Репликация ДНК: Матричные биосинтезы

rS
O
ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России
Кафедра химии
,d
U
M
ep
Д.б.н. Сгибнев А.В.
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
Матричные биосинтезы.
Репликация ДНК
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
1
O
rS
Молекулярная биология – это комплексная
наука, изучающая свойства и проявления жизни на молекулярном
уровне
,d
U
M
ep
fc
to
en
tm
ar
Термин молекулярная биология был введен Уильямом Астбери в 1938 году, а
использован Френсисом Криком в 1953 году для объяснения, чем он занимается.
Ему надоело в ответ на вопрос о его профессии объявлять себя смесью
кристаллографа, биохимика, биофизика и генетика
y
tr
is
m
he
Матричные биосинтезы – это синтезы с использованием матрицы, с помощью
которой осуществляется образование информационных молекул ДНК (в роли
матрицы выступают обе материнские цепи ДНК), РНК (в роли матрицы выступает
одна из цепей ДНК) и белка.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
2
Что такое «реализация генетической информации»?
rS
O
Это перенос смысла, записанного в последовательности нуклеотидов в ДНК, в последовательность
аминокислот в белке.
U
M
,d
Реализация наследственной информации осуществляется посредством транскрипции
и трансляции
ep
tm
ar
Схема
переноса наследственной информации от ДНК на белок составляет суть
fc
to
en
«ЦЕНТРАЛЬНОЙ ДОГМЫ молекулярной биологии»
y
tr
is
m
he
Информация передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в
обратном направлении!
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
3
Центральная догма молекулярной биологии
rS
O
U
M
репликация
,d
ep
fc
to
en
tm
ar
транскрипция
трансляция
tr
is
m
he
y
«Центральная догма» в ее общепринятой форме описывает матричные
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев
А.В.
процессы: репликацию, транскрипцию
и трансляцию
4
rS
O
Центральная догма молекулярной биологии
,d
U
M
Репликация
РНК
Обратная
транскрипция
fc
to
ar
ДНК
Трансляция
tm
ep
Транскрипция
белок
en
m
he
Репликация
РНК
Только РНК-вирусы
y
tr
is
Ретро-РНК-вирусы
Другие организмы тоже получили от
них этот фермент и используют в
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
некоторых случаях
5
rS
O
Матричные синтезы, разрешенные по центральной
догме
,d
U
M
ep
y
tr
is
Не обнаружен
белок
m
he
ДНК
fc
to
en
tm
ar
РНК
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
6
rS
O
«Запрещенные» матричные синтезы
,d
U
M
ep
РНК
fc
to
en
tm
ar
белок
is
m
he
ДНК
y
tr
Белки никогда не бывают матрицами
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
7
rS
O
ДНК
U
M
,d
Классическая схема
ep
РНК
tm
ar
Современная схема
y
tr
is
m
he
БЕЛОК
fc
to
en
ikipedia.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
8
rS
O
Открытия, интерпретируемые как исключения из
ЦЕНТРАЛЬНОЙ ДОГМЫ молекулярной биологии
U
M
,d
• Обратная транскрипция
• Действие рибозимов
• Редактирование РНК
• Сплайсинг
• Эпигенетические явления (Геномный импринтинг)
• РНК-интерференция
• Прионизация
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
9
УСПЕХИ ХИМИИ ДНК
O
Открытие
Открыта нуклеиновая кислота. Показано, что нуклеиновая кислота
находится в ядре и обладает кислотными свойствами.
rS
Год
1869
Авторы
Ф. Мишер
U
M
Выделены составные элементы нуклеиновой кислоты: пурины и
А. Коссель
пиримидины, фосфорная кислота, углеводный остаток. Было
обнаружено четыре азотистых основания. Нобелевская премия (1910
г.).
Обнаружен краситель (фуксин), избирательно окрашивающий
Р. Фельген
нуклеиновую кислоту.
,d
1879-1891
ep
Получены химически чистые препараты ДНК тимуса теленка. Было
показано, что ДНК — это полимер. Используя специфику поглощения
ДНК УФ-светом, была показана связь ДНК с хромосомами.
Получена первая рентгенограмма ДНК. Показано, что азотистые
основания расположены в определенном порядке – одно за другим.
Расшифрована структура нуклеотидов.
