
Ф-6-Ф
одной
осуществляется фосфофруктокиназой с
молекулы
АТФ;
это
вторая ключевая
реакция гликолиза, её регуляция определяет интенсивность гликолиза в целом.
Альдольное
расщепление Ф-1,6-бФ происходит
под
действием альдолазы фруктозо-1,6-бифосфата:
23
В результате четвёртой реакции
образуются дигидроксиацетонфосфат и глицеральдегид-3-фосфат, причём
первый почти сразу под действиемфосфотриозоизомеразы переходит во
второй (5), который и участвует в дальнейших превращениях:
Каждая
молекула
глицеральдегидфосфата
присутствии дегидрогеназы
окисляется НАД+ в
глицеральдегидфосфата до 1,3-
дифосфоглицерата (6):
Далее с 1,3-дифосфоглицерата, содержащего макроэргическую связь в
1
положении,
переносится
ферментом фосфоглицераткиназой на
остаток
фосфорной
кислоты
молекулу
(реакция 7) —
АДФ
образуется
молекула АТФ:
24
Затем последовательно: фосфоглицеролмутаза образует 2-фосфоглицерат (8):
Енолаза образует фосфоенолпируват (9):
И наконец происходит вторая реакция субстратного фосфорилирования АДФ с
образованием енольной формы пирувата и АТФ (10):
Реакция протекает под действием пируваткиназы. Это последняя
ключевая реакция гликолиза. Изомеризация енольной формы пирувата в
пируват происходит неферментативно. С момента образования Ф-1,6-бФ с
выделением энергии протекают только реакции 7 и 10, в которых и происходит
к субстратное фосфорилирование АДФ.
Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса, цитратный цикл, цикл
лимонной кислоты) — центральная часть общего пути катаболизма,
циклический биохимический аэробный процесс, в ходе которого происходит
превращение двух- и трёхуглеродных соединений, образующихся как
промежуточные продукты в живых организмах при распаде углеводов, жиров
и белков, до CO2. При этом освобождённый водород направляется в цепь
тканевого дыхания, где в дальнейшем окисляется до воды, принимая
25
непосредственное участие в синтезе универсального источника энергии —
АТФ.
Цикл Кребса — это ключевой этап дыхания всех клеток, использующих
кислород, центр пересечения множества метаболических путей в организме.
Кроме значительной
энергетической роли
циклу отводится также и
существенная пластическая функция, то есть это важный источник молекулпредшественников, из которых в ходе других биохимических превращений
синтезируются такие важные для жизнедеятельности клетки соединения как
аминокислоты, углеводы, жирные кислоты и др.
Цикл превращения лимонной кислоты в живых клетках был открыт и
изучен немецким биохимиком Хансом Кребсом, за эту работу он (совместно с
Ф. Липманом) был удостоен Нобелевской премии (1953 год).
У эукариот все реакции цикла Кребса протекают внутри митохондрий,
причём катализирующие их ферменты, кроме одного, находятся в свободном
состоянии
в
митохондриальном
сукцинатдегидрогеназа,
которая
матриксе,
исключение
локализуется
на
составляет
внутренней
митохондриальной мембране, встраиваясь в липидный бислой. У прокариот
реакции цикла протекают в цитоплазме.
Дыхательная электронтранспортная цепь (ЭТЦ, ETC, Electron
transport
chain)
—
система
структурно
и
функционально
связанных
трансмембранных белков и переносчиков электронов. ЭТЦ позволяет запасти
энергию, выделяющуюся в ходе окисления НАД∙Н и ФАДН2 молекулярным
кислородом (в случае аэробного дыхания) или иными веществами (в случае
анаэробного) в форме трансмембранного протонного потенциала за счёт
последовательного переноса электрона по цепи, сопряжённого с перекачкой
протонов через мембрану.
У прокариот ЭТЦ локализована в ЦПМ, у эукариот — на внутренней
мембране митохондрий. Переносчики расположены по своему окислительновосстановительному потенциалу, транспорт электрона на всём протяжении
цепи протекает самопроизвольно.
26
Протонный
потенциал
преобразуется
АТФ-синтазой
в
энергию
химических связей АТФ. Сопряжённая работа ЭТЦ и АТФ-синтазы носит
название окислительного фосфорилирования.
Бактерии, в отличие от
митохондрий, используют большой набор доноров и акцепторов электронов, а
также разные пути переноса электрона между ними. Эти пути могут
осуществляться одновременно, например, E. coli при выращивании на среде,
содержащей глюкозу в качестве основного источника органического вещества,
использует две НАДН дегидрогеназы и две хинолоксидазы, что означает
наличие 4 путей транспорта электрона. Большинство ферментов ЭТЦ
индуцибельны и синтезируются только в случае, если путь, в который они
входят, востребован.
Донором электрона помимо органического вещества у бактерий могут
выступать молекулярный водород, угарный газ, аммоний, нитрит, сера,
сульфид, двухвалентное железо. Вместо НАДН и сукцинатдегидрогеназы
могут
присутствовать
формиат-,
лактат-,
глицеральдегид-3-
фосфатдегидрогеназа, гидрогеназа и т. д. Вместо оксидазы, использующейся в
аэробных условиях, в отсутствие кислорода бактерии могут использовать
редуктазы, восстанавливающие различные конечные акцепторы электрона:
фумаратредуктазу, нитрат- и нитритредуктазу и т. д.
Так
как
электроны
всегда
стремятся
переходить
от
электроотрицательных систем к электроположительным, их транспорт по ЦПЭ
к кислороду сопровождается снижением свободной энергии.
При сравнении величин электрохимических потенциалов переносчиков
электронов снижение свободной энергии происходит на каждом этапе ЦПЭ, и
энергия электронов выделяется порциями.
Вместе с тем в дыхательной цепи можно выделить 3 участка, в которых
перенос электронов сопровождается относительно большим снижением
свободной энергии. Эти этапы способны обеспечить энергией синтез АТФ, так
как количество выделяющейся свободной энергии приблизительно равно
энергии, необходимой для синтеза АТФ из АДФ и фосфата. Экспериментально
27
было подтверждено, что процесс переноса электронов по ЦПЭ и синтез АТФ
энергетически сопряжены.
Первый процесс - перенос электронов от восстановленных коферментов
NADH и FADH2 через ЦПЭ на кислород - экзергонический. Например:
NADH + Н+ +1/2 O2 → NAD+ + H2O + 52 ккал/моль(≈220 кДж/моль).
(1)
Второй процесс - фосфорилирование АДФ, или синтез АТФ, эндергонический:
АДФ + Н3РО4+7,3 ккал/моль (30,5 кДж/моль) = АТФ + Н2О. (2)
Механизм сопряжения окисления и фосфорилирования. Каким же
образом осуществляется
сопряжение этих
двух
процессов?
Наиболее
обоснованный ответ на этот вопрос даёт хемиосмотическая теория Митчелла,
предложенная им в 1961 г. Основные положения были подтверждены и
разработаны детально совместными усилиями многих исследователей в
последующие годы.
1. Протонный градиент и электрохимический потенциал
Перенос электронов по дыхательной цепи от NADH к кислороду
сопровождается выкачиванием протонов из матрикса митохондрий через
внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. На эту работу
затрачивается часть энергии электронов, переносимых по ЦПЭ.
Протоны, перенесённые из матрикса в межмембранное пространство, не
могут вернуться
обратно в матрикс, так как внутренняя мембрана
непроницаема для протонов. Таким образом, создаётся протонный градиент,
при котором концентрация протонов в межмембранном пространстве больше,
а рН меньше, чем в матриксе. Кроме того, каждый протон несёт
положительный заряд, и вследствие этого появляется разность потенциалов по
обе стороны мембраны: отрицательный заряд на внутренней стороне и
положительный
-
на
внешней.
В
совокупности
электрический
и
28
концентрационный градиенты составляют электрохимический потенциал
ΔμН+ - источник энергии для синтеза АТФ. Так как наиболее активный
транспорт протонов в межмембранное пространство, необходимый для
образования
ΔμН+,
происходит
на
участках
ЦПЭ,
соответствующих
расположению комплексов I, III и IV, эти участки называют пунктами
сопряжения дыхания и фосфорилирования.
Механизм транспорта протонов через мито-хондриальную мембрану в
пунктах сопряжения недостаточно ясен. Однако установлено, что важную роль
в этом процессе играет KoQ. Наиболее детально механизм переноса протонов
при участии KoQ изучен на уровне комплекса III.
KoQ переносит электроны от комплекса I к комплексу III и протоны из
матрикса
в
межмембранное
пространство,
совершая
своеобразные
циклические превращения, называемые Q-циклами. Донором электронов для
комплекса III служит восстановленный убихинон (QH2), а акцептором цитохром с. Цитохром с находится с внешней стороны внутренней мембраны
митохондрий; там же располагается активный центр цитохрома с1 с которого
электроны переносятся на цитохром с.
29
Рис. Сопряжение дыхания и синтеза АТФ в митохондриях. I - NADHдегидрогеназа; II - сукцинат дегидрогеназа; III - QН2-дегидрогеназа; IV цитохромоксидаза; V - АТФ-синтаза. Энергия протонного потенциала
(электрохимического потенциала ΔμН+ используется для синтеза АТФ, если
протоны возвращаются в матрикс через ионные каналы АТФ-синтазы.
Рис.
Сопряжение переноса электронов через дыхательный
комплекс III с транспортом Н+ через мембрану. Восстановленный убихинон
(QH2) взаимодействует с Fе3+ гема b1 и, восстанавливая его, освобождает
протон в водную фазу, превращаясь в семихинон (НQ•). Электрон от тема b1
переносится на Fe3+ тема b2. HQ• отдаёт второй электрон на FeS-центр,
расположенный ближе к наружной поверхности мембраны; при этом второй
протон оказывается в межмембранном пространстве; электрон передаётся на
цитохром с1, а далее на цитохром с. Окисленный Q диффундирует к
внутренней стороне мембраны, где получает электрон от тема b2 и протон из
матрикса, превращаясь в НQ•. НQ• получает электрон от комплекса I и протон
из матрикса; в мембране образуется QН2, и весь процесс повторяется сначала.
В мембране существует стационарный общий фонд Q/QH2, из которого
каждая молекула QH2 в одном цикле обеспечивает перенос протонов из
матрикса в межмембранное пространство и электронов, которые в конечном
итоге поступают на кислород. На работу, совершаемую при выкачивании
протонов, расходуется часть свободной энергии, которая освобождается при
переносе
электронов
по
градиенту
редокс-потенциала.
Энергия
30
электрохимического потенциала (∆μH+) используется для синтеза АТФ, если
протоны возвращаются в матрикс через ионные каналы АТФ-синтазы.
2. Строение АТФ-синтазы и синтез АТФ
АТФ-синтаза
(Н+-АТФ-аза)
-
интегральный
белок
внутренней
мембраны митохондрий. Он расположен в непосредственной близости к
дыхательной цепи. АТФ-синтаза состоит из 2 белковых комплексов,
обозначаемых как F0 и F1.
Гидрофобный комплекс F0 погружён в мембрану. Он служит
основанием, которое фиксирует АТФ-синтазу в мембране. Комплекс F0
состоит из нескольких субъединиц, образующих канал, по которому протоны
переносятся в матрикс.
Комплекс F1 выступает в митоховдриальный матрикс. Он состоит из 9
субъединиц (Зα, 3β, γ, ε, δ). Субъединицы аир уложены попарно, образуя
"головку"; между α- и β-субъединицами располагаются 3 активных центра, в
которых происходит синтез АТФ; γ-, ε-, δ- субъединицы связывают комплекс
F1 с F0.
Повышение концентрации протонов в межмембранном пространстве
активирует АТФ-синтазу. Электрохимический потенциал ΔμH+ заставляет
протоны двигаться по каналу АТФ-синтазы в матрикс. Параллельно под
действием ΔμH+ происходят конформационные изменения в парах α, βсубъединиц белка F1, в результате чего из АДФ и неорганического фосфата
образуется АТФ. Электрохимический потенциал, генерируемый в каждом из 3
пунктов сопряжения в ЦПЭ, используют для синтеза одной молекулы АТФ.
31
Рис. Строение и механизм действия АТФ-синтазы. А - F0 и F1 - комплексы
АТФ-синтазы, В состав F0входят полипептидные цепи, которые образуют
канал, пронизывающий мембрану насквозь. По этому каналу протоны
возвращаются в матрикс из межмембранного пространства; белок F1 выступает
в матрикс с внутренней стороны мембраны и содержит 9 субъединиц, 6 из
которых образуют 3 пары α и β ("головка"), прикрывающие стержневую часть,
которая состоит из 3 субъединиц γ, δ и ε. γ и ε подвижны и образуют стержень,
вращающийся внутри неподвижной головки и связанный с комплексом F0. В
активных центрах, образованных парами субъединиц α и β, происходит
связывание АДФ, неорганического фосфата (Рi) и АТФ. Б - Каталитический
цикл синтеза АТФ включает 3 фазы, каждая из которых проходит поочерёдно в
3 активных центрах: 1 - связывание АДФ и Н3РО4; 2 - образование
фосфоангидридной связи АТФ; 3 - освобождение конечного продукта. При
каждом переносе протонов через канал F0 в матрикс все 3 активных центра
катализируют очередную фазу цикла. Энергия электрохимического потенциала
32
расходуется на поворот стержня, в результате которого циклически изменяется
конформация α- и β-субъединиц и происходит синтез АТФ.
3.Коэффициент окислительного фосфорилирования
Окисление молекулы NADH в ЦПЭ сопровождается образованием 3
молекул АТФ; электроны от FAD-зависимых дегидрогеназ поступают в ЦПЭ
на KoQ, минуя первый пункт сопряжения. Поэтому образуются только 2
молекулы
АТФ.
Отношение
количества
фосфорной
кислоты
(Р),
использованной на фосфорилирование АДФ, к атому кислорода (О),
поглощённого в процессе дыхания, называют коэффициентом окислительного
фосфорилирования и обозначают Р/О. Следовательно, для NADH Р/О = 3, для
сукцината Р/О - 2. Эти величины отражают теоретический максимум синтеза
АТФ, фактически эта величина меньше.
4.Дыхательный контроль
Окисление субстратов и фосфорилирование АДФ в митохондриях
прочно сопряжены. Скорость использования АТФ регулирует скорость потока
электронов в ЦПЭ. Если АТФ не используется и его концентрация в клетках
возрастает, то прекращается и поток электронов к кислороду. С другой
стороны, расход АТФ и превращение его в АДФ увеличивает окисление
субстратов и поглощение кислорода. Зависимость интенсивности дыхания
митохондрий от концентрации АДФ называют дыхательным контролем.
Механизм дыхательного контроля характеризуется высокой точностью и имеет
важное значение, так как в результате его действия скорость синтеза АТФ
соответствует потребностям клетки в энергии. Запасов АТФ в клетке не
существует. Относительные концентрации АТФ/АДФ в тканях изменяются в
узких пределах, в то время как потребление энергии клеткой, т.е. частота
оборотов цикла АТФ и АДФ, может меняться в десятки раз.
Общее содержание АТФ в организме 30-50 г, но каждая молекула АТФ
в клетке "живёт" меньше минуты. В сутки у человека синтезируется 40-60 кг
АТФ и столько же распадается. Увеличение концентрации АДФ немедленно
приводит к ускорению дыхания и фосфорилирования.
33
Ингибиторы
окислительного
фосфорилирования.
Ингибиторы
блокируют V комплекс:
Олигомицин — блокируют протонные каналы АТФ-синтазы.
Атрактилозид, циклофиллин — блокируют транслоказы.
Разобщители окислительного фосфорилирования. Разобщители —
липофильные вещества, которые способны принимать протоны и переносить
их через внутреннюю мембрану митохондрий минуя V комплекс(его
протонный канал). Разобщители:
Естественные — продукты перекисного окисления липидов, жирных
кислот с длинной цепью; большие дозы тиреоидных гормонов.
Искусственные — динитрофенол, эфир, производные витамина К,
анестетики.
Они не прекращают процессов окисления, но снижают синтез АТФ.
Дыхательная цепь работает, а АТФ при этом синтезируется в меньшем
количестве, чем в норме. Тогда энергия, получаемая при переносе электронов
по цепи МтО, выделяется в виде тепла. Такое состояние, когда происходит
окисление субстратов, а фосфорилирование (образование АТФ из АДФ и Ф) не
идет, называется разобщением окисления и фосфорилирования. К такому
состоянию
может
приводить
действие
веществ-разобщителей.
2,4-
динитрофенол, открытый в 1944 году Липманом, при введении в организм
повышает температуру тела и понижает синтез АТФ. Это вещество, наряду с
другими, открытыми позже, пытались использовать для лечения ожирения, но
безуспешно.
Механизм действия веществ-разобщителей становится понятням только
с точки зрения хемиоосмотической теории. Разобщители являются слабыми
кислотами, растворимыми в жирах. В межмембранном пространстве они
связывают протоны, и затем диффундируют в матрикс, тем самым снижая
ΔμΗ+.
Подобным действием обладает и йодсодержащие гормоны щитовидной
железы – тироксин и трийодтиронин. При состояниях, сопровождающихся
34
гиперфункцией щитовидной железы (например, Базедова болезнь), больным не
хватает энергии АТФ: они много едят (нужно большое количество субстратов
для окисления), но при этом теряют в весе. Большая часть энергии выделяется
в виде тепла.
Схема цепи митохондриального окисления не раскрывает механизма
образования АТФ путем окислительного фософорилирования. Этот механизм
объясняется гипотезой П. Митчелла.
Супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1) относится к группе
антиоксидантных
ферментов.
Вместе
с
каталазой
и
другими
антиоксидантными ферментами она защищает организм человека от постоянно
образующихся
высокотоксичных
кислородных
радикалов.
Супероксиддисмутаза катализирует дисмутацию супероксида в кислород и
пероксид водорода. Таким образом, она играет важнейшую роль в
антиоксидантной защите практически всех клеток, так или иначе находящихся
в
контакте
с
кислородом.
Одним
из
редких
молочнокислая
бактерия
Lactobacillus
молочнокислые
бактерии,
использующие
исключений
и
plantarum
иной
является
родственные
механизм
защиты
ей
от
образующегося супероксида.
Реакцию
дисмутации
супероксида,
катализируемую
супероксиддисмутазой, можно разбить на две части (парциальные реакции)
следующим образом:
M(n+1)+ − СОД + O2− → Mn+ − СОД + O2
Mn+ − СОД + O2− + 2H+ → M(n+1)+ − СОД + H2O2.
где M (переходный металл) = Cu (n=1) ; Mn (n=2) ; Fe (n=2) ; Ni (n=2).
В
данной
реакции
окислительное
состояние
катиона
металла
осцилирует между n и n+1.
Существует несколько форм супероксиддисмутазы в зависимости от
типа переходного металла-кофактора активного центра фермента: Cu,Zn-СОД
(медь как кофактор активного центра и цинк как кофактор, стабилизирующий
35
конформацию), Mn-СОД (с марганцем в активном центре), а также менее
распространённые Fe-СОД (с железом)) и Ni-СОД (с никелем).
Цитозоль
практически
супероксиддисмутазу
типа
всех
эукариотических
Cu,Zn-СОД.
Это
самая
клеток
содержит
распространённая
супероксиддисмутаза и единственная коммерчески доступная форма фермента
(как правило выделенная либо из эритроцитов, либо из печени быка: PDB
1SXA, EC 1.15.1.1). Cu,Zn-СОД является гомодимером (то есть состоящим из
двух одинаковых субъединиц), молекулярная масса 32,5 кДа. Субъединицы
белка связаны друг с другом в первую очередь гидрофобными и
электростатическими связями. Медь и цинк связаны с белковой частью
молекулы через гистидиновые остатки.
Митохондрии эукариотических клеток и многие бактерии содержат
супероксиддисмутазу с Mn (Mn-СОД). Например, митохондриальная СОД
человека: PDB 1N0J, EC 1.15.1.1, молекулярная масса 86-88 кДа. Марганец в
этом ферменте координирован с белком через 3 гистидина и аспартат и с водой
либо гидроксильным лигандом в зависимости от окислительного состояния Mn
(Mn(II) или Mn(III)).
E. coli и многие другие бактерии содержат формы фермента с железом
(Fe-СОД), другие — с марганцем (Mn-СОД), а некоторые — оба эти типа. (E.
coli Fe-SOD: PDB 1ISA, EC 1.15.1.1). Активные центры Mn- и Fe-СОД
содержат те же аминокислоты в боковых цепях.
Супероксидный
радикал
(O2−)
спонтанно
довольно
быстро
дисмутирует в кислород O2 и пероксид водорода H2O2 (~105 M−1 s−1 при pH
7). Тем не менее, супероксид ещё быстрее реагирует с некоторыми другими
молекулами-мишенями, такими как оксид азота NO, образуя при этом
пероксинитрит. Однако, супероксиддисмутаза обладает самой высокой
известной каталитической скоростью реакции (~109 M−1 s−1). Реакция
лимитирована только частотой столкновения супероксида с ферментом (т. н.
диффузионно-лимитированная реакция), благодаря чему супероксиддисмутаза
защищает клетку от повреждающего действия супероксида.
36
Супероксид является одним из основных прооксидантов в клетке,
поэтому СОД играет одну из ключевых ролей в антиоксидантной защите
организма. Роль этого фермента была показана экспериментально: мыши, у
которых отсутствует митохондриальная СОД, выживают лишь несколько дней
после рождения, так как у них развивается сильный оксидативный стресс.
3. БИОСИНТЕЗ РАЗЛИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ГЛЮКОЗЫ
У
ESCERICHIA COLI И ДРУГИХ СУБСТРАТОВ (2 часа)
Состав
Ассимиляционное
макромолекул
клеток
восстановление
E.coli.
сульфата.
Ассимиляция
Биосинтез
аммиака.
аминокислот.
Образование пентозофосфатов и NADPH2. Синтез РНК и ДНК. Биосинтез
липидов. Образование углеводов. Синтез полимеров (липиды, периодические
макромолекулы,
информационные
макромолекулы).
Анаплеротическая
последовательность. Особенности метаболизма при использовании в качестве
субстратов фруктозы, лактозы, ацетата, пирувата и малата.
А. Компоненты бактериальной клетки
Основным компонентом всех клеток является вода (70%). Остальная часть
— это макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды), небольшие
органические молекулы и неорганические ионы. Наиболее распространенными из
макромолекул являются белки, составляющие до 55% сухого веса клетки.
Единичная клетка E. coli имеет объем около 0,88 мкм3. По одной шестой
этого объема составляют мембраны и ДНК (DNA) («нуклеоид»). Оставшееся
внутреннее пространство заполнено цитоплазмой (не «цитозолем», см. с. 202). С
учетом ряда допущений относительно размера белков (средняя молекулярная
масса 40 кДа) и их распределения в клетке можно считать, что цитоплазма клетки
E. coli содержит приблизительно 250000 белковых молекул. В эукариотических
клетках, которые примерно в 1000 раз больше, число белковых молекул можно
оценить в несколько миллиардов.
37
Б. Содержимое бактериальной клетки
На схеме приведен участок цитоплазмы E. coli (длиной около 100 нм),
составляющий 1/600 объема клетки; увеличение 1 х 106. При таком увеличении
размер атома углерода соответствует крупинке соли, а молекулы АТФ —
рисовому зернышку. В целях упрощения небольшие по размерам молекулы,
такие, как вода, кофакторы и метаболиты, на рисунке не приведены (они
показаны в увеличенном виде внизу справа). В таком участке цитоплазмы
содержатся: — сотни макромолекул, необходимых для синтеза белков, т. е. 30
рибосом, более чем 100 белковых факторов, 30 молекул аминоацил-тРНКсинтетаз, 340 молекул тРНК (tRNA), 2-3 мРНК (mRNA) (каждая из которых по
размерам 10-кратно превышает приведенный участок клетки) и 6 молекул РНКполимеразы;
— около 300 молекул других ферментов, включая 130 гликолитических
ферментов и 100 ферментов цитратного цикла;
— 30000 небольших органических молекул с молекулярной массой от 100
до 1000 Да, например продукты промежуточного метаболизма и коферменты
(показаны в 10-кратном увеличении внизу справа);
— наконец, 50000 неорганических ионов: остальной объем занимает вода.
Схема иллюстрирует тот факт, что цитоплазма клеток заполнена
макромолекулами и малыми органическими молекулами, причем макромолекулы
расположены очень близко друг к другу: большинство из них разделено лишь
несколькими молекулами воды. Все эти молекулы находятся в постоянном
движении. Однако повторяющиеся столкновения предотвращают их движение в
каком-либо определенном направлении. В действительности они движутся
беспорядочно по зигзагообразным траекториям. Белки из-за большой массы
движутся особенно медленно. Тем не менее, средняя скорость миграции
составляет около 5 нм/мс, т.е. за 2 мс они проходят расстояние, равное диаметру
белковой глобулы. По статистической оценке любой белок может достичь любой
точки в клеточной цитоплазме менее чем за секунду.
В. Биохимические функции цитоплазмы
38
У эукариот цитоплазма составляет 50% общего объема клетки, т.е. в
количественном отношении является наиболее важной органеллой клетки.
Цитоплазма — это главное реакционное пространство клетки. Здесь протекают
большинство процессов деградации питательных веществ и синтеза структурных
компонентов клетки, а также почти весь промежуточный метаболизм: гликолиз,
гексозомонофосфатный путь, глюконеогенез, биосинтез жирных кислот, белков и
т. п.
