МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ
«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Специальность — 020209.65 «Микробиология»
Форма подготовки очная
Школа естественных наук
Кафедра <биохимии, микробиологии и биотехнологии>
курс 5_______ семестр 9_______
лекции _51__ (час.)
практические занятия__час.
семинарские занятия____час.
лабораторные работы _51__час.
всего часов аудиторной нагрузки__102___ (час.)
самостоятельная работа __48____ (час.)
зачет __9_____ семестр
экзамен__________семестр
Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями
государственного образовательного стандарта высшего профессионального образования
(№ Гос.Рег. 86 ЕН / СП от 10 марта 2000 г.).
Учебно-методический комплекс дисциплины обсужден на заседании кафедры_ биохимии,
микробиологии и биотехнологии « 6 » июня 2012 г., протокол № 15
Составитель: Ю.Н.Шкрыль
1
Оглавление
АННОТАЦИЯ.......................................................................................................... 3
РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ .................................... 5
КОНСПЕКТЫ ЛЕКЦИЙ ...................................................................................... 25
МАТЕРИАЛЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ЗАНЯТИЙ ................................................ 241
МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ОРГАНИЗАЦИИ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
СТУДЕНТОВ ....................................................................................................... 255
КОНТРОЛЬНО-ИЗМЕРИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ..................................... 258
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................... 282
ГЛОССАРИЙ ....................................................................................................... 287
2
Аннотация учебно-методического комплекса дисциплины
«Молекулярная биотехнология»
Учебно-методический
комплекс
дисциплины
«Молекулярная
биотехнология» разработан для студентов _5__ курса, обучающихся по
специальности 020209.65 «Микробиология» в соответствии с требованиями
ГОС по данной специальности (утверждено приказом и.о. ректора ДВФУ от
17.04.2012 № 12-13-87).
Дисциплина
«Молекулярная
биотехнология»
входит
в
число
общепрофессиональных дисциплин специальности (ДС) для студентов,
выбравших специальность «Микробиология».
Общая трудоемкость освоения дисциплины составляет 150 часов.
Учебным
планом
предусмотрены
лекционные
занятия
(51
часов),
лабораторные работы (51 час) самостоятельная работа студента (48 часов).
Дисциплина реализуется на 5 курсе в 9 семестре.
Содержание дисциплины охватывает следующий круг вопросов:
История биотехнологии, этапы ее развития как науки. Теоретические основы
структуры и функции генов про- и эукариот. Реализация генетической
информации в клетке и механизмы ее регуляции. Инструменты и методы
генетической инженерии. Способы переноса ДНК в клетки. Структура и
слагаемые биотехнологического процесса. Устройство и классификации
ферментеров.
Основные
требования
к
ферментационному
процессу.
Микробиологическое производство лекарственных средств. Получение и
свойства одноклеточного белка. Теория и практика культивирования клеток
растений и животных in vitro. Методы получения трансгенных растений и
животных и использование их в практике. Принципы инженерной
энзимологии, иммобилизация ферментов и клеток
3
.
Создание
рекомбинантых
и
съедобных
вакцин.
Промышленное
производство
рекомбинантных белков и полипептидов.
Дисциплина
«Молекулярная
биотехнология»
логически
и
содержательно связана с такими курсами, как микробиология, генетика,
биохимия и молекулярная биология.
Дисциплина
компетенций
направлена
выпускника:
на
формирование
овладение
профессиональных
теоретическими
знаниями,
современными методами исследований в области генной инженерии и
молекулярной биотехнологии, методами биоинформатики для анализа
последовательностей ДНК отдельных генов и геномов организмов и
использование теоретических знаний на практике.
Учебно-методический комплекс включает в себя:
1. рабочую учебную программу дисциплины;
2. конспекты лекций (в виде развернутых планов лекций);
3. материалы для лабораторных занятий;
4. материалы для орнанизации самостоятельной работы студентов;
5. контрольно-измерительные материалы;
6. список литературы (в том числе интернет-ресурсов);
7. глоссарий.
Достоинством данного УМКД является то, что программа лекционного
курса
охватывает
практически
полный
спектр
задач
и
проблем
биотехнологии, что позволяет сформировать у студентов комплексное
понимании роли и места этой науки в системе знаний и технологий.
Автор-составитель учебно-методического комплекса
к.б.н., доцент кафедры биохимии, микробиологии и
биотехнологии ШЕН ДВФУ, доцент
Шкрыль Ю.Н.
4
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
Рабочая программа учебной дисциплины
«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Специальность — 020209.65 «Микробиология»
Форма подготовки очная
Школа естественных наук
Кафедра <биохимии, микробиологии и биотехнологии>
курс 5_______ семестр 9_______
лекции _51__ (час.)
практические занятия__час.
семинарские занятия____час.
лабораторные работы _51__час.
всего часов аудиторной нагрузки__102___ (час.)
самостоятельная работа __48____ (час.)
зачет ___9______ семестр
экзамен__________семестр
Рабочая программа составлена в соответствии с требованиями государственного образовательного
стандарта высшего профессионального образования (№ Гос.Рег. 86 ЕН / СПот 10 марта 2000 г.).
Рабочая программа обсуждена на заседании кафедры_ биохимии, микробиологии и биотехнологии « 6 » июня
2012 г., протокол № 15
Составитель: Ю.Н.Шкрыль
5
Оборотная сторона титульного листа РПУД
1.
Рабочая программа пересмотрена на заседании кафедры:
Протокол от «______» ________________20____г. №_____________
Заведующий кафедрой ___________________________
(подпись)
____________________
(И.О. Фамилия)
2.
Рабочая программа пересмотрена на заседании кафедры:
Протокол от «________» _________________20_____г. №______________
Заведующий кафедрой ___________________________
(подпись)
6
____________________
(И.О. Фамилия)
ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА
Целями изучения дисциплины является формирование системных
знаний в области современной молекулярной биотехнологии; обучение
основным
методам
генно-инженерной
модификации
первичного
и
вторичного метаболизма клеток; освоение теоретических основ и актуальных
проблем
биотехнологического
производства;
знакомство
с
наиболее
значительными достижениями молекулярной биотехнологии.
Задачами
биотехнологии
как
профильной
учебной
дисциплины
являются:
- обучение студентов деятельности биотехнолога, исходя из знания
основ молекулярной биологии и генетики продуцентов, совершенствования
производства методами генетической инженерии и инженерной энзимологии,
знания фундаментальных основ методов контроля качества и подлинности
препаратов, получаемых биотехнологическими методами;
- формирование у студентов практических умений и навыков
изготовления биотехнологических препаратов, оценки качества сырья,
питательных сред, полупродуктов и целевых продуктов;
- выработка у студентов способности правильно оценивать соответствие
биотехнологического
производства
правилам
GMP,
соответствие
требованиям экологической безопасности, применительно к используемым
на производстве биообъектам - продуцентам и целевым продуктам.
Выработка правильной ориентации при оценке качества рекомбинантных
белков как лекарственных препаратов.
Студент должен знать:
- базовые представления о хранении и реализации генетической
информации у про- и эукариот,
- задачи и методологию генетической инженерии, принципы создания
рекомбинантных молекул ДНК,
7
- особенности и отличия биотехнологического от других видов
производств,
- основные достижения биотехнологии в области получения новых
лекарственных препаратов,
- структуру и аппаратную базу биотехнологического производства,
- основные риски и требования, предъявляемые к биотехнологическому
производству.
Студент должен иметь представление:
- об основных направлениях развития биотехнологии;
-
о
технико-экономических
особенностях
биотехнологических
процессов;
- о ресурсах природных биоценозов как источника биологически
активных веществ;
- об особенностях устройства молекулярно-биологической лаборатории.