Нобелевская премия (1957 г.)
Э. Хаммерштайн,
Т. Касперсон
У. Астбери
А. Тодд
y
tr
is
m
he
fc
to
1948
en
1938
tm
1934
ar
1924
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
10
РАЗВИТИЕ МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ИЗУЧЕНИЯ ДНК
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
1933
ep
19311939
19061942
Изобретение оптических приборов и разработка методов спектроскопии.
А. Майкельсон
Нобелевская премия (1907)
Разработка метода дифракции рентгеновских лучей. Нобелевская премия.
М. фон Лауэ
Применение метода для выяснения структуры вещества. Нобелевская
У. Брегг,
премия.
Г. Вульф
Разработан метод высокоскоростного центрифугирования (более 10 000
Т. Сведберг
об/мин).
Т. Беренс
Нобелевская премия (1938 г.). Этот метод впервые использован для
разделения ядер и цитоплазмы.
Создан электронный микроскоп.
Э. Руска
Нобелевская премия (1986 г.).
Изобретена хроматография.
М.С. Цвет
Изобретена разделительная хроматография. Метод введен в биохимические А. Мартин,
исследования.
Р. Синж
Нобелевская премия (1952 г.).
Разработан метод электрофореза, который применен для разделения
А. Тизелиус
белков. Нобелевская премия (1938 г.)
,d
1922
1938
Авторы
U
M
1912
1913
Открытие
rS
1907
O
Год
Разработан метод радиоизотопного анализа биомолекул. Нобелевская
премия (1943 г.).
y
tr
1943
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
Д. Хевеши
11
Идея матричного принципа
O
rS
Кольцову принадлежит главная идея ХХ века в молекулярной
биологии – идея матричного происхождения хромосом.
U
M
,d
В 1927 г. Кольцов предположил, что наследственные «тексты»
копируются с использованием матриц.
Матричное воспроизведение «текста» - еще одно озарение
Кольцова.
ep
tm
ar
белков к конвариантной редупликации лежит в основе
наследственности.
m
he
fc
to
en
”...признаки, передаваемые по наследству, определются
линейным расположеним мономеров в полимерных
молекулах. ”
(Кольцов думал, что это последовательность аминокислот в
полипептидах). По его мнению способность молекул каких-то
Николай Константинович
Кольцов
(1872-1940 г.)
y
tr
is
В 1917 г. организовал и возглавил Институт
экспериментальной биологии.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
12
rS
O
Идея Кольцова: наследственность передается
молекулами, которых не так много, но эти молекулы –
длинные полимерные нити, отдельные участки которых
(мономеры) и определяют конкретные наследственные
признаки.
,d
U
M
ep
tm
ar
y
tr
is
m
he
fc
to
en
Схема хромосомы перед делением клетки, по Н.К. Кольцову.
Видны четыре одинаковых (2+2) полимерных молекулы – генонемы.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
13
NH2
R
(ген)
U
M
CO
NH
,d
R2
(ген)
rS
CH
O
1
CH2
Генонема (от ген и греч. nema — нить), длинная белковая
молекула-нить (или их пучок), которая, согласно модели,
предложенной в 1928 советским биологом Н. К. Кольцовым,
представляет основу хромосомы и является носителем
генетической информации. Радикалы Г рассматривались как
гены, а атомные изменения в белковой молекуле — как
причины мутаций. Эта модель после открытия роли
дезоксирибонуклеиновой кислоты устарела, но выдвинутое
Кольцовым при её построении предположение о способности
хромосомы к самокопированию было подтверждено
дальнейшими исследованиями.
CH
ep
CO
CH
tm
ar
NH
CH3
en
CO
CH2
CO
NH
CH2
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
Модель белковой хромосомы, предложенная Н.К. Кольцовым (1927 г.)
tr
is
CH
R3
(ген)
m
he
fc
to
NH
14
rS
O
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
Доказательство генетической роли ДНК
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
15
С чего все началось?