Биосинтез аминокислот. Наиболее чувствительный тип регуляции
синтеза аминокислот - это аллостерическое ингибирование первой реакции
биосинтетического пути конечным продуктом данной последовательности
реакций. Первая реакция биосинтетического пути обычно необратима и
катализируется аллостерическим ферментом. На рисунке аллостерическая
регуляция показана на примере синтеза изолейцина из треонина. Конечный
продукт - изолейцин - действует как отрицательный модулятор первой реакции
этого пути. Такого рода аллостерическая, или нековалентная, модуляция
синтеза аминокислот обеспечивает у бактерий быстрый ответ на изменение
ситуации.
Другим заслуживающим внимания примером может служить регуляция
активности глутаминсинтетазы у Е. coli, в которой участвует целый набор
аллостерических эффекторов. У этой бактерии глутамин играет роль донора
аминогрупп при биосинтезе многих метаболических продуктов. Известно
восемь продуктов обмена глутамина, которые выполняют у Е. coli функцию
отрицательных модуляторов активности глутаминсинтетазы, действуя по типу
обратной связи. Глутаминсинтетаза - один из самых сложных регуляторных
ферментов, какие мы знаем.
39
40
Поскольку 20 обычных аминокислот требуются для белкового синтеза в
определенных
обеспечивающие
соотношениях,
не
только
в
клетках
регуляцию
выработались
скорости
синтеза
механизмы,
отдельных
аминокислот, но и координирование их синтеза. Особенно хорошо выражено
такое координирование у быстро растущих бактериальных клеток. На рисунке
показано, каким образом координируется у Е. coli синтез четырех
аминокислот, образующихся из аспартата,-лизина, метионина, треонина и
изолейцина. Этап, ведущий от аспартата к аспартилфосфату, катализируется
тремя изоферментами, регулируемыми независимо друг от друга. Этапы, на
которых из полуальдегида аспартата образуется гомосерин, а из треонина - кетобутират, катализируются двумя изоферментами, также регулируемыми
независимо. Один из изоферментов, катализирующих превращение аспартата в
аспартилфосфат, может аллостерически ингибироваться двумя различными
модуляторами - лизином и изолейцином, действие которых более чем
аддитивно. Это еще один пример согласованного ингибирования. В
последовательности реакций, ведущих от аспартата к изолейцину, действуют
множественные взаимно перекрывающиеся виды ингибирования по типу
обратной связи: изолейцин подавляет превращение треонина в -кетобутират, а
треонин тормозит свое собственное образование на трех стадиях, в которых
субстратами служат гомосерин, полуальдегид аспартата и аспартат.
41
Рис. 22-8. Биосинтез изолейцина из треонина у Е. coli. Первая реакция этого
биосинтетического пути ингибируется его конечным продуктом изо лейцином.
Это один из первых изученных примеров аллостерического ингибирования по
типу обратной связи. Валин способен устранять или предотвращать
ингибирующее действие изолейцина.
42
Рис. Аллостерическое ингибирование глутаминсинтетазы у Е. coli. У этого
организма глутамин является предшественником указанных здесь продуктов.
Все они способны ингибировать фермент по типу обратной связи. Такое
действие нескольких отрицательных модуляторов называется согласованным
ингибированием. Глутаминсинтетаза резко ингибируется также избытком АТР,
под влиянием которого она переходит в неактивную форму вследствие
ковалентной модификации тех остатков тирозина в ее субъединицах, которые
важны для каталитической активности. В животных тканях активность
глутаминсинтетазы регулируется гораздо более простым способом.
43
Рис. 22-10. Сложная сеть регуляторных механизмов. контролирующих у Е. coli
биосинтез
нескольких
аминокислот,
образующихся
из
аспартата.
Представленные здесь различные типы регуляции описаны в тексте. Там же
разъяснены и обозначения, приведенные на рисунке.
Синтез РНК и ДНК
Репликация ДНК. Молекула ДНК, состоящая из двух спиралей,
удваивается при делении клетки. Удвоение ДНК основано на том, что при
расплетении нитей к каждой нити можно достроить комплементарную копию,
таким образом получая две нити молекулы ДНК, копирующие исходную.
Репликацию ДНК осуществляет фермент ДНК-полимераза. Этот фермент
способен наращивать ДНК только на 3΄– конце. Если мы посмотрим в
реплицирующуюся ДНК бактерии, а это можно наблюдать в электронном
микроскопе, мы увидим, что у нее вначале образуется "глазок", затем он
расширяется, в конце концов, вся кольцевая молекула ДНК оказывается
реплицированной. Процесс репликации происходит с большой точностью, но не
абсолютной. Бактериальная ДНК-полимераза делает ошибки, то есть вставляет не
тот нуклеотид, который был в матричной молекуле ДНК, примерно с частотой 106. У эукариот ферменты работают точнее, так как они более сложно устроены,
44
уровень ошибок при репликации ДНК у человека оценивается как 10-7 – 10 -8 .
Точность репликации может быть разной на разных участках геном, есть участки
с повышенной частотой мутаций и есть участки более консервативные, где
мутации происходят редко.
Транскрипция – синтез РНК на ДНК, то есть синтез комплементарной нити
РНК на молекуле ДНК осуществляется ферментом РНК-полимеразой. У бактерий,
например, кишечной палочки – одна РНК-полимераза, и все бактериальные
ферменты очень похожи друг на друга; у высших организмов (эукариотов) –
несколько ферментов, они называются РНК-полимераза I, РНК-полимераза II,
РНК-полимераза III, они также имеют сходство с бактериальными ферментами, но
устроены сложнее, в их состав входит больше белков.
В процессе транскрипции можно выделить три этапа. Первый этап инициация транскрипции – начало синтеза нити РНК, образуется первая связь
между нуклеотидами. Затем идет наращивание нити, ее удлинение – элонгация, и,
когда синтез завершен, происходит терминация, освобождение синтезированной
РНК. РНК-полимераза при этом «слезает» с ДНК и готова к новому циклу
транскрипции. Бактериальная РНК-полимераза изучена очень подробно. Она
состоит из нескольких белковых-субъединиц: двух α-субъединиц (это маленькие
субъединицы), β- и β΄-субъединиц (большие субъединицы) и ω-субъединицы.
Вместе они образуют так называемый минимальный фермент, или кор-фермент. К
этому кор-ферменту может присоединяться σ-субъединица. σ-субъединица
необходима для начала синтеза РНК, для инициации транскрипции. После того,
как инициация осуществилась, σ-субъединица отсоединяется от комплекса, и
дальнейшую работу (элонгацию цепи) ведет кор-фермент. При присоединении к
ДНК σ-субъединица распознает участок, на котором должна начинаться
транскрипция. Он называется промотор. Промотор - это последовательность
нуклеотидов, указывающих на начало синтеза РНК. Без σ-субъединицы корфермент промотор распознать не может. σ-субъединица вместе с кор-ферментом
называется полным ферментом, или холоферментом.
Связавшись с ДНК, а именно с промотором, который распознала σ45
субъединица, холофермент расплетает двунитевую спираль и начинает синтез
РНК. Участок расплетенной ДНК – это точка инициации транскрипции, первый
нуклеотид,
к
которому
должен
комплементарно
быть
присоединен
рибонуклеотид. Инициируется транскрипция, σ-субъединица уходит, а корфермент продолжает элонгацию цепи РНК. Затем происходит терминация, корфермент освобождается и становится готов к новому циклу синтеза.
Трансляция проводится рибосомами. Рибосома состоит из двух субчастиц:
большой и малой. Каждая субчастица состоит из нескольких десятков белков,
каждый из которых уже изучен, известно, каким образом каждый белок уложен в
субчастицу. Белки в рибосоме держатся на каркасе, состоящем из рибосомной
РНК. Формирование рибосомы начинается с того, что рибосомная РНК
сворачивается и на нее в определенном порядке начинают налипать белки. На
рисунке представлена рибосомная РНК. В ней самокомплементарные участки
нити РНК спариваются, образуя шпильки (вторичная структура), и затем РНК
сворачивается (третичная структура РНК), образуя каркас субчастиц.
В рибосоме находится матричная РНК (мРНК). С кодоном (тремя
нуклеотидами) мРНК комплементарно связан антикодон транспортной РНК, на
которой висит остаток аминокислоты. На рисунке видна такая структура (тРНК
вместе с аминокислотой, которая называется аминоцил-тРНК).
Биосинтез олигосахаридов и полисахаридов бактериями. На долю
внутриклеточных олиго- и полисахаридов может приходится до 60% сухой массы
бактериальной клетки, тогда как количество синтезируемых внеклеточных
полисахаридов может во много раз превышать массу бактерии. При отсутствии
сахаров в окружающей среде бактерии синтезируют их из доступных источников
углерода. Например, бактерии, растущие на средах, содержащих трёхуглеродные
соединения, синтезируют гексозофосфаты из пирувата с помощью реакций,
характерных
для
фруктозодифосфатного
пути.
Бактериальные олиго- и
полисахариды образуются путём присоединения к акцепторным молекулам
остатков
Сахаров
из
нуклеозиддифосфосахаров.
Например,
трегалоза,
содержащая два остатка глюкозы, соединённых а-1,4-связями, образуется из
46
уридиндифосфатглюкозы и глюкозо-6-фосфата. Характерная особенность синтеза
полисахаридов, как и в случае синтеза ДНК, — необходимость затравки —
короткого фрагмента того же полисахарида, который будет синтезироваться; он
служит акцептором новых мономерных фрагментов.
Биосинтез липидов (жиров) бактериями. Липиды — гетерогенный класс
клеточных компонентов, выделенный на основании их растворимости в
неполярных растворителях (эфир, бензол, хлороформ) и нерастворимости в воде.
К ним относят жиры, фосфолипиды, стероиды, изопреноиды и поли-Bоксибутират. Липиды подразделяют на два большие класса: липиды, содержащие
жирные кислоты, связанные эфирной связью (например, поли-B-оксимаслиная
кислота, гликолипидный компонент мембраны цианобактерий, ЛПС клеточной
стенки), и липиды, состоящие из повторяющихся пятиуглеродных изопреновых
фрагментов (например, бактопренол, к которому прикрепляются составляющие
компоненты клеточной стенки во время её синтеза). Липиды с изопреновыми
единицами содержат хлорофиллы и хиноны. Жирные кислоты синтезируются
отдельно, а затем с помощью эфирной связи включаются в липиды. Число типов
жирных кислот у каждого вида бактерий строго определено. У прокариот
преимущественно встречают насыщенные жирные кислоты, образование которых
начинается с переноса ацетильной группы с ацетил-КоА на особый ацилпереносящий
белок.
Этот
комплекс
служит
акцептором,
к
которому
последовательно присоединяются двухуглеродные фрагменты, пока не будет
достигнута длина, характерная для соединения, присущего данной бактерии
(обычно C14-C18).
4.
МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ
РАЗНООБРАЗИЕ
АЭРОБНЫХ
ГЕТЕРОТРОФОВ (2 часа)
Различные механизмы поглощения субстратов (пассивная диффузия,
облегченная диффузия, активный транспорт). Путь Энтнера-Дудорова.
Расщепление сахаров в пентозофосфатном цикле. Метилглиоксалевый шунт.
Разнообразие энергетического метаболизма. Диссимиляционное восстановление
47
нитрата.
Анаплеротические
последовательности.
Биосинтез
гликогена,
полиоксимасляной кислоты, полифосфатов.
Механизмы поглощения субстратов. Для того чтобы экзогенный
субстрат мог быть использован клеткой, он должен пройти через ее пограничные
слои. Клеточная стенка не служит существенной преградой для небольших
молекул и ионов, но она задер­живает макромолекулы, масса которых превышает
600 Да. Пограничным слоем, ответственным за транспорт питательных веществ
внутрь клетки, является плазматическая мембрана.
Перенос питательных веществ через плазматическую мембрану, как
правило, специфичен: поглощаться могут только те вещества, для ко­торых
имеется соответствующая транспортная система. За небольшими исключениями,
транспорт зависит от наличия специфических пермеаз или транслоказ. Речь идет о
мембранных белках, само название ко­торых указывает на то, что они обладают
свойствами ферментов, т.е. могут индуцироваться субстратом, специфичны в
отношении субстрата и образуются только в таких условиях, в которых возможен
синтез белков.
Что касается механизма транспорта веществ, то различают ряд различных
процессов, два из которых способны обеспечивать только транспорт, но не
накопление веществ в клетке; им можно противопоставить процессы активного
транспорта, приводящие к аккумуляции веществ внутри клетки.
Простая диффузия. Неспецифическое проникновение веществ в клетку
происходит путем пассивной диффузии. Для диффузии существенны величина
молекул и степень их липофильности. Скорость перемещения путем диффузии
невелика. Для Сахаров такие процессы не были обнаружены, и они мало
вероятны. Путем простой диффузии в клетку проникают,
видимо,
яды,
ингибиторы и другие чуждые клетке вещества.
48
Облегченная
диффузия.
При
облегченной
диффузии
вещество,
содержащееся в питательной среде, транспортируется в клетку «вниз» по своему
градиенту концентрации. Этот процесс осуществляется благодаря субстратспецифической пермеазе и не требует затраты метаболической энергии. Скорость
транспорта в широком диапазоне зависит от концентрации субстрата в среде.
Питательное вещество не может накапливаться в клетке против градиента
концентрации.
Активный транспорт. Активный транспорт и транслокация группы
имеют с облегченной диффузией то общее, что эти процессы происхо­дят с
участием субстрат-специфических транспортных белков. Однако в отличие от
облегченной диффузии такого рода транспорт требует за­траты энергии. При
использовании метаболической энергии вещество может накапливаться в клетке
против концентрационного градиента. Основное различие между
транспортом
и
активным
транслокацией группы заключается в природе молекулы,
поступающей внутрь клетки.
При активном транспорте в цитоплазму поступает та же молекула, которая
была поглощена из питательной среды. При транслокации группы переносимая
49
молекула в процессе транспорта видоизменяется, например фосфорилируется.
Все теории, объясняющие активный транспорт, включают представление о
наличии в мембране специфических транспортных белков. Эти белки получили
названия, указывающие на их функцию: пермеазы, транслоказы, белкитранслокаторы, переносчики. Транспортные процессы отличаются друг от друга
главным образом тем, что служит для них источником энергии - протонный
потенциал Ар, АТР или фосфоенолпируват.
Для переноса многих веществ, в том числе неорганических и органических
ионов, а также Сахаров, используется энергия протонного потенциала.
Бактериальные клетки поддерживают протонный потенциал, непрерывно
откачивая из клетки протоны и другие ионы (Na+). Для этого в мембране имеются
специфические транс­портные белки.
Каждый из этих белков имеет совершенно определенную функцию. Есть,
например, белок, катализирующий одновременный и однонаправленный перенос
одного протона и одной молекулы сахара (лактозы, мелибиозы, глюкозы). В таких
случаях говорят о симпорте двух (или нескольких) веществ. Другие транспортные
белки катализируют одновременный встречный перенос двух частиц, например
одного протона и какого-то другого иона (Na+ или аниона органической
кислоты); в этих случаях говорят об антипорте. При переносе сахаров,
сопряженном с транспортом ионов, вероятно, всегда используются ионы Н+ или
Na + . У прокариот преобладает симпорт с ионами Н + , у эукариот - симпорт с
Na+ .
То, что у бактерий действительно существуют транспортные белки
описанного типа, было подтверждено (а) путем очистки и последующего
встраивания белка-переносчика в протопласты или в так называемые липосомы и
(б) путем выделения мутантов, лишенных соответствующего белка и его
специфической функции. Что касается транспорта с использованием энергии
протонного потенциала, то это, вероятно, наиболее
распространенный
механизм активного поглощения субстратов.
Представление об участии специфических белков-переносчиков в
50
транспорте ионов подтверждают данные о действии ряда антибиотиков и
синтетических веществ. Речь идет о ионофорах. Это соединения с относительно
небольшой моле­кулярной массой (500-2000), молекулы которых снаружи
гидрофобны, а внутри гидрофильны. Обладая гидрофобными свойствами, они
диффундируют в липидную мембрану. Из аитибиотиков-ионофоров наиболее
известен валиномицин; он диффундирует внутрь мембраны и катализирует
транспорт (унипорт) ионов К +, Cs + , Rb+ или NH^- Поэтому присутствие таких
катионов в суспензионной сре­де приводит к выравниванию заряда по обе
стороны мембраны (как бы корот­кому замыканию) и тем самым к падению
протонного потенциала. Другие ио-нофоры образуют каналы, по которым могут
проходить ионы. Существуют также синтетические соединения, повышающие
протонную проводимость мем­бран; наиболее известный переносчик протонов карбонилцианид-и-трифторме-токсифенилгидразон.
Он
действует
как
«разобщитель» нарушает сопряжение синтеза АТР с транспортом электронов,
перенося в клетку протоны в обход АТР-синтазы. Изучение мембранного
транспорта
привело
к
важным
результатам,
которые
согласуются
с
хемиосмотической теорией преобразования энергии и подкрепляют ее.
Наряду с транспортными
системами, использующими протонный
потенциал, существуют также системы, зависимые от АТР. Определен­ную роль
здесь играют периплазматические связующие белки. Плазматическая мембрана
животных клеток не транспортирует протоны и не создает протонного градиента.
Мембранный потенциал, вероятно, поддерживается только АТР-зависимыми
насосными механизмами, например натрий-калиевым насосом, а натриевый
потенциал в свою очередь доставляет энергию для симпорта питательных
веществ вместе с ионами Na + .
Транслокация группы. При транспорте этого типа молекула химически
модифицируется; поглощается, например, сахар как таковой, а внутрь клетки он
поступает в фосфорилированной форме. Фруктоза, глюкоза, маннитол и
родственные вещества поглощаются с помощью фосфотрансферазной системы,
зависимой от фосфоенолпирувата. Эта система состоит из неспецифического и
51
специфического
компонентов.
Неспецифический
компонент-это
термостабильный белок, который при участии фермента I, находящегося в
цитоплазме,
фосфорилируется
фос-фоенолпируватом.
Второй
компонент,
находящийся в мембране индуцибельный фермент II, специфичный для того или
иного сахара; он катализирует перенос фосфата с термостабильного белка (ТБ) на
сахар во время транспорта последнего через мембрану. Фермент II, вероятно,
выполняет функцию пермеазы и фосфотрансферазы одновременно.
В остальном поглощение веществ клетками - процесс очень сложный и
пока еще плохо изученный. Многие метаболические эффекты торможения и
явления конкуренции между одновременно доступными субстратами связаны, повидимому, с особенностями регуляторных механизмов, которые проявляются уже
в процессах транспорта веществ.
Выход веществ из клетки. О выходе метаболитов в окружающую среду
известно существенно меньше, чем о механизмах поглощения веществ клеткой.
По-видимому, и выделение их из клетки тоже происходит как при участии
транспортных систем, так и путем неконтролируемой диффузии. Вещества
выходят из клетки тогда, когда в результате перепроизводства они накапливаются
в ней, достигая концентраций, превышающих нормальный уровень. Накопление
может быть следствием неполного окисления, нарушения регуляции или
процессов брожения.
Транспорт железа. Для транспорта этого макроэлемента микробная
клетка обладает специальным механизмом. В анаэробных условиях же­лезо
представлено двухвалентным ионом (Fe2 +), и его концентрация может достигать
10" 1 М/л, так что она не лимитирует рост микроорга­низмов. Однако в аэробных
условиях при рН 7,0 железо представлено в виде гидроксидного комплекса Fe3 +,
который почти нерастворим; концентрация ионов трехвалентного железа
составляет всего лишь 10 ~ 18 М/л. Неудивительно поэтому, что микроорганизмы
выделяют вещества, переводящие железо в растворимую форму. Эти веществатак называемые сидерофоры-связывают ионы Fe3 + в комплекс и в таком виде
транспортируют
его;
речь
идет
в
основном
о
низкомолекулярных
52
водорастворимых веществах (с мол. массой меньше 1500), связывающих железо
координационными связями с высокой специфичностью и высо­ким сродством
(константа устойчивости порядка 1030). По своей химической природе это могут
быть феноляты или гидроксаматы. К первым относится энтерохелин; он обладает
шестью
фенольными
гидрокси-группами,
и
его
выделяют
некоторые
энтеробактерии. Выйдя в окружающую среду, он связывает железо, и
образовавшийся ферри-энтеро-хелин поглощается клеткой. В клетке железо
освобождается в результате ферментативного гидролиза ферри-энтерохелина.
Многие грибы для той же цели образуют феррихромы; их относят к
гидроксаматным сидерофорам. Это циклические гексапептиды, удерживающие
трехвалентное железо с помощью трех гидроксаматных групп. Они тоже
выделяются из клетки в виде не содержащих железо соединений, связывают в
питательной среде железо и в виде феррихро-мов снова поглощаются. В клетке
железо восстанавливается до Fe2 +, к которому феррихромы имеют лишь
незначительное сродство и поэтому освобождают его. Сходную функцию
выполняют ферриоксамины (у актиномицетов), микобактины (у микобактерий) и
экзохелины (тоже у микобактерий).
Микроорганизмы обычно выделяют сидерофоры в питательную сре­ду
только тогда, когда железо лимитирует рост. Выделение сидерофо­ров - следствие
дерепрессии их синтеза. В присутствии растворенного, комплексно связанного
железа сидерофоры синтезируются лишь в малых количествах и удерживаются в
клеточной стенке. В этих условиях они служат только для транспорта железа в
клетку.
В связи с этим интересно то, что среди естественных защитных
приспособлений высших организмов мы находим «очистку» внутренней среды от
железа. Существуют специальные белки, которые так прочно связывают
имеющееся железо, что оно становится недоступным для микроорганизмов. Так,
например, в белке куриного яйца содержится ко-нальбумин, в молоке, слезной
жидкости и слюне - лактотрансферрин, а в сыворотке крови - серотрансферрин.
При посеве бактерий на куриный белок они растут только в том случае, если
53
одновременно с инокуляцией вводят ионы железа (в виде цитрата). Таким
образом, железо играет важную роль в антагонистических отношениях между
высшими организмами и бактериями. Борьбу выигрывает тот партнер, который
вырабатывает вещество, прочнее связывающее железо.
Путь Энтнера-Дудорова. Первые два его этапа - фосфорилирование
молекулы глюкозы и ее дегидрирование до 6-фосфоглюконовой кислоты идентичны первым двум этапам окислительного пентозофосфатного пути.
Специфичны для пути Энтнера-Дудорова две следующие реакции:
-
дегидратирование
6-фосфоглюконовой
кислоты,
приводящее
к
образованию КДФГ-кислоты;
- расщепление продукта первой реакции на два С3-фрагмента.
Конечными продуктами второй реакции являются пировиноградная
кислота и 3-ФГА. Последний окисляется в пировиноградную кислоту так же, как
в гликолитическом пути. Следовательно, при разложении молекулы глюкозы до
пирувата по пути Энтнера-Дудорова образуется 1 молекула АТФ (2 молекулы
АТФ синтезируются на отрезке пути 3-ФГА переходит в пировиноградная
кислота минус 1 молекула АТФ, затраченная на фосфорилирование глюкозы), 1
молекула НАД*Н2 и 1 молекула НАДФ*Н2 .
Путь Энтнера-Дудорова имеет важное значение, когда сбраживаемыми
субстратами служат глюконовая, маннановая, гексуроновые кислоты или их
производные. Он функционирует у довольно широкого круга эубактерий ,
главным образом грамотрицательных, получающих энергию в процессе дыхания (
энтеробактерии , виды Azotobacter , Pseudomonas , Alcaligenes , Rhizobium ,
Spirillum , Xanthomonas , Thiobacillus и др.). (У энтеробактерий гликолитический и
окислительный пентозофосфатный пути функционируют как центральные
конститутивные пути метаболизирования углеводов, путь Энтнера-Дудорова - как
индуцибельный). У анаэробов он встречается довольно редко. В качестве примера
организма, сбраживающего сахара по пути Энтнера-Дудорова, можно привести
облигатно анаэробную бактерию Zymomonas mobilis . Однако ее изучение
позволяет предполагать, что Zymomonas mobilis - вторичный анаэроб,
54
произошедший от цитохромсодержащих аэробов.
Путь Энтнера-Дудорова обнаружен у некоторых клостридиев, что еще раз
подчеркивает неоднородность эубактерий, объединенных в эту таксономическую
группу.
Согласно
существующим
представлениям
путь
Энтнера-Дудорова
сформировался позднее гликолитического и окислительного пентозофосфатного
путей и возник как ответвление последнего, поскольку начала окислительного
пентозофосфатного пути и пути Энтнера-Дудорова идентичны и для последнего
необходимо
было
сформировать
только
два
новых
фермента
(6-
фосфоглюконатдегидратазу и КДФГ-альдолазу). Появление пути ЭнтнераДудорова, вероятно, было вызвано высокой потребностью клеток в пирувате,
поэтому возникла необходимость сформировать механизм, при помощи которого
пируват образовывался бы из исходного субстрата как можно более коротким и
прямым путем. Действительно, к получению пирувата по пути Энтнера-Дудорова
ведут всего 4 реакции, в то время как в гликолитическом пути для этого требуется
9 ферментативных преобразований.