Студент должен уметь:
-
определять
доброкачественность
микроорагнизмов-продуцентов
методом микроскопии, определения концентрации жизнеспособных клеток и
их ферментативной активности. Обеспечить требуемые условия хранения
промышленных штаммов;
- учитывать влияние биотехнологических факторов на эффективность
технологического процесса и качестве конечного продукта;
- поддерживать оптимальные условия для биосинтеза целевого продукта
и решать ситуационные задачи при отклонениях от этих условий;
- обеспечивать условия асептического проведения технологического
процесса;
- оценивать применяемые на производстве и в лаборатории методы
работы с рекомбинантными штаммами;
- проводить выделение и очистку конечных продуктов ферментации из
биомассы и культуральной жидкости;
8
- осуществлять постадийный контроль и стандартизацию получаемых
препаратов
(определение
антимикробной
активности
антибиотиков,
активности ферментных препаратов, жизнеспособности микроорганизмов);
- проводить исследования по совершенствованию биотехнологического
процесса.
Студент должен иметь навыки:
- определения биологической активности антибиотиков, витаминов,
гормонов, рекомбинантных белков и иммунобиопрепаратов;
эксплуатации
-
биореакторов
и
корректирования
технологических
параметров ферментации.
СОДЕРЖАНИЕ ДИСЦИПЛИНЫ
1.
Содержание теоретической части курса (51 час).
Модуль 1 «Молекулярная биотехнология: история и направления
развития»
Лекция 1. Введение в биотехнологию. (3 часа).
Предмет и задачи биотехнологии. Основные этапы становления
современной
биотехнологии
как
науки.
Связь
биотехнологии
с
фундаментальными науками второй половины XX века. Отличительные
особенности молекулярной биотехнологии от других технологий с
использованием живых организмов. Различные аспекты конкретных
применений молекулярной биотехнологии.
Лекция 2.
Объекты молекулярной биотехнологии (3 часа).
Основные критерии выбора биообъекта для решения конкретных
задач биотехнологического производства. Классификация биообъектов.
Список GRAS, коллекции и криобанки штаммов.
9
Модуль 2 «Фундаментальные основы молекулярной биотехнологии»
Лекция 3. Понятие гена, его структура и функция. (3 часа).
Структура ДНК. Строение и отличия генов прокариот и эукариот.
Регуляторные элементы генов. Регуляция транскрипции у бактерий и
эукариот. Понятие о геномике.
Лекция 4. Реализация генетической информации у живых
организмов. (3 часа).
Универсальные факторы транскрипции. Экспрессия. Механизм базовой и
активированной транскрипции. Модель активации Пташне-Ганна. Основные
этапы трансляции.
Модуль 3 «Генная инженерия»
Лекция 5. История и инструменты генной инженерии. (3 часа).
Краткая история развития генной инженерии. Инструменты и методы
генной
инженерии.
Классификация
нуклеаз.
Система
рестрикции-
метилирования у прокариот. Рестрикция и лигирование. ДНК-зависимые и
РНК-зависимые ДНК полимеразы. Полимеразная цепная реакция. Различные
принципы полимеразной цепной реакции и их применение. Трансферазы,
киназы и фосфатазы в генной инженерии.
Лекция 6. Понятие вектора в генной инженерии. (3 часа).
Основные компоненты вектора. Плазмидные вектора, вектора на основе
фаговых ДНК, бактериальные искусственные хромосомы. Кассетные и
экспрессионные векторные системы. Семейство векторов pET.
10
Лекция 7. Прямые методы переноса генов. (3 часа).
Трансформация протопластов векторной ДНК, трансфекция с ПЭГ,
электропорация,
микроинъекция,
бомбардировка,
липосомальная
трансформация.
Лекция 8. Непрямые методы переноса генов. (3 часа).
Природный механизм переноса генов от агробактерий к растениям и его
использование в биотехнологии. Перенес генов с помощью вирусов.
Лекция 9. Векторы для трансформации растений и животных. (3
часа).
Особенности векторов для разных групп организмов. Плазмиды
агробактерий
как
векторы
для
трансформации.
Бинарные
и
коинтегративные векторные системы. Векторы для трансформации клеток
животных.
Модуль 4 «Биотехнологическое производство»
Лекция 10. Структура и слагаемые биотехнологического процесса –
часть 1. (3 часа).
Структура и слагаемые биотехнологического процесса. Биотехнология
микроорганизмов.
Устройство
ферментера.
Основные
классификации
ферментеров.
Лекция 11. Структура и слагаемые биотехнологического процесса –
часть 2. (3 часа).
Основные требования к ферментационному процессу. Риски и способы их
избежания.
Особенности
подготовки
биотехнологическом производстве.
11
конечного
продукта
при
Модуль 5 «Биотехнология микробиологических систем»
Лекция 12. Традиционная микробиологическая биотехнология и
биотехнология рекомбинантных штаммов микроорганизмов. (3 часа).
Производство антибиотиков, витаминов, аминокислот и др. Производство
препаратов нормофлоры. Биосинтез биологически активных пептидов
человека: инсулин, интерферон, интерлейкин в бактериях.
Лекция 13. Одноклеточный белок. (3 часа).
Проблема белкового голодания на Земле. Одноклеточный белок (SCP),
свойства, получение, примеры. Использование микроорганизмов в сельском
хозяйстве.
Модуль 6 «Биотехнология эукариотических систем»
Лекция 14. Культивирование клеток растений и животных в условиях
in vitro. (3 часа).
Методы культуры клеток растений и животных. Питательные среды,
условия культивирования. Производство БАВ в культуре клеток растений.
Лекция 15. Трансгенные растения и животные. (3 часа).
Получение
трансгенных
растений
и
животных
методами
генной
инженерии. Сельскохозяйственная биотехнология. Растения и животные как
биореакторы. Проблема ГМО в современном обществе.
Модуль 7 «Коммерческие продукты молекулярной биотехнологии»
Лекция 16. Инженерная энзимология. (2 часа).
12
Определение
инженерной
энзимологии.
Понятие
иммобилизации.
Физические и химические способы иммобилизации. Иммобилизованные
клетки и ферменты.
Лекция 17. Иммунобиотехнология. (2 часа).
Субъеденичные вакцины. Генная иммунизация. Аттенуированные вакцины.
Векторные вакцины. Противовирусные и противобактериальные вакцины.
Получение съедобных вакцин.
Лекция 18. Рекомбинантные белки и полипептиды. (2 часа).
Выделение кДНК интерферона. Гормон роста человека, полученный
методом генетической инженерии. Лекарственные средства против ВИЧ.
Ферменты
(ДНКаза
I
и
альгинат-лиаза).
Профилактика
отторжения
трансплантированных органов.
2.
Содержание практической части курса.
Лабораторные работы (51 час)
Занятие № 1
Биотехнология как динамически развивающаяся наука. Знакомство
студентов с современной достижениями биотехнологии, формирование
целостного представления о возможностях применения полученных знаний и
навыков для решения конкретных задач (6 часов).
Занятие № 2
13
Возможности и задачи биотехнологии. Устройство биотехнологической
лаборатории. Обучение студентов правилам работы в биотехнологической
лаборатории, подготовке рабочего места и инструментария для исследований
(6 часов).
Занятие № 3
Объекты
молекулярной
биотехнологии.
Методы
совершенствования
биообъектов. Освоение основных приемов манипуляции с растительным и
животным геномами. Отбор наиболее ценных мутантов (6 часов).
Занятие № 4
Реализация генетической информации у живых организмов. Изучение
устройства генетического аппарата про- и эукариот. Освоение техники
амплификации и детекции нуклеиновых кислот на примере полимеразной
цепной реакции и электрофореза, соответственно (6 часов).
Занятие № 5
Инструменты и методы генной инженерии. Изучение инструментов и
методов генной инженерии при создании рекомбинантных молекул (6 часов).