O
rS
В 1928 г. Фредерик Гриффитс открыл явление трансформации у бактерий
U
M
,d
• Объект - Streptococcus pneumoniae, патогенные
бактерии, вызывающие пневмонию.
ep
ar
• Использовал 2 штамма Streptococcus:
фактором вирулентности);
– R- штамм, невирулентный
(полисахаридная капсула отсутствует)
fc
to
en
капсулой, являющейся
tm
– S-штамм, вирулентный (клетки окружены полисахаридной
y
tr
is
m
he
• Осуществляли инфицирование мышей указанными
штаммами для того, чтобы понять различия между
капсульным и бескапсульным вариантами.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
16
Эксперимент Ф. Гриффитса
rS
O
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
17
rS
O
Ф. Гриффитс предположил, что убитые нагреванием вирулентные пневмококки
S-типа, имеют некий фактор (он устойчив к температуре), который способен
трансформировать невирулентные клетки R-типа в вирулентные, при этом
вирулентные клетки превращаются в слизистые, покрытые полисахаридной
капсулой. Ф. Гриффитс предположил, что трансформирующим фактором
является белок.
,d
U
M
ep
fc
to
en
tm
ar
y
tr
is
m
he
Ф. Гриффитс назвал превращение невирулентных клеток пневмококков в
вирулентные - трансформацией.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
18
rS
O
Через 16 лет
,d
U
M
В 1944 г. Освальд Эйвери, Колин МакЛеод и Маклин МакКарти поставили перед
собой цель - установить природу «трансформирующего» фактора, отрытого в 1928 г.
Ф. Гриффитсом.
ep
М. МакКарти
y
tr
К. МакЛеод
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
О. Эйвери
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
19
Суть эксперимента Освальд Эйвери, Колин МакЛеод и Маклин МакКарти
rS
O
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
Вместо убитых нагреванием целых клеток Streptococcus
pneumoniae ученые предварительно разрушили их и взяли
экстракт этих клеток.
Полученный экстракт поочередно подвергли действию
гидролитических ферментов, которые специфически
разрушают определенные классы макромолекул –
полисахариды, белки, липиды, РНК и ДНК. И затем
определяли, при деградации каких макромолекул исчезает
трансформирующая активность клеточного экстракта.
Эйвери с сотр. поочередно обрабатывали клеточный
экстракт трипсином,
химотрипсином,
рибонуклеазой,
липазой,
гидролитическими
ферментами
для
разрушения
полисахаридов,
но эти обработки никак не влияли на трансформирующую
активность экстракта.
Лишь обработка ДНК-азой приводила к исчезновению
трансформирующего начала!
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
20
rS
O
Таким образом было установлено, что действующим началом
бактериальной трансформации является дезоксирибонуклеиновая
кислота (ДНК)
U
M
,d
• Химический анализ показал, что соотношение углерода, водорода, азота и фосфора в
трансформирующем веществе соответствуют соотношению этих же элементов в молекуле ДНК.
ep
tm
ar
• По молекулярной массе молекулы трансформирующего вещества были больше, чем белков.
fc
to
en
• Максимум поглощения при спектрофотометрическом анализе соответствовал 260 нм, что
соответствовало нуклеиновой кислоте ( у белков – 280 нм).
• ДНК, выделенная из клеточного экстракта, обладала трансформирующей активностью.
y
tr
is
m
he
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
21
Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз, 1952 г.
rS
O
,d
U
M
Объекты:
бактериофаг Т2 и бактерия Е.coli
ep
y
tr
is
Марта Чейз (1927–2003) и
Альфред Херши (1908–1997)
m
he
fc
to
en
tm
ar
Херши и Чейз для разработки своего
эксперимента осуществляли радиоактивное
мечение белка и ДНК бактериофага Т2
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
22
Предпосылки эксперимента:
rS
O
А. Херши и М. Чейз решили проверить, насколько верна картина
нарисованная прежними исследователями в 1944 г.
На поверхности клетки в электронный микроскоп бактериофаги были
видны. Но разглядеть их внутри клеток в те годы никому не удавалось.
Тем более нельзя было увидеть процесс проникновения фага в клетку.
,d
U
M
ep
ar
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
Стоило только подставить клетку с налипшими фагами под
пучок электронов, как электроны убивали все живое, и то,
что отражалось на экране микроскопа, было лишь
постлетальной маской бактериофагов.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
23
H
CH2
CH2
SH
OH
C
HO
OH
Цистеин
P
NH2
O
O
OH H
ep
CH3
OH
Метионин
C
O
,d
S
H2N
U
M
CH2
C
rS
C
O
H2N
H
O
ar
Нуклеотиды содержат
фосфатную группу. Поэтому
ДНК может быть помечена
радиоактивным фосфором
32P.