Путь Энтнера- Дудорова имеет несколько точек пересечения с
гликолитическим
и
окислительным
пентозофосфатным
путями:
6-
фосфоглюконовая кислота представляет собой промежуточное соединение пути
Энтнера-Дудорова и окислительного пентозофосфатного; пируват и 3-ФГА промежуточные соединения пути Энтнера-Дудорова и гликолиза.
Пентозофосфатный цикл. Открытие пути прямого окисления углеводов,
или, как его называют, пентозофосфатного цикла, принадлежит О. Варбургу, Ф.
Липману, Ф. Ди-кенсу и В.А. Энгельгарду. Расхождение путей окисления
углеводов – классического (цикл трикарбоновых кислот, или цикл Кребса) и
пентозофосфатного – начинается со стадии образования гексозомонофосфата.
Если глюкозо-6-фосфат изомеризуется во фруктозо-6-фосфат, который фосфорилируется второй раз и превращается во фруктозо-1,6-бисфосфат, то в этом
случае
дальнейший
распад
углеводов
происходит
по
обычному
гликолитическому пути с образованием пировиноградной кислоты, которая,
55
окисляясь до ацетил-КоА, затем «сгорает» в цикле Кребса.
Если второго фосфорилирования гексозо-6-монофосфата не происходит,
то фосфорилированная глюкоза может подвергаться прямому окислению до
фосфопентоз. В норме доля пентозофосфатного пути в количественном
превращении глюкозы обычно невелика, варьирует у разных организмов и
зависит от типа ткани и ее функционального состояния.
У млекопитающих активность пентозофосфатного цикла относительно
высока в печени, надпочечниках, эмбриональной ткани и молочной железе в
период лактации. Значение этого пути в обмене веществ велико. Он поставляет
восстановленный НАДФН, необходимый для биосинтеза жирных кислот,
холестерина и т.д. За счет пентозофосфатного цикла примерно на 50%
покрывается потребность организма в НАДФН.
Другая функция пентозофосфатного цикла заключается в том, что он
поставляет пентозофосфаты для синтеза нуклеиновых кислот и многих
коферментов. При ряде патологических состояний удельный вес пентозофосфатного
пути
окисления
глюкозы
возрастает.
Механизм
реакций
пентозофосфатного цикла достаточно расшифрован. Пентозофосфатный цикл
начинается с окисления глюкозо-6-фосфата и последующего окислительного
декарбоксилирования продукта (в результате от гексозофосфата отщепляется
первый атом углерода). Это первая, так называемая окислительная, стадия
пентозофосфатного
цикла.
Вторая
стадия
включает
неокислительные
превращения пентозофосфатов с образованием исходного глюкозо-6-фосфата
(рис. 10.12). Реакции пен-тозофосфатного цикла протекают в цитозоле клетки.
56
Первая реакция – дегидрирование глюкозо-6-фосфата при участии
фермента
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
и
кофермента
НАДФ+.
Образовавшийся в ходе реакции 6-фосфоглюконо-δ-лактон – соединение
нестабильное и с большой скоростью гидролизуется либо спонтанно, либо с
помощью
фермента
6-фосфоглюконолактоназы
с
образованием
6-фос-
фоглюконовой кислоты (6-фосфоглюконат):
Во второй – окислительной – реакции, катализируемой 6-фосфоглюконатдегидрогеназой (декарбоксилирующей), 6-фосфоглюконат дегидрируется и
декарбоксилируется. В результате образуется фосфорилированная кетопентоза –
D-рибулозо-5-фосфат
и
еще
1
молекула
НАДФН.
Под
действием
57
соответствующей эпимеразы из рибулозо-5-фосфата может образоваться другая
фосфопентоза – ксилулозо-5-фосфат. Кроме того, рибулозо-5-фосфат под
влиянием особой изомеразы легко превращается в рибозо-5-фосфат. Между
этими формами пентозофосфатов устанавливается состояние подвижного
равновесия. При определенных условиях пентозофосфатный путь на этом этапе
может быть завершен. Однако при других условиях наступает так называемый
неокислительный этап (стадия) пентозофосфатного цикла. Реакции этого этапа не
связаны с использованием кислорода и протекают в анаэробных условиях. При
этом образуются вещества, характерные для первой стадии гликолиза (фруктозо6-фосфат, фруктозо-1,6-бисфосфат, фосфотрио-зы), а другие – специфические для
пентозофосфатного
пути
(седогептуло-зо-7-фосфат,
пентозо-5-фосфаты,
эритрозо-4-фосфат).
Основными реакциями неокислительной стадии пентозофосфатного цикла
являются транскетолазная и трансальдолазная. Эти реакции катализируют
превращение изомерных пентозо-5-фосфатов. Коферментом в транскетолазной
реакции
служит
ТПФ,
играющий
роль
промежуточного
переносчика
гликольальдегидной группы от ксилулозо-5-фосфата к рибозо-5-фосфату. В
результате образуется семиуглеродный моносахарид седогептулозо-7-фосфат и
глицеральдегид-3-фосфат.
Транскетолазная
реакция
в
пентозном
цикле
встречается дважды, второй раз – при образовании фруктозо-6-фосфата и
триозофосфата в результате взаимодействия второй молекулы ксилулозо-5фосфата с эритро-зо-4-фосфатом. Фермент трансальдолаза катализирует перенос
остатка диоксиацетона (но не свободного диоксиацетона) от седогептулозо-7фосфата на гли-церальдегид-3-фосфат. Шесть молекул глюкозо-6-фосфата,
вступая в пентозофосфатный цикл, образуют 6 молекул рибулозо-5-фосфата и 6
молекул СО2, после чего из 6 молекул рибулозо-5-фосфата снова регенерируется
5 молекул глюко-зо-6-фосфата (см. рис. 10.12). Однако это не означает, что
молекула глюкозо-6-фосфата, вступающая в цикл, полностью окисляется. Все 6
молекул СО2 образуются из С-1-атомов 6 молекул глюкозо-6-фосфата.
Образовавшийся НАДФН используется в цитозоле на восстановительные синтезы
58
и, как правило, не участвует в окислительном фосфорилировании, протекающем в
митохондриях.
Считают, что пентозофосфатный путь и гликолиз, протекающие в
цитозоле, взаимосвязаны и способны переключаться друг на друга в зависимости
от соотношения концентраций промежуточных продуктов, образовавшихся в
клетке.
Денитрификация
и
восстановление
нитрата.
Микроорганизмы
используют нитрат для двух целей. Во-первых, подобно большинству растений,
многие бактерии способны извлекать из него азот для синтеза азотсодержащих
клеточных
компонентов.
Такая
ассимиляционная нитратредукция
может
протекать и в аэробных, и в анаэробных условиях. Во-вторых, возможна также
диссимиляционная нитратредукция, или «нитратное дыхание»; при этом нитрат в
анаэробных условиях служит конечным акцептором водорода. В обоих случаях
нитрат сначала восстанавливается до нитрита с помощью молибденсодержащего
фермента нитратредуктазы.
Ассимиляция нитрата. В процессе ассимиляции нитрат сначала
восстанавливается до нитрита, а затем до аммиака; последний используется для
синтеза аминокислот и других азотсодержащих компонентов клетки. Первый этап
катализирует нитратредуктаза; этот фермент (нитратредуктаза В) находится в
цитоплазме, и его синтез индуцируется в том случае, если нитрат оказывается
единственным источником азота в питательной среде. Нитрит восстанавливается
до аммиака с помощью нитритредуктазы, на что затрачивается 6 электронов.
Электроны поступают от NAD(P)H2 (у грибов и бактерий) или ферредоксина (у
растений и некоторых бактерий). Нитритредуктаза - сложный фермент, его
каталитические центры содержат атомы железа, из которых одни входят в состав
тема (сирогем), а другие связаны с атомами серы. Нитритредуктазная реакция
сходна с превращениями, катализируемыми нитрогеназой и сульфитредуктазой,
так как при восстановлении субстрата происходит перенос 6 электронов и не
высвобождается никаких промежуточных продуктов.
Сравнивая рост клеток в аэробных условиях на средах, содержащих в
59
качестве источника азота нитрат или соответственно аммоний, можно заметить,
что в первом случае затрачивается больше восстановительной силы (донора
водорода), чем при
восстановлении
аммония
(при
одинаковом выходе
биомассы).
Нитратное дыхание: денитрификация. Денитрифицирующие бактерии
обладают способностью восстанавливать нитрат через нитрит до газообразной
закиси азота (N20) и азота (N2). В отсутствие кислорода нитрат, таким образом,
служит конечным акцептором водорода.
Способность получать энергию путем использования нитрата как
конечного акцептора водорода с образованием молекулярного азота широко
распространена у бактерий. Этот процесс денитрификации до сих пор был
обнаружен только у факультативных аэробов; по-видимому, среди облигатных
анаэробов нет денитрифицирующих форм. Кроме того, бактерии чаще обладают
полной
дыхательной
системой;
синтез
ферментов,
необходимых
для
денитрификации (мембраносвязанные нитратредуктаза А и нитритредуктаза),
индуцируется только в анаэробных условиях. У многих денитрификаторов эта
индукция происходит лишь в присутствии нитрата, хотя для некоторых
достаточно создания анаэробных условий. Многие денитрификаторы могут расти,
используя в качестве акцептора водорода не только нитрат, но и нитрит, а иногда
даже закись азота. Из этого следует, что не только нитратредуктаза А, но и
диссимиляционная нитритредуктаза связана у них с дыхательной цепью и
участвует в выработке энергии.
Накопительная культура денитрифицирующих бактерий. Если в среду,
содержащую
доноры
водорода,
субстраты
для
построения
клеточных
компонентов и нитрат, внести почву или ил и инкубировать культуру без доступа
воздуха, то в ней будут расти различные бактерии: а) при наличии следов пептона
и этанола или пропионовой кислоты - Pseudomonas aeruginosa; б) на глюкозе Pseudomonas fluoresceins; в) на тартрате, сукцинате или малате - Pseudomonas
stutzeri; г) на среде с органическими кислотами, спиртом, мясным экстрактом и
при высокой концентрации нитрата (5-12% KNO3) - Bacillus licheniformis; д) при
60
наличии следов дрожжевого экстракта и Н2 в качестве донора водорода Paracoccus denitrificans; e) в присутствии серы или тиосульфата - Thiobacillus
denitrificans.
Поскольку
некоторые
денитрификаторы
используют
нитрат
исключительно или преимущественно как акцептор водорода, но не могут
восстанавливать его до NH4, необходимо добавлять в среду источник азота
(пептон или соль аммония).
Нитратное дыхание: восстановление нитрата до нитрита. Для целого ряда
факультативно-анаэробных бактерий (Enterobacter, Escherichia coli и др.) нитрат
может служить конечным акцептором водорода в процессе транспорта
электронов, поставляющем энергию. Этот вид «нитратного дыхания» отличается
от денитрификации тем, что здесь только первая ступень, а именно
восстановление нитрата до нитрита с по­мощью нитратредуктазы А, сопряжена с
переносом электронов и преобразованием энергии:
При этом нитрит может накапливаться в культуральной жидкости образования
N2 не происходит.
Однако
вместо
этого нитрит может
восстанавливаться до аммиака путем ассимиляционной нитритредукции с
последующим выделением NH4 в среду. В таком случае говорят об
аммонификации нитрата. Вос­становление нитрита до аммиака не позволяет
клетке получать энергию. Речь идет скорее о процессе брожения, в котором
нитрит играет роль экзогенного акцептора электронов. Таким образом,
восстановле­ние нитрита все же дает известное преимущество: при сбраживании
глюкозы часть атомов водорода расходуется на восстановление нитрита, в
результате чего образуется больше ацетата.
5.
КАТАБОЛИЧЕСКАЯ
АКТИВНОСТЬ
АЭРОБНЫХ
ГЕТЕРОТРОФОВ (2 часа)
Расщепление полимеров экзоферментами. Рост на аминокислотах. Рост
на органических кислотах. Рост на алифатических углеводородах. Рост на
ароматических соединениях (орто-расщепление или 3-оксоадипатный путь,
61
мета-расщепление. Рост на С1-соединениях. Облигатные метилотрофы.
Факультативные метилотрофы. Неполные окисления.
Расщепление полимеров ферментами. Ферменты – биокатализаторы –
вещества, ускоряющие реакции в сотни, тысячи и миллионы раз, но сами они при
этом не изменяются. Все реакции в организме проходят при участии ферментов.
По структуре ферменты бывают однокомпонентные и двухкомпонентные.
Однокомпонентные ферменты состоят только из белка (пример – пепсин
желудочного сока).
Двухкомпонентные состоят из белка (апофермента) и
небелковой части – кофермента (ферменты каталаза, пероксидаза) Коферментами
могут служить витамины, гормоны, нуклеотиды, ионы металлов.
По скорости синтеза ферменты делят на коститутивные и индуцибельные.
Коститутивные
ферменты
синтезируются
с
постоянной
скоростью
и
концентрация их в клетке относительно постоянна. Индуцибельные ферменты
синтезируются по необходимости. Их концентрация зависит от присутствия в
среде тех или иных питательных веществ – субстратов.
По месту нахождения выделяют две группы: эндоферменты и
экзоферменты.
Эндоферменты
синтезируются и проявляют каталитическую
активность внутри клетки. Экзоферменты синтезируются внутри клетки, затем
выделяются за ее пределы и длительное время сохраняют активность. Чаще
экзоферментами являются гидролитические ферменты, разлагающие полимеры
на мономеры.
Свойства ферментов:
1.Термолабильность
2.Наличие активного центра.
3.Субстратная специфичность.
4.Специфичность к типу катализируемой реакции.
Активный центр фермента – часть молекулы, конфигурация которой
соответствует форме субстрата (субстрат – вещество с которым работает данный
фермент). Реакция происходит при непосредственном участии активного центра.
62
Главной особенностью ферментативных реакций является то, что они
протекают в составе активного комплекса, образованного в результате связывания
субстрата с определенным участком фермента (активным центром), к которому
субстрат обладает сильным химическим сродством. Образуется ферментсубстратный комплекс (ФСК). В фазе ФСК происходит ферментирование
(преобразование) субстрата, в результате чего высвобождаются продукты реакции
.
Особенности ферментных систем микроорганизмов:
1.Способность продуцировать большое количество экзоферментов.
2.Быстрая смена ферментных наборов.
Классификация ферментов по принципу действия.
В основу классификации ферментов положен тип реакции. Выделяют
шесть основных классов ферментов:
- Оксидоредуктазы;
- Трансферазы;
- Гидролазы;
- Лиазы;
- Изомеразы;
- Лигазы.
Оксидоредуктазы – Это ферменты, катализирующие окислительно –
вастоновительные
реакции.
Они
играют
большую
роль
в
процессах
биологического получения энергии. К ним относятся
Первичные дегидрогеназы – отщепляют водород от субстрата и передают
его на вторичные дегидрогеназы. Коферменты первичных дегидрогеназ –
нуклеотиды
НАД
и
НАДФ
(никотинамидаденин-динуклеотид
или
никотинамидадениндинуклеотидфосфат).
Вторичные дегидрогеназы - получают водород, отщепляя его от
первичных или от органических субстратов. Могут передавать водород на
цитохромы.
Коферменты
вторичных
дегидрогеназ
–
ФАД
или
ФМН
(флавинадениндинуклеотид или флавинмононуклеотид).
63
Цитохромы (В, с, а) - ферменты, участвующие в переносе электронов.
Обязательный компонент цитохромов – железопорфирины, содержащие атом
железа. Окислительно-восстановительные превращения происходят при смене
валентности железа:
Оксидазы – ферменты, присоединяющие кислород. В конце электронтранспортных цепей аэробов часто присутствует цитохромоксидаза (фермент А3)
из группы оксидаз.
Трансферазы
функциональных
–
осуществляют
групп
от
одних
перенос
соединений
отдельных
радикалов,
к
Например,
другим.
ацетилтрансферазы переносят остатки уксусной кислоты CH3CO─, а также
молекул жирных кислот, фосфотрансферазы (или киназы), обуславливают
перенос остатков фосфорной кислоты Н2РО4-. Известны многие другие
трансферазы (аминотрансфераза, фосфорилаза и т. д.)
Гидролазы – катализаторы реакций расщепления сложных соединений
(полимеров на мономеры) с участием воды. К этому классу относятся
протеолитические ферменты (протеазы), расщепляющие белки или пептиды до
аминокислот; амилазы расщепляют крахмал до глюкозы; эстеразы, катализируют
расщепление сложных эфиров, в том числе жиров.
Лиазы
–
катализируют
пируватдекарбоксилаза
катализирует
разрыв
углеродных
отщепление
цепей.
углекислого
газа
Так,
от
пировиноградной кислоты.
К лиазам относятся такие ферменты как альдолаза, Расщепляющая
молекулу фруктозо–1,6–дифосфата (С6) на две триозы – С3-Соединения.
Изомеразы – осуществляют превращение органические соединения в их
изомеры. Происходит внутримолекулярное перемещение атомов, различных
радикалов.
Изомеризации
подвергаются
углеводы
и
их
производные,
органические кислоты, аминокислоты. Ферменты этой группы играют большую
роль в ряде процессов метаболизма. К ним относятся Триозофосфатизомераза,
глюкозофосфатизомераза и др.
Лигазы (синтетазы)– катализаторы синтеза сложных органических
64
соединений из простых (ферменты синтеза углеродных цепей).
К группе лигаз относятся карбоксилаза - катализатор присоединения СО2
к различным кислотам. Фермент карболигаза из двух ацетильных остатков
(СН3СО—) образует С4–фрагмент для синтеза масляной кислоты.
Метилотрофы. Отличительным свойством метилотрофных бактерий
является способность ассимилировать углерод из одноуглеродных соединений,
содержащих метильную группу (СН3-), а также соединений, содержащих две или
более метальные группы, не связанные непосредственно друг с другом (например,
диметилового эфира СН3-О-СН3). В природе из соединений этого класса
наиболее широко распространен газ метан (CH4), который встречается в залежах
угля и нефти и в больших количествах синтезируется метан-образующими
бактериями в анаэробных условиях. При распаде пектинов и других природных
органических веществ, содержащих метиловые эфиры, образуется метанол,
который также является субстратом для метилотрофных бактерий. В тканях
растений и животных содержатся другие субстраты метилотрофных бактерий метиламины [CH3NH2) (CH3)2NH, (CH3)3N] и их оксиды.
Ассимиляция этих восстановленных соединений, содержащих метильную
группу, почти всегда сопряжена с дыханием и осуществляется строгими
аэробами. Единственное исключение из этого правила составляет использование
метанола метанобразующими и пурпурными бактериями в анаэробных условиях.
Окислять, метан способны только прокариоты. Метиловый спирт, может служить
субстратом и для некоторых дрожжей.
Поскольку пищевые потребности хемоавтотрофов и метилотрофов весьма
просты, их когда-то считали "примитивными" организмами, относящимися,
возможно, к самым ранним формам жизни на Земле. Позднее представление об их
месте в эволюции живых организмов изменилось. Биохимический аппарат
данных бактерий оказался таким же сложным, как и у большинства
хемогетеротрофных бактерий. Самые первые живые организмы на Земле
возникли в анаэробных условиях, когда первобытный океан в изобилии содержал
образованные ранее органические вещества. Богатая кислородом биосфера
65
возникла гораздо позднее около 2 млрд. лет назад. Этот важнейший
геохимический переворот объясняется фотосинтезом. При таком характере
эволюции аэробные хемоавтртрофы и метилотрофы могли появиться на Земле
только
после
того,
как
развился
сам
фотосинтез.
Предположительно,
хемоавтотрофы и метилотрофы возникли из прокариотических предков, которые
осуществляли фотосинтез, но утратили аппарат фотосинтеза, а их цепи переноса
электронов, функционировавшие при фотосинтезе, стали выполнять новую
функцию. Некоторые представители этих двух основных групп прокариот,
фотосинтезирующей и нефотосинтезирующей, обладают весьма интересными
свойствами. Сюда относятся наличие нескольких сложных, характерных для них
типов систем внутренних мембран; отсутствие функционирующего цикла
трикарбоновых
кислот;
наличие
цикла
Кальвина
или
его
аналога,
пентозофосфатного цикла; локализация в карбоксисомах ключевого фермента
цикла Кальвина (рибулозодифосфаткарбоксилазы).
По способности утилизировать углерод метилотрофы подразделяются на
две основные подгруппы микроорганизмов - на облигатных и факультативных
метилотрофов. Облигатные метилотрофы способны расти на метане; из других
субстратов их рост могут поддерживать лишь диметиловый эфир и метанол.
Факультативные метилотрофы способны расти на метаноле и метиламинах, но не
на метане. Часто они растут также на муравьиной кислоте и на небольшом числе
простых С2- и С4- соединений.
Облигатные метилотрофы. Первая бактерия Methylomonas methanica,
грамотрицательная палочка с полярными жгутиками, была описана почти 90 лет
назад и в течение нескольких десятилетий оставалась единственной известной
бактерией, окисляющей метан. Развитие и усовершенствование методов
накопления и очистки окисляющих метан бактерий в последнее время привело к
открытию большого числа новых организмов, в принципе сходных по пищевым
свойствам, но разнообразных по структуре. Электронные микрофотографии
показывают,
что
все
эти
бактерии
обладают
сложными
системами
внутриклеточных мембран. Такие мембранные внедрения бывают двух типов: в
66
виде стопки тонких дисков (мембраны типа I) и парные мембраны, обычно
идущие по периферии цитоплазмы параллельно цитоплазматической мембране
(мембраны типа II). По топологии и сложному строению эти мембранные
системы похожи на внутриклеточные мембраны некоторых нитрифицирующих
бактерий. Исходя из структурных особенностей клеток, все облигатные
метилотрофы можно разделить на несколько групп. Некоторые из них образуют
устойчивые к высушиванию покоящиеся клетки. По своей структуре такие клетки
бывают двух типов: цисты, похожие на цисты Azotobacter, и так называемые
экзоспоры,
представляющие
собой
маленькие
сферические
клетки,
отпочковывающиеся от одного из полюсов родительской клетки.
Наилучшим субстратом для данных бактерий является метан. Метиловый
спирт для многих штаммов токсичен, и потому его следует вводить в среду в
очень низких концентрациях. Скорость роста бактерий невелика даже при
оптимальных условиях (время генерации составляет 4-6 ч). Облигатные
метилотрофы могут окислять лишь немногие из тех органических субстратов,
которые неспособны поддерживать их рост. К таким соединениям относятся
муравьиная кислота, которую они окисляют до СO2, этилен и этиловый спирт,
окисляемые до ацетальдегида. В качестве источников азота эти бактерии могут
использовать как нитрат, так и аммиак. Однако аммиак, являясь ингибитором
окисления метана, снижает скорость роста бактерий, если его концентрация
превышает 0,05%. В содержащих аммиак средах образуются следовые количества
нитрата.
Таким
образом,
окисляющие
метан
бактерии
.оказываются
нитрификаторами, хотя данные о том, что они могут получать энергию при таком
незначительном в количественном отношении окислении аммония, отсутствуют.
Факультативные метилотрофы. Хотя облигатные метилотрофы и могут
расти за счет использования метанола, накопительные культуры при потреблении
этого субстрата неизменно обогащаются организмами другого типа, так
называемыми факультативными метилотрофам. Из аэробных накопительных
культур с метиловым спиртом или с метиламинами были выделены
грамотрицательные палочки с полярно расположенными жгутиками, ни одна из;
67
форм которых подробно не описана. Лучше всего из факультативных
метилотрофов изучена почкующаяся бактерия Hyphomicrobium. Она является
мощным денитрификатором, и ее можно специфически накопить, проводя
инкубацию в анаэробных условиях в среде, содержащей метиловый спирт и
нитрат.
Метаболизм метильных соединений. Химический путь полного окисления
метана и метилового спирта очень прост и выглядит следующим образом:
СН4 ---------- СН3ОН >- НСНО >- НСООН >СО2.
Некоторые грамположительные бактерии используют для своего роста в
качестве субстрата этиловый эфир (С2Н5-О-С2Н5). Это соединение расщепляется
при окислении путем оксигенации, в результате чего образуются этиловый спирт
и ацетальдегид.
Аналогичное окисление диметилового эфира метановыми бактериями
может, следовательно, приводить к образованию метилового спирта и
формальдегида, хотя существование приведенной ниже реакции не доказано.
В отличие от окисления первичных спиртов, которое осуществляется
пиридин-зависимыми дегидрогеназами, окисление метилового спирта идет с
участием фермента, обладающего необычными свойствами: для его работы
необходимы ионы аммония, а в качестве простетической группы он, повидимому, содержит птеридин. Акцепторами электронов могут служить
синтетические красители; пиридиннуклеотиды эта дегидрогеназа восстанавливать
не
может.
Имеются
метанолдегидрогеназа
данные,
катализирует
позволяющие
также
предположить,
окисление
формальдегида
что
с
образованием муравьиной кислоты, хотя у метилотрофов обнаружены и НАДзависимые
формальдегиддегидрогеназы.
Окисление
муравьиной
кислоты
Метилотрофы
способны
катализируется НАД-зависимой дегидрогеназой.
Ассимиляция
метилотрофами
углерода.
образовывать весь углерод клетки из C1-соединений, т. е. как из органического
субстрата, так и из СО2. Однако опыты с использованием меченых соединений
показали, что основная масса углерода клетки происходит из окисляемого
68
субстрата, а не из СО2. На самом деле источником углерода клетки является
промежуточное соединение формальдегид, и у большинства метилотрофов
обнаружены два разных циклических пути превращения формальдегида в
материал клетки.
