Клеточные технологии в
селекции растений
Лектор - Мелдебекова А.А., к.б.н., ст. преподаватель каф. Биотехнологии
Содержание
1. Виды культур растительных клеток, используемые в
клеточной селекции
2. Клеточные технологии в селекции растений:
2.1. Технологии для облегчения и ускорения селекционного
процесса (вспомогательные технологии)
- Отдаленная гибридизация (преодоление прогамной и
постгамной несовместимости)
- Гаплоидная технология
- Метод эмбриокультуры
1. Виды культур растительных клеток,
используемые в клеточной селекции
Одно из направлений клеточных технологий – это использование их в
селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный
процесс в создании новых форм и сортов растений.
• Проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые
формы растений в 2-4 раза быстрее по сравнению с традиционными
способами селекции.
Наиболее активно развиваются такие направления проведения клеточной
селекции как:
• отбор
клеток
устойчивых к гербицидам,
засолению,
экстремальным температурам, патогенам,
• клеток, характеризующихся повышенным синтезом незаменимых
аминокислот и др.
Виды клеточных культур, используемых в
селекции
Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in
vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы:
каллусные, суспензионные культуры
изолированные протопласты,
органогенные экспланты,
культуры соматических или андрогенных эмбриоидов.
Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий
применительно к различным видам растений, а также от конечных целей
исследования.
Как проводится работа по клеточной селекции
с использованием каллусной ткани
• Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал,
который наиболее часто используют для клеточной селекции.
Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной
каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на
протяжении ряда субкультивирований.
• Однако при работе с каллусными культурами имеются существенные
недостатки данного объекта:
медленный рост ткани,
неравноценное для всех клеток действие токсических веществ,
которые применяются в качестве селективного фактора, а также
потеря регенерационной способности в процессе культивирования
каллусных клеток.
Получение стабильно устойчивых каллусных линий – процесс
длительный.
Как правило, он включает следующие этапы:
1) Селекция начинается с получения достаточного количества
каллусной массы из изолированных растительных эксплантов.
2) Этот каллус в дальнейшем используется для определения
концентрации селективного фактора (построение дозовой
кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной
ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает.
(селективным фактором например, может быть хлориды, тяжелые металлы,
сульфаты в среде)
Выбранная концентрация селективного фактора признается
оптимальной и используется в дальнейших экспериментах.
3) На протяжении последующих 4-6 субкультивирований на
селективной среде проверяется стабильность устойчивости
полученных клонов. Проверка проводится, так как первично
полученные на средах с селективными факторами устойчивые
колонии
клеток
могли
возникнуть
вследствие
физиологической адаптации или определенного состояния
дифференцировки клеток и могут и не быть генетически
устойчивыми.
4) Затем культуру каллуса переносят на среду без селективного фактора и
субкультивируют еще 2-3 пассажа.
5) И только после повторного возвращения в селективные условия
отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растениярегенеранты.
Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения
нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене,
рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне
редко, на древесных.
Уже достигнуты первые положительные результаты по получению
растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCI или
Na2SО4.
Получены клетки, а из них растения моркови, которые синтезируют в 20
раз больше метионина, в 30 раз — триптофана, в 5 раз — лизина
путем добавления в питательную среду токсичных аналогов
аминокислот.
Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили.
Что касается древесных, то для них работы в этом направлении крайне
редки и часто имеют поисковый характер.
Таким образом, использование каллусной культуры в селекционных
целях открывает огромные возможности в создании новых форм
растений, несущих ценные признаки.
Однако
удобнее использовать
клеточные
сусупензии
или
изолированные протопласты.
Преимущество этих объектов состоит в быстром росте культуры и
равномерном действии селективного фактора на все клетки.
Другие Виды клеточных культур, используемых в селекции
Как оговаривалось ранее, в качестве исходного материала для селекции
могут быть использованы:
культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, органогенные
экспланты (сегменты листьев или различные меристематические и
стеблевые части растений), а также культура изолированных
зародышей.
Например, путем культивирования и селекции in vitro зародышей из
семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам
аминокислот, с улучшенным содержанием белка.
Для картофеля разработан эффективный метод обработки побегов и
черенков мутагеном, приводивший к получению химерных мутантов
хлорофиллдефектности и антибиотикоустойчивости.