Занятие № 6
14
Трансформация клеток растений и животных. Освоение переноса
генетического материала в клетки растительных и животных организмов (6
часов).
Занятие № 7
Промышленнаябиотехнология. Процессы и аппараты в биотехнологии.
Обучение
принципам
получения
биотехнологического
продукта
в
промышленных масштабах (6 часов).
Занятие № 8
Промышленная
биотехнология.
Микробиологическое
производство
лекарственных
средств
пищевых
Традиционная
и
продуктов.
микробиологическая биотехнология и биотехнология рекомбинантных
штаммов микроорганизмов (6 часов).
Занятие № 9
Молекулярная
диагностика.
Основные
методы
иммуодиагностики.
Постановка ферментативной реакции (на примере ELISA) и
оценка
полученного результата (3 часа).
Самостоятельная работа (48 часов).
1.
Подготовка к семинарским занятиям и коллоквиумам.
2.
Работа с учебной литературой.
3.
Подготовка докладов для выступления на практических занятиях.
15
III КОНТРОЛЬ ДОСТИЖЕНИЯ ЦЕЛЕЙ КУРСА
Вопросы к зачету
1. Центральная догма молекулярной биологии: транскрипция, трансляция и
экспрессия генов.
2. Первичная структура ДНК. История открытия.
3. Репликация ДНК.
4. Первичная структура РНК. 5. РНК: функция, типы, структурные отличия
от ДНК.
5. Ген, структура и функция (общее).
6. Генетический код, основные свойства. Универсальность. Избыточность.
Однозначность.
7. Структура и функции эукариотического гена.
8. Структура и функции прокариотического гена.
9. Основные отличия структуры генов прокариот и эукариот.
10. Промоторы – регуляторные элементы генов прокариот и эукариот.
11. Регуляция экспрессии структурных генов эукариот.
12 Регуляция экспрессии структурных генов прокариот.
13. Транскрипция, особенности транскрипции эукариот.
14. Транскрипция, особенности транскрипции прокариот.
15. Процессинг РНК. Структура матричной РНК эукариот.
16. Трансляция, основные элементы и этапы.
17. Структура и функция рибосом.
18. Структура и функция транспортных РНК.
19. Особенности трансляции у эукариот.
20. Особенности трансляции у прокариот.
16
21. Процессинг беков.
22. Белки, определение белков, структура.
23. Общие функции белков. Каталитическая, транспортная, рецепторная,
структурная, защитная, двигательная функции белков, примеры.
24. Белки токсины и антибиотики.
25. Определение биотехнологии, история развития.
26. Основные направления биотехнологического производства.
27.Связь биотехнологии с фундаментальными науками второй половины XX
века. Биотехнология микроорганизмов.
28. Биотехнология при решении проблем экологии.
29. Эукариотические организмы в биотехнологии.
30. Биотехнология прокариотов.
31.
Биотехнология
растительной
клетки,
получение
и
поддержание
клеточных культур растений, микроклонирование.
32. Методы культуры клеток растений. Питательные среды, условия
культивирования .
33. Использование и значение в биотехнологии растений факторов роста
растений.
34. Практическая биотехнология растений. Производство БАВ в культуре
клеток растений.
35. Суспензионные клеточные культуры как продуценты важных первичных
и вторичных метаболитов.
36. Методы получения штаммов-суперпродуцентов. Примеры рентабельных
клеточных производств.
37. Культуры клеток редких, эндемичных и исчезающих видов растений,
преимущества и перспективы использования.
38. Методы культуры клеток животных. Питательные среды, условия
культивирования.
17
39. Особенности культивирования клеток животных, отличия от культур
клеток растений.
40. Структура и слагаемые биотехнологического производства. Особенности
подготовки конечного продукта при биотехнологическом производстве.
41.
Ферментеры.
Устройство
ферментера.
Основные
классификации
ферментеров.
42. Особенности подготовки конечного продукта при биотехнологическом
производстве.
43. Традиционная микробиологическая биотехнология и биотехнология
рекомбинантных штаммов микроорганизмов.
44. Биосинтез биологически активных пептидов человека: инсулин,
интерферон, интерлейкин в бактериях.
45. Инженерная энзимология. Иммобилизованные клетки и ферменты.
46. Иммунобиотехнология. Рекомбинантные вакцины.
47. Трансгенные растения и животные. Производство ценных веществ в
трансгенных растениях и животных. Преимущества подхода.
48. Понятие ГМО. Отличия ГМО от обычных организмов. Возможные риски.
49. Понятие рекомбинантной ДНК.
50. Генетическая инженерия. Краткая история развития генной инженерии.
51.Прямые методы переноса генов: трансформация протопластов векторной
ДНК, трансфекция с ПЭГ, электропорация.
52. Прямые методы переноса генов: микроинъекция, бомбардировка,
липосомальная трансформация.
53. Непрямые методы переноса генов. Природный механизм переноса генов
от агробактерий к растениям и его использование в биотехнологии.
54. Понятие плазмиды, природные функции бактериальных плазмид.
55. Понятие вектора в генетической инженерии, использование плазмид в
качестве векторов для переноса трансгенов.
56. Понятие о Т-ДНК агробактерий.
18
57. Молекулярный механизм переноса генов при агробактериальной
трансформации растений: Ti- и Ri- плазмиды, vir-гены.
58. Основные этапы активации vir-генов, функции соответствующих белков.
59. Основные инструменты генетической инженерии, этапы клонирования
гена.
60. Принцип ПЦР. Применение метода ПЦР в генетической инженерии.
61.
Эндонуклеазы
рестрикции,
принцип
действия,
использование
в
генетической инженерии.
62. Понятие процессов рестрикции и лигирование, понятие липких и тупых
концов ДНК.
63. Вектора для клонирования, касcетный, бинарный, коинтегративный.
Элементы векторов.
64. Регуляторные элементы вектора: промоторы и терминаторы для
прокариот, растений и животных.
65. Селективные маркеры векторов, особенности селективных маркеров для
прокариот, растений и животных, использование антибиотиков для селекции
трансгенных клеток.
66. Трансформация бактерий E. coli и A. tumefaciens. Этапы трансформации
агробактериями растений.
67. Метаболическая инженерия растений.
68. Создание новых биообъектов методами клеточной и генетической
инженерии.
69. Рекомбинантные ферменты, белки и пептиды, получение, примеры.
70. Получение съедобных вакцин. Растения и животные как биореакторы.
71. Моноклональные антитела как лекарственные средства.
72. Профилактика отторжения трансплантированных органов.
IV. УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ДИСЦИПЛИНЫ
19
1. Образовательные технологии
Рабочая программа подразделяется на 7 модулей – лекции, которые могут
быть представлены в мультимедийном варианте, пригодном для заочного
и очного обучения.
Предусмотрены экскурсии в отдел биотехнологии БПИ ДВО РАН на базе
которого создана одна из крупнейших коллекций клеточных культур
ценных
лекарственных
растений.
В
ЦКП
"Биотехнологии
и
биоинженерии" студентам демонстрируют современное оборудование
для проведения исследований в области геномики, протеомики, генной
инженерии, а так же аппаратное обеспечение для биотехнологии.
2.
Учебно-методическое
студентов.
обеспечение
Оценочные
средства
самостоятельной
для
текущего
работы
контроля
успеваемости, промежуточной аттестации по итогам освоения
дисциплины.
Освоение дисциплины «Молекулярная биотехнология» предусматривается
широкое использование активных и интерактивных форм приобретения
новых знаний. В обязательном порядке должен быть обеспечен доступ
студентов в Интернет.
Для
текущего
контроля
усвоения
теоретического
материала,
изложенного на лекциях, подготовлен список вопросов, включающий все
темы. Этот перечень служит основой для самоконтроля и проверки знаний.