Рис. Упрощенная схема рибулозодифосфатного цикла ассимиляции углерода
метилотрофными бактериями (сверху) и рибулозодифосфатного цикла (цикла
Кальвина).
Один из них, рибулозомонофосфатный путь, во многом аналогичен пути
Кальвина при ассимиляции СО2. Ключевыми реакциями этого пути является
присоединение
формальдегида
к
рибулозо-5-фосфату
с
образованием
фосфорилиро-ванного сахара (D-арабино-З-гексулозо-б-фосфат), который затем
превращается в фруктозо-6-фосфат.
Сериновый путь включает цикл из совершенно иных реакций.
Получившийся из формальдегида С1 фрагмент переносится после его
присоединения к тетрагидрофолиевой кислоте (ТГФ) на глицин, в результате чего
69
образуется серии.
Через
цепь
последовательных
реакций
серии
превращается
в
фосфоглицериновую кислоту, часть которой превращается в триозофосфат и
затем ассимилируется, а часть используется для регенерации глицина, первичного
акцептора С1. Цепь реакций регенерации глицина довольно сложна. Она
включает
превращение
фосфоглицериновой
кислоты
через
фосфоенолпировиноградную кислоту в яблочную; этот процесс сопровождается
фиксацией СО2. Яблочная кислота расщепляется на глиоксиловую кислоту и
ацетил-КоА. Последний, пройдя через глиоксилатный цикл, приводит к
образованию второй молекулы глиоксиловой кислоты.
Рис. Сопряженный с глиоксилатным циклом сериновый путь, используемый
некоторыми метилотрофами для ассимиляции формальдегида
Учёными исследовано распределение этих двух циклических путей
ассимиляции углерода у метилотрофов. У факультативных метилотрофов чаще
встречается сериновый путь. Среди облигатных метилотрофов сериновый путь
функционирует только у тех организмов, которые обладают мембранной
системой типа II (Methylosinus - Methylocystis), а пентозофосфатный путь - у
70
организмов с мембранной системой типа I (Methylomonas - Methy-lobacter Methylococcus).
Неспособность облигатных метилотрофов расти за счет муравьиной
кислоты (хотя она и является конечным промежуточным соединением при
окислении метана) объясняется, по-видимому, особенностями механизмов
ассимиляции углерода у этих организмов. Если муравьиная кислота не может
быть восстановлена до формальдегида, то она не может быть источником
восстановленного углерода и ассимиляция углерода обязательно должна
происходить в виде СО2. Некоторые факультативные метилотрофы способны
использовать муравьиную кислоту в качестве субстрата и, как показано-для
одного из представителей данной группы, при этом углерод ассимилируется через
цикл Кальвина. Необходимой предпосылкой для роста на муравьиной кислоте
является способность синтезировать два ключевых фермента данного цикла фосфорибулокиназу и рибулозодифосфаткарбоксилазу.
Наличие и роль цикла трикарбоновых кислот у метилотрофов. Все
факультативные метилотрофы обладают глиоксилатным циклом фиксации
углерода, поскольку он играет ключевую роль в ассимиляции углерода из C1субстратов. Эти организмы могут расти и за счет субстратов, содержащих более
одного атома углерода (например, за счет уксусной кислоты). Это означает, что
они обладают также и полным набором ферментов, которые необходимы для
функционирования цикла трикарбоновых кислот, что и было подтверждено в
случае Hyphomicrobium.
Среди облигатных метилотрофов имеется любопытная дихотомия. У тех
организмов, которые ассимилируют формальдегид через пентозофосфатный путь,
отсутствует а-кето-глутаратдегидрогеназа, и поэтому цикл трикарбоновых кислот
не работает. Облигатные метилотрофы, ассимилирующие формальдегид через
сериновый путь, обладают этим ключевым ферментом.
Таким образом, по составу ферментов облигатные метилотрофы четко
разделяются на две группы. Те из них, которые имеют мембранную систему типа
II, по своему ферментативному аппарату очень похожи на факультативные
71
метилотрофы. Те же, которые имеют мембранную систему типа I, обладают
набором ферментов, который аналогичен (но не идентичен) набору ферментов
многих облигатных хемоавтотрофов.
6. РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА У БАКТЕРИЙ (2 часа).
Регуляция синтеза ферментов путем индукции и репрессии (индукция
ферментов, катаболитная репрессия, репрессия конечным продуктом, синтез
ферментов центральных метаболических путей). Регуляция активности
ферментов. Ингибирование по типу обратной связи. Свойства аллостерических
ферментов. Аллостерическая регуляция центральных метаболических путей.
Ковалентная модификация ферментов.
Индукция фермента — это относительное увеличение скорости синтеза
фермента в ответ на появление химического соединения — индуктора. Аналоги
субстратов часто являются превосходными индукторами, не будучи субстратами
для индуцируемых ферментов. К примеру, для р-галактозидазы таким
соединением является
(ИПТГ) — неметаболизируемый аналог лактозыТТГдругой стороны,
некоторые субстраты не могут быть индукторами иногда индуктором является
продукт реакции, катализируемой индуцируемым ферментом. В частности,
лактоза прежде чем выступить в роли индуктора, сначала должна превратиться
под действием Р-галактозидазы в свой изомер — аллолактозу (1-6-0-р-Д-галактопиранозил-глюкозу). Индуктором ферментов, участвующих в катаболизме
нуклеозидов у Е. coli, является дезоксирибозо- 5-фосфат, который представляет
собой промежуточный продукт катаболизма нуклеозидов.
Метаболизм многих субстратов, которые оказываются единственными
источниками углерода или азота в питательной среде, связан с необходимостью
их транспорта в клетку. Поступление лактозы в клетки Е. coli обеспечивает
специальный ферментоподобный белок — галактозидпермеаза, синтез которого
индуцируется одновременно с β-галактозидазой в результате так называемой
72
координированной индукции. Галактоза, образующаяся под действием β галактозидазы, в свою очередь, может индуцировать координированный синтез
ряда ферментов, превращающих ее в глюкозо-1-фосфат. Таким образом, полное
усвоение лактозы происходит в результате последовательной индукции
ферментов,
пре­вращающих
ее
в
метаболиты,
которые
могут
быть
непосредственно использованы клеткой.
В 1953 г. впервые было обнаружено, что образование триптофансинтетазы,
которая катализирует последний этап биосинтеза триптофана, специфически
подавляется, если бактерии получают экзогенный триптофан. В последующие
годы были получены многочисленные данные, свидетельствующие о том, что
добавление в ростовую среду соединения, которое является конечным продуктом
какого-либо биосинтетического пути, наряду с подавлением активности первого
фермента этого пути вызывает замедление или остановку синтеза всех ферментов
соответствующего пути. Это явление, прямо противоположное индукции,
называется репрессией ферментов или, точнее, координированной репрессией
ферментов. Ферменты, синтез которых подавляется конечным продуктом, могут
быть дерепрессированы, т. е. скорость их синтеза может быть увеличена, если
внутриклеточная концентрация конечного продукта падает до очень низкого
уровня.
Механизмы индукции и репрессии предохраняют клетку от напрасной
траты аминокислот и энергии на образование ненужных в данных условиях
ферментов, однако, когда появляется необходимость, эти ферменты могут быстро
синтезироваться.
С помощью репрессии регулируется синтез аминокислот, пуринов,
пиримидинов, витаминов и других первичных метаболитов. Следовательно,
регуляция биосинтетических путей по принципу обратной связи осуществляется
двумя способами: с помощью ретроингибирования и репрессии.
Были проведены специальные опыты для выяснения вопроса о
соотношении между этими регуляторными механизмами. Показано, что если к
культуре Е. coli, растущей на глюкозоминеральной среде, добавить низкие
73
концентрации (от 1 до 10 мкг/мл) аргинина, то репрессии ферментов пути
биосинтеза аргинина не происходит, а весь экзогенный аргинин усваивается.
Очевидно, что в этих условиях действует механизм ретроингибирования, который
компенсирует увеличение концентрации аргинина уменьшением собственного
синтеза этой аминокислоты. Однако при добавлении аргинина в концентрации
более 10 мкг/мл он используется не полностью и можно наблюдать репрессию
ферментов пути биосинтеза аргинина. Ретроингибирование, следовательно,
можно рассматривать как способ быстрого и тонкого регулирования биосинтеза
малых молекул, тогда как репрессия осуществляет более медленное и грубое
регулирование, главным образом с целью экономии синтеза белка. Оба эти
механизма при совместном действии дополняют друг друга, обеспечивая
максимальную экономию всех клеточных ресурсов.
Какие процессы лежат в основе индукции и репрессии ферментов? Ответ
на
этот
вопрос
был
получен
в
результате
молекулярно-генетических
исследований, выполненных в основном на Е. coli. Известно, что вся генетическая
информация для синтеза белка содержится в хромосоме (молекуле ДНК)и что эта
информа­ция
реализуется
в
результате
последовательных
процессов
транскрипции и трансляции. При этом сначала на соответствующем гене (участке
молекулы ДНК) синтезируется информационная, или матричная, РНК (мРНК).
Она служит матрицей для синтеза белка (полипептида) в процессе трансляции.
Таким образом, процесс транскрипции представляет собой непосредственное
проявление активности отдельных генов.
В 1961 г. Ф. Жакоб и Ж. Моно на основании генетического и
биохимического изучения усвоения лактозы клетками Е. coli К 12 предложили
гипотезу о регуляции активности генов у бакте­рий, получившую широкую
известность как «модель оперона». Согласно этой модели, на хромосоме имеется
по крайней мере четыре компонента системы регуляции: структурный ген (или
гены, контролирующие связанные биохимические функции), ген- регулятор,
оператор и промотор, которые составляют оперон. Ген-регулятор (R) определяет
структуру белка-репрессора.
74
Этот белок способен связываться с оператором (О), который контролирует
функционирование прилежащих структурных генов (Si, S2, S3). Промотор (Р)
является начальным участком для связывания РНК-полимеразы — фермента,
который катализирует транскрипцию ДНК в мРНК. Если белок-репрессор связан
с оператором, то РНК-полимераза не может перемещаться (или присоединяться) к
промотору и мРНК, которые комплементарны последовательности генов Si, S2 и
S3, не образуются. Следовательно, соответствующие ферменты также не
синтезируются.
Когда
оператор
свободен
от
белка-репрессора,
РНК-полимераза,
присоединившись к промотору Р, может перемещаться и транскрибировать гены
Si, S2 и S3. Образование индуцибель- ных ферментов происходит при добавлении
индуктора, который связывается с белком-репрессором и инактивирует его.
Первым из исследованных был оперон, контролирующий метаболизм
лактозы (lac-оперон). Он образован генами lac Z, lacY и lac А, которые
соответственно определяют синтез р-га­лактозидазы, галактозидпермеазы и
ацетилтрансферазы. Синтез их координированно регулируется репрессором —
продуктом гена lac I. К гену lac Z прилежат оператор (lac О) и промотор (lac Р),
расположенный перед оператором.
Жакоб и Моно предположили, что репрессор представляет собой
аллостерический белок, содержащий два специфических центра. Один из них
обладает сродством к нуклеотидной последовательности оператора, а другой — к
молекуле индуктора. Присоединение индуктора к репрессору снижает сродство
первого аллостерического центра к оператору, в результате чего освобождает
оператор от репрессора.
Репрессор lac-оперона был выделен и очищен. Он имеет молекулярную
массу около 150000 Д и состоит из четырех идентичных субъедиииц. Каждая
субъединица связывает по одной молекуле индуктора — ИПТГ. Очищенный
репрессор имеет исключительно высокое сродство к специфическому 1асоператорному участку ДНК Е. coli, связывание с которым нарушается в
присутствии индуктора.
75
Эти исследования послужили веским подтверждением гипотезы Жакоба и
Моно, и в настоящее время она считается полностью доказанной.
Мутации в гене-регуляторе или в операторе могут нарушать образование
репрессора или его связывание. В обоих случаях потребность в индукторе для
синтеза ферментов исчезает. Такие мутанты называются конститутивными,
поскольку у них соответствующие ферменты начинают синтезироваться
постоянно.
Модель оперона применима и для репрессии ферментов. Только здесь
продукт гена R является неактивным репрессором (апорепрессором), который сам
по себе не способен взаимодействовать с оператором, но который может
активироваться конечным продуктом (корепрессором) с образованием активного
репрессора.
Репрессор (апорепрессор) триптофанового оперона был частично очищен,
и механизм его действия изучен in vitro. Показано, что репрессор переходит в
активную форму, связывая триптофан. Этот комплекс репрессор-корепрессор
подавляет инициацию транскрипции, конкурируя с РНК-полимеразой за место
связывания на промоторе.
Таким образом, индукция и репрессия представляют собой два сходных
механизма: регуляции транскрипции и различие между ними заключается в
природе репрессора.
Следует отметить, что объединение генов, ответственных за образование
ферментов одного метаболического пути, в единый оперон не является
непременным условием для регуляции их с помощью репрессии или индукции. У
Е. coli гены, кодирующие ферменты биосинтеза аргинина, находятся в различных
участках хромосомы, но все они контролируются одним и тем же регуляторным
геном, образуя регулон. Другой пример регулона — это совокупность генов,
кодирующих около двух десятков белков и ферментов, которые индуцируются в
клетке в ответ на воз­действия, повреждающие ДНК, — так называемый SOSрегулон. Все они регулируются одним репрессором — продуктом гена lex А.
Опероны и регулоны, контролирующие связанные физиологические
76
функции, обнаружены почти у всех генетически изученных видов бактерий.
В случае индукции и репрессии исследователь имеет дело с так
называемой негативной регуляцией выражения генов. Существует также
механизм позитивной регуляции — активация действия генов, которая
осуществляется с помощью аллостерических регуляторных белков. Наиболее
известные и хорошо изученные примеры такого рода регуляции — это регуляция
катаболизма арабинозы и синтеза щелочной фосфатазы у Е. coli.
Продукт регуляторного гена, агаС, контролирующего арабинозный
оперон, может находиться как в состоянии репрессора, так и в состоянии
активатора. В форме репрессора он присоединяется к оператору и блокирует
транскрипцию структурных ге­нов. Соединяясь с индуктором оперона,
арабинозой, белок-регулятор переходит в форму активатора и, взаимодействуя с
про- моторным участком (инициатором), стимулирует транскрипцию оперона.
Щелочная фосфатаза позволяет клеткам получать фосфат за счет
гидролиза органического фосфата. Неорганический фосфат среды в комплексе с
продуктом гена-регулятора репрессирует синтез щелочной фосфатазы. Однако в
отсутствие
неорганического
фосфата
продукт
гена-регулятора
является
необходимым активатором синтеза щелочной фосфатазы. Этот регуляторный
механизм обеспечивает высокую чувствительность синтеза щелочной фосфатазы
к присутствию неорганического фосфата, который превращает активатор синтеза
фермента в репрессор.
Таким образом, имеется большое разнообразие механизмов регуляции
действия генов и, вероятно, не существует даже двух оперонов, которые
регулировались бы одинаково.
Важным регуляторным элементом, присущим всем оперонам, является
промотор, т. е. участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза, чтобы
начать синтез РНК. Свойствами промо­тора может быть обусловлена низкая
эффективность транскрип­ции одних генов или, наоборот, интенсивная
транскрипция дру­гих, а также потребность в специальных факторах для
инициа­ции транскрипции. Известно, например, что ген-регулятор лак- тозного
77
оперона транскрибируется, по-видимому, всего один раз в течение генерации и
количество молекул репрессора не превы­шает 10 на клетку. В то же время
рибосомальные гены, состав­ляющие не более 1% от всего генома Е. coli,
обеспечивают до 40% одномоментного синтеза всей РНК в клетке.
Мутации могут изменять свойство промоторов, и в результате выражение
соответствующих оперонов может повышаться или понижаться. Так, для
выделения репрессора лактозного оперона использован мутант Е. coli с
измененным промотором гена-регулятора, который интенсивно синтезировал этот
белок.
Репрессия
синтеза
ферментов
конечным
продуктом.
Все
биосинтетические пути находятся под контролем механизма репрессии конечным
продуктом. Точно так же образование большинства анаболических ферментов
регулируется путем репрессии их синтеза.
Репрессия
осуществляется
особыми
присутствующими
в
клетке
веществами - репрессорами. Факторами, модифицирующими активность
репрессоров, могут быть конечные продукты биосинтетических путей, а также
промежуточные продукты некоторых катаболических или амфиболических
путей.
Репрессия может быть координированной, т.е. синтез каждого фермента
данного пути в одинаковой степени подавляется конечным продуктом. Часто
синтез ферментов одного пути репрессируется в разной степени. В разветвленных
биосинтетических путях механизмы репрессии могут быть модифицированы (как
и механизмы ингибирования), чтобы лучше обеспечить регуляцию нескольких
конечных продуктов из общего исходного субстрата. Синтез многих ферментов в
таких путях репрессируется только при совместном действии всех конечных
продуктов. Если реакция на общем участке разветвленного пути катализируется
изоферментами синтез каждого из них находится под контролем "своего"
конечного продукта.
Механизм репрессии конечным продуктом на уровне транскрипции стал
проясняться с 50-х гг. XX в. Большой вклад в это внесли работы Ф.Жакоба и
78
Ж.Моно. Было показано, что наряду со структурными генами, кодирующими
синтез
ферментов,
в
бактериальном
геноме
существуют
специальные
регуляторные гены. Один из них - ген-регулятор (ген R) , функция которого
заключается в регуляции процесса транскрипции структурного гена (или генов).
Ген-регулятор кодирует синтез специфического аллостерического белкарепрессора, имеющего два центра связывания: один узнает определенную
последовательность нуклеотидов на участке ДНК, называемом оператором (ген
О) , другой - взаимодействует с эффектором. Ген-оператор расположен рядом со
структурным геном (генами) и служит местом связывания репрессора.
Часто структурные гены, относящиеся к одному биохимическому пути,
объединены в группу, составляющую вместе с оператором единицу транскрипции
и регуляции - оперон . Все структурные гены, объединенные в оперон, имеют
один операторный участок, локализованной на краю оперона, и координированно
регулируются
одним
репрессором.
Оперон
представляет
собой
весьма
рациональную и эффективную систему регуляции метаболического пути.
Процесс транскрипции начинается с прикрепления РНК-полимеразы ,
катализирующей синтез иРНК , к определенному участку ДНК, называемому
промотором (Р) . Когда молекула репрессора "садится" на операторный участок,
она "закрывает" промотор, тем самым препятствуя связыванию с ним РНКполимеразы и началу транскрипции.
У прокариот пять генов, кодирующих синтез ферментов триптофанового
пути, образуют оперон. Ген-регулятор обеспечивает синтез аллостерического
белка - триптофанового репрессора, не активного в свободном состоянии.
Последний в таком виде не связывается с операторным участком и,
следовательно, не может препятствовать началу транскрипции. Когда конечный
продукт метаболического пути (триптофан) накапливается выше определенного
уровня, он взаимодействуете репрессором и активирует его. Активированный
репрессор присоединяется к операторному участку и подавляет транскрипцию
триптофанового оперона. Таким образом, триптофан является корепрессором.
Катаболитная репрессия. Кроме репрессии конечным продуктом,
79
характерной для анаболических путей, описан тип репрессии, называемой
катаболитной и заключающейся в том, что быстро используемые клеткой
источники энергии способны подавлять синтез ферментов других путей
катаболизма, участвующих в метаболизировании сравнительно медленно
используемых источников энергии.
Катаболитную репрессию можно рассматривать как приспособление
клетки к использованию в первую очередь наиболее легкодоступных источников
энергии. В присутствии такого источника энергии потребление других
субстратов, менее "удобных" для клетки, временно приостанавливается, и пути
катаболизирования этих субстратов временно выключаются.
Известно, что если в среде для выращивания E.coli одновременно
содержатся глюкоза и лактоза, сначала используется глюкоза. Несмотря на
присутствие индуктора лактозного оперона, ферменты, участвующие в
катаболизме лактозы, не синтезируются. Транскрипция генов лактозного оперона
начинается, когда концентрация глюкозы в среде становится низкой. Таким
образом, глюкоза препятствует синтезу ферментов лактозного оперона.
Как это осуществляется? Изучение механизма катаболитной репрессии
обнаружило, что этот тип регуляции тесно связан с внутриклеточным уровнем
циклического АМФ (цАМФ) , который в этом процессе функционирует в
качестве эффектора . Он образует комплекс с аллостерическим белком катаболитным активатором, не активным в свободном состоянии. Этот комплекс,
присоединившись к определенному участку на промоторе, обеспечивает
возможность связывания РНК-полимеразы с промотором и инициацию
транскрипции.
Количество
образующегося
комплекса
определяется
концентрацией цАМФ, которая уменьшается пр увеличении содержания глюкозы
в среде. Таким образом, глюкоза вызывает изменение внутриклеточной
концентрации цАМФ. Это соединение обнаружено в клетках всех прокариот. Его
единственная функция - регуляторная.
Циклический АМФ образуется из АTФ в реакции, катализируемой
аденилатциклазой , связанной с ЦПМ :
80
АТФ обратимо переходит в цАМФ + пирофосфат.
Аденилатциклаза обладает высокой активностью, если компоненты
системы транспорта глюкозы в клетку фосфорилированы. Это происходит в
отсутствие глюкозы, которую необходимо транспортировать. Таким образом,
активность аденилатциклазы возрастает при уменьшении концентрации глюкозы
в среде. Последнее приводит к повышению образования цАМФ и в конечном
итоге к индукции синтеза ферментов катаболизма лактозы. Наоборот, при
высокой концентрации глюкозы в среде система ее транспорта находится в
дефосфорилированном состоянии, следствием чего является уменьшение
активности аденилатциклазы и соответственно количества цАМФ. Таким
способом глюкоза через систему своего транспорта регулирует концентрацию
цАМФ в клетке.
Поскольку катаболизм глюкозы связан с образованием метаболической
энергии и запасанием ее в молекулах АТФ, через глюкозу в клетке связаны пулы
АТФ и цАМФ: при увеличении количества АТФ уменьшается количество цАМФ,
и наоборот.
Особенностью всех ферментных систем, находящихся под контролем
катаболитной репрессии, является участие в их индукции универсального
комплекса, состоящего из белкового катаболитного активатора и цАМФ.
Регулирование
концентрации
ферментов
центральных
метаболических путей. Эти ферменты тоже могут быть подвержены регуляции.
В клетках Escherichia coli, растущих в аэробных условиях, ферменты цикла
трикарбоновых кислот присутствуют в высокой концентрации; между тем при
росте в анаэробных условиях их активность в 10-20 раз меньше, а образование 2оксоглутаратдегидрогеназы
бывает
полностью
по­давлено.
Некоторые
анаплеротические ферменты, такие как малатсинтаза, изоцитратлиаза и
глиоксилаткарболигаза, содержатся только в тех клетках, которым они
необходимы для использования имеющегося субстрата.
Регуляция активности ферментов. Факторы, регулирующие активность
ферментов, разнообразны по своей природе. Физические факторы (температура,
81
давление, свет, магнитное поле, электрические импульсы) оказывают менее
специфическое действие, чем химические. В свою очередь действие последних
также может быть разделено на несколько типов. Одни химические вещества
связываются с активным центром фермента, например субстраты, кофакторы,
конкурентные ингибиторы, что приводит к изменению ферментативной
активности. Другие вещества взаимодействуют со специальными участками на
поверхности
молекулы
определенного
типа
фермента,
не
имеющими
непосредственного отношения к центрам каталитической активности, но, тем не
менее, приводящими к ее изменению.
Наконец,
активность
некоторых
ферментов
регулируется
путем
химической модификации их молекулы, в основе которой лежит ковалентное
обратимое связывание с ферментом определенной группировки, что приводит к
изменению его активности. У прокариот известны две ферментные системы,
активность которых регулируется таким путем. Глутаминсинтетаза E.coli,
катализирующая синтез глутамина, существует в двух формах, различающихся
присутствием в одной из них остатка адениловой кислоты. Присоединение его с
помощью
ковалентной
связи,
катализируемое
соответствующим
модифицирующим ферментом, приводит (обратимо) к образованию менее
активной аденилированной глутаминсинтетазы:
Глутаминсинтетаза (активная форма) - Модифицирующий фермент Глутаминсинтетаза+АМФ (неактивная форма).
Удаление
адениловой
группы,
ведущее
к
возникновению
деаденилированной формы фермента, резко повышает его каталитическую
активность.
82
Рис. Регуляторные воздействия на уровень клеточных метаболитов у
прокариот
Аналогичный механизм регулирования активности фермента путем
присоединения и удаления остатка уксусной кислоты (ацетилирование деацетилирование) обнаружен для цитратлиазы у фотосинтезирующей бактерии
Rhodopseudomonas gelatinosa . В этом случае активна ацетилированная форма
фермента.
Наиболее быстрым, точным и тонким механизмом регуляции активности
ферментов является регуляция, которой подвергается определенный тип
ферментов, получивших название аллостерических (термин подчеркивает
особенность данного типа фермента, заключающуюся в том, что вещества,
регулирующие
его
активность,
структурно
отличаются
от
субстрата
катализируемой им ферментативной реакции). Эти ферменты, как правило,
занимают ключевые позиции в обмене веществ, располагаясь в "стратегических"
пунктах клеточного метаболизма - начале метаболических путей или местах
разветвлений, где расходятся или сходятся несколько путей.