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
Некоторые аминокислоты
содержат серу. Поэтому
белки могут быть
помечены
радиоактивной 35S.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
24
rS
O
Радиоактивное мечение
белковых оболочек
бактериофага Т2 и его ДНК,
позволило проследить их
судьбу при инфицировании
бактериальных клеток.
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
Радиоактивно меченая ДНК из
родительских фагов попадает в
клетки бактерий и
обеспечивает размножение
фагового потомства.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
25
rS
O
После инфекции бактерии фагами,
с помощью центрифугирования
удалось выделить две фракции:
пустые белковые оболочки фага и
бактерии, инфицированных
фаговой ДНК. Оказалось, что 80%
метки 35S осталась в пустых
фаговых оболочках, а 70% метки
32P - в инфицированных
бактериях.
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
Результаты этого эксперимента
прямо показали, что при
инфицировании бактерий
бактериофагами, их ДНК
проникает внутрь клеток и затем
участвует в размножении новых
фагов частиц.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
26
rS
O
Таким образом, эксперимент А. Херши и М. Чейз показал, что
только ДНК бактериофага Т2 при инфицировании бактерий
попадает внутрь клеток, и именно, она контролирует
размножение фагов внутри клеток (т.е. репликацию фаговых
геномов, синтез фаговых оболочек, а также лизис
бактериальных клеток и высвобождение фаговых частиц
наружу).
Результаты эксперимента А. Херши и М. Чейз были сразу же
приняты в качестве решающего доказательства генетической
роли ДНК.
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
27
rS
O
U
M
Основной фигурой матричных биосинтезов являются
,d
нуклеиновые кислоты.
ep
ar
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
Они представляют собой высокомолекулярные
биополимеры, состоящие из нуклеотидов, соединенных
между собой фосфодиэфирными связями.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
28
O
Нуклеиновые кислоты
rS
• Высокомолекулярные соединения, состоящие из нуклеотидов.
• Типы:
• ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота)
• РНК (рибонуклеиновая кислота): мРНК, рРНК, тРНК.
,d
U
M
ep
fc
to
en
tm
ar
y
tr
is
m
he
Функции нуклеиновых кислот - хранение и
передача генетической информации
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
29
Нуклеотиды – мономеры нуклеиновых кислот
O
rS
3 компонента:
• Азотистое основание
• Пентоза
• Фосфорная кислота
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
30
O
Нуклеозиды
rS
• Азотистое основание + пентоза
,d
U
M
ep
N-гликозидная
связь
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
31
rS
O
Нуклеотиды
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
32
rS
O
Номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов
Нуклеозид
Нуклеотид
Аденин
,d
U
M
Азотистое основание
Гуанин
Гуанозин
Аденозин-моно-, ди- или
трифосфат
Гуанозин-моно-, ди- или
трифосфат
Цитозин
Цитидин
Урацил
Уридин
Тимин
Тимидин
ep
Аденозин
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
Цитидин-моно-, ди- или
трифосфат
Уридин-моно-, ди- или
трифосфат
Тимидин-моно-, ди- или
трифосфат
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
33
rS
O
Функции нуклеотидов
U
M
,d
• Предшественники и мономеры нуклеиновых кислот
• Макроэргические соединения
• Кофакторы
• Активаторы определенных веществ (УДФ-глюкоза, ЦДФ-холин)
• Вторичные посредники (циклические нуклеотиды – цАМФ,
цГМФ)
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
34
rS
O
Репликация ДНК
U
M
,d
Универсальный биологический процесс передачи
генетической информации в поколениях клеток и
организмов, благодаря созданию точных копий ДНК.
ep
en
tm
ar
y
tr
is
m
he
fc
to
ДНК – единственная молекула клетки, способная к
самоудвоению.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
35
Репликация ДНК
rS
O
В организме постоянно происходит деление клеток. Каждая
соматическая клетка получает диплоидный набор хромосом.
Делению клетки предшествует удвоение ДНК.
Синтез ДНК происходит не беспорядочно, а в строго
определенный период жизни клетки. Всего выделяют 4 фазы
клеточного цикла: митоз (М), синтетическую (S), пресинтетическую
(G1, от англ. gap – интервал), постсинтетическую (G2).