При культивировании пыльников яровой пшеницы сорта Саратовская-29
и Московская-35 на питательных средах с повышенным содержанием
солей хлорида натрия получены соматические эмбриоиды, а в
дальнейшем растения-регенеранты, проявившие повышенную
солеустойчивость
Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей
растений in vitro можно разделить на две группы по их использованию с
целью создания растений с новыми полезными признаками (далее в таблице).
Первая группа методов – это технологии для
облегчения и ускорения селекционного процесса (т.е.
Вторая группа
вспомогательные технологии). Они не подменяют
– технологии,
обычную селекцию, а служат ей.
Прежде всего это касается отдаленной гибридизации. К ним предназначенн
можно отнести:
ые для
- оплодотворение in vitro,
создания
- эмбриокультуру,
генетического
- культивирование семяпочек и незрелых гибридных
разнообразия
зародышей,
- получение гаплоидов путем культивирования пыльников и исходных
микроспор,
форм для
- хранение и криосохранение изолированных клеток, тканей и
селекции.
органов,
- клональное микроразмножение отдаленных гибридов
Вспомогательные технологии.
Особое место, как в селекции, так и в генетике занимает отдаленная
гибридизация.
Скрещивание представителей культурных и дикорастущих видов,
позволяет не только улучшать существующие сорта, расширять ареал их
возделывания, но и создавать совершенно новые, высокоценные формы,
сорта и даже виды растений.
Ни один другой метод не позволяет так обогащать генофонд культурных
растений как отдаленная гибридизация.
Однако при использовании данного метода экспериментатор сталкивается
с проблемой нескрещиваемости из-за прогамной и постгамной
несовместимости.
Прогамная несовместимость – физиологическая
несовместимость партнеров при отдаленном скрещивании,
проявляющаяся на этапе до оплодотворения.
Она может быть обусловлена:
- физиологическими причинами (несоответствие во времени
созревания пыльцы отцовского растения или отсутствие
секрета рыльца пестика материнского растения), а также
- морфологическими причинами (различие партнеров по
длине столбика пестика и пыльцевой трубки; блокирование
роста трубки на разных этапах ее пути от рыльца пестика до
микропиле семяпочки вследствие тканевой несовместимости
партнеров).
Основной способ преодоления прогамной несовместимости –
оплодотворение in vitro.
Метод заключается в совместном культивировании пыльцы и
неоплодотворенных семяпочек, которое может осуществляться двумя
различными способами.
В первом случае:
- столбик пестика срезается,
- завязь помещается на
питательную среду, и
- на завязь наносят готовую
пыльцу.
Второй вариант данного метода предполагает:
- вскрывание завязи,
- перенос на питательную среду кусочков
плаценты с семяпочками,
- вблизи которых или непосредственно на их
поверности культивируется готовая пыльца.
Визуально определить прошло ли оплодотворение in vitro можно по быстрому
увеличению размеров семяпочек.
Сформировавшийся зародыш, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и
дает начало гибридному поколению.
Опыление in vitro хорошо удается для растений семейства маковых, гвоздичных,
пасленовых (табак, петуния), у которых в завязях имеются многочисленные семяпочки.
Постгамная несовместимость – несовместимость таксономически
отдаленных партнеров, которая наблюдается после оплодотворения, и
приводит к образованию щуплых невсхожих семян.
Физиологические причины постгамной несовместимости заключаются:
- в несоответствии темпов развития зародыша и эндосперма,
- либо непригодности (токсичности) метаболитов тканей материнского
растения для питания зародыша.
Способ их преодоления – культивирование незрелых гибридных зародышей на
питательной среде.
Генетические причины постгамной несовместимости выражается в аномалиях
развития органов зародыша или молодого проростка.
Для их преодоления используется:
- шунтирование нормального развития,
- получение гибридной каллусной ткани из живых тканей проростка или зародыша и
- регенерация растений из этих гибридных каллусных клеток.
Культура гаплоидных клеток
• Гаплоиды – это особи растений, в клетках соматических тканей которых
содержится половинный набор хромосом (гаметический набор
хромосом) по отношению к уровню плоидности родительской особи.
Как образуются гаплоидные растения?
Гаплоиды могут возникать естественным путем в результате нарушения
процесса оплодотворения из неоплодотворенных яйцеклеток или других
клеток зародышевого мешка, при элиминации хромосом одного из
родителей в зиготе или замещении ядра яйцеклетки ядром спермия.
Однако частота их появления в природе крайне незначительна (0,001-0,01
%) и не может удовлетворить потребности генетики и селекции.