83
Аллостерические ферменты имеют каталитический и регуляторный
(аллостерический) центры, пространственно разобщенные, но функционально
тесно взаимосвязанные. Каталитическая активность фермента меняется в
результате связывания с его регуляторным центром определенных метаболитов,
называемых эффекторами . Кроме конечных продуктов данного пути,
эффекторами могут быть субстраты ферментов, а также некоторые конечные
продукты родственных метаболических путей. Если действие эффектора
приводит к понижению каталитической активности фермента, такой эффектор
называется отрицательным, или ингибитором. Положительным называют
эффектор, действие которого повышает каталитическую активность фермента.
Положительным эффектором, или активатором, чаще всего бывает субстрат
данного фермента.
Связывание эффектора с регуляторным центром приводит к изменению
сродства фермента к субстрату в результате какого-то конформационного
изменения фермента.
Наиболее простой случай аллостерической регуляции - регуляция первого
фермента неразветвленного биосинтетического пути его конечным продуктом.
Если конечный продукт накапливается в избытке, он подавляет активность
первого фермента в процессе, называемом ингибированием по принципу
обратной связи. Примером такого типа регулирования является ингибирование
биосинтеза L-изолейцина. Первый фермент на пути синтеза L-изолейцина Lтреониндезаминаза является аллостерическим и ингибируется только Lизолейцином.
Для разветвленных путей биосинтеза (а к таким относится большинство
биосинтетических путей) механизмы регуляции усложняются, так как от
активности первого фермента зависит биосинтез нескольких конечных продуктов.
Очевидно следующее: механизмы регулирования в этом случае должны быть
видоизменены таким образом, чтобы перепроизводство одного конечного
продукта не приводило к прекращению синтеза других связанных с ним конечных
продуктов. Выработалось несколько механизмов контроля по принципу обратной
84
связи применительно к разветвленным биосинтетическим путям. Они сводятся к
тому, что в этом случае в регулировании принимают участие все конечные
продукты этих путей. Если первый этап биосинтетического пути катализируется
одним ферментом, на поверхности молекулы этого фермента имеются различные
регуляторные центры, с каждым из которых связывается один из конечных
продуктов, выполняющих функцию эффектора.
Некоторые аллостерические ферменты существуют в виде нескольких
молекулярных форм (изоферментов). Изоферменты катализируют одну и ту же
реакцию, но обладают разными регуляторными свойствами. Это связано с тем,
что изоферменты имеют одинаковые каталитические, но разные регуляторные
центры. Каждый изофермент кодируется отдельным геном.
Существование изоферментов позволяет конечным продуктам независимо
друг от друга ингибировать активность определенного изофермента, так как
каждый
изофермент
индивидуально
контролируется
"своим"
конечным
продуктом.
Аллостерическая регуляция. Аллостерическими ферментами называют
ферменты, активность которых регулируется не только количеством молекул
субстрата, но и другими веществами, называемыми эффекторами. Участвующие в
аллостерической регуляции эффекторы - клеточные метаболиты часто именно
того пути, регуляцию которого они осуществляют.
Роль аллостерических ферментов в метаболизме клетки. Аллостерические
ферменты играют важную роль в метаболизме, так как они чрезвычайно быстро
реагируют
на
малейшие
изменения
внутреннего
состояния
клетки.
Аллостерическая регуляция имеет большое значение в следующих ситуациях:
при анаболических процессах. Ингибирование конечным продуктом
метаболического пути и активация начальными метаболитами позволяют
осуществлять регуляцию синтеза этих соединений;
при катаболических процессах. В случае накопления АТФ в клетке
происходит ингибирование метаболических путей, обеспечивающих синтез
энергии. Субстраты при этом расходуются на реакции запасания резервных
85
питательных веществ;
для координации анаболических и катаболических путей. АТФ и АДФ аллостерические эффекторы, действующие как антагонисты;
для
координации
параллельно
протекающих
и
взаимосвязанных
метаболических путей (например, синтез пуриновых и пиримидиновых
нуклеотидов, используемых для синтеза нуклеиновых кислот). Таким образом,
конечные продукты одного метаболического пути могут быть аллостерическими
эффекторами другого метаболического пути.
Аллостерические
эффекторы.
Эффектор,
вызывающий
снижение
(ингибирование) активности фермента, называют отрицательным эффектором,
или ингибитором. Эффектор, вызьгоаюший повышение (активацию) активности
ферментов, называют положительным эффектором, или активатором.
Аллостерическими эффекторами часто служат различные метаболиты.
Конечные продукты метаболического пути - часто ингибиторы аллостерических
ферментов, а исходные вещества - активаторы. Это так называемая гетеротропная
регуляция. Такой вид аллостерической регуляции очень распространён в
биологических системах.
Более редкий случай аллостерической регуляции, когда сам субстрат
может выступать в качестве положительного эффектора. Такая регуляция
называется гомотропной (эффектор и субстрат - одно и то же вещество). Эти
ферменты имеют несколько центров связывания для субстрата, которые могут
выполнять двойную функцию: каталитическую и регуляторную. Аллостерические
ферменты такого типа используются в ситуации, когда субстрат накапливается в
избытке и должен быстро преобразоваться в продукт.
Выявить ферменты с аллостерической регуляцией можно, изучая кинетику
этих ферментов. Эти ферменты не подчиняются законам Михаэлиса-Ментен, они
имеют характерную S-образную кривую зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата.
86
Рис. Схема, поясняющая работу аллостерического фермента. А - действие
отрицательного эффектора (ингибитора); Б - действие положительного
эффектора (активатора).
Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов:
обычно это олигомерные белки, состоящие из нескольких протомеров
или имеющие доменное строение;
они имеют аллостерический центр, пространственно удалённый от
каталитического активного центра;
эффекторы
присоединяются
к
ферменту
нековалентно
в
аллостерических (регуляторных) центрах;
аллостерические центры, так же, как и каталитические, могут
проявлять различную специфичность по отношению к лигандам: она может быть
87
абсолютной
и
групповой.
Некоторые
ферменты
имеют
несколько
аллостерических центров, одни из которых специфичны к активаторам, другие - к
ингибиторам.
протомер,
на
котором
находится
аллостерический
центр,
-
регуляторный протомер, в отличие от каталитического протомера, содержащего
активный центр, в котором проходит химическая реакция;
аллостерические ферменты обладают свойством кооперативности:
взаимодействие аллостерического эффектора с аллостерическим центром
вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех
субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и
изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает
каталитическую активность фермента;
эффектора
регуляция аллостерических ферментов обратима: отсоединение
от
регуляторной
субъединицы
восстанавливает
исходную
каталитическую активность фермента;
аллостерические ферменты катализируют ключевые реакции данного
метаболического пути.
Локализация аллостерических ферментов в метаболическом пути.
Фермент, катализирующий превращение субстрата А в продукт В, имеет
аллостерический центр для отрицательного эффектора, которым служит
конечный продукт метаболического пути F. Если концентрация F увеличивается
(т.е. вещество F синтезируется быстрее, чем расходуется), ингибируется
активность одного из начальных ферментов. Такую регуляцию называют
отрицательной обратной связью, или ретроингибированием. Отрицательная
обратная связь - часто встречающийся механизм регуляции метаболизма в клетке.
В центральных метаболических путях исходные вещества могут быть
активаторами ключевых ферментов метаболического пути. Как правило, при этом
аллостерической активации подвергаются ферменты, катализирующие ключевые
реакции заключительных этапов метаболического пути:
88
В качестве примера можно рассмотреть принципы регуляции гликолиза специфического (начального) пути распада глюкозы. Один из конечных
продуктов распада глюкозы - молекула АТФ. При избытке в клетке АТФ
происходит
ретро-ингибирование
аллостерических
ферментов
фосфофруктокиназы и пируваткиназы. При образовании большого количества
фруктозо-1,6-бисфосфата наблюдают аллостерическую активацию фермента
пируваткиназы.
фермента пируваткиназы.
Рис. Схема положительной и отрицательной регуляции катаболизма
глюкозы. Молекула АТФ участвует в ретроингибировании аллостерических
ферментов фосфофруктокиназы и пируваткиназы. Фруктозе-1,6-бисфосфат активатор метаболического пути распада глюкозы. Плюсами отмечена
активация, минусами - ингибирование ферментов.
Благодаря такой регуляции осуществляется слаженность протекания
метаболического пути распада глюкозы.
Регуляция
каталитической
активности
ферментов
89
ассоциацией/диссоциацией протомеров. Протеинкиназы - группа ферментов,
катализирующих перенос остатка фосфорной кислоты с АТФ на специфические
ОН-группы аминокислотных остатков белков (вызывают фосфорилирование
белков). Механизмы активации различных протеинкиназ неодинаковы. В
качестве примера регуляции каталитической активности ферментов ассоциацией
или диссоциацией протомеров можно привести регуляцию активности фермента
Протеинкиназы А.
Протеинкиназа А (цАМФ-зависимая) состоит из 4 субъединиц 2 типов: 2
регуляторных (R) и 2 каталитических (С). Такой тетрамер не обладает
каталитической активностью. Регуляторные субъединицы имеют участки
связывания для циклического 3',5'-АМФ (цАМФ), по 2 на каждую субъединицу.
Присоединение 4 молекул цАМФ к 2 регуляторным субъединицам приводит к
изменению
конфор-мации
регуляторных
протомеров
и
к
диссоциации
тетрамерного комплекса, при этом высвобождаются 2 активные каталитические
субъединицы. Такой механизм регуляции обратим. Отщепление молекул цАМФ
от
регуляторных
субъединиц
приведёт
к
ассоциации
регуляторных
и
каталитических субъединиц Протеинкиназы А с образованием неактивного
комплекса.
90
Рис. Регуляция активности аденилатциклазы. Гормон (Г), взаимодействуя
с рецептором (R) на поверхности клеток, приводит к уменьшению сродства
ГТФ-связывающего белка (G-белка, состоящего из протомеров α, β, γ) к ГТФ и
увеличению сродства к ГТФ. Присоединение молекулы ГТФ к активному
центру G-белка вызывает диссоциацию комплекса на субъединицы α-ГТФ и
димер βγ. Комплекс α-ГТФ активирует аденилатциклазу, что способствует
синтезу из АТФ внутриклеточных регуляторных молекул цАМФ. АЦ аденилатциклаза, ПКА - протеинкиназа А, Рi - Н3РО4.
7. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ БРОЖЕНИЯ (3 часа)
Спиртовое брожение. Эффект Пастера. Молочнокислое брожение.
Гомоферментативное и гетероферментативное молочнокислое брожение.
91
Брожение, вызываемое бифидобактериями. Образование диацетила и ацетоина.
Маслянокислое и ацетон-бутаноловое брожение. Ферредоксин и пируват, путь
образования бутирата. Образование ацетона и бутанола. Этанол-ацетатное
брожение.
Особенности
Смешанное
и
бутандиоловое
ацетолактат-синтаза.
янтарнокислое
биосинтетического
брожение.
метаболизма
Пируват-формиат-лиаза.
Формиат-водород-лиаза.
брожение.
Сульфатредукция
клостридий.
Пропионовокислое
(десульфатация).
–
и
Брожение
азотсодержащих соединений.
Брожение - метаболический процесс, при котором регенерируется АТР, а
продукты расщепления органического субстрата могут служить одновременно и
донорами, и акцепторами водорода. Реакции, приводящие к фосфорилированию
ADP, являются реакциями окисления. От окисленного углерода клетка
избавляется, выделяя С02. Отдельные этапы окисления представляют собой
дегидрирование, при котором водород переносится на NAD. Акцепторами
водорода, находящегося в составе NADH2, служат промежуточные продукты
расщепления субстрата. При регенерации NAD последние восстанавливаются, а
продукты восстановления выводятся из клетки.
При сбраживании углеводов и ряда других веществ образуются (по
отдельности или в смеси) такие продукты, как этанол, лактат, пропио-нат,
формиат, бутират, сукцинат, капронат, ацетат, н-бутанол, 2,3-бутан-диол, ацетон,
2-пропанол, С02 и Н2. В зависимости от того, какие продукты преобладают или
являются особенно характерными, различают спиртовое, молочнокислое,
пропионовокислое, муравьинокислое, маслянокислое и уксуснокислое брожение.
Многие микроорганизмы, осуществляющие брожение,-облигатные анаэробы, а
некоторые-факультативные анаэробы, способные расти как в присутствии
кислорода, так и без него; при этом кислород подавляет брожение и оно
сменяется дыханием.
Регенерация
АТР
при
брожении.
При
сбраживании
глюкозы
микроорганизмами образуется от 1 до 4 молей АТР.
92
У
большинства
микроорганизмов,
осуществляющих
брожение,
ис­пользуются только реакции, катализируемые фосфоглицераткиназой или
пируваткиназой, а необходимые акцепторы водорода образуются при этом из
пирувата и ацетилкофермента А. При сбраживании одного моля глюкозы
образуется лишь от двух до трех молей АТР, а продуктами оказываются лактат,
этанол, ацетон, бутират, н-бутанол, 2-пропанол, 2,3-бутандиол, капронат, ацетат,
С02 и молекулярный водород.
При использовании ацетаткиназы бактерии получают дополнительный
АТР. Ацетилфосфат образуется из ацетил-СоА и неорганического фосфата с
помощью фосфотрансацетилазы:
Ацетил-СоА + Р; -* Ацетилфосфат + СоА
Кроме того, возможно образование ацетилфосфата из фосфорилированных
сахаров (ксилулозо-5-фосфата, фруктозо-6-фосфата) при участии фосфокетолазы.
Способность
бактерий
использовать
реакцию,
катализируемую
ацетаткиназой, зависит от того, могут ли они выделять молекулярный водород
(Н2). В случае переноса восстановительных эквивалентов (электронов) на
протоны они могут выделяться в виде молекулярного водорода; поэтому клетке
нет надобности синтезировать акцепторы водорода. Чтобы понять это, нужно
остановиться на механизмах высвобождения Н2.
Анаэробные бактерии окисляют пируват в ацетил-СоА двумя способами.
В реакции, катализируемой пируват: ферредоксин-оксидоредуктазой (эта реакция
свойственна, в частности, клостридиям), восстанавливается ферредоксин (Fd). Его
окислительно-восстановительный потенциал очень низок (Е° = = - 420 мВ),
поэтому
с
помощью
специальной
гидрогеназы-ферредоксин
:Н2-
оксидоредуктазы-может освобождаться газообразный водород:
В
реакции,
катализируемой
пируват:
формиат-лиазой
(как
у
энтеробактерий), наряду с ацетил-СоА образуется также формиат. Он может
расщепляться гидрогенлиазной системой:
Формиат---- ► Н2 + С02
Оба механизма выделения Н2 имеют между собой то общее, что у
93
предшественников
(FdH
и
формиата)
очень
низкие
окислительно-
вос­становительные потенциалы. Поэтому клетке нетрудно избавляться от
восстановительных эквивалентов, образующихся при окислении пирува-та в
ацетил-СоА.
В отличие от этого водород, образующийся при дегидрировании
глицеральдегид-3-фосфата и связанный в форме NADH2, у большинства
анаэробных бактерий передается затем на органические акцепторы. Многие
бактерии
обладают,
однако,
способностью
высвобождать
и
эти
восстановительные эквиваленты в виде Н2 благодаря ферменту NADH2 :
ферредоксин-оксидоредуктазе, катализирующему реакцию
NADH2 + 2 Fd-- ► NAD + 2 FdH
С помощью гидрогеназы от FdH может отделяться Н2. Так как эти
ре­акции связаны с увеличением потенциала Н (от £„' = - 320 мВ для NADH2 до
£„' = - 420 мВ для ферредоксина) и их равновесие неблаго­приятно для выделения
Н2, они протекают только тогда, когда обра­зующийся и выделяющийся
молекулярный водород непрерывно уда­ляется. Поэтому организмы, способные к
образованию Н2 из NADH2, могут воспользоваться этим изящным способом
избавления от водоро­да в форме Н2 только тогда, когда живут вместе с другими
видами, не­прерывно потребляющими Н2. Именно так обычно обстоит дело в
при­роде. Такое явление называют межвидовой передачей водорода и говорят об
особой форме симбиоза в микробных сообществах.
Бактерии, способные таким образом избавляться от связанного с NAD
водорода, выделяя его в виде Н2, естественно, могут обходиться без превращения
ацетил-СоА в акцепторы для NADH2. Поэтому они могут превращать ацетилСоА в ацетилфосфат и регенерировать АТР путем ацетилкиназнои реакции.
Выделяют они главным образом ацетат и при сбраживании одного моля глюкозы
способны регенерировать до четырех молей АТР (как, например, Ruminococcus
albus; см. стр. 299). Роль процессов брожения в балансе природы. Виды,
осуществляющие брожение, играют важную роль в природном круговороте
веществ. Большая часть целлюлозы, поедаемой растительноядными животными,
94
выводится в непереваренном виде с калом. Когда этот содержащий целлюлозу
детрит попадает в анаэробные слои почвы или донных осадков водоемов,
целлюлозу сбраживают разлагающие ее клостридии и некоторые другие строго
анаэробные бактерии. При этом образуются на­званные выше продукты
брожения, в том числе почти всегда молекулярный водород. Водород находится в
начале анаэробной пищевой цепи, главные продукты которой метан и (или)
сероводород:
В осадках пресноводных озер и в рубце жвачных Н2 превращается
метанобразующими бактериями в метан, а в морских анаэробных эко­системах
сульфатредуцирующие бактерии превращают Н2 и сульфат в сероводород.
Большинство природных соединений, состоящих из углерода, водорода,
кислорода и (или) азота, поддается сбраживанию в анаэробных условиях.
Предпосылкой для этого является возможность частичного окисления субстрата в
результате внутримолекулярного расщепления, сопровождающегося выделением
энергии (экзергоническая реакция). Сбраживаются, например, полисахариды,
гексозы, пентозы, тетрозы, многоатомные спирты, органические кислоты (в том
числе сахарные кислоты, глюконат, малат, тартрат и т.д.), аминокислоты (за
исключением ароматических, лишь условно поддающихся сбраживанию),
пурины и пиримидины.
Наряду с соединениями, которые сбраживаются в анаэробных усло­виях,
есть вещества, неспособные сбраживаться. Таковы насыщенные алифатические и
ароматические углеводороды, стероиды, каротиноиды, терпены, порфирины. В
аэробных условиях все эти вещества поддаются расщеплению и полностью
окисляются, но в анаэробных условиях они очень стабильны. Стабильность их
может быть обусловлена двумя при­чинами. Во-первых, большинство названных
соединений
содержит
толь­ко
атомы
углерода
и
водорода;
при
внутримолекулярном расщеплении таких веществ энергия не выделяется. Вовторых, насыщенные углеводороды и полиизопреноиды могут окисляться только
в присутствии молекулярного кислорода; первичное воздействие на них
катализируется в этом случае оксигеназой. Высокая стабильность углеводородов
95
в анаэробных условиях подтверждается в каждом лабораторном опыте. Повидимому, именно благодаря этой стабильности углеводороды так долго
сохраняются в нефтяных месторождениях.
Спиртовое брожение. Этиловый спирт (этанол) - один из широко
распространенных продуктов сбраживания Сахаров микроорганизмами. Даже
растения и многие грибы в анаэробных условиях накапливают этанол. Главные
продуценты этанола - дрожжи, особенно штаммы Saccharomyces cerevisiae.
Дрожжи, как и большинство других грибов, осуществляют аэробное дыхание, но
без доступа воздуха они сбраживают углеводы до этанола и С02. У ряда
анаэробных и факультативно-анаэробных бактерий этиловый спирт тоже является
главным или побочным продуктом сбраживания гексоз или пентоз.
Известный для дрожжей путь образования этанола (фруктозобисфосфатный путь, пируватдекарбоксилазная реакция) из всех исследованных бактерий
обнаружен только у Sarcina ventriculi. Из пульке - бродящего сока агавы (Agave
mexicana) в Мексике была выделена палочковидная подвижная бактерия с
полярными жгутиками, образующая этанол. Эта бактерия Zymomonas mobilis
96
разлагает глюкозу по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатному пути и расщепляет
пируват с помощью пируватдекарбоксилазы на ацетальдегид и двуокись
углерода.
Ацетальдегид
восстанавливается
до
этанола.
Единственными
продуктами этого брожения являются этанол, С02 и небольшие количества
молочной кислоты. Интересно, что в водке, приготовленной из сока агавы,
обнаруживаются углеродные атомы 2, 3, 5 и 6 глюкозы, тогда как в спирте,
образуемом дрожжами, содержатся углеродные атомы 1, 2, 5 и 6 (рис. 8.1).
При брожениях, вызываемых некоторыми видами Enterobacteriaceae и
клостридиями, этанол является побочным продуктом. Предшественник этанолаацетальдегид-образуется в этом случае не прямо из пирувата (под действием
пируватдекарбоксилазы), а путем восстановления ацетил-СоА.
Совершенно иным путем образуют этиловый спирт гетероферментативные
молочнокислые бактерии (например, Leuconostoc mesenteroides). Глюкоза
разлагается ими по пентрзофосфатному пути до пентозофосфата. На ксилулозо-5фосфат воздействует фосфокетолаза:
Образовавшийся
ацетилфосфат
восстанавливается
ацетальдегид-
дегидрогеназой и алкогольдегидрогеназой в этанол. Другой продукт расщепления
глюкозы - глицеральдегид-3-фосфат - восстанавливается до лактата (через
пируват).
Нормальное сбраживание глюкозы дрожжами. Сбраживание глюкозы до
этанола и С02 дрожжами (Saccharomyces cerevisiae) осуществляется по
фруктозобисфосфатному пути. Превращение пирувата в этанол происходит в два
этапа. Сначала пируват декарбоксилируется пируватде-карбоксилазой при
97
участии
тиаминпирофосфата
до
ацетальдегида,
а
затем
ацетальдегид
восстанавливается алкогольдегидрогеназой в этанол при участии NADH2.
Переносится при этом водород, образующийся при дегидрировании
триозофосфата;
окислительно-восстановительный
баланс,
таким
образом,
сохраняется.
Формы брожения, открытые Нейбергом. Открытия Карла Нейберга и
разработанные им оригинальные методы имеют не только историческое значение.
Этот исследователь показал, что дрожжи способны сбраживать помимо глюкозы
также и пируват. В качестве промежуточного продукта при сбраживании
пирувата образуется ацетальдегид; это можно доказать, связывая альдегид
бисульфитом (который для дрожжей практически нетоксичен). Если к дрожжам,
сбраживающим глюкозу, прибавить бисульфит, будет происходить следующая
реакция:
СН3-СНО + NaHS03 -* СН3-СНОН-S03Na
При этом появится новый продукт брожения-глицерол-и одновременно
снизится выход этанола и С02.
Брожение
в
присутствии
бисульфита
стали
использовать
в
промышленности при производстве глицерола. Эта технология основана на том,
что ацетальдегид связывается и поэтому не может служить акцептором водорода.
Вместо
ацетальдегида
роль
такого
акцептора
принимает
на
себя
дигидроксиацетонфосфат; он восстанавливается до глицерол-3-фос-фата и
дефосфорилируется с образованием глицерола. Брожение можно представить так:
Глюкоза + Бисульфит -> > Глицерол + Ацетальдегидсульфит +
С02
Это модифицированное дрожжевое брожение известно как вторая форма
брожения по Нейбергу. Принцип перехватывания одного из метаболитов - метод
ловушки- стал впоследствии общим биохимическим методом.
При добавлении к бродящему раствору NaHC03 или Na2HP04 то­же
образуется глицерол, так как ацетальдегид превращается в результа­те реакции
дисмутации в этанол и уксусную кислоту и поэтому не мо­жет быть использован
98
в качестве акцептора водорода. Это третья форма брожения по Нейбергу.
Нормальное дрожжевое брожение Нейберг назвал первой формой
брожения. Он считал, что образующийся при небиологическом разложении
фруктозы 2-оксопропаноль (метилглиоксаль, СН3-СО-СНО) также является
промежуточным продуктом сбраживания глюкозы.
Отношение дрожжей к кислороду. Сбраживание дрожжами глюкозы анаэробный процесс, хотя дрожжи – аэробные организмы. В анаэробных
условиях брожение идет очень интенсивно, но роста дрожжей почти не
происходит. При аэрации брожение ослабевает, уступая место дыханию. У
некоторых дрожжей можно почти полностью подавить брожение усиленной
аэрацией (эффект Пастера). Пастер открыл этот эффект более ста лет тому назад,
исследуя процессы брожения при изготовлении вина. Это явление свойственно не
только дрожжам, но и всем другим факультативно-анаэробным клеткам, включая
клетки тканей высших животных.
Аэрация уменьшает потребление глюкозы, а также образование этанола и
С02, но делает возможным рост дрожжей. С энергетической точки зрения эти
явления понятны; они указывают на существование у дрожжей чрезвычайно
полезного регуляторного механизма: в анаэробных условиях образуются только 2
моля АТР на один моль использованной глюкозы, а при дыхании-38 молей АТР.
Таким образом, клетка, регулируя превращения субстрата, может получать
максимум энергии как в тех, так и в других условиях.
В
реакции
Пастера
участвует,
видимо,
несколько
регуляторных
механизмов, действующих в одном направлении. Эффект одного из них
про­является на уровне процессов фосфорилирования. В основе его лежит
конкуренция за аденозиндифосфат (ADP) и неорганический фосфат (Р). Для
дегидрирования
при
расщеплении
глицеральдегидфосфата
необхо­димы
ортофосфат и ADP.