Ключевые и трудноусвояемые моменты обсуждаются на семинарах, также
проводится устный опрос студентов. В теоретической части курса
для
осуществления текущего контроля предусмотрено выполнение домашних
заданий (рефератов) по основным направлениям дисциплины.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
20
Основная
1. Воробьева В.М., Турецкова В.Ф.. Биотехнология лекарственных средств и
диагностических препаратов. Часть 1. Общая биотехнология/ Учебное пособие.
– Барнаул: АГМУ, 2003. – 2186с.; 2005. – 156 с.
2. Орехов
С.Н..
Фармацевтическая
биотехнология.
Руководство
к
практическим занятиям / Учебное пособие // С.Н. Орехов; под ред. В.А. Быкова
и А.В. Катлинского / М.: Изд.группа «ГЕОТАР-Медиа», 2009. – 384 с.
3. Сазыкин Ю.О. Биотехнология: учеб. пособие для студентов высших
учебных заведений // Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чикалева; под ред. А.В.
Катлинского/ М.: Изд.центр «Академия», 2006. – 256 с.
4. Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм. / Под ред.
И.И. Краснюка и Г.В. Михайловой.- 2-е изд. – М.: Издательский центр
«Академия», 2006.- 592 с.
5. Микробиология и иммунология. 2-е изд., перераб. Под ред. Воробьева А.А.
Изд-во МЕДИЦИНА. 2005. 496 с. ISBN 5225042716
6. Егорова Т. А., Клунова С. М., Живухин Е. А. Основы биотехнологии. —
М., 2003.
Дополнительная
1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1 3. М.: Мир, 1994.
2. Анализ генома. Методы / Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. 246 с.
3. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦиГСО
РАН, 1993. – 241 с.
4. Барановов В. С. Генная терапия – медицина XXI века // Соросовский
образовательный журнал. № 3. 1999. С. 3 – 68.
21
5. Бекер М. Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.:
Агропромиздат, 1990. 334 с.
6. Валиханова Г. Ж. Биотехнология растений. Алматы: Конжык, 1996. 272 с.
7. Глеба Ю. Ю. Биотехнология растений // Соросовский образовательный
журнал. № 6. 1998. С. 3 – 8.
8. Глебов О. К. Генетическая трансформация соматических клеток // Методы
культивирования клеток. Л.: Наука, 1988.
9. Егоров
Н.
С.,
Самуилов
В.
Д.
Современные
методы
создания
промышленных штаммов микроорганизмов // Биотехнология. Кн. 2. М.:
Высшая школа, 1988. 208 с.
10.
Зверева С. Д., Романов Г. А. Репортерные гены для генетической
инженерии растений: характеристика и методы тестирования // Физиология
растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 479-488.
11.
Лещинская
И.
Б.
Генетическая
инженерия
//
Соросовский
образовательный журнал. 1996. №1. С. 33 - 39.
12.
Ли А., Тинланд Б. Интеграция т-ДНК в геном растений: прототип и
реальность // Физиология растений. 2000, том 47, № 3. С. 354-359
13.
Лутова Л. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н. и др. Генетика развития
растений. СПб.: Наука, 2000. 539 с.
14.
Пирузян Э. С. Генетическая инженерия растений. М.: Знание, 1988. 64
с.
15.
Пирузян Э. С. Проблемы экспрессии чужеродных генов в растениях //
Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Биотехнология. 1990. Т. 23. 176 с.
16.
Попов Л. С., Языков А. А. Трансгенные животные как модели для
изучения репродукции эмбрионального развития и заболеваний человека //
Успехи современной биологии.1999. Т 119, № 1. С. 30-41.
17.
Романов Г. А. Генетическая инженерия растении и пути решения
проблемы биобезопасности / Физиология растений, 2000. Том 47, № 3. С.
343-353.
22
18.
Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. Ч. 1. Новосибирск: Изд-во
Новосибирского ун-та, 1994. 304 с.
19.
Томилин Н. В., Глебов О. К. Генетическая трансформация клеток
млекопитающих // Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л.:
Наука, 1986. С. 62 - 82.
Томилин Н. В., Глебов О. К. Генетическая трансформация клеток
млекопитающих // Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л.:
Наука, 1986. С. 62 - 82.
Дрейпер Дж. и др. (ред.). Генная инженерия растений. Лабораторное
руководство. — М.: Мир, 1991.
20.
Сингер М., Берг П. Гены и геномы. — М.: Мир, 1998.
21.
Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.
22.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и
применение. — М.: Мир, 2002.
23.
Патрушев Л. И. Экспрессия генов. — М.: Наука, 2000.
Список образовательных интернет- ресурсов
1. Щелкунов С.Н.,Учебно-справочное пособие:Генная инженерия,
2004http://www.booksmed.com/biologiya/1302-geneticheskayainzheneriya-shhelkunov.html
2. Глик Б., Пастернак Дж., Молекулярная биотехнология, 2002
http://www.booksmed.com/mikrobiologiya/898-molekulyarnayabiotexnologiya-glik-pasternak.html
3. Громова Н.Ю., Косивцов Ю.Ю., Сульман Э.М. Технология синтеза и
биосинтеза биологически активных веществ: Учебное пособие. - Тверь:
23
ТГТУ, 2006. - 84 с. http://window.edu.ru/resource/627/58627/files/tstutver33.pdf
ТЕХНИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ
1.
Мультимедийные презентации лекций
2.
Тесты по разделам курса.
3.
Коллекция клеточных культур отдела биотехнологии БПИ ДВО РАН.
24
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
КОНСПЕКТЫ ЛЕКЦИЙ
по дисциплине
«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Специальность — — 020209.65 «Микробиология»
Форма подготовки очная
г. Владивосток
2012
25
МОДУЛЬ 1 «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ: ИСТОРИЯ И НАПРАВЛЕНИЯ
РАЗВИТИЯ»
Лекция 1. Введение в биотехнологию.
В настоящий момент вряд ли у кого-нибудь может возникнуть сомнение
в
том,
что
современная
биология
представляет
собой
наиболее
разнообразную область естественных наук. Действительно, она включает
казалось бы совершенно не связанные между собой разделы научных знаний:
микробиологию, анатомию растений и животных, биохимию, иммунологию,
клеточную биологию, физиологию растений и животных, различные
систематики, экологию, генетику, биофизику, математику и много других
областей
естествознания.
Постоянно
увеличивающееся
разнообразие
современной биологии началось после окончания второй мировой войны,
когда в биологию внедрились другие естественнонаучные дисциплины, такие
как физика, химия и математика, которые сделали возможным описание
жизненных процессов на новом качественном уровне – на уровне клетки и
молекулярных
взаимодействий.
Именно
существенные
успехи
в
фундаментальных исследованиях в области биохимии, молекулярной
генетики и молекулярной биологии, достигнутые во второй половине
текущего столетия, создали реальные предпосылки управления различными
(пусть, возможно и не самыми главными) механизмами жизнедеятельности
клетки. Сложившаяся благоприятная ситуация в биологии явилась мощным
толчком в развитии современной биотехнологии, весьма важной области
практического приложения результатов фундаментальных наук. Можно с
уверенностью
утверждать,
что
биотехнология
является
наиболее
разительным примером того, как результаты, казалось бы "чистой науки",
находят применение в практической
обеспечивающей
благоприятную
деятельности
ситуацию
для
человека.
Основой,
бурного
развития
биотехнологии, явились революционизирующие открытия и разработки:
26
•
доказательства роли нуклеиновых кислот в хранении и передаче
наследственной информации в биологических системах (имеются в виду
индивидуальные клетки и отдельные организмы, а не их популяции);
•
расшифровка
универсального
для
всех
живых
организмов
генетического кода;
• раскрытие механизмов регуляции функционирования генов в процессе
жизни одного поколения организмов;
• совершенствование существовавших и разработка новых технологий
культивирования микроорганизмов, клеток растений и животных;
•
как логическое следствие из вышесказанного, явилось создание
(возникновение) и бурное развитие методов генетической и клеточной
инженерии,
с
помощью
которых
искусственно
создаются
новые
высокопродуктивные формы организмов, пригодные для использования в
промышленных масштабах.