• Экспериментальное получение гаплоидов традиционными методами
селекции (внутривидовая и межродовая гибридизация, задержка
опыления, опыление с облученной пыльцой и др.) малоэффективно и
требует значительных затрат времени.
Биотехнологический подход – культивирование in vitro генеративных
органов растений (пыльников и семяпочек) – перспективное и
приоритетное направление.
Использование таких приемов, как культивирование in vitro мужского и
женского гаметофитов намного облегчают и ускоряют получение
гаплоидов.
И так, в настоящее время используют два подхода.
1. Получение гаплоидных растений-регенерантов путем андрогенеза в
культуре in vitro пыльников или микроспор,
2. Получение гаплоидных растений-регенерантов путем гиногенеза из
неоплодотворенных яйцеклеток или других гаплоидных клеток
зародышевого мешка в культуре in vitro, а также из имеющих
гаплоидный зародыш семян, полученных при опылении материнского
растения пыльцой другого вида или специального гаплоиндуктора.
• Пыльцевые
зерна,
запрограммированные
на
гаметофитный
путь
развития,
в
условиях
іn
vitro
переключаются
на
спорофитный, что дает
уникальные
преимущества при что
изучении
процессов
деления
и
дифференцировки
клеток.
Т.е. переключается программа развития
гаплоидных клеток-микроспор пыльника с
обычного гаметофитного пути (что обычно ведёт к
образованию пыльцевого зерна – мужского
гаметофита) на иной путь – спорофитный (ведёт к
образованию гаплоидного растения-регенеранта).
При этом образование в культуре in vitro
пыльников растения-регенеранта происходит
посредством двух путей морфоге-неза, таких как
эмбриоидогенез и гемморизогенез.
В условиях культуры индукция роста и развития микроспор может протекать двумя
путями - прямым и непрямым.
- в первом случае, эмбриоиды образуются непосредственно из микроспор,
- во втором случае – через образования каллуса и затем индуцирования в нем
органогенеза.
В обоих случаях это происходит совершенно отлично того, как это осуществляется в
естественных условиях. Образование мужских гамет блокируется после 1-2 деления
генеративной клетки, в то время как вегетативная клетка делится подобно зиготе и даёт
начало эмбриоидам или каллусной ткани.
Показано, что более желателен прямой андрогенез, при котором пыльца ведет себя аналогично
зиготической клетке и проходит ряд этапов эмбриогенеза, вплоть до формирования растеньиц на
пыльнике. В случае регенерации из каллуса, не все растения будут иметь гаплоидный набор
хромосом.
Иногда ошибочно считают, что полученные растения-регенеранты всегда гаплоидны, однако это не
совсем правильно, так как на ранних стадиях культивирования может произойти спонтанная
мультипликация генома микроспор или же начало новообразованиям могут дать соматические клетки
стенки пыльника.
Получение гаплоидов лука Allium cepa L. путем индукции гиногенеза in vitro:
а – культура in vitro неоплодотворенных семяпочек;
б – появление гаплоидного эмбриоида через 60-180 дней культивирования семяпочек;
в – гаплоидный проросток
Терминология. Андрогенез = пыльцевой эмбриогенез = «андроклиния»
Показано, что более
желателен
прямой
андрогенез, при котором
пыльца
ведет
себя
аналогично
зиготической клетке и
проходит ряд этапов
эмбриогенеза, вплоть до
формирования
растеньиц на пыльнике.
В случае регенерации из
каллуса, не все растения
будут иметь гаплоидный
набор хромосом.
Непрямой андрогенез.
Культура пыльников картофеля in vitro:
a - образование каллуса из пыльников;
б - стеблевой органогенез из каллуса
Прямой андрогенез.
Пыльцевой эмбриогенез в культуре пыльников перца Capsicum annuum L.: а, б высвобождение эмбриоида из пыльника через 30 дней культуры:
сначала появляются корешки (а), затем зародыш полностью (б);
в - проросток пыльцевого происхождения с семядолями; 2 - проросток с листьями
Факторы, оказывающие влияние на эффективность андрогенеза в культуре
пыльников и микроспор
1. Роль генотипа.
• Способность к андрогенезу в культуре пыльников и микроспор
существенно различается у разных видов растений.
• У большинства двудольных растений получить гаплоиды с помощью
этого метода проще, чем у однодольных.
• В свою очередь, среди двудольных наиболее высокую
андрогенетическую способность имеют представители семейств
пасленовых и крестоцветных.