Таким образом, расщепление субстрата (глюкозы) по фруктозобисфосфатному пути зависит от наличия ADP и неорганического фосфата. В
отсутствие ADP и фосфата дегидрирование глицеральдегидфосфата оказывается
99
невозможным. Однако в аэробных условиях с этой реакцией конкурирует за ADP
и фосфат процесс фосфорилирования в дыхательной цепи, который тоже
приводит к образованию АТР. Вполне вероятно, что расщепление глюкозы, а
вместе с тем и образование этанола тормозятся в результате снижения
внутриклеточной концентрации ADP и фосфата. Если же под действием ДНФ
процессы окисления в дыхательной цепи и фосфорилирование разобщаются, то
ADP
и
фосфат
снова
могут
использоваться
для
дегидрирования
глицеральдегид­фосфата, и аэробное потребление глюкозы повышается до
уровня, соответствующего анаэробным условиям.
За реакцию Пастера ответствен еще один регуляторный механизм, а
именно аллостерический эффект торможения фермента фосфофруктокиназы
аденозинтрифосфатом. Объяснение процесса, описанного Гарденом и Ионгом.
Отжатый дрожжевой сок разлагает глюкозу в соответствии с уравнением Гардена-Ионга. Накопление фруктозо-1,6-бисфосфата объясняется в этом случае тем,
что АТР в нарушенной ферментной системе (в отличие от живой клетки) не
может использоваться для энергетических целей и остается в избытке.
Дрожжевой сок не содержит фосфатаз, поэтому ADP должен непрерывно
регенерироваться за счет фосфорилирования лишней глюкозы или фруктозо-6фосфата.
Молочнокислое брожение. Молочнокислые бактерии объединяют в сем.
Lactobacillaceae. Хотя эта группа морфологически гетерогенна (включает длинные
и короткие палочки, а также кокки), в физиологическом отношении ее можно
охарактеризовать достаточно хорошо. Все относящиеся к ней бактерии
грамположительны, не образуют спор (за исключением Sporolactobacillus inulinus)
и в подавляющем большинстве неподвижны. Все они используют в качестве
источника энергии углеводы и выделяют молочную кислоту. В отличие от
Enterobacteriaceae, тоже образующих лактат, молочнокислые бактерии способны
только к брожению; они не содержат гемопротеинов (таких, как цитохромы и
каталаза). Несмотря на это, Lactobacteriaceae могут расти в присутствии
кислорода воздуха; будучи анаэробами, они все же аэротолерантны. Если какая100
нибудь бактерия растет в аэробных условиях, но не образует каталазу, ее с
большой вероятностью можно отнести к молочнокислым бактериям.
Потребность в факторах роста. Еще один отличительный признак
молочнокислых бактерий - это их потребность в ростовых веществах. Ни один
представитель этой группы не может расти на среде с глюкозой и солями
аммония. Большинство нуждается в ряде витаминов (лактофлавине, тиамине,
пантотеновой, никотиновой и фолиевой кислотах, биотине) и аминокислот, а
также в пуринах и пиримидинах. Культивируют эти бактерии преимущественно
на сложных средах, содержащих относительно большие количества дрожжевого
экстракта, томатного сока, молочной сыворотки и даже крови. Неожиданным
оказалось то, что некоторые молочнокислые бактерии (и другие организмы,
осуществляющие брожение) при росте на средах, содержащих кровь, образуют
цитохромы и даже, возможно, способны осуществлять фосфорилирова-ние в
дыхательной
цепи.
Молочнокислые
бактерии
не
могут,
следовательно,
синтезировать порфирины; если же порфирины добавлены в питательную среду,
то некоторые из этих бактерий способны образовать соответствующие геминовые
пигменты.
Таким
образом,
«метаболические
молочнокислые
инвалиды»,
которые,
бактерии
-
это
своего
рода
вероятно
в
результате
своей
специализации (рост в молоке и других средах, богатых питательными и
ростовы­ми веществами), утратили способность к синтезу многих метаболитов. С
другой стороны, многие из них обладают способностью, которой нет у
большинства других микроорганизмов; они могут использовать молочный сахар
(лактозу). В этом они сходны с многими кишечными бак­териями (например,
Escherichia coli). Лактоза в растительном царстве, по-видимому, не встречается;
она образуется у млекопитающих, выделяется с молоком и соответственно с ним
же поглощается. Таким образом, способность использовать лактозу можно
считать приспособлением к среде, характерной для кишечника млекопитающих.
Лактоза-дисахарид, который, прежде чем вступить на путь катаболизма гексоз,
должен быть расщеплен. Галактоза после фосфорилирования превращается в
101
глюкозофосфат.
В связи с образованием больших количеств молочной кислоты
питательная среда для молочнокислых бактерий должна быть хорошо забуферена.
Чаще всего с этой целью добавляют карбонат кальция. На агаризованной среде со
взвесью СаСО3 («меловом агаре») образование кислоты
обнаруживается
по
прозрачным ореолам вокруг колоний.
Распространение и места обитания. Распространение молочнокислых
бактерий в природе определяется их сложными потребностями в питательных
веществах и способом получения энергии (только брожение). Эти бактерии почти
никогда не обнаруживаются в почве или водоемах. В естественных условиях они
встречаются:
а) в молоке, местах его переработки и молочных продуктах
(Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermentum, L
brevis; Streptococcus lactis, S. diacetilactis);
б) на растениях и на разлагающихся растительных остатках
(Lactobacillus plantarum, L. delbriickii, L. fermentum, L. brevis; Streptococcus
lactis; Leuconostoc mesenteroides);
в) в кишечнике и на слизистых оболочках человека и животных
(Lactobacillus acidophilus; Bifidobacterium; Streptococcus faecalis, S.
salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae).
Streptococcus faecalis -обычный обитатель кишечника человека; S. bovis
распространен в пищеварительном тракте жвачных. Многие стрептококки
являются безобидными обитателями слизистых рта, дыхательных и мочевых
путей, половых органов; однако среди стрептококков есть и паразиты кровивесьма вирулентные возбудители болезней.
Благодаря образованию больших количеств молочной кислоты, к которой
сами они в значительной степени толерантны, молочно­кислые бактерии при
подходящих условиях могут довольно быстро размножаться, вытесняя другие
микроорганизмы. По этой причине их лег­ко культивировать на элективных
средах и легко выделять. «Естественные накопительные культуры» этих бактерий
102
содержатся в кислом молоке и молочных продуктах, кислом тесте, кислой
капусте, силосе и т.п.
Гомоферментативное молочнокислое брожение. Гомоферментативные
молочнокислые бактерии образуют практически только одну молочную кислоту
(она составляет не менее 90% всех продуктов брожения). Катаболизм глюкозы
происходит у них по фруктозобисфосфатному пути (бактерии обладают всеми
необходимыми для этого ферментами, включая альдолазу), а водород,
отщепляющийся при дегидрировании глице-ральдегид-3-фосфата, передается на
пиру ват.
От
стереоспецифичности
лактатдегидрогеназы
и
от
наличия
лактатрацемазы зависит, какой продукт образуется - D ( -)-, L( + )- или DLмолочная кислота. Лишь небольшая часть пирувата декарбоксилируется,
превращаясь в уксусную кислоту, этанол и С02, а также в ацетоин. Количество
образующихся побочных продуктов зависит, по-видимому, от доступа кислорода.
Гетероферментативное молочнокислое брожение. У гетероферментативных молочнокислых бактерий нет главных ферментов фруктозобисфосфатного пути - альдолазы и триозофосфат-изомеразы. Начальное превращение
глюкозы идет у них исключительно по пентозофосфатно-му пути, т.е. через
глюкозо-6-фосфат, 6-фосфоглюконат и рибулозо-5-фосфат (см. рис. 7.4 и 8.2).
Рибулозо-5-фосфат под действием эпимеразы превращается в ксилулозо-5фосфат, который в результате тиаминпиро-фосфат-зависимой
катализируемой
реакции,
пентозофосфокетолазой, расщепляется с образованием
глицеральдегидфосфата и ацетилфосфата.
У этих бактерий ацетилфосфат восстанавливается через ацетил-СоА и
ацетальдегид в этанол. Другие гетероферментативные молочнокислые бактерии
переводят ацетилфосфат частично или целиком в уксусную кисло­ту, что
сопровождается переносом высокоэнергетической фосфатной связи на ADP с
образованием АТР. Избыток водорода передается в этом случае глюкозе, из
которой
образуется
маннитол.
Глицеральдегидфосфат
через
пируват
превращается в лактат. Рибозу Leuconostoc mesenteroides сбраживает в лактат и
103
ацетат.
При
сбраживании
фруктозы
гетероферментативными
бактериями
образуются лактат, ацетат, С02 и маннитол:
3 Фруктоза -» Лактат + Ацетат + С02 + Маннитол
Фруктоза при этом служит акцептором избыточных восстановительных
эквивалентов:
Фруктоза + NADH2 -» Маннитол + NAD
Lactobacillus plantarum (= pentosus или arabinosus) сбраживает глюкозу по
гомоферментативному пути, а пентозы расщепляет с помощью фосфокетолазы,
превращая в лактат и ацетат. Следует отметить, что даже такая типичная
гомоферментативная бактерия, как Lactobacillus casei, хотя и сбраживает глюкозу
по гомоферментативному, пути, но рибозу превращает в ацетат и лактат
гетероферментативным путем. Рибоза индуцирует у нее синтез фосфокетолазы.
Если клетки, выросшие на среде с рибозой, отмыть, то после этого они и глюкозу
будут сбраживать как гетероферментативные бактерии.
Брожение,
осуществляемое
Bifidobacterium
bifidum.
Гетероферментативная молочнокислая бактерия В. bifidum получила это название
за свою V- или Y-образную форму (лат. bifidus-раздвоенный). Она известна тем,
что преобладает в кишечнике грудных детей, особенно детей, вскармливаемых
грудью. Эту зависимость ее распространения от способа кормления грудного
ребенка можно было связать с потребностью бактерии в углеводах, содержащих
N-ацетилглюкозамин, которые имеются только в молоке человека, но не коровы.
Все представители рода Bifidobacterium-строгие анаэробы; они не переносят
присутствия кислорода, и для их роста нужна атмосфера, содержащая 10% С02. С
тех пор как стали известны эти необычные для молочнокислых бактерий
особенности, бифидобактерии были обнаружены и в кишечной флоре взрослых
людей, и во многих других местах, даже в гниющем иле, и теперь различают
много видов этого рода. Они не имеют ни альдолазы, ни глюкозо-6фосфатдегидрогеназы, но содержат активные фосфокетолазы, расщепляющие
фруктозо-6-фосфат и ксилуло-зо-5-фосфат на ацетилфосфат и эритрозо-4-фосфат
104
или глицеральде-гид-3-фосфат.
Маслянокислое и ацетон-бутаноловое брожение. Масляная кислота
(бутират), н-бутанол, ацетон, 2-пропанол и ряд других органических кислот и
спиртов являются типичными продуктами сбраживания углеводов анаэробными
спорообразующими бактериями (клостридиями). Поэтому клостридии, а также
некоторые
специализированные
виды,
сбраживающие
только
этанол,
аминокислоты или иные вещества, рассматриваются здесь в связи с
маслянокислым брожением, которое они вызывают.
Признаки. Физиологически клостридии отличаются резко выраженным
бродильным типом метаболизма, а также чувствительностью к кислороду: они
растут только в анаэробных условиях. Однако существуют, по-видимому, все
переходные формы-от строго анаэробных видов (Clostridium pasteurianum, С.
kluyveri) до почти аэротолерантных (например, С. histolyticum, С. acetobutylicum).
Клостридии, как правило, не содержат ге-мопротеинов (цитохромов, каталазы).
Некоторые виды способны, однако, образовывать цитохромы, если в питательной
среде содержатся их предшественники. Из запасных веществ широко
распространены крахмалоподобные полисахариды.
Субстраты. Клостридии весьма сильно различаются в отношении
субстратов, которые они могут использовать и сбраживать. Некоторые виды мало
разборчивы и используют широкий круг веществ, другие узко специализированы
и способны сбраживать лишь один или несколько субстратов. В целом же
клостридиям доступно множество различных природных соединений. Они
способны
разлагать
полисахариды
(крахмал,
гликоген,
целлюлозу,
гемицеллюлозы, пектины), нуклеиновые кис­лоты, белки, аминокислоты, пурины
и пиримидины. Одним клостри­диям нужны сложные питательные среды или
ростовые вещества, другие в них не нуждаются. Некоторые могут обходиться
молекулярным азотом как единственным источником этого элемента; азот они
связывают с большой скоростью (Clostridium pasteurianum).
По способности использовать различные субстраты клостридии можно
подразделить на ряд групп. Сахаролитические клостридии расщепляют
105
преимущественно полисахариды или сахара. Пептолитические клостридии
расщепляют белки, пептоны и аминокислоты. Группы в свою очередь
объединяют на основе типов брожения и его продуктов.
Биохимия брожения и его продукты. При брожении образуются в разных
соотношениях кислоты (масляная, уксусная, молочная), спирты (бутанол, этанол,
2-пропанол), а также ацетон и газообразные продукты (Н2 и С02). Клостридии
расщепляют
глюкозу
по
фруктозобисфосфатному
пути.
Водород,
освобождающийся при дегидрировании глицеральдегидфосфата, переносится, как
правило, на органические кислоты или кетоны, образуемые из пирувата или
ацетил-СоА. Прототипом брожения, осуществляемого клостридиями, можно
считать сбраживание глю­козы Clostridium butyricum и С. acetobutylicum; при этом
образуются бу­тират, ацетат, бутанол, этанол, ацетон, 2-пропанол, С02 и Н2.
Выход продуктов варьирует в зависимости от условий.
Масляная кислота (бутират)-продукт конденсации двух молекул ацетилСоА при участии тиолазы с образованием ацетоацетил-СоА и его последующим
восстановлением. Кротонил-СоА под действием флавинового фермента бутирилСоА-дегидрогеназы восстанавливается до бутирил-СоА. От бутирил-СоА с
помощью СоА-трансферазы СоА может пере­носиться на ацетат; при этом
освобождается масляная кислота, которая выходит в среду. Из ацетил-СоА при
участии фосфотрансацетилазы и ацетаткиназы может быть получен свободный
ацетат, что сопровождается синтезом АТР из ADP. При чистом маслянокислом
брожении образующийся при окислении пирувата водород выделяется в
газообразном виде.
Бутанол, бутират, ацетон и 2-пропанол образуются при сбраживании
глюкозы клетками Clostridium acetobutylicum. При этом вначале выделяется также
масляная кислота; однако по мере подкисления среды начинают синтезироваться
ферменты (в том числе ацетоаце-татдекарбоксилаза), действие которых приводит
к накоплению ацетона и бутанола. Процессы образования этих веществ тесно
связаны между собой. В результате декарбоксилирования части ацетоацетата
утрачивается потенциальный акцептор водорода, который при восстановлении в
106
бутират мог бы дважды присоединить 2[Н]. Этот водород так или иначе должен
быть передан другим акцепторам, в том числе и только что образовавшемуся
бутирату. Для восстановления до бутанола бутират должен быть сначала
активирован путем превращения в бутирил-СоА.
Молекулярный водород может происходить из NADH2, образующегося
как
при
расщеплении
пирувата,
так
и
при
дегидрировании
глицеральдегидфосфата. Чем больше водорода может быть образовано при этом,
тем меньше нужно синтезировать акцепторов водорода (ацетоацетил-СоА). Таким
образом, энергия связи ацетил-СоА может быть сохранена в форме АТР. Значит,
если при сбраживании глюкозы С. butyricum на один моль глюкозы образуется
больше двух молей Н2 и поэтому меньше бутирата и соответственно больше
ацета­та, то выход АТР может превышать 3 моля.
Поскольку ацетон, 2-пропанол и бутанол служат важными органическими
растворителями, брожение, осуществляемое клостридиями, имеет большое
техническое значение. Именно в связи с получением этих веществ перед
промышленносью впервые встала задача проведения микробиологических
синтезов в условиях, исключающих возможность вся­кого загрязнения.
Сбраживание
этанола
и
ацетата.
Из
накопительных
культур
Methanobacterium omelianskii, содержавших в качестве субстрата этанол, была
выделена анаэробная спорообразующая бактерия, которая наряду с этанолом
нуждается и в ацетате. Эта бактерия -Clostridium кluyveri-превращает смесь
уксусной кислоты и этанола в масляную и капроновую кислоты и молекулярный
водород. Ацетат служит дополнительным акцептором водорода, и он образуется в
ходе брожения. АТР синтезируется только при ацетаткиназной реакции.
Пропионовокислые бактерии обитают в рубце и кишечнике жвачных
животных (коров, овец); они участвуют там в образовании жирных кислот,
главным образом пропионовой и уксусной. Благодаря им образующаяся в рубце в
результате различных видов брожения молочная кислота превращается главным
образом в пропионовую. Пропионовокислые бактерии не встречаются в молоке, и
их не удается выделить из почвы или при­родных вод. Для получения
107
накопительной культуры этих бактерий питательную среду с лактатом и
дрожжевым экстрактом инокулируют швейцарским сыром и инкубируют в
анаэробных
условиях.
В
швейцарский
сыр,
в
созревании
которого
пропионовокислые бактерии играют важную роль (определяя также его вкус), они
попадают с сычужным ферментом, применяемым в процессе приготовления сыра
для свертывания молока.
Рост и метаболизм представителей рода Propionibacterium. Этот род
относят к коринеформным бактериям, он включает грамположительные
неподвижные палочки, не образующие спор. При неблагоприятных условиях
роста часто появляются булавовидные формы. Про-пионовокислые бактерии на
твердых средах при доступе воздуха не растут. Так как они не переносят
присутствия атмосферного 02, способны расти в анаэробных условиях и
регенерировать АТР за счет энергии брожения, их считали организмами,
облигатно осуществляющими брожение. С другой стороны, давно известно, что
они обладают гемсо-держащими ферментами, такими как цитохромы и каталаза.
Действительно, исследованные представители рода Propionibacterium оказались
способными расти как в анаэробных, так и в аэробных условиях. При достаточно
слабой контролируемой аэрации урожай их клеток во много раз больше, чем в
строго анаэробных условиях. В случае аэробного роста, правда, скорость
диффузии кислорода из газовой фазы в бактериальную взвесь не должна
превышать его потребления в процессе дыхания: кислород при измеримых
парциальных давлениях оказывает токсическое действие. Виды Propionibacterium,
таким образом, следует относить к микроаэротолерантным формам. В
анаэробных условиях представители этого рода сбраживают глюкозу, сахарозу,
лактозу и пентозы, а также лактат, малат, глицерол и другие субстраты с
образованием пропионовой кислоты. Расщепление гексоз идет по фруктозобисфосфатному пути.
Образование
пропионовой
кислоты
(метилмалонил-СоА-путь).
Восстановление лактата или пирувата до пропионата идет по пути, который по
характерному промежуточному продукту был назван метилмалонил-СоА-путем
108
(рис. 8.3). Сначала пируват при участии комплекса
карбоксилируется
биотин-С02
метилмалонил-СоА-карбокситрансферазой с образованием
оксалоацетата, а затем восстанавливается через малат и фумарат до сукцината.
Транспорт электронов на этом этапе сопряжен с фосфорилированием
(фумаратное дыхание). Затем сукцинат с помощью СоА-трансферазы (сукцинилСоА: пропионат-СоА-трансферазы) присоединяется к СоА и таким образом
активируется. Сукцинил-СоА под действием метилмалонил-СоА-мутазы и при
участии кофермента В12 (цианкобаламина) превращается в метил-малонил-СоА,
и только от этого промежуточного продукта, наконец, отщепляется С02; в
результате образуется пропионил-СоА, а С02 связывается с упомянутой выше
метилмалонил-СоА-карбокситрансфе-разой.
Из
пропионил-СоА
образуется
пропионат, в результате того что СоА-трансфераза переносит СоА на сукцинат.
Следует особо отметить, что в процессе образования пропионата две группы (С02
и СоА) пере­носятся с последующего продукта на предшествующий, не
освобождаясь. Заслуживает внимания и участие трех кофакторов (биотина, СоА и
кофермента В12) в этом процессе. По метилмалонил-СоА-пути пропионат
образуется у большинства пропионовокислых бактерий, а также у Veillonella
alcalescens и Selenomonas ruminantium.
Реакции метилмалонил-СоА-пути могут протекать и в обратном
направлении, как, например, при расщеплении валина, изолеицина и жирных
кислот с длинной цепью и нечетным числом углеродных атомов. Из жирных
кислот и изолеицина образуется пропионил-СоА, который карбоксилируется с
образованием метилмалонил-СоА. Для пре­вращения последнего в сукцинил-СоА
при участии метилмалонил-СоА-мутазы необходим витамин В12 (кофермент
В12); это относится и к корневым клубенькам бобовых, и к клеткам Rhizobium, и
к животным клеткам.
Сульфатредукция.
Сульфатредукция–
процесс
восстановления
сульфатных ионов до сероводорода под воздействием сульфатредуцирующих
бактерий (Microspiro) в отсутствие кислорода и в присутствии органических
веществ. Анаэробные сульфатредуцирующие бактерии используют кислород
109
сульфатов
для
дыхания,
выделяя
сероводород
—
необычайно
реакционноспособное вещество, которое выступает в природных водоемах как
основной регулятор окислительно-восстановительных процессов и кислородного
режима. Процесс этот протекает в грунтах водоемов повсеместно, где есть
достаточное количество органического вещества и некоторое количество
сульфатов. Для его протекания в толще воды нужны также условия замедленного
водообмена, способствующие формированию анаэробной зоны. Основными
показателями локализации и интенсивности процесса служат содержание
сероводорода, сульфидов, тиосульфатов и сульфатов в пробе, окислительновосстановительный потенциал, количество сульфатредуцирующих бактерий и их
активность. Анализы локализации и интенсивности процессов образования
сероводорода были выполнены во многих морских и пресных водоемах. С
наибольшей активностью процесс идет в меромиктических водоемах типа озера
Беловодь и Черного моря, имеющих сероводородную зону. При этом он наиболее
интенсивен в осадках, куда в большом количестве поступает свежее органическое
вещество.
110
В водоемах с хорошим кислородным режимом процесс С. идет только в
толще иловых отложений. Его результатом является черный цвет толщи озерных
илов, вызванный образованием сульфида железа. Процесс восстановления
сульфатов особенно активно протекает в водоемах, подверженных загрязнению.
Развитие С. вызывает гибель водных организмов, подрывая самоочистительную
способность водоема. Дальнейшее загрязнение приводит к ускоренному
накоплению органического вещества, что, в свою очередь, еще больше усиливает
процессы образования сероводорода. Особую опасность в этом отношении
представляют
водоемы,
промышленности,
загрязняемые
богатыми
сточными
сульфатами.
Сильная
водами
С.
гидролизной
возникает
в
эвтрофированных водоемах в условиях летней и зимней стагнации (см.). В этом
случае сульфаты, которые не считаются особо загрязняющим ионом природных
вод и всегда присутствуют в сточных водах, становятся чрезвычайно опасным
загрязняющим агентом. При обилии углекислоты, образующейся при распаде
органики в эвтрофированном водоеме, сероводород появляется в водоеме в
наиболее токсичной свободной форме. Сероводород, образующийся в результате
111
восстановления сульфатов, при хорошем кислородном режиме постепенно
окисляется в водоеме как чисто химическим путем, так и при участии бактерий.
Установлено, что окисление сероводорода кислородом воды протекает в
водоемах в два этапа: первый этап — чисто химическое окисление его до
тиосульфата
и
сульфата,
второй
этап
—
бактериальное
доокисление
образовавшегося при химическом окислении тиосульфата.
8. ХЕМОЛИТОТРОФНЫЙ И ФОТОТРОФНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ (2
часа)
Физиологические
генерирование
группы
хемолитотрофов.
восстановительных
Получение
эквивалентов.
энергии
и
Факультативные
и
облигатные хемолитотрофы. Окисление окиси углерода. Ассимиляция СО2.
Фототрофный
метаболизм.
Реакции
фотосинтезирующего
аппарата.
Обратный перенос электронов. Углеродный метаболизм. Фотообразование
молекулярного водорода. Фотосинтез у галобактерий.
Хемолитотрофы - организмы, для которых источником энергии служат
окислительно-восстановительные
реакции,
а
донором
электронов
—
неорганические вещества. Большинство организмов, способных расти в условиях,
когда единственным источником углерода служит углекислота, фиксируют ее
через рибулозобисфосфатный цикл (цикл-Кальвина-Бассама). К таким организмам относятся аэробные хемолитоавтотрофные бактерии, почти все
фототрофные
Кальвина-
бактерии,
Бассама
цианобактерии
определенно
не
и
зеленые
участвует
в
растения.
Цикл
ассимиляции
С02 у
метанобразующих и ацетогенных бактерий, хотя они тоже относятся к
хемолитоавтотрофным организмам.
Для рибулозобисфосфатного цикла характерны два фермента, не
участвующие
в
других
метаболических
путях,-фосфорибулокиназа
и
рибулозобисфосфат-карбоксилаза. Последний фермент представляет собой белок,
в количественном отношении преобладающий над всеми другими белками на
112
нашей планете. Рибулозобисфосфатный цикл -это восстановительный процесс, в
котором С02 восстанавливается до уровня углеводов. В цикле могут быть
выделены три участка: 1) реакция карбоксилирования, 2) восстановление и 3)
регенерация молекул, служащих акцепторами С02.