Абсолютно
новым
направлением
является
так
называемая
инженерная энзимология, возникшая вследствие развития современных
методов изучения структуры и синтеза белков-ферментов и выяснения
механизмов функционирования и регуляции активности этих соединений
(важных элементов клетки). Достижения в этой области позволяют
направленно
модифицировать
белки
специфичности
функционирования,
катализаторов
промышленно
различной
разрабатывать
ценных
реакций
с
сложности
и
создание
мощных
помощью
высоко
стабилизированных иммобилизованных ферментов.
Все эти достижения вывели биотехнологию на новый уровень ее
развития, позволяющий сознательно и целенаправленно управлять сложными
клеточными процессами. Данная новая область биологических знаний и ее
последние достижения уже стали крайне важными для здоровья и
благополучия человека. И наконец, что же такое биотехнология и каковы ее
направления деятельности?
27
Термин «биотехнология» был введен в 1917 г. венгерским инженером
Карлом Эреки при описании процесса крупномасштабного выращивания
свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению
Эреки, биотехнология – это «все виды работ, при которых из сырьевых
материалов с помощью живых организмов производятся те или иные
продукты».
Однако этот термин в те годы не получил широкого распространения.
Только в 1961 г. к нему вновь вернулись после того как шведский
микробиолог Карл Герен Хеден порекомендовал изменить название научного
журнала "Journal of Microbiological and Biochemical Engineering and
Technology" (Журнал микробиологической и химической инженерии и
технологии), специализирующегося на публикации работ по прикладной
микробиологии и промышленной ферментации, на "Biotechnology and
Bioengineering"
(Биотехнология
и
биоинженерия).
С
этого
момента
биотехнология оказалась четко и необратимо связана с исследованиями в
области «промышленного производства товаров и услуг при участии живых
организмов, биологических систем и процессов». Понятие биотехнология
может быть представлено многими определениями:
• использование биологических объектов, систем или процессов для
производства необходимых продуктов или для нужд сервисной индустрии;
•
комплексное применение биохимических, микробиологических и
инженерных
знаний
с
целью
промышленного
использования
потенциальных возможностей микроорганизмов, культур клеток и отдельных
их компонентов или систем;
•
технологическое
использование
биологических
явлений
для
воспроизводства и получения (изготовления) различных типов полезных
продуктов;
28
•
приложение научных и инженерных принципов для обработки
материалов биологическими агентами с целью получения необходимых
продуктов или создания сервисных технологий.
Биотехнология на самом деле не что иное, как название, данное набору
технических приемов (подходов) и процессов, основанных на использовании
для этих целей биологических объектов.
Термин биотехнология включает составляющие «биос», «техне»,
«логос» греческого происхождения (от греч. «биос» – жизнь, «техне» –
искусство, мастерство, умение и «логос» – понятие, учение).
Таким образом, как это явствует из приведенных определений,
биотехнология по существу сводится к использованию микроорганизмов,
животных и растительных клеток или же их ферментов для синтеза,
разрушения или трансформации (превращения) различных материалов с
целью получения полезных продуктов для различных нужд человека.
Биотехнологические направления имеют своей целью создание и
практическое внедрение (т. е. практическое использование):
• новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов,
используемых в здравоохранении для диагностики, профилактики и лечения
различных заболеваний;
•
биологических средств защиты сельскохозяйственных растений от
возбудителей заболеваний и вредителей, бактериальных удобрений и
регуляторов роста растений и животных; новых сортов растений, устойчивых
к разного рода неблагоприятным воздействиям (факторам внешней среды);
новых пород животных с полезными свойствами (трансгенные животные);
•
ценных
кормовых
добавок
для
повышения
продуктивности
сельскохозяйственных животных (кормового белка, аминокислот, витаминов,
ферментов, способствующих повышению усвояемости кормов, и т. п.);
29
• новых биоинженерных методов для получения высокоэффективных
препаратов различного назначения, используемых в сельском хозяйстве и
ветеринарии;
•
новых технологий создания и получения хозяйственно ценных
продуктов
для
пищевой,
химической
и
микробиологической
переработки
сельскохозяйственных,
промышленности;
•
эффективных
технологий
промышленных и бытовых отходов для получения продуктов, которые могут
использоваться в других отраслях хозяйственной деятельности человека
(например, биогаза, удобрений, топлива для автомобилей и т. п.).
Само собой разумеется, что такие комплексные задачи требуют
интеграции различных отраслей научных и
технических
знаний и
характеризуют биотехнологию как ряд перспективных технологий, которые
найдут применение в самых разнообразных индустриальных направлениях.
Интеграция биологии, химии и инженерных приемов в биотехнологии
осуществляется
таким
путем,
чтобы
обеспечить максимальное
использование потенциальных возможностей всех входящих в нее областей
знаний. И все же, несмотря на комплексность биотехнологии, ее нельзя
рассматривать как нечто единое целое, наподобие микроэлектроники. Скорее
она должна рассматриваться как ряд перспективных технологий, сочетания
которых будут постоянно варьировать в зависимости от конкретных
практических задач.
Биотехнология – междисциплинарная область научно-технического
прогресса, возникшая на стыке биологических, химических и технических
знаний и призванная к созданию новых биотехнологических процессов,
которые в большинстве случаев будут осуществляться при низких
температурах, требовать небольшого (меньшего) количества энергии и будут
базироваться преимущественно на дешевых субстратах, используемых в
качестве первичного сырья.
30
Однако следует отдавать себе отчет в том, что биотехнология не
является чем-то новым, ранее не известным, а представляет собой развитие и
расширение набора технологических приемов, корни которых появились
тысячи лет тому назад.
Биотехнология
известные
и
включает многие традиционные процессы, давно
давно
используемые
человеком.
Это
пивоварение,
хлебопечение, изготовление вина, производство сыра, приготовление многих
восточных пряных соусов, а также разнообразные способы утилизации
отходов. Во всех перечисленных процессах использовались биологические
объекты (пусть даже без достаточных знаний о них) и все
эти процессы на протяжении многих лет совершенствовались, правда
эмпирически. Начало этого этапа биотехнологии теряется в глубине веков и
он продолжался примерно до конца XIX в.
Работы великого французского ученого Луи Пастера (1822–1895)
заложили
фундамент
микробиологии
и
практического
биохимии
в
использования
традиционных
достижений
биотехнологиях
(пивоварение, виноделие, производство уксуса) и ознаменовали начало
нового, научного периода развития биотехнологии. Для этого периода
характерно
развитие
ферментационных
разработаны
ацетона,
промышленной
процессов
промышленных
стерильные процессы
глицерина.
–
биохимические
особенности
Александром
для
возбудителей
Флемингом
глубинного
в
особенности
масштабах.
Были
производства путем ферментации
Интенсивно
микроорганизмов
аппараты
в
биотехнологии,
изучаются
процессов
данных
пенициллина
основные
брожения,
процессов.
культивирования
исследуются
После
разрабатываются
продуцентов,
группы
открытия
процессы
что
и
резко
удешевило производство данного антибиотика, и он стал доступным для
широкого использования в клинической практике во время второй мировой
войны.
31
После войны быстрыми темпами развивались процессы ферментации
для производства антибиотиков, стероидных гормонов, а в 1961 г. возник
журнал
«Биотехнология
и
биоинженерия»
и
снова
термин
«биотехнология» стал применяться для обозначения процессов, которые
относили к области промышленной микробиологии.