Важное участие в регуляции смены фаз клеточного цикла
занимают белки циклины. По функции циклины – это
активаторные субъединицы ферментов циклин-зависимых киназ.
Синтез (репликация, удвоение) ДНК происходит в S-фазу
клеточного цикла, когда клетка готовится к делению. Мэтью
Мезельсон и Франклин Сталь в 1957г установили, что репликация
осуществляется полуконсервативным способом, т.е. на каждой
нити материнской ДНК синтезируется дочерняя копия.
Образовавшиеся молекулы ДНК будут иметь в своем составе одну
дочернюю и одну материнскую цепь.
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
36
Место репликации в клеточном цикле
rS
O
,d
U
M
• Репликация ДНК всегда предшествует делению
клетки.
ep
Деление
is
m
he
S-период
(Synthesis)
fc
to
Репликация
en
tm
ar
Интерфаза
y
tr
Каждая дочерняя клетка получает точную копию всей ДНК
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
37
РЕПЛИКАЦИЯ
rS
,d
U
M
▪ Инициация
▪ Элонгация
▪ Терминация
O
Фазы репликации:
ep
ar
tm
Репликация требует наличия нескольких компонентов:
y
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
tr
is
m
he
fc
to
en
▪ Матрица – в ее роли выступает материнская нить ДНК
▪ Субстраты для синтеза – дАТФ, дГТФ, дЦТФ, ТТФ,
▪ Источник энергии – дАТФ, дГТФ, дЦТФ, ТТФ
▪ Ферменты
▪ Факторы роста
▪ SSВ-белки
38
rS
O
Скорость репликации ДНК
U
M
,d
• У прокариот – 1000 нуклеотидов /сек
ep
tm
ar
• У эукариот – 100 нуклеотидов /сек
y
tr
is
m
he
fc
to
en
(медленнее, потому что ДНК сложно упакована –
нуклеосомы и другие уровни упаковки)
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
39
rS
O
Принципы репликации
U
M
1. Полуконсервативность
,d
2. Комплементарность
ep
4. Униполярность
y
tr
is
m
he
fc
to
5. Прерывистость
en
tm
ar
3. Антипараллельность
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
40
rS
O
Полуконсервативность – каждая исходная (материнская) цепь ДНК
выступает в качестве матрицы для синтеза дочерней цепи
U
M
Старые цепочки ДНК
,d
ep
Вновь синтезированные
tr
Дисперсионный
y
Консервативный
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
Полуконсервативный
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
41
Полуконсервативность – эксперимент Мезельсона и Шталя
rS
O
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
42
Комплементарность
rS
O
Вновь синтезируемая ( дочерняя) цепь ДНК строится по принципу
комплементарности. В состав растущей цепи включается тот
нуклеотид , который комплементарен нуклеотиду родительской
цепи (аденин с тимином, гуанин с цитозином).
,d
U
M
ep
Антипараллельность
fc
to
en
Униполярность:
tm
ar
– синтез дочерней цепи ДНК
происходит в противоположном от материнской цепи направлении
Удвоение цепи ДНК идет в направлении от 5` конца к 3` концу, следовательно
новый нуклеотид присоединяется к 3 ` концу растущей цепи.
3'
y
tr
is
m
he
5'
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
43
O
Прерывистость репликации
rS
Репликация может идти одновременно в нескольких местах
молекулы ДНК.
ori
ori
,d
U
M
ep
ДНК одной
хромосомы
en
tm
ar
Репликон
m
he
fc
to
Репликон – расстояние между двумя сайтами начала репликации
ori ~ 100 тыс. н.п.