Реакция
карбоксилирования. При
участии
рибулозобисфосфат-кар-
боксилазы к рибулозо-1,5-бисфоефату присоединяется С02, и в результате
образуются две молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты:
Этот же фремент может катализировать и другую реакцию. В отсутствие
С02 и в присутствии 02он проявляет оксигеназную активность, окисляя
рибулозобисфосфат до фосфогликолата и 3-фосфоглицерата. Эта реакция
участвует в образовании гликолевой кислоты у авто-трофных бактерий и у
зеленых растений, а следовательно - в фотодыхании.
Реакция восстановления. За реакцией карбоксилирования следует восстановление карбоксильной группы 3-фосфоглицерата до альдегидной группы. В
нем участвуют реакции, известные для фруктозобисфосфатного пути, т.е.
фосфорилирование под действием 3-фосфогли-цераткиназы за счет АТР и
восстановление при участии
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы за счет NAD(P)H2. У бактерий эта
реакция зависит от NAD, а у растений-от NADP.
113
Восстановление 3-фосфоглицерата-это, собственно, и есть тот этап
ассимиляции С02, который требует затраты энергии и восстановительной силы.
Последующие стадии происходят на примерно одинаковом энергетическом
уровне.
Регенерация акцепторов СО. Глицеральдегид-3-фосфат находится в
равновесии с дигидроксиацетонфосфатом (триозофосфатизомеразная реакция),
а
оба
триозофосфата-в
равновесии
с
фруктозо-1,6-бисфосфа-
том (альдолазная реакция).
Фруктозобисфосфат дефосфорилируется под действием фруктозобисфосфатазы с образованием фруктозо-6-фосфата. Затем из одной молекулы
фруктозо-6-фосфата и трех молекул триозофосфата образуются три молекулы
рибозо-5-фосфата. Некоторые из ферментов, катализирующих эти превращения,
участвуют и в окислительном пентозофос-фатном цикле. Первое из этих
превращений-транскетолазная реакция
катализирует
перенос
гликольной
(рис.
группы
11.2, справа). Транскетолаза
от
кетозомонофосфата
на
альдозофосфат. Гликолевый альдегид при этом временно связывается с
тиаминдифосфатом (тиаминпирофос-фатом),
играющим роль
кофермента:
получается «активный гликолевый альдегид.
Образующийся в ходе транскетолазной реакции тетрозофосфат (эри-трозо4-фосфат) превращается в альдолазной реакции с дигидроксиацетонфосфатом в
седогептулозо-1,7-бисфосфат.
Последний
подвергается
при
участии
фруктозобисфофатазы дефосфорилированию в положении 1 с образованием
седогептулозо-7-фосфата. Эта реакция гидролиза фосфорного эфира необратима и
дает возможность регулировать метаболизм в данном пункте.
Для высших растений точно установлено, что в ходе фотосинтеза регенерация рибулозо-5-фосфата происходит через седогептулозо-1,7-бис-фосфат
(рис. 11.2, справа); однако в темноте синтез пентозофосфатов ведет через
трансальдолазную реакцию прямо к седогептулозо-7-фосфату (рис. 11.2, слева).
Гликолильная группа седогептулозо-7-фосфата переносится с помощью
транскетолазы на глицеральдегид-3-фосфат, что ведет к образованию двух
114
пентозофосфатов. Эти пентозофосфаты (рибозо-5-фосфат и ксилулозо-5-фосфат)
находятся
в
равновесии
с
рибулозо-5-фосфатом.
Последней
реакцией
рибулозобисфосфатного цикла является фосфори-лирование рибулозо-5-фосфата
за счет АТР при участии фосфорибуло-киназы до рибулозо-1,5-бисфосфата.
Баланс рибулозобисфосфатного цикла. Для синтеза 1 моля гексозы из 6
молей
С02необходимы
шесть
оборотов.
Баланс
фиксации
С02 в
ри-
булозобисфосфатном цикле можно представить следующим уравнением:
Хотя цикл и изображают замкнутым, многие его промежуточные
продукты служат важными исходными веществами для синтеза клеточных
компонентов: из 3-фосфоглицерата образуются пируват и аце-тил-СоА, из
эритрозо-4-фосфата
-
ароматические
аминокислоты;
рибо-зо-5-фосфат
используется для синтеза нуклеотидов, а гексозофосфаты-для построения
полимеров. Регуляция активности некоторых участвующих в цикле ферментов
преследует, видимо, две цели: с одной стороны, на фиксацию С02 (связанную с
большой затратой энергии) не должно расходоваться слишком много АТР; с
другой стороны, цикл не должен прерваться (что могло бы произойти, если бы его
промежуточные продукты оказались использованными; стр. 496-497).
Другие пути автотрофной фиксации С02. Фиксация С02 в рибулозобисфосфатном цикле является ныне хотя и важнейшей для биосферы, но далеко
не единственной цепью реакций, ведущей к синтезу органических веществ.
Анаэробные автотрофные бактерии располагают двумя другими механизмами
ассимиляции С02. Метанобразующие, ацетогенные и сульфатредуцирующие
(сульфидогенные) бактерии, способные использовать в качестве донора
электронов Н2 или СО, восстанавливают С02 по анаэробному ацетил-СоАпути до ацетил-СоА и пирувата (разд. 9.4). Последний вступает в результате
известных реакций на центральные пути биосинтеза.
Зеленые
серобактерии (Chlorobium limicola, forma thiosulfatophilum) фиксируют
С02 исключительно
трикарбоновых
с
кислот;
помощью
реакций
С02 фиксируется
восстановительного
благодаря
цикла
восстановительному
115
карбоксилированию сукцинил-СоА.
Сравнение всех трех типов автотрофной фиксации С02 позволяет заключить, что анаэробные процессы более экономны, чем аэробные. Синтез 1 моля
триозофосфата из 3 молей С02 по анаэробному ацетил-СоА-пути требует затраты
всего лишь 3 молей АТР, в восстановительном цикле трикарбоновых кислотзатраты 5 молей АТР, а в рибулозобисфосфатном цикле-9 молей АТР.
Общие реакции фиксации С02. Мы уже не раз упоминали о том, что и
гетеротрофные организмы нуждаются в двуокиси углерода и вовлекают ее в свой
метаболизм. Отмечалась роль карбоксилирования пирувата и фосфоенолпирувата
в функционировании цикла трикарбоновых кислот. В какие промежуточные
продукты обмена может включиться С02, показано на рис. 11.3.
Упоминавшиеся реакции фиксации С02 играют различную роль у разных
организмов. Некоторые из них служат для активации метаболитов или для
пополнения
центральных
восстановительного
биохимических
карбоксилирования,
путей
метаболитами.
зависимые
от
Реакции
ферредоксина,
встречаются лишь у некоторых анаэробных и фото-трофных бактерий.
Окисление
двухвалентного
Железобактерия Thiobacillus ferrooxidans окисляет
двухвалентное
железа.
железо
до
116
трехвалентного. Эта бактерия очень похожа на Т. thiooxidans, жизнеспособна при
рН среды до 2,5, однако энергию она получает не только за счет окисления
восстановленных соединений серы, но и за счет окисления ионов Fe2 +. Эта
железобактерия обитает в кислых рудничных водах, содержащих сульфиды
различных металлов, в том числе пирит (FeS2). С несомненностью установлено,
что ацидофильные железобактерии способны к хемоавтотрофному образу жизни.
Недавно были также открыты термофильные штаммы тиобацилл,
окисляющих железо и серу. Штаммы термофила Sulfolobus acidocaldarius тоже
могут окислять двухвалентное железо. Из почв, содержащих антимонит, удалось
выделить автотрофную бактерию Stibiobacter senarmontii,способную окислять
Sb3 + до Sb5 + .
Другие железобактерии. К наиболее известным и легко распознаваемым
железобактериям относятся также Gallionella ferruginea и Leptothrix ochracea. Их
можно найти, например, в дренажных трубах и горных ручьях среди хлопьев и
толстых налетов оксидов железа. До последних лет оставалось неясным,
способны ли эти бактерии использовать энергию, освобождающуюся при
окислении Fe2 + в Fe3 + , и расти как автотрофы. Недавно у представителей
рода Gallionella была обнаружена рибулозобисфосфат-карбоксилаза; поэтому их
относят сейчас к литоавтотрофным бактериям.
Бактерии окисляют не только железо, но и марганец. Хламидобактерия Leptothrix discophorusспособна окислять Мп2+ до Мп4 + . Однако еще не
установлено точно, используется ли энергия, получаемая в результате такого
окисления, для метаболических целей.
Облигатная хемолитоавтотрофия. Облигатная хемолитоавтотрофия-это
выражение крайней степени приспособления и специализации организмов, окисляющих неорганические субстраты. Для того чтобы объяснить этот феномен,
было предложено и проверено несколько гипотез:
1. Можно исходить из предположения, что цикл трикарбоновых кислот не
является необходимым для окисления неорганического субстрата (подобно тому
117
как он не нужен для брожения). В самом деле, восстановительные эквиваленты,
получающиеся благодаря окислению неорганического субстрата, поступают
в дыхательную цепь. Должны быть обеспечены лишь синтетические функции цикла трикарбоновых кислот (образование 2-оксоглутарата и сукцината). Но для
этого фермент 2-оксоглутаратдегидрогеназа не нужен. Проверка показала, что у
ряда облигатно-автотрофных бактерий его действительно нет. 2-Оксоглутаратдегидрогеназа не обнаруживалась и у многих факультативно-автотрофных бактерий, если клетки росли на среде с неорганическим источником энергии. Таким
образом, мутант факультативно-автотрофной бактерии, потерявший способность
к синтезу 2-оксоглутаратдегидрогеназы, вел бы себя как.облигатно-авто-трофный
микроорганизм.
2. Поскольку нитрифицирующие бактерии, а также бактерии, окисляющие
серу, сульфит и железо, обладают «разделенной» дыхательной цепью, вполне
возможно, что у некоторых облигатных автотрофов в первом участке этой цепи
имеется необратимый этап, который делает невозможной ее нормальную функцию, а именно окисление NADH2 (этот отрезок используется только для обратного переноса электронов). Такое нарушение обратимости цепи, возможно связанное с регуляцией ферментов, могло бы служить для сохранения восстановительной силы (NADH2), полученной с большими затратами энергии.
Пока еще не удалось дать единое объяснение облигатной автотрофии. Возможно, что у разных физиологических групп бактерий этот феномен имеет разные причины.
Окисление восстановленных соединений серы. Способностью получать
энергию в результате окисления восстановленных соединений серы обладают
грамотрицательные
бактерии
с
полярно
расположенными
жгутиками,
объединяемые в род Thiobacillus. Недавно была открыта спирилла с полярными
жгутиками (Thiomicrospira), а
также
неподвижная
термофильная
бактерия Sulfolobus. Большинство тиобацилл может окислять различные соединения серы, образуя в качестве конечного продукта сульфат:
118
Многие
гатные
тиобациллы
хемолитоавтотрофы,
(Т. thiooxidans, T. thioparus, T. denitrificans)-облификсирующие
С02.
Другие
(Т. novellus,
Т. intermedins) способны также использовать в качестве источников энергии и
углерода органические соединения.
Т. thiooxidans образует большие количества серной кислоты и хорошо
переносит низкие значения рН среды (клетки не теряют жизнеспособности даже в
1 н. растворе серной кислоты). Такое подкисление среды во многих случаях
полезно для нас. Чтобы уменьшить щелочность, в известковые почвы вносят
элементарную серу; в результате образуемая тиобациллами серная кислота
перводит карбонат кальция в более растворимый сульфат кальция, который
вымывается из почвы. Аналогичным путем можно бороться с ацидофобным
возбудителем парши картофеля.
В то время как названные выше тиобациллы живут в аэробных условиях, Т. denitrificans наряду с 02 может использовать в качестве акцептора
водорода также и нитрат (анаэробное дыхание). Эта бактерия денитрифицирует
нитрат, но не способна к ассимиляционному восстановлению его до аммиака.
Поэтому в качестве источника азота ей необходимы соли аммония.
Sulfolobus acidocaldarius и Caldariella acidophila живут
в
экстремальных
экосистемах. Места их обитания - горячие кислые источники, где окисляется
главным
образом
сероводород
магматического
(вулканического)
119
происхождения. S. acidocaldarius -это термофил, факультативный хемолитотроф,
окисляющий элементарную серу до серной кислоты; он лучше всего растет при
рН от 2 до 3 и при температурах от 70 до 75°С, однако сохраняет
жизнеспособность и при 90"С.
Этапы окисления соединений серы. Трудность изучения отдельных стадий
этого процесса связана с тем, что в водных растворах сероводород и сера
окисляются и небиологическим путем, хотя и медленно. На рис. 11.1
представлены наиболее важные реакции. Желтая элементарная сера (серный
цвет) представляет собой кольцо из восьми атомов (S8); она плохо растворима в
воде (0,176 мг/л).
Как полагают, электроны, освобождающиеся при окислении сульфита до
сульфата, поступают в дыхательную цепь на уровне цитохрома с. По крайней
мере
некоторые
использовать
тиобациллы {Thiobacillusthioparus, T. denitrificans) способны
выделяющуюся
при
этом
окислении
энергию
для
фосфорилирования на уровне субстрата (рис. 11.1. 5 и 6).
Caldariella сейчас относят к роду Sulfolobus.-Прим. ред.
Реакции (1) и (2) противоположны реакциям диссимиляционного восстановления сульфата (рис. 9.3).
Нитчатые и другие серобактерии. В местах, где в осадках стоячих и
медленно текущих вод образуется H2S, часто можно обнаружить на черной
120
поверхности
ила
бесцветные
нитчатые
серобактерии Beggiatoa, Thiothrix и Thioploca, а также крупные одноклеточные
формы Achromatium oxaliferum и Thiovulum. На Beggiatoa С. Н. Виноградский
проводил свои эксперименты, которые легли в основу представления о
хемолитоавтотрофии. Однако получить хотя бы одну из этих «классических
серобактерий» в чистой культуре и подробно изучить их физиологические и
биохимические особенности до сих пор не удалось. Неудача попыток
выращивать их в чистой лабораторной культуре связана, очевидно, с особыми
требованиями этих бактерий. Наряду с сероводородом им нужен молекулярный
кислород, но они переносят его присутствие только в самых малых
концентрациях
(т.е.
являются
микроаэрофилами).
Для
создания
таких
оптимальных условий необходимы особые экспериментальные приемы и много
терпения.
Сероводород как основа бессветовой экосистемы. Для жизни всех высших
гетеротрофных
организмов необходима
биомасса,
создаваемая с
помощью фотосинтеза. Однако несколько лет назад было найдено исключение из
этого правила. На больших морских глубинах, в тех местах, где расходятся
континенты, из морского дна бьют горячие источники с температурой воды
около 350°С. В воде этих источников растворено много различных минеральных
веществ, в том числе H2S. Там, где такая вода приходит в соприкосновение с
холодной, содержащей кислород морской водой, могут расти бактерии,
окисляющие серу или сероводород. Они служат пищей для моллюсков,
ракообразных и червей. Один из представителей погонофор-Riftiapachyptilaпрекрасно приспособился к существованию в таких местах. У этого животного
нет ни ротового, ни анального отверстия, зато оно обладает особым органом
(трофосомой), в котором в качестве эндосимбионтов растут бактерии,
окисляющие H2S; кровь снабжает этот орган сероводородом и кислородом. Таким
образом, на больших морских глубинах, куда не проникает свет, в
непосредственной близости от горячих источников существует экосистема, в
121
которой
продукция
биомассы
основана
не
на
фотосинтезе,
а
на
хемолитоавтотрофии.
Использование
неорганических
доноров
водорода:
аэробные
хемолитотрофные бактерии. Многие группы почвенных и водных бактерий
могут использовать в качестве доноров водорода или электронов неорганические
соединения или ионы (ионы аммония, нитрита, сульфида, тиосульфата, сульфита
и двухвалентного железа), а также элементарную серу, молекулярный водород и
СО, т.е. способны получать в результате их окисления восстановительные
эквиваленты и энергию для синтетических процессов. Получение энергии
происходит, как правило, в результате дыхания с 02 как конечным акцептором
водорода. Лишь немногие из относящихся к этой группе бактерий способны
расти за счет «анаэробного дыхания», используя в качестве акцепторов водорода
нитрат, нитрит, закись азота и т. п. Такой образ жизни с использованием
неорганического донора водорода называют хемолитотрофным.
Большинство бактерий с таким типом метаболизма используют СО 2 в
качестве единственного или главного источника клеточного угле­рода. Они
являются поэтому автотрофами (хемолитоавтотрофами). Почти все аэробные
хемолитоавтотрофные бактерии, до сих пор изученные в этом отношении,
ассимилируют углерод С02 через рибулозобисфос-фатный цикл. Механизм
такого типа фиксации С02 будет рассмотрен в конце этой главы.
Для некоторых хемолитотрофных бактерий такой образ жизни является
облигатным, другие же - факультативные хемолитотрофы, т.е. способны также и
к хемоорганогетеротрофному росту. Многие хемолитоавтотрофные бактерии
благодаря своей высокой специализации занимают монопольное положение.
Окисление аммиака, нитрита и неорганических соединений серы в природе в
первую очередь связано с деятельностью нитрифицирующих и серуокисляющих
бактерий.
Фототрофные бактерии и фотосинтез. Способность использовать свет
как источник энергии, необходимой для роста, присуща двум группам бактерий,
122
принципиально отличающимся друг от друга.
Пурпурные и зеленые бактерии, объединяемые в порядок Rhodospirillales,
можно рассматривать как реликтовые организмы, дошедшие до нас из времен
начальной эволюции фотосинтеза. Они не в состоянии использовать в качестве
донора водорода воду (как это делают зеленые растения); им требуются доноры с
более высокой степенью восстановления (H2S, H2 или органические вещества).
Поэтому фотосинтез у этих бактерий протекает без выделения 02. В таких
случаях говорят об аноксигенном фотосинтезе. Бактерии этой группы - типичные
водные организмы, распространенные как в пресной, так и в морской воде. Их
красная,
оранжевая
или
зеленая
окраска
обусловлена
присутствием
бактериохлорофиллов и каротиноидов.
Цианобактерии используют в качестве донора водорода воду и выделяют
на свету кислород. Таким образом, они осуществляют оксигенный фотосинтез.
Пигментная система этих бактерий включает хлорофилл а, каротиноиды и
фикобилины. Поскольку процесс фотосинтеза у циано­бактерии принципиально
не отличается от фотосинтеза зеленых растений, эту группу бактерий до
недавнего
времени
рассматривали
совместно
с
фотосинтезирующими
эукариотами и называли сине-зелеными водорослями. Однако по строению своих
клеток это типичные прокариоты.
Использование световой энергии галобактериями. Виды, относящиеся к
роду
Halobacterium
(Н.
halobium,
H.
cutirubrum),
составляют
высокоспециализированную в физиологическом отношении группу бактерий.
Места их естественного обитания-высококонцентри­рованные или насыщенные
растворы солей, такие как воды Большого соленого озера в США или места, где
добывают соль путем выпаривания морской воды. Приспособленность бактерий к
существованию в столь экстремальных условиях связана с тем, что концентрация
соли внутри клеток так же высока, как и в окружающей среде. Оптимальный рост
таких бактерий наблюдается в 3,5-5,0 М растворе NaCl. Для нормального
функционирования выделенных из клеток ферментов тоже не­обходимы более
чем двухмолярные концентрации соли. Галобактерии относятся к архебактериям.
123
Палочковидные подвижные клетки Н. halobium окрашены содержащимися
в них каротиноидами в красный, оранжевый или желтый цвет. В их
плазматической мембране выделяются темно-красные пятна диаметром около 0,5
мкм, занимающие в целом около половины поверхности клетки. Эти пятна
образованы так называемой пурпурной мембраной. Ее цвет обусловлен наличием
в ней бактериородоп-сина - пигмента, сходного с родопсином, который
содержится в зрительных клетках животных. Благодаря этому пигменту на свету
создается протонный градиент между наружной и внутренней сторонами
мембраны. Пурпурная мембрана выполняет, таким образом, функцию протонного
насоса, приводимого в действие светом, и это ведет к возникновению
электрохимического мембранного потенциала. Уравнивание зарядов может
сопровождаться синтезом АТР: пурпурная мембрана делает возможным особый
вид фосфорилирования. Преобразованная энергия света дополняет энергию,
получаемую путем аэробного окисления субстрата.
Аноксигенный фотосинтез. Фотосинтетический транспорт электронов у
анаэробных фототрофных бактерий во многих отношениях отличается от только
что описанного. В аноксигенном фотосинтезе участвует только одна световая
реакция; она поддерживает циклический транспорт электронов. Электроны,
покидающие цикл для восстановления NAD, не являются продуктом разложения
воды. Фотосинтез зависит от наличия в среде восстановленных субстратов и не
сопровождается выделением 02. Собственно фотореак­ция хотя и аналогична
первой фотореакции у зеленых растений, однако у некоторых бактерий она
приводит, вероятно, лишь к созданию протонного потенциала и тем самым к
запасанию энергии (АТР), но не к восстановлению NAD. Таким образом,
нециклический перенос электронов (от донора электронов к пиридиннуклеотиду)
здесь отсутствует. По-видимому, NADH2 образуется в результате какой-то
темновой реакции в ходе обратного транспорта электронов, протекающего с
затратой энергии.
Следует, однако, заметить, что у фототрофных бактерий между
отдельными группами существуют гораздо большие различия в составе
124
пигментов и механизмах фотосинтеза, чем у зеленых растений. В последующем
изложении мы вначале не будем касаться зеленых бактерий.
Фотореакция у пурпурных бактерий. Как уже говорилось, у пурпурных
бактерий пигменты и компоненты электрон-транспортной системы тоже
находятся в мембранах. Пигментный комплекс фотохимического реакционного
центра удается отделить от пигментов антенны.
Энергия, поглощенная пигментами антенны (бактериохлорофиллом и
каротиноидами) передается реакционным центрам. Изолированные реакционные
центры состоят из белкового комплекса, содержащего Бхл а, бактериофеофитин,
каротиноиды,
убихинон
и
железосерный
белок
(FeS-белок).
Пигмент
реакционного центра обозначают Р870~по длине волны, при которой
максимально снижается поглощение под действием света. На свету Р870
окисляется в Р870+. Окислительно-восстановительный потенциал этого донора
электронов лежит между + 450 и + 490 мВ. Первичным акцептором электронов,
вероятно,
служит
ком­плекс
убихинона
с
FeS-белком.
Окислительно-
восстановительный потен­циал этого комплекса должен быть близок к -100 мВ.
Поэтому кажется маловероятным, что электроны, возбуждаемые при световой
реакции у пурпурных бактерий, способны восстанавливать NAD. Ско­рее, они
возвращаются через убихинон, цитохромы Ь и с2 и, возможно, FeS-белки назад к
Р870. Необходимые же для восстановле­ния NAD электроны, видимо, покидают
путь циклического транспорта. Они переносятся на NAD в результате обратного
транспорта, проте­кающего с затратой АТР. Это существенное отличие от в
остальном аналогичной первой фотореакции при оксигенном фотосинтезе. Для
пополнения цикла электронами пурпурные бактерии нуждаются во внешних
донорах электронов. Пурпурные серобактерии могут использовать с этой целью
сероводород, серу или тиосульфат; органические соединения (малат, сукцинат и
др.) и молекулярный водород служат донорами электронов для обеих групп
пурпурных бактерий.
Как показали многочисленные эксперименты, и у пурпурных бактерий
фотосинтетический перенос электронов приводит к созданию протонного
125
градиента. Интактные клетки реагируют на воздействие света выделением в среду
протонов, приводящим к закислению среды. В суспензии пузырьков из
фотосинтетических мембран (хроматофоров) свет вызывает перенос протонов,
направленный внутрь. Таким образом, мембраны хроматофоров и тилакоидов
имеют такую же полярность, как и субмитохондриальные пузырьки. Это будет
понятно, если учесть, что все эти мембраны образуются путем впячивания внутрь
и разрастания плазматической мембраны или же внутренней мембраны
хлоропласта. Хотя точная локализация отдельных компонентов в мембране еще
не установлена, можно думать, что переносчики водорода и электронов
расположены и в мембране анаэробных фототрофных бактерий таким образом,
что
происходит
разделение
зарядов.
В
хроматофорах
электроны
транспортируются наружу, а протоны - внутрь. Создающийся протонный
потенциал и служит движущей силой фотосинтетического фосфорилирования.
Фотореакция у зеленых бактерий. Механизмы фотореакции у зеленых
бактерий еще не полностью выяснены. Есть указания на то, что первичный
акцептор электронов, участвующий в световой реакции, у зеленых серобактерий
обладает потенциалом около - 500 мВ (у пурпурных бактерий - всего лишь - 100
мВ!). При столь большом отрицательном потенциале становится возможным
прямое использование электронов от первичного акцептора для восстановления
ферредоксина и пиридиннуклеотида. Таким образом, восстановительную силу
Chlorobiaceae, возможно, получают не путем обратного транспорта электронов,
требующего затрат энергии. Такая независимость от обратного транспорта
электронов была бы важной отличительной чертой фотосинтеза у зеленых
бактерий по сравнению с пурпурными. Тог­да фотореакция у Chlorobiaceae не
уступала бы по своей эффективности первой фотореакции цианобактерий. С
эволюционной точки зрения фотосинтез зеленых бактерий мог бы быть
связующим звеном между фотосинтезом пурпурных бактерий и фотосинтезом
цианобактерий и растений.