Факторы, оказывающие влияние на эффективность андрогенеза в культуре пыльников и микроспор
Фенотипический отбор донорных растений
2. Оптимальная фаза развития микроспор для индукции
андрогенеза. Как отмечалось выше, изменение программы
развития с гаметофитной на спорофитную в культуре in vitro
возможно, только когда микроспоры являются компетентными к
условиям культивирования, т.е. к перепрограммированию.
Для большинства видов растений это стадия одноядерной
микроспоры.
Однако в некоторых случаях лучшие результаты были достигнуты
при использовании микроспор, находящихся на более ранних
(вовремя, или сразу после мейоза) или поздних (двуядерная
микроспора) стадиях развития.
В каждом конкретном случае оптимальная стадия развития
микроспор определяется экспериментально с помощью
цитологических методов.
Наиболее
подвержены к
формированию
андроклинных
структур
(эмбриоидов и
морфогенных
каллусов) пыльники,
содержащие
микроспоры
(молодые клетки
пыльцы) в стадии
сильной
вакуолизации.
Морфологические и
цито-гистологические
данные по пыльнику
пшеницы, содержащему
инициальные клетки
андроклинии –
сильновакуолизирова
нные микроспоры.
Стенка пыльника,
содержащего микроспоры,
имеет следующий статус:
хорошо развитые экзотеций
и эндотеций,
дегенеровавшие средний
слой и тапетум.
При этом все микроспоры
прикреплены к стенке
пыльника
Стрессовая холодовая
предобработка пыльников
пшеницы
На примере представителей
различных семейств растений
выявлено, что именно стрессовое
воздействие на пыльники in situ
холодом перед их инокуляцией на
питательную среду in vitro
способствует индукции
андроклинии,
иначе говоря, переключению
гаметофитной программы
развития
сильновакуолизированных
микроспор на спорофитную.
Экспериментально выявлено, что
индукции андроклинии у пшеницы
способствует стрессовое воздействие
холодом in situ на пыльники в режиме (+4
±1 С, 7 суток).
Срезанные в поле колосья размещают
концами в воду и переносят в
холодильник при указанных условиях.
При необходимости меняют воду и
подрезают стебли растений, предотвращая
их загнивание.
По данным световой микроскопии, к 7 сут
воздействия такой температурой все
сильновакуолизированные микроспоры,
отрываются от стенки пыльника (рис.).
В оторвавшихся микроспорах ядро
перемещается в центр клетки, тем самым
нарушая её полярность; в цитоплазме
образуются тяжи, придающие микроспоре
звездчатую структуру.
Схема регламента
биотехнологии
получения растенийрегенерантов
пшеницы на основе
феномена
андроклинной
гаплоидии путями
эмбриоидогенеза и
гемморизогенеза in
vitro
Другие стресс факторы (кроме холодовой предобработки).
• Помимо холодовой обработки, нашли применение и другие стрессовые
воздействия, которые используют в зависимости от вида растений:
- тепловой стресс (температура 32-38 °С, продолжительность от нескольких
часов до нескольких дней),
- инкубирование пыльников или микроспор на питательной среде, содержащей
неметаболизируемые источники углеводов, например, маннитол
(углеводное голодание), с пониженным содержанием азота (азотное
голодание), на среде с добавлением колхицина.
- Реже в качестве стрессовых воздействий используют центрифугирование
эксплантатов, пониженное атмосферное давление, γ-облучение,
инкубирование пыльников на питательной среде с высокой рН, с абсцизовой
кислотой, полиэтиленгликолем, этанолом, в присутствии тяжелых металлов и
др.
- Также применяют комбинации стрессовых воздействий, например, тепловой
стресс плюс углеводное и азотное голодание.
Факторы, оказывающие влияние на эффективность андрогенеза в культуре пыльников и микроспор
3. Влияние физиологического состояния и условий
выращивания растений-доноров пыльников на
эффективность андрогенеза.
Условия выращивания растений, их физиологическое
состояние могут оказывать весьма существенное влияние на
выход гаплоидов или удвоенных гаплоидов в культуре
пыльников или микроспор.
В связи с этим нередки случаи, когда в разные годы или при
выращивании в разных условиях растений одних и тех же
генотипов получают сильно различающиеся результаты.
Считается, что более высокий выход гаплоидов получают в
культуре пыльников от выращиваемых в поле растений по
сравнению с тепличными.
Факторы, оказывающие влияние на эффективность андрогенеза в культуре пыльников и микроспор
4. Выбор питательной среды и условий культивирования пыльников или
микроспор.