Однако
термин
«биотехнология»
в
большей
степени
стал
ассоциироваться с новым этапом развития этой науки, начало которому
положено в 1973 г., когда Стэнли Коэн и Герберт Бойер получили
рекомбинантные плазмиды и произвели трансформацию ими клеток E.coli. В
течение четырех лет после открытия рекомбинантных ДНК-технологий
появились штаммы бактерий, продуцирующие инсулин и человеческий
гормон роста. Это привело к притоку инвестиций в новые компании. В
настоящее время в США только микробная (основанная на культивировании
генетически
модифицированных
микроорганизмов)
биотехнология
представлена 1300 компаниями, насчитывающими 153 000 служащих, с
годовым доходом 19,6 млрд долл. и с продажами 13,4 млрд долл. В Канаде
282 компании с годовым доходом 1,1 млрд долл., в Японии с годовым
доходом 10,0 млрд долл., в Европе 1178 компаний (45 000 служащих) с
годовым доходом 3,7 млрд долл. Основные продукты, получаемые с
помощью микроорганизмов и рекомбинантных ДНК-технологий – животные
пептиды, такие как гормоны, факторы роста, ферменты, антитела и
биологические модификаторы иммунного ответа.
По
приблизительной
растениеводческой
оценке,
продукции,
общемировая
полученной
на
рыночная
стоимость
основании
ДНК-
технологий, достигнет к 2010 г. 30–40 млрд. долларов. Мировой рынок
биотехнологической продукции составляет ежегодно около 150 млрд. долл.
Во
многих
странах
биотехнологии.
Так,
мира
приняты
например,
в
национальные
США
программы
ежегодные
затраты
по
на
биотехнологию составляют 2-3 млрд. долл. В Германии на 2001 год выделено
32
около 2 млрд. марок на новую программу по биотехнологии. Ниже
приведены основные факты, характеризующие развитие биотехнологии.
1917 Карл Эреки ввел термин «биотехнология»;
1943 Произведен пенициллин в промышленном масштабе;
1944
Эвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что генетический
материал представлен ДНК;
1953 Уотсон и Крик определили структуру молекулы ДНК;
1961 Учрежден журнал “Biotechnology and Bioengineering”;
1961–1966 Расшифрован генетический код;
1970 Выделена первая рестрицирующая эндонуклеаза;
1972 Корана и др. синтезировали полноразмерный ген тРНК;
1973 Бойер и Коэн положили начало технологии рекомбинантных ДНК;
1975 Колер и Мильштейн описали получение моноклональных антител;
1976
Изданы первые руководства, регламентирующие работы с
рекомбинантными ДНК;
1976
Разработаны
методы
определения
нуклеотидной
последовательности ДНК;
1978 Фирма Genentech выпустила человеческий инсулин, полученный с
помощью E. coli;
1982 Разрешена к применению в Европе первая вакцина для животных,
полученная по технологии рекомбинантных ДНК;
1983 Для трансформации растений применены гибридные Ti-плазмиды;
1988 Создан метод полимеразной цепной реакции (ПЦР);
1990
В США утвержден план испытаний генной терапии с
использованием соматических клеток человека;
1990 Официально начаты работы над проектом «Геном человека»;
1994–1995 Опубликованы подробные генетические и физические карты
хромосом человека;
33
1996
Ежегодный объем продаж первого рекомбинантного белка
(эритропоэтина) превысил 1 млрд. долларов;
1997
Клонировано
млекопитающее
из
дифференцированной
соматической клетки.
Вполне
обоснованно
предполагать,
что
скорость
практического
использования биотехнологических достижений в меньшей степени будет
определяться научными и техническими условиями, а больше будет зависеть
от таких факторов, как капиталовложения заинтересованных отраслей
промышленности, улучшение технологических схем, рыночных ситуаций и
экономичности новых методов по сравнению с недавно внедренными
технологиями иного типа.
Отрасли
промышленности,
с
которыми
будет
конкурировать
биотехнология, включают изготовление пищи для людей и животных,
создание
и
производство
изготовляемые
с
новых
помощью
материалов,
нефтехимии,
призванных
создание
заменить
альтернативных
источников энергии, разработку технологии безотходных производств,
контроль и устранение загрязнений и сельское хозяйство. Конечно,
биотехнология
ветеринарии
революционизирует
и
фармацевтической
и
многие
разделы
промышленности.
медицины,
Вышеизложенное
однозначно предполагает рассмотрение биотехнологии как межотраслевой
дисциплины,
основанной
на применении многопрофильной стратегии
(различных подходов) для решения различных проблем.
Биотехнология
микробиологии,
применяет
биохимии,
методы,
заимствованные
молекулярной
биологии,
из
химии,
химической
технологии и компьютерной техники с целью создания новых разработок,
развития
и
оптимального
использования
процессов,
в
которых
каталитические реакции играют фундаментальную и незаменимую роль.
34
Любой биотехнолог должен
стремиться к достижению
тесного
кооперирования со специалистами других смежных (близких) дисциплин,
таких, как медицина, пищевая промышленность, фармацевтика и химическая
индустрия,
защита
окружающей
среды
и
процессы переработки
продуктов, представляющих собой отходы различных производств.
Главная причина успехов биотехнологии кроется в разительных успехах
и быстром прогрессе молекулярной биологии, в частности в разработке
технологии рекомбинантных молекул ДНК. С помощью этой технологии
оказалось возможным непосредственно манипулировать с наследственным
материалом клеток, получая новые сочетания полезных признаков и
способностей. Возможности этих технических приемов, которые впервые
были разработаны в лабораториях, вскоре оказались вполне приемлемыми в
промышленных условиях. Однако, несмотря на определенные, а порой и
весьма значительные выгоды, которые несет технология рекомбинантных
молекул, постоянно следует учитывать возможные опасности, связанные с
вмешательством человека в природу. В настоящее время развитие
биотехнологии осуществляется со скоростью, напоминающей таковую при
становлении микроэлектронной промышленности в середине 70-х годов.
Ни для кого уже не является секретом, что ископаемое топливо (хотя и
добываемое в настоящее время с большим избытком), а также другие не
восполняемые
ресурсы,
в
один
прекрасный
день
станут
крайне
ограниченными. И совершенно естественно, что данное обстоятельство уже
сейчас заставляет искать новые, более дешевые и лучше сохраняемые
источники
энергии
биотехнологическим
и
питания,
путем.
В
которые
этой
могли
ситуации
бы
страны
восполняться
с
климатом,
позволяющим ежегодно производить большие количества биомассы, будут
находиться в более выгодных условиях по сравнению со странами с менее
благоприятными климатическими условиями. В частности, тропические
35
области
земного
шара
в
этом
отношении
имеют существенное
преимущество над другими регионами.
Следующим
фактором,
способствующим
росту
интереса
к
биотехнологии, является современный мировой спад в химических и
инженерных
направлениях,
обусловленный
частичным
истощением
источников энергии. В силу этого биотехнология рассматривается в качестве
одного из важнейших средств рестимуляции (обновления) экономики на
основе новых методов, новой технологии и новых сырьевых материалов.
Фактически, индустриальный бум 1950-х и 1960-х годов был обусловлен
дешевой нефтью, так же как успехи в информационной технологии
обусловили в 1970-х и 1980-х годах развитие микроэлектроники. И есть
основания полагать, что 2000-е годы станут эрой биотехнологии. Во всяком
случае, в мире отмечается существенный подъем исследований в области
молекулярной
компаний,
биологии,
увеличение
возникновение
новых
биотехнологических
инвестиций
в биотехнологические отрасли
промышленности (как национальными компаниями, так и отдельными
лицами), а также рост фундаментальных знаний, увеличение количества
источников информации и средств информатики.