В процессе фотосинтеза происходит превращение энергии света в
биохимическую энергию. Первичное действие света состоит в том, что в
126
фотохимических реакционных центрах электроны донора переносятся на
акцептор в термодинамически невыгодном направлении. По крайней мере часть
электронов возвращается по электрон-транс­портной цепи к реакционным
центрам. Благодаря особому расположению компонентов электрон-транспортной
системы в мембране это сопровождается направленным Переносом протонов и
созданием протонного потенциала. Таким образом, аппарат фотосинтеза - это
прежде всего протонный насос, приводимый в действие светом. Протонный
потенциал
обеспечивает
возможность
преобразования
энергии
путем
фосфорилирования. Синтез АТР происходит с помощью тех же в своей основе
механизмов, что и в мембранах аэробных бактерий или митохондрий. Что же
касается преобразования энергии света в биохи­мически полезную энергию
(АТР), то здесь нет принципиального различия между фототрофными бактериями
и зелеными растениями. У пурпурных бактерий роль фотосинтеза, по-видимому,
исчерпывается этим преобразованием. У цианобактерий и зеленых растений
можно видеть дальнейший этап эволюции фотосинтеза. У них благодаря
последовательному включению двух фотореакций энергетический уровень
электронов в ходе первой реакции удается поднять настолько, что становится
возможным восстановление ферредоксина и NADP. Вторая фотореакция
позволяет использовать в качестве источника электронов воду. В результате такой
комбинации наряду с запасанием энергии происходит восстановление NADP и
выделение 02.
Процесс фотосинтеза представляет собой химическую реакцию, наиболее
часто совершающуюся на нашей планете. Ему мы обязаны как непрерывным
синтезом нового органического материала, так и существованием таких видов
ископаемого топлива, как уголь, нефть и природный газ. Поэтому те огромные
усилия, которые потребовались для раскрытия тайны фотосинтеза, можно считать
вполне оправданными. Однако многие проблемы еще не решены. Поэтому наряду
с экспериментально доказанными фактами в описанную выше модель
фотосинтеза был включен ряд гипотез, для проверки которых нужны дальнейшие
настойчивые исследования.
127
Оксигенный фотосинтез. Первичные процессы фотосинтеза протекают в
тилакоидах - плоских замкнутых мембранных пузырьках, содержащихся в
клетках цианобактерий и в хлоропластах водорослей и высших растений.
Тилакоидные мембраны и светособирающие пигменты (пигменты антенн).
Тилакоидная мембрана содержит в себе пигментные молекулы (хлорофилл а,
хлорофилл в и каротиноиды), переносчики электронов и ферменты. Подавляющее
большинство молекул хлорофилла (99,5%), а также дополнительные пигменты
(каротиноиды, фикобилипротеины) ответственны за поглощение света и
распределение энергии; они образуют систему антенны. Лишь незначительная
часть хлорофилла а выполняет роль фотохимического реакционного центра, в
котором протекает собственно фотохимическая окислительно-восстановительная
реакция. Пигменты антенн (светособирающие пигменты) улавливают свет и
передают энергию хлорофиллу реакционного центра. Каротиноиды выполняют
также защитную функцию: при очень ярком солнечном освещении они отдают
избыточную энергию в окружающую среду и тем самым защищают молекулы
хлорофилла от фотоокисления. Система светособирающих пигментов и
реакционный центр объединены в так называемую фотосинтетическую единицу.
Фотореакции. Фотореакции относятся к первичным процессам любого
фотосинтеза. Местом, где протекают эти фотохимические окислительновосстановительные реакции, являются реакционные центры. Реакционный центр
состоит из ряда компонентов, наиболее важные из которых - первичный донор
электронов (особый комплекс из хлорофилла и белка) и первичный акцептор
электронов.
Эти
два
компонента
представляют
собой
окислительно-
восстановительные системы. Система донора (Р/Р+) обладает положительным, а
система акцептора (Х/Х ~)- отрицательным потенциалом. Под воздействием
энергии света происходит перенос одного электрона.
Таким образом, в результате фотореакции донор теряет один электрон возникает «дырка» (электронный дефект). Такие «дырки» должны заполняться
электронами, которые могут поступать сюда по одному из двух путей-по пути
нециклического или циклического переноса электронов. При нециклическом
128
переносе электроны поступают от экзогенного внешнего донора: в случае второй
фотореакции-от молекул воды, в случае первой реакции-из электронтранспортной цепи, связывающей обе фотосистемы между собой. При
циклическом переносе электроны возвращаются от восстановленного акцептора
(X ~) к окисленному донору. Циклический перенос электронов приводит к
изменению заряда мембраны, а нециклический перенос-кроме того, и к
восстановлению NADP.
Две фотореакции в двух пигментных системах (фотосистемах). При
оксигенном фотосинтезе работают две пигментные системы, включенные
последовательно. Пигментную систему, возбуждаемую более длинноволновым
светом (к < 730 нм), называют фотосистемой I, а возбуждаемую более
коротковолновым светом (X < < 700 нм) - фотосистемой II. Фотохимически
активный реакционный центр фотосистемы I содержит Хл а.(Р700), играющий
роль первичного донора электронов в первой фотореакции. Световая энергия,
поглощаемая светособирающими пигментами фотосистемы I, передается в
реакционный центр и переводит в возбужденное состояние Хл а. Это приводит к
окислению Хла, т.е. к отдаче им одного электрона. Хл а превращается при этом в
Хл а. Другими словами, в результате отдачи электрона в реакционном центре
образуется «дырка», или «электронная вакансия». Эта «дырка» тотчас же
заполняется другим электроном, поступающим по специальному электронтранспортному пути. Акцептором отданного электрона, по-видимому, служит
железосерный белок («X»). Он обладает еще более отрицательным окислительновосстановительным потенциалом, чем - 420 мВ, возможно - 530 мВ. Этот
акцептор в свою очередь отдает электрон ферредоксину, а с восстановленного
ферредоксина восстановительная сила может передаваться на NADP или другие
акцепторы. Наряду с этим возможен и циклический перенос электрона, при
котором электрон от «X» передается через пластохинон, цитохромы и
пластоцианин обратно к хлорофиллу а реакционного центра.
Реакционный центр фотосистемы II содержит Хл а (Р680), который служит
первичным донором электронов во второй фотореакции. Получив энергию,
129
поглощенную светособирающими пигментами фотоси­стемы II, этот хлорофилл
переходит в возбужденное состояние. Возбуждение Хл а ведет к эмиссии одного
электрона, являющегося слабым восстановителем (Е'0 ~ О В). Этот электрон
принимает молекула особого пластохинона (Х320), который при этом
восстанавливается до семихинона. Донором электронов для фотосистемы II
служит вода. «Дырка», образовавшаяся в Хл а в результате потери электрона,
заполняется одним из электронов, освобождающихся при образовании 02 из воды.
Разложение воды происходит при участии марганца.
Две описанные выше пигментные системы связаны между собой электронтранспортной цепью, важным звеном которой является пластохинон. Подобно
убихинону в дыхательной цепи, пластохинон в фотосинтетической электронтранспортной цепи находится в большом избытке и выполняет функцию
накопителя (депо) электронов. Этот накопитель может вмещать не менее 10
электронов (на 1 молекулу Хл ац), поступающих от Х320. Окисление
пластохинона осуществляет фо­тосистема I, т.е. электроны «накопителя»
расходуются на заполнение «дырок» в Хл а. От пластохинона электроны
передаются цитохрому (мембраносвязанному цитохрому типа с), затем
пластоцианину (растворимый медьсодержащий белок) и, наконец, хлорофиллу а.
Таким образом, пластохинон выполняет важную функцию накопления и
дальнейшей передачи электронов, поступающих из нескольких (как минимум
десяти) электрон-транспортных цепей.
Основные пути транспорта электронов в ходе первичных процессов
фотосинтеза показаны на рис. 12.14. Это известная Z-схема - результат
исследований, в которых использовались методы импульсной спектрофотометрии, а также искусственные доноры и акцепторы электронов и
специфические ингибиторы. Она дает представление об
окислительно-
восстановительных потенциалах пигментов и переносчиков электронов и о
последовательности их окисления и восстановления, но ничего не говорит о
локализации этих компонентов в мембране.
Локализация пигментов и переносчиков электронов в мембране.
130
Некоторые сведения по этому вопросу были получены при исследовании
функций тилакоидов в присутствии антител, а также липофильных или
гидрофильных
искусственных
окислительно-восстановительных
систем.
Иммунные антитела, полученные против отдельных очищенных компонентов
фотосинтетической электрон-транспортной системы, не в состоя­нии проникать
сквозь мембрану и реагируют поэтому только с теми компонентами, которые
расположены на наружной поверхности тилакоидов. Например, антитела к
ферредоксину или к ферредоксин-NADP-редуктазе эффективно подавляют
функцию фотосистемы I; значит, эти два компонента находятся на внешней
поверхности тилакоидов. В то же время поверхность, на которой расположены
доноры электронов, недоступна для антител. Хотя данные о структурной
организации фотоси­стемы II еще весьма противоречивы, уже можно привести
гипотетическую схему (рис. 12.15). Эту схему пространственной ориентации
направленного фотосинтетического транспорта электронов внутри тилакоидной
мембраны следует отличать от схемы на рис. 12.14, где компоненты расположены
по
вертикали
в
соответствии
с
их
окислительно-восстановительными
потенциалами. Схема на рис. 12.15 наглядно показывает, что электроны,
освобождающиеся в результате расщепления воды, переносятся из внутреннего
пространства тилакоидов в строму.
131
Направленный транспорт электронов и создание протонного градиента.
Представления о локализации компонентов фотосинтетической электронтранспортной цепи согласуются с данными физиологических наблюдений и
измерений. Если суспензию тилакоидов или разрушенных хлоропластов
подвергнуть воздействию света, то рН суспензионной среды возрастает, а после
выключения света снова понижается. Свет вызывает передвижение протонов
внутрь тилакоидов. Таким образом, световая энергия может использоваться для
создания градиента протонов на тилакоидной мембране. Еще раньше было
известно, что повышение рН в суспензии тилакоидов с 4 до 8 (в темноте)
приводит к синтезу АТР. Подобного рода эксперименты легли в основу гипотезы
о хемиосмотическом механизме преобразования энергии. Более детальные
исследования показали, что перенос одного электрона через обе фотосистемы
сопровождается поступлением двух протонов во внутреннее пространство
132
тилакоида. Как сейчас полагают, две фотоси­стемы вместе со связывающей их
электрон-транспортной цепью обеспечивают направленный поток электронов от
воды (с внутренней стороны тилакоидной мембраны) к NADP (с внешней
стороны). Таким образом, фотореакции ведут к восстановлению NADP и
образованию заряда на мембране. Иными словами, световые реакции выступают в
роли протонного насоса, который работает за счет энергии света и создает
положительный заряд внутри тилакоида; в результате мембрана аккумулирует
энергию в форме протонного потенциала, и эта энергия используется для синтеза
АТР. Протонный потенциал связывает фотосинтетический транспорт электронов
с фосфорилированием таким же образом, как он связывает с фосфорилированием
транспорт электронов при дыхании.
133
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ОРГАНИЗАЦИИ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ
РАБОТЫ СТУДЕНТОВ
по дисциплине «Основы регуляции метаболизма микроорганизмов»
Специальность – 020209.65 «Микробиология»
г. Владивосток
2011
134
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ (23 часа)
1. Знакомство с периодическими изданиями по биохимии микробов.
2. Знакомство с научной и научно-популярной литературой освещающих
вопросы метаболизма микроорганизмов
3. Отбор методик изучения особенностей метаболизма разных видов
микроорганизмов.
4. Подготовка реферата.
5. Подготовка к контрольной работе.
6. Подготовка вопросов к зачету.
Самостоятельная работа студентов включает библиотечную или
домашнюю работу с учебной литературой и конспектом лекций, подготовку к
контрольной работе и зачету, а также написание реферата.
По курсу необходимо подготовить одну реферативную работу. Работы
должны содержать конкретный материал, по которому рецензент определяет
степень проработки вопросов студентом. Кроме описательной части должны
приводиться примеры и цифровые данные, характеризующие тот или иной
процесс. В случае необходимости должен быть приложен графический, в т.ч. и
картографический материал.
Работы должны быть подготовлены в печатной форме. Рабочая
программа Microsoft Word. Объем материалов, включая рисунки и таблицы –
до 20 страниц. Размер шрифта – 14 кегль. Тип шрифта – Times New Roman.
Межстрочный интервал – 1. Поля (левое, правое, верхнее, нижнее) – 2 см.
Абзац – 1,25 см. Подписи к рисункам располагаются под рисунком слева. В
таблицах допускается меньший размер кегля – 11. Названия таблиц
располагаются над таблицами, пишутся строчными буквами по центру.
Литература приводится в конце материалов по алфавиту. Работы, содержащие
более 5 грамматических ошибок на лист, не засчитываются и должны быть
переработаны.
135
Темы для рефератов
1. Экстремальные галлофилы
2. Метанобразующие бактерии
3. Экстремальные термофилы
4. Аммонификаторы
5. Бактерии, разрушающие целлюлозу
6. Метилотрофы
7. Некультивируемые формы бактерий
8. L-формы микроорганизмов и их значение в медицине
9. Пигменты фотосинтезирующих эубактерий
10.Маслянокислое, молочночнокислое брожение в промышленном
производстве
11.Карбаксидобактерии
12.Водородные бактерии
Объем и порядок выполнения самостоятельной работы учащиеся
определяют сами.
Контроль результатов самостоятельной работы осуществляется в ходе
проведения контрольной работы и зачета, а также проверки реферата.
Контрольные вопросы и задания для проведения текущего контроля и
промежуточной аттестации по итогам освоения дисциплины вытекают из
тематического содержания дисциплины «Основы регуляции метаболизма
микроорганизмов».
136
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
КОНТРОЛЬНО-ИЗМЕРИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
по дисциплине «Основы регуляции метаболизма микроорганизмов»
Специальность - 020209.65 - «Микробиология»
г. Владивосток
2012
137
ВОПРОСЫ К ЗАЧЕТУ
1. Механизмы синтеза АТФ у микроорганизмов
2. основные источники энергии у бактерий
3. Потребности бактерий в факторах роста
4. Транспорт глюкозы в клетки E.coli
5. Метаболический путь Эмдена-Мейергофа-Парнаса
6. Дыхание. Компоненты электрон-транспортной цепи.
7. Особенности ассимиляции аммиака у E.coli
8. Ассимиляционное восстановление сульфата.
9. Биосинтез аминокислот
10.Образование пентозофосфатов и NADPH2
11.Биосинтез нуклеиновых кислот
12.Биосинтез липидов
13.Образование углеводов
14.Синтез полимеров и мономеров
15.Запасающие вещества бактерий
16.Аэробный рост E.coli на субстратах, отличных от глюкозы
17.Метоболическое разнообразие аэробных гетеротрофов. Сравнительный анализ путей
субстратного фосфорилирования .
18.Механизмы питания у бактерий.
19. Катаболическая активность аэробных гетеротрофов
20.Расщепление полимеров микроорганизмами
21.Рост на аминокислотах
22.Рост на органических кислотах
23.Рост бактерий на алифатических углеводородах и ароматических соединениях и
24. Рост на С1-соединениях
25.Регуляция синтеза ферментов путем индукции и репрессии
26.Регуляция активности ферментов
27.Брожение. Типы брожения у бактерий.
28.Спиртовое брожение
138
29.Молочно-кислое брожение
30.Маслянокислое брожение
31.Пропионовокислое брожение
32.Метановое и ацетатное брожение
33.Хемолитотрофный метаболизм
34.Фототрофный метаболизм
35. Бактерии гетеротрофы и автотрофы
36.Фиксация молекулярного азота
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ (23 часа)
1.
Знакомство с периодическими изданиями по биохимии микробов.
2.
Знакомство с научной и научно-популярной литературой освещающих
вопросы метаболизма микроорганизмов
3.
Отбор методик изучения особенностей метаболизма разных видов
микроорганизмов.
4. Подготовка реферата.
5.
Подготовка вопросов к зачету.
По курсу необходимо подготовить одну реферативную работу. Работы
должны содержать конкретный материал, по которому рецензент определяет
степень проработки вопросов студентом. Кроме описательной части должны
приводиться примеры и цифровые данные, характеризующие тот или иной
процесс. В случае необходимости должен быть приложен графический, в т.ч. и
картографический материал.
Работы должны быть подготовлены в печатной форме. Рабочая программа
Microsoft Word. Объем материалов, включая рисунки и таблицы – до 20
страниц. Размер шрифта – 14 кегль. Тип шрифта – Times New Roman.
Межстрочный интервал – 1. Поля (левое, правое, верхнее, нижнее) – 2 см.
Абзац – 1,25 см. Подписи к рисункам располагаются под рисунком слева. В
таблицах допускается меньший размер кегля – 11. Названия таблиц
139
располагаются над таблицами, пишутся строчными буквами по центру.
Литература приводится в конце материалов по алфавиту. Работы, содержащие
более 5 грамматических ошибок на лист, не засчитываются и должны быть
переработаны.
Темы для рефератов
Экстремальные галлофилы
Метанобразующие бактерии
Экстремальные термофилы
Аммонификаторы
Бактерии, разрушающие целлюлозу
Метилотрофы
Некультивируемые формы бактерий
L-формы микроорганизмов и их значение в медицине
Пигменты фотосинтезирующих эубактерий
Маслянокислое, молочночнокислое брожение в промышленном производстве
Карбаксидобактерии
Водородные бактерии
Вопросы к контрольной работе:
1. Назовите основные функция мембраны в клетке.
2. Назовите основные функция рибосомы в клетке.
3. Что представляет собой геном?
4. Роль цитоплазмы в клетке.
5. Назовите источники энергии для организмов.
6. Назовите механизмы синтеза АТФ.
7. Что представляют собой окислительно-восстановительные реакции в клетке?
8. Что служит донорами электронов у аноксигенных организмов? Назовите группы бактерий
с аноксигенным фотосинтезом.
9. Назовите механизмы транспорта веществ в клетку.
10. Перечислите механизмы переноса через мембрану веществ без их химической
140
модификации.
11. Что является конечными продуктами гликолиза.
12. Роль цикла Кребса для клетки.
13. Что такое хромосома?
14. Что такое плазмиды?
15. Назовите 3 этапа синтеза белка на рибосоме.
16. Что такое секвенирование?
17. Что такое генетическая рекомбинация?
18.
Какими
способами
осуществляется
обмен
генетической
информацией
между
бактериями?
19. Что представляет собой ПЦР?
20. Что такое генетическая инженерия?
141
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
по дисциплине «Основы регуляции метаболизма микроорганизмов»
Специальность - 020209.65 - «Микробиология»
г. Владивосток
2012
142
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Основная
1. Лысак В.В. Микробиология. М.: Изд-во БГУ, 2007. 430 с.
2. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. Экология
микроорганизмов. - М.: Издательский центр "Академия", 2004. 272 с.
3. Современная микробиология. Прокариоты. Том 1. / Под ред. Й. Ленгелера, Г.
Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005. 656 с.
Дополнительная
1. Заварзин Г.А. Литотрофные микроорганизмы. М.: Наука, 1972. С.106 – 161
2. Заварзин Г.А. Водородные бактерии и карбаксидобактерии М.: Наука, 1978.
206 с.
3. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их
использования. М.: Наука, 1975. 389 с.
4. Кондратьева Е.Н. Фотосинтезирующие бактерии и бактериальный
фотосинтез. М.: Наука, 1972.
5. Кондратьева Е.Н. Хемолитотрофы и метилотрофы. М.: Изд-во МГУ, 1983.
176 с.
6. Малашенко Ю.Р., Романовская В.А., Троценко Ю.А. Метанокисляющие
микроорганизмы М.: Наука, 1978. 197 с.
Список образовательных интернет-ресурсов
основные
http://bookfi.org/book/147279 Мямин В. Е. Биохимия и физиология
6
микроорганизмов. – Мн.: БГУ, 2009. – 56 с
http://bookfi.org/book/133526 Структура бактериальных сообществ почв
1
Автор: Добровольская Т.Г.
Год издания: 2002
Место издания: ИКЦ «АКАДЕМКНИГА» Москва
143
http://bookfi.org/book/1426700
Количество страниц: 281
Ископаемые бактерии и другие микроорганизмы
в земных породах и астроматериалах. Научное
издание. М.М. Астафьева,
Л.М. Герасименко, А.Р. Гептнер и др. / Научные
редакторы Розанов А.Ю., Ушатинская Г.Т. М.:
ПИН РАН, 2011. 172 с.
дополнительные
1. Варфоломеев С. Д. Химическая энзимология. М.: Изд-во «Академия»,
2005. 480 с.
http://www.kodges.ru/medik/naukmed/71891-ximicheskayayenzimologiya.html
2. Современная микробиология. Прокариоты. Том 1. / Под ред. Й. Ленгелера, Г.
Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005. 656 с.
http://www.twirpx.com/file/866273/
144
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
ГЛОССАРИЙ
по дисциплине «Основы регуляции метаболизм микроорганизмов»
Специальность – 020209.65 «Микробиология»
г. Владивосток
2011
145
Аллостерическая регуляция - (от алло и греч. stereos — пространственный),
контроль за скоростью протекания отдельных метаболич. процессов в
организме за счёт изменения активности регуляторных (аллостерических)
ферментов.
Амфиболизм— стадия метаболизма, завершающая разрушение продуктов
катаболизма (см. Катаболизм), интермедиаты которой служат
предшественниками продуктов анаболизма (см. Анаболизм).
Анаболи́зм или пластический обмен — совокупность химических процессов,
составляющих одну из сторон обмена веществ в организме, направленных на
образование клеток и тканей.
Антипорт — перенос другого вещества в противоположном направлении.
Например, натрий-калиевый насос в эукариотических плазматических
мембранах работает по принципу антипорта, качая ионы натрия из клетки, а
ионы калия — внутрь клетки.
Газотрофы - группа бактерий, использующих в качестве источника энергии
восстановленные газы. Большинство Г. – высокоспециализированные
организмы–СН4 окисляют метанотрофы, Н2 – водородные бактерии, СО –
карбоксидобактерии, NH3 – нитрификаторы, Н2S – серобактерии. При этом
многие Г. способны окислять вещества в очень низкой концентрации, являясь,
таким образом, олиготрофами. Г. являются составной частью «бактериального
окислительного фильтра», их сообщество располагается в водоемах на границе
раздела анаэробной и аэробной зон. Образование восстановленных газов
происходит в анаэробной зоне водоемов при деградации органического
вещества. Окисляя эти газы кислородом, Г. препятствуют их выходу в
атмосферу.
146
Глико́лиз (фосфотриозный путь, или шунт Эмбдена — Мейерхофа, или путь
Эмбдена-Мейергофа-Парнаса) — ферментативный процесс последовательного
расщепления глюкозы в клетках, сопровождающийся синтезом АТФ. Гликолиз
при аэробных условиях ведёт к образованию пировиноградной кислоты
(пирувата), гликолиз в анаэробных условиях ведёт к образованию молочной
кислоты (лактата). Гликолиз является основным путём катаболизма глюкозы в
организме животных.
Катаболи́зм или энергетический обмен — процесс метаболического распада,
разложения на более простые вещества (дифференциация) или окисления
какого-либо вещества, обычно протекающий с высвобождением энергии в
виде тепла и в виде АТФ. Катаболические реакции лежат в основе
диссимиляции: утраты сложными веществами своей специфичности для
данного организма в результате распада до более простых.
Катаболитная репрессия [греч. katabole — сбрасывание, разрушение; лат.
repressio — подавление] — замедление или остановка синтеза ферментов,
участвующих в катаболизме (см. Катаболизм).
Копиотрофы - микроорганизмы, растущие на средах, богатых питательными
веществами (концентрация углерод–содержащих соединений исчисляется
граммами в литре). К К. принадлежит большинство бактерий, культивируемых
в лабораторных условиях.
Олиготро́фы — растения, а также микроорганизмы, обитающие на почвах
(или в водоёмах) с низким содержанием питательных веществ, например, в
полупустынях, сухих степях, на верховых болотах.
Симпорт — парный транспорт двух различных органических молекул или
147
ионов через мембрану клетки благодаря активному транспорту,
осуществляемому специфичными белками, расположенными внутри
мембраны. Такие белки называются котранспортерами.
Унипорт — Простой перенос растворимых веществ с одной стороны
мембраны клетки на другую.
Фосфорилирование — процесс переноса остатка фосфорной кислоты от
фосфорилирующего агента- донора к субстрату, как правило, катализируемый
ферментами и ведущий к образованию эфиров фосфорной кислоты.
Ци́кл трикарбо́новых кисло́т (цикл Кре́бса, цитра́тный цикл, цикл лимонной
кислоты) — центральная часть общего пути катаболизма, циклический
биохимический аэробный процесс, в ходе которого происходит превращение
двух- и трёхуглеродных соединений, образующихся как промежуточные
продукты в живых организмах при распаде углеводов, жиров и белков, до CO2.
При этом освобождённый водород направляется в цепь тканевого дыхания, где
в дальнейшем окисляется до воды, принимая непосредственное участие в
синтезе универсального источника энергии — АТФ.
148
149