Важно создать благоприятные условия для индукции их делений и образования
эмбриоидов или каллуса.
Оптимальная температура культивирования пыльников или микроспор обычно
не сильно отличается от той, при которой производят культивирование
соматических клеток того же вида растений.
Считается, что для индукции эмбриогенеза освещение культур не требуется,
однако во многих случаях пыльники или микроспоры культивируют на свету
(под лампами дневного света), что, как полагают, может стимулировать процесс
эмбриогенеза.
Сформировавшиеся эмбриоиды для получения растений-регенерантов требуют
обязательного освещения, причем необходима оптимизация интенсивности
освещения, его продолжительности, подбор источника света с оптимальными
спектральными характеристиками света.
Подсветка культур необходима также при получении растений-регенерантов из
каллуса из пыльников.
Определение плоидности растений-регенерантов.
Получение удвоенных гаплоидов, оценка их
гомозиготности
Полученные растения-регенеранты могут быть:
- гаплоидами,
- удвоенными гаплоидами (в результате спонтанного удвоения
хромосом, это оптимальный вариант) или
- иметь иную плоидность (анеуплоиды и полиплоиды).
Наиболее простой метод отделить гаплоиды от диплоидов и
полиплоидов по внешнему виду: сеянцы гаплоидов в большинстве
случаев явно уступают в мощности и скорости развития. Гаплоиды
являются стерильными и не завязывают семян при самоопылении.
• Точно определить плоидность позволяет подсчет числа хромосом в
метафазных пластинках молодых корешков растенийрегенерантов, или в мейотических материнских клетках пыльцы на
стадии метафазы - анафазы II или пыльцевого митоза.
• Ускорить процесс определения плоидности можно путем анализа
ядер клеток растений-регенерантов с помощью проточной
цитометрии (flow cytometry).
Значение гаплоидных растений
Роль гаплоидных растений в генетических исследованиях очень
велика.
Применение их позволяет легче обнаружить:
- рецессивные мутации,
- редкие рекомбинации,
- экспрессию введенного извне генетического материала.
Гаплоидия может широко применяться при количественном
генетическом анализе сельскохозяйственных растений.
Такой анализ включает:
- изучение взаимодействия генов и генетической изменчивости,
- определения групп сцепления,
- установления числа генов, действующих на количественные
признаки,
- установление локализации полигенов.
Роль гаплоидной технологии в селекции велика.
Применение ее позволяет быстрее найти нужную
комбинацию, сокращает время создания сорта.
Гаплоиды широко используются в селекционном
процессе (рис. 6.4).
Одно из важнейших направлений их применения
заключается в возможности получения из
гаплоидных клеток путем их обработки
колхицином
полностью
гомозиготных
диплоидных растений.
Такие изогенные линии на основе удвоенных
гаплоидов можно создать в течение года, тогда как
метод имбридинга требует более 4-6 лет.
Гомозиготность
широко
используется
в
селекционном процессе.
Изогенные линии облегчают селекционеру
оценку и отбор новых признаков и позволяют
ускорить процесс создания нового сорта в 2–3 раза.
Гомозиготность
широко
используется в
селекционном
процессе.
Изогенные
линии
облегчают
селекционеру
оценку и отбор
новых
признаков
и
позволяют
ускорить
процесс
создания нового
сорта в 2-3 раза.
• Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь, они
образуют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом.
• Кроме селекции гаплоиды также применяются в генно-инженерных
исследованиях.
МЕТОД ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ
Выращивание зародышей на искусственной питательной среде называется
эмбриокультурой.
В зависимости от стадии развития могут быть изолированы недостаточно
дифференцированные или вполне сформировавшиеся зародыши.
Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок
физиологически активных веществ.
Для культивирования недифференцированных зародышей требуются более
сложные питательные среды, содержащие не только витамины и
стимуляторы роста, но и дополнительные трофические факторы (набор
аминокислот, необходимые сахара, осмотики типа сорбита и маннита,
растительные экстракты неопределенного состава).
Практические аспекты использования метода эмбриокультуры
заключаются в следующем:
1. Возможно получить межвидовые и межродовые гибриды;
2. Сохранить важный для селекции материал путем
культивирования in vitro изолированных семяпочек и потерявших
всхожесть семян;
3. Сокращается длительный селекционный процесс путем
ускорения in vitro прохождения жизненного цикла растения;
4. Из гибридной каллусной ткани получают сомаклональные
варианты.