y
tr
is
У прокариот вся кольцевая молекула – один репликон
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
44
Прерывистость репликации
rS
O
ori
,d
U
M
ep
ДНК одной
хромосомы
ori
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
Репликативные вилки
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
45
Основные ферменты репликации
rS
O
ДНК ГЕЛИКАЗА – Фермент разделяющий цепи двухцепочечной ДНК на
одинарные
ДНК ТОПОИЗОМЕРАЗА / ГИРАЗА– фермент, изменяющий степень
сверхспиральности, возникающее при раскручивании двух цепей в
репликативной вилке
ПРАЙМАЗА – фермент, обладающий РНК – полимеразной активностью; служит
для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза ДНК
ДНК ПОЛИМЕРАЗА – синтезирует новую цепь ДНК по принципу
комплементарности
ДНК ЛИГАЗА – фермент, образующий фосфодиэфирную связь между двумя
полинуклеотидами
SSB (single-strand binding protein)-белки –связывающиеся с одноцепочечными
нитями ДНК и предотвращают комплементарное спаривание
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
46
rS
O
Антипараллельные цепи
,d
U
M
• Нуклеотиды в основной цепи ДНК
связаны от фосфата к сахару
между 3–5 атомами углерода.
• В молекуле ДНК одна из в
противоположном направлении
ep
3
y
tr
is
m
he
fc
to
• ЭТО ПРОБЛЕМА ДЛЯ
РЕПЛИКАЦИИ
en
tm
ar
5
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
3
5
47
Типы химической связи в ДНК
O
rS
Водородная связь
3
,d
U
M
5
ep
3
fc
to
en
tm
ar
Ковалентная
фосфодиэфирная
связь
5
m
he
y
tr
is
… сильные или слабые связи?
Как эти связи соответствуют механизму копирования ДНК?
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
48
rS
O
ИНИЦИАЦИЯ
,d
U
M
Запускается факторами роста.
1) В определенных участках, получивших название точка ori (англ. origin – начало, на
молекуле ДНК около 100 таких точек), на ДНК действует фермент ДНК-топоизомераза 1. Она
разрывает фосфодиэфирную связь в молекуле ДНК и крепится к 5‘-концу в месте разрыва.
2) Фермент ДНК-геликаза разрывет водородные связи между цепочками ДНК. Процесс
распространяется от этих участков в обе стороны по нитям ДНК с образованием
репликативных "пузырей". В каждом таком "пузыре" имеются две репликативные "вилки",
в которых происходит раскручивание и непосредственный синтез ДНК. При этом
репликативные вилки удаляются друг от друга
3) Обратному соединению и закручиванию ДНК препятствуют SSВ-белки, крепящиеся к
каждой из цепей ДНК. Азотистых оснований они не перекрывают.
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
49
rS
O
Инициация синтеза ДНК
,d
U
M
ep
en
tm
ar
y
tr
is
m
he
fc
to
• Origin (Ori) - точка начала репликации – это участок молекулы ДНК (300 п.н.),со
специфической последовательностью нуклеотидов, который узнают
специальные белки репликации:
• dnaA – у прокариот
• RPA - у эукариот
Репликация: 1-й этап - инициация
rS
O
• Раскручивание ДНК
геликаза разделяет спираль двухцепочечной ДНК на одинарные цепи
• ДНК стабилизируется белками, связывающими одноцепочечные ДНК
ДНК-гираза/топоизомераза
• Фермент, предотвращающий запутывание перед репликационной
вилкой
,d
U
M
ep
tm
ar
гираза
Репликативная вилка
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
single-stranded binding proteins
tr
is
m
he
fc
to
en
геликаза
51
ЭЛОНГАЦИЯ
O
rS
Включает в себя процесс образования новых цепей. Синтез идет в направлении 5‘3‘. Осуществляется под действием ДНК-полимераз.
1) ДНК-полимераза α присоединяется к участку на раскрученной цепи ДНК в
репликативной вилке и синтезирует небольшой фрагмент РНК (праймер) из 8 – 10
нуклеотидов и участок ДНК из 50 нуклеотидов
2) Затем ДНК-полимераза δ продолжает наращивать цепь ДНК
3) ДНК-полимераза ε достраивает праймеры РНК до их встречи друг с другом
(работает только на отстающей цепи)
4) ДНК-полимераза β удаляет постепенно РНК праймеры и заполняет
образовавшуюся брешь комплементарными дезоксирибонуклеотидами
5) ДНК-лигаза «сшивает» фрагменты цепи с формированием фосфодиэфирных
связей
Все репликация ДНК занимает примерно 9 часов
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
52
Репликация: 2-й этап - элонгация
rS
O
• РНК-праймаза/ДНК-полимераза α
• Добавляет небольшой участок РНК (праймер РНК) к 3 ’концу матричной ДНК
• Зачем это нужно делать? ДНК-полимераза III/ДНК-полимераза δ (фермент,
создающий новую цепь ДНК) может добавлять нуклеотиды только к существующим
цепям ДНК.