Многие биотехнологические процессы могут рассматриваться как
имеющие три главных стержневых компонента: первая часть состоит в
получении
наиболее
процессов,
вторая
оптимальных
часть
сводится
катализаторов
к
обеспечению по
специфических
возможности
оптимальных условий для осуществления требуемого каталитического
процесса и третья – связана с отделением и очисткой целевого продукта или
продуктов из ферментационной смеси.
В большинстве случаев наиболее эффективной, стабильной и удобной
формой для катализа биотехнологических процессов являются цельные
организмы,
вследствие
чего
в
биотехнологии
широко используются
микробиологические процессы. Конечно, это не исключает использование и
36
высших организмов (в частности, культур растительных и животных клеток),
которые,
несомненно,
в
будущем
будут
играть
важную
роль
в
биотехнологии.
Микроорганизмы обладают огромным генетическим пулом (фондом),
позволяющим
им
осуществлять
практически
неограниченную
биосинтетическую деятельность и потенциал деградации. Кроме того,
микроорганизмам присущ исключительно быстрый рост, скорость которого
намного превышает скорость роста высших организмов (растений и
животных). Указанное свойство позволяет за короткий промежуток времени
осуществить синтез больших количеств требуемого продукта в строго
контролируемых условиях.
Существенным
моментом
первого
компонента
биотехнологии
является селекция и улучшение объекта с помощью различных генетических
методов, а в последнее время с использованием высокоэффективных
приемов молекулярной биологии, которые, как уже упоминалось, способны
обеспечить
конструирование
организмов
с
новыми
биохимическими
возможностями.
Во многих случаях катализатор используется в изолированной форме в
виде очищенного фермента, для получения которого в настоящее время
разработаны эффективные методы выделения и очистки, а также методы
стабилизации.
Второй компонент биотехнологии связан с изготовлением систем,
обеспечивающих оптимальное функционирование организмов-продуцентов
или чистых ферментов. Сюда относятся специальные знания о химии
процессов, а также сведения об инженерном обеспечении конструирования и
изготовления этих систем.
Лекция 2.
Объекты молекулярной биотехнологии.
37
Объектами
молекулярной
биотехнологии
являются
самые
разнообразные биологические системы: микроорганизмы, клеточные линии
насекомых, растений и млекопитающих, вирусы насекомых, растений и
млекопитающих, многоклеточные организмы (растения, мыши, домашние
животные и т. д.) — выбор системы зависит от целей эксперимента. Характер
биологической системы исключительно важен для биотехнологического
процесса. Во многих случаях именно генетически модифицированная
самовоспроизводящая биологическая единица — микроорганизм, вирус,
растение или животное — является конечным коммерческим продуктом.
Среди множества биологических объектов, использующихся в молекулярной
биотехнологии, основными «рабочими лошадками» являются бактерии
Escherichia
coli,
одноклеточные
дрожжи
Saccharomyces
cerevisiae
и
различные клеточные линии животного происхождения. Все они играют
важную роль в получении белков, кодируемых клонированными генами.
Все живые организмы делятся на две основные группы: прокариоты и
эукариоты.
В
основе
этой
классификации
лежат
многочисленные
структурные различия., на которых мы остановимся более детально в
последующих главах, а здесь укажем лишь основные из них: 1) наличие или
отсутствие ядра, содержащего хромосомную ДНК; 2) строение и химический
состав клеточной стенки и 3) наличие или отсутствие субклеточных
цитоплазматических органелл. В прокариотической клетке, например
бактериальной, хромосомная ДНК находится непосредственно в цитоплазме,
клетка окружена ригидной клеточной стенкой, в состав которой часто входит
пептидогликан, но не хитин или целлюлоза; в клетке нет субклеточных
цитоплазматиче-ских органелл. В эукариотической клетке имеется ядро,
отделенное от цитоплазмы ядерной мембраной, хромосомная ДНК находится
в ядре; клеточная стенка, если она есть, может содержать хитин или
целлюлозу, но не пептидогликан; в цитоплазме содержатся различные
38
субклеточные органеллы (митохондрии, аппарат Гольджи, хлоропласт в
клетках растений).
Escherichia coli. Бактерия Escherichia coli — один из наиболее хорошо
изученных организмов. За последние пятьдесят лет удалось получить
исчерпывающую информацию о ее генетике, молекулярной биологии,
биохимии,
физиологии
и
общей
биологии.
Это
грамотрицательная
непатогенная подвижная палочка длиной менее 1 мкм. Ее средой обитания
является кишечник человека, но она также может высеваться из почвы и
воды. Благодаря способности размножаться простым делением на средах,
содержащих только ионы Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4+, Сl—, HPO42— и SO42—,
микроэлементы и источник углерода (например, глюкозу), E. coli стала
излюбленным объектом научных исследований. При культивировании E.coli
на обогащенных жидких питательных средах, содержащих аминокислоты,
витамины, соли, микроэлементы и источник углерода, время генерации (т. е.
время между образованием бактерии и ее делением) в логарифмической фазе
роста при температуре 37 °С составляет примерно 22 мин.
Для каждого живого организма существует определенный температурный
интервал, оптимальный для его роста и размножения. При слишком высоких
температурах происходит денатурация белков и разрушение других важных
клеточных компонентов, что ведет к гибели клетки. При низких
температурах биологические процессы существенно замедляются или
останавливаются совсем вследствие структурных изменений, которые
претерпевают белковые молекулы. Исходя из температурного режима,
который
предпочитают
те
или
иные
микроорганизмы,
их
можно
подразделить на термофилы (от 45 до 90 °С и выше), мезофилы (от 10 до 47
°С) и психрофилы, или психротрофы (от —5 до 35 °С). Микроорганизмы,
активно размножающиеся лишь в определенном диапазоне температур,
могут
быть
полезным
инструментом
для
решения
различных
биотехнологических задач. Например, термофилы часто служат источником
39
генов, кодирующих термостабильные ферменты, которые применяются в
промышленных
или
в
лабораторных
процессах,
а
генетически
видоизмененные психротрофы используют для биодеградации токсичных
отходов, содержащихся в почве и воде, при пониженных температурах.
E. coli можно культивировать как в аэробных (в присутствии кислорода),
так и в анаэробных (без кислорода) условиях. Однако для оптимальной
продукции рекомбинантных белков E. coli и другие микроорганизмы обычно
выращивают в аэробных условиях. Если целью культивирования бактерий в
лаборатории является синтез и выделение определенного белка, то культуры
выращивают на сложных жидких питательных средах в колбах. Для
поддержания нужной температуры и обеспечения достаточной аэрации
культуральной
среды
колбы
помещают
в
водяную
баню
или
термостатируемую комнату и непрерывно встряхивают. Такой аэрации
достаточно для размножения клеток, но не всегда — для синтеза белка. Рост
клеточной массы и продукция белка лимитируются не содержанием в
питательной среде источников углерода или азота, а содержанием
растворенного кислорода: при 20 °С оно равно примерно девяти миллионным
долям. Это становится особенно важно при промышленном получении
рекомбинантных белков с помощью микроорганизмов. Для обеспечения
условий, оптимальных для максимальной продукции белков, конструируют
специальные ферментеры и создают системы аэрации.
Некоторые
генетически
модифицированные
микроорганизмы,
использующиеся в биотехнологии: Acremonium chrysogenum, Bacillus brevis,
Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Corynebacterium glutamicum, Erwmia
herbicola, Escherichia coli, Pseudotnonas spp. , Rhizobium spp., Streptomyces
spp, Trichoderma reesei, Xanthomonas campestris, Zymomonas mobilis.
Помимо E. coli, в молекулярной биотехнологии используют множество
других микроорганизмов (табл. 2.1). Их можно разделить на две группы:
микроорганизмы как источники специфических генов и микроорганизмы,
40
созданные генноинженерными методами для решения определенных задач. К
специфическим
генам
относится,
термостабильную
ДНК-полимеразу,
например,
которая
ген,
кодирующий
используется
в
широко
применяемой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот ген был выделен из
термофильных бактерий и клонирован в E. coli. Ко второй группе
микроорганизмов относятся, например, различные штаммы Corynebacterium
glutamicum, которые были генетически модифицированы с целью повышения
продукции промышленно важных аминокислот.
Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae — это
непатогенные
одноклеточные
микроорганизмы
с
диаметром
клетки
примерно 5 мкм, которые во многих отношениях представляют собой
эукариотический аналог E. coli. Их генетика, молекулярная биология и
метаболизм детально изучены. S. cerevisiae размножаются почкованием и
хорошо растут на такой же простой среде, как и Е. coli. Их способность к
превращению сахара в этанол и углекислый газ издавна использовалась для
изготовления алкогольных напитков и хлеба. В настоящее время ежегодно во
всем мире расходуется более 1 млн. тонн S. cerevisiae. Дрожжи S. cerevisiae
представляют также большой научный интерес. В частности, они являются
наиболее удобной моделью для исследования других эукариот, в том числе
человека, поскольку многие гены, ответственные за регуляцию клеточного
деления S. cerevisiae, сходны с таковыми у человека. Это открытие
способствовало
идентификации
отвечающих
за
развитие
генетическая
система
и
характеристике
новообразований.
дрожжей
(искусственная
генов
Широко
человека,
используемая
хромосома)
является
непременным участником всех исследований по изучению ДНК человека. В
19% г. была определена полная нуклеотидная последовательность всего
набора хромосом S. cerevisiae, что еще более повысило ценность этого
микроорганизма для научных исследований. Такая работа на эукариотах
была выполнена впервые.
41
Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок часто
приходится подвергать ферментативной модификации, присоединяя к
белковой молекуле низкомолекулярные соединения — во многих случаях это
необходимо для правильного функционирования белка. К сожалению, E. coli
и другие прокариоты не способны осуществлять эти модификации, поэтому
для получения полноценных эукариотических белков используют S.
cerevisiae, а также другие виды дрожжей: Kluyveromyces lactis, Saccharomyces
diastaticus, Schizisaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia postons,
Hansenula pofymorpha. Наиболее эффективными продуцентами полноценных
рекомбинантных белков являются P. pastoris и H. polymorpha.
Культуры эукариотических клеток. При всех различиях между типами
эукариот методические подходы к культивированию клеток насекомых,
растений и млекопитающих имеют много общего. Сначала берут небольшой
кусочек ткани данного организма и обрабатывают его протеолитическими
ферментами, расщепляющими белки межклеточного материала (при работе с
растительными клетками добавляют специальные ферменты, разрушающие
клеточную стенку). Высвободившиеся клетки помещают в сложную
питательную среду, содержащую аминокислоты, антибиотики, витамины,
соли,
глюкозу и факторы роста. В этих условиях клетки делятся до тех пор, пока
на стенках емкости с культурой не образуется клеточный монослой. Если
после этого не перенести клетки в емкости со свежей питательной средой, то
рост
прекратится.
Обычно
удается
переносить
(перевивать,
субкультивировать) и поддерживать до 50-100 клеточных генераций
исходной (первичной) клеточной культуры, затем клетки начинают терять
способность к делению и гибнут. Культивируемые клетки сохраняют
некоторые свойства исходного клеточного материала, поэтому их можно
использовать для изучения биохимических свойств различных тканей.
42
Часто некоторые клетки перевиваемых первичных клеточных культур
претерпевают генетические изменения, в результате которых ускоряется их
рост. Культуры клеток, которые при этом приобретают селективные
преимущества, оказываются способными к неограниченному росту in vitro и
называются устойчивыми клеточными линиями. Одни клеточные линии
сохраняют основные биохимические свойства исходных клеток, другие нет.
У большинства клеток, способных к неограниченному росту, имеются
значительные хромосомные изменения, в частности отмечается увеличение
числа одних хромосом и потеря других. В молекулярной биотехнологии
устойчивые клеточные линии иногда используют для размножения вирусов и
для
выявления
белков,
последовательностями
ДНК.
которые
кодируются
Кроме
того,
они
клонированными
применяются
для
крупномасштабного производства вакцин и рекомбинантных белков.
МОДУЛЬ 2 «ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ
БИОТЕХНОЛОГИИ»
Лекция 3. Понятие гена, его структура и функция.
Ген - функциональная единица наследственного материала. Ген (от
греч. genos - род, происхождение) - участок молекулы геномной нуклеиновой
кислоты, характеризуемый специфической для него последовательностью
нуклеотидов, представляющий единицу функции, отличной от функций
других генов, и способный изменяться путем мутирования.
От
гипотетических
дискретных
наследственных
факторов
до
локализованных в хромосомах и молекулах ДНК генов. Долгое время ген
рассматривали как минимальную часть наследственного материала (генома),
обеспечивающую развитие определенного признака у организмов данного
вида. Однако каким образом функционирует ген, оставалось неясным.
43
Термин ген предложен В. Иогансеном в 1909 году, однако проникновение в
его сущность связано с именем Г. Менделя, который еще в 1860-х гг. ввел
термин «наследственный фактор» и на основе точных экспериментов сделал
гениальные обобщения относительно свойств и поведения наследственных
факторов при передаче информации от родителей потомкам, которые в
последующем легли в основу теории гена.
Фундаментальные свойства наследственных факторов - генов:
1) Наличие альтернативных наследственных факторов для развития каждого
конкретного
признака
организма
(в
современном
представлении
доминантный и рецессивный аллели гена).
2) Парность наследственных факторов, определяющих развитие признака (у
диплоидного организма). Существенный вывод: наследуются не признаки, а
от родителей к потомкам передаются вместе с гаметами гены. Из этих двух
положений был развит принцип аллелизма.
3) Относительное постоянство гена.
Мендель
не
имел
никаких
сведений
о
местонахождении
наследственных факторов в клетке, и тем более об их химической природе и
механизме влияния на признак, т. е. наследственный фактор в начале 20 века
выступал
как
конкретизация
условная
единица
представлений
о
наследственности.
гене
связана
с
Дальнейшая
работами
школы
американского биолога Т. Х. Моргана. Введя в генетические исследования
плодовую мушку-дрозофилу, удалось существенно увеличить разрешающую
способность генетического анализа и на основе синтеза генетических и
цитологических
представлений
доказать
существование
материальной
структуры наследственности - хромосом, в которых локализованы гены.
Доказательствами хромосомной локализации генов явились: открытие генов,
наследующихся
сцеплено
с
полом
(локализация
генов
в
половых
хромосомах, X или Y); сцепленное наследование группы признаков. Было
показано
наличие
определенного
числа
44
групп
сцепления
генов,
соответственно гаплоидному числу хромосом конкретного биологического
вида. Кроме того, были получены генетические и цитологические
доказательства кроссинговера - обмена генами между гомологичными
хромосомами, приводящего к рекомбинации генов. Величина генетической
рекомбинации (процент кроссинговера-перекреста) отражает расстояние
между генами одной группы сцепления: чем дальше отстоят друг от друга
гены, тем больше процент кроссинговера. Таким образом, было доказано, что
гены в хромосоме располагаются в линейном порядке, и каждый ген имеет
свое определенное местоположение - локус. Соответственно открылась
возможность построения плана взаимного расположения в хромосоме
известных генов с указанием относительных расстояний между ними,
выраженных
в
процентах
перекреста
(генетические
карты)
и
идентифицировать местоположение гена в хромосоме (цитологические
карты). В 1945 г. Дж. Бидлом и Э. Татумом была сформулирована гипотеза,
которую можно выразить формулой «Один ген - один фермент». Согласно
этой гипотезе, каждая стадия метаболического процесса, приводящая к
образованию в организме (клетке) какого-то продукта, катализируется
белком-ферментом, за синтез которого отвечает