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
53
Репликация: 2-й этап - элонгация
rS
O
,d
U
M
▪ Построение дочерней цепи ДНК
▪ Добавляются новые
ep
комплиментарные основания с
помощью фермента ДНК-полимеразы
III / ДНК-полимеразы δ
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
DNA
Polymerase III
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
54
Реакция полимеризации нуклеотидов
rS
O
,d
U
M
ep
y
tr
is
• (дНМФ)n + дНТФ = (дНМФ)n+1 + ФФ
• ФФ
→
2Ф
m
he
fc
to
en
tm
ar
• Суммарное уравнение реакции синтеза
полинуклеотида:
Необходимым условием
биосинтеза ДНК и РНК является
использование полимеразами
нуклеозидтрифосфатов в качестве
низкомолекулярного субстрата и
образование молекулы
пирофосфата с последующим его
гидролизом пирофосфатазой. В
случае сохранения пирофосфата в
среде реакция бы шла в
направлении пирофосфоролиза,
т.е. отщепления от ДНК (РНК)
нуклеотидных звеньев с
образованием
нуклеозидтрифосфатов. В этом
случае синтез молекул
нуклеиновых кислот был бы
невозможен.
rS
O
Свойства ДНК-полимеразы
U
M
,d
1. Присоединяет по одному
нуклеотиду с 3‘ конца растущей
цепочки.
3'
ep
tm
ar
fc
to
en
2. Требует для начала работы
спаренного 3‘ конца.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
tr
is
m
he
3. Отщепляет один нуклеотид назад,
если он не спарен – т.е.
исправляет свои ошибки.
Логически
связанные
свойства !
56
rS
O
ДНК-полимераза исправляет
ошибки
,d
U
M
ep
m
he
fc
to
en
tm
ar
y
tr
is
Если новый нуклеотид не спарен – фермент не может
двигаться дальше.
Тогда он убирает неверный
нуклеотид
и ставит
другой.
ОрГМУ, кафедра
химии, Сгибнев
А.В.
57
rS
O
Точность репликации
U
M
Частота ошибок при репликации составляет 10-6 -10-7.
,d
ep
tm
ar
Точность репликации обеспечивается 2-мя факторами:
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
tr
is
m
he
fc
to
en
▪ Соблюдение принципа комплементарности.
▪ Экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы.
58
rS
O
Отличия репликации в клетках прокариот и эукариот
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
rS
O
Репликация: 3-й этап терминация
,d
U
M
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
• Замена праймера РНК на ДНК с помощью ДНКполимеразы I/ДНК-полимеразы β
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
60
Ведущие и отстающие нити
Okazaki
O
rS
Ограничение: ДНК-полимераза III/
ДНК-полимераза δ может
наращивать цепь только на 3 конце
существующей цепи ДНК.
,d
U
M
ep
5
tm
ar
5
3
ligase
Leading strand
3
m
he
✓
5
3
DNA polymerase III
is
Лидирующая нить
y
tr
Отстающая нить
Фрагменты Окадзаки,
соединенные ферментом
"точечной сварки" лигазой

3
Lagging strand
fc
to
growing
3
replication fork
en
5
3
5
5
5
3
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
◆
Продолжается синтез
61
Репликация ДНК на отстающей нити
O
rS
Добавлен праймер РНК:
• создан праймазой
• служит стартовой последовательностью для ДНК-полимеразы III
НО синтезируются короткие сегменты, называемые фрагментами
Окадзаки
,d
U
M
ep
tm
ar
5
en
3
growing
3
replication fork
DNA polymerase III
primase
is
m
he
5
5
5
3
5
fc
to
3
3
y
tr
RNA 5
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
3
62
O
Замена праймеров РНК на ДНК
rS
ДНК-полимераза I/ДНК-полимераза β
удаляет участки праймера РНК и
заменяет нуклеотиды на ДН
DNA polymerase I
,d
U
M
ep
5
3
ligase
fc
to
growing
3
replication fork
en
5
5
tm
ar
3
m
he
3
y
tr
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
5
is
Нити склеены вместе с помощью
ДНК-лигазы
RNA
63
rS
O
Вилка репликации
5’
5’
SSB
3’
fc
to
en
helicase
DNA
polymerase III
m
he
leading strand
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
direction of replication
tr
is
5’
3’
3’
primase
tm
Okazaki
fragments
ar
ligase
ep
5’
3’
lagging strand
,d
DNA
polymerase I
U
M
DNA
polymerase III
SSB = single-stranded binding proteins
64
rS
O
Выводы по репликации ДНК
U
M
▪ В результате репликации каждая дочерняя
,d
клетка получает точную копию всей ДНК
содержавшейся в материнской клетке.
ep
tm
ar
en
▪ ДНК всех клеток одного организма –
fc
to
одинаковая, как по количеству молекул,
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
tr
is
m
he
т.е. хромосом, так и по их нуклеотидному
составу.
65
Медицинское значение
rS
O
Иногда в растующую цепь случайно вклинивается неправильное основание, однако у
здоровых клеток присутствует пострепликационные репаративные ферменты,
которые исправляют подобные ошибки.
,d
U
M
ep
Патология пострепликационных механизмов репарации иногда обусловливает
предрасположенность пациентов к некоторым онкологическим заболеваниям.
tm
ar
К ним относятся:
мутациями генов BRCA1 и BRCA2;
fc
to
en
➢ Синдром множественной ломкости хромосом (синдром Блума);
➢ Наследственная предрасположенность к раку молочной железы, вызванную
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
tr
is
рак толстой кишки)
m
he
➢ Аутосомно-доминантная форма рака кишечника (наследственный неполипозный
66
rS
O
Проблема укорочения концов у
линейных ДНК
U
M
,d
▪ Сформулирована – А.М. Оловников, 1971
ep
▪ При каждой репликации новые цепи должны укорачиваться с
en
tm
ar
5‘ концов
fc
to
▪ Почему? – Там убирается РНК-праймер, а достроить брешь
ДНК-полимераза не может – нет спаренного конца.
m
he
▪ При каждом делении хромосома теряет 50 н.п. на концах –
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
tr
is
теломерах.
67
Гипотеза Оловникова
rS
O
▪ Укорочение концов – это внутренние часы, отмеряющие время жизни многоклеточного
U
M
организма – число отпущенных ему делений, начиная с зиготы.
,d
▪ Как только теломеры «закончатся» – клетка больше не делится и погибает.
Но почему тогда клетки зародышевой линии делятся
бесконечно?
ep
tm
ar
fc
to
хромосом.
en
▪ Оловников: должен существовать механизм удлинения концов
▪ Теломераза – фермент, надстраивающий концы хромосом, содержит
m
he
РНК длиной 150 нуклеотидов и осуществляет обратную транскрипцию
y
гомологичные по структуре
и топологии.
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
tr
is
▪ Теломераза и обратная транскриптаза – родственные белки,
68
Синтез теломерных участков ДНК
rS
O
Теломераза
,d
U
M
•
фермент, надстраивающий
концы хромосом, содержит
РНК.
•
удлинение происходит путем
обратной транскрипции:
ep
ar
РНК → ДНК
tm
▪На концах хромосом находятся
10-15 тысяч н.п. у человека
y
tr
is
m
he
fc
to
en
длинные некодирующие повторы
5’ – ГГТ ТАГ – 3’
rS
O
▪ Теломераза активна в клетках
U
M
▪ зародышевого пути
,d
▪ эмбриональных
▪ стволовых
▪ раковых – поэтому они бессмертны
ep
en
tm
ar
fc
to
▪ Теломераза неактивна
m
he
▪ в соматических клетках – ген для нее
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
tr
is
там, конечно же, есть, но выключен
70
rS
O
Значение для медицины
,d
U
M
После каждого клеточного цикла теломеры
укорачиваются на один повтор, а следовательно,
количество делений клетки ограничено числом
повторов в теломерной цепи. Согласно этому
бесконечный рост и деление опухолевых клеток
происходят из-за присутствия активных мутантных
теломераз, которые препятствуют разрушению
теломер.
ep
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
71
rS
O
,d
U
M
ep
ОрГМУ, кафедра химии, Сгибнев А.В.
y
tr
is
m
he
fc
to
en
tm
ar
Спасибо за внимание!
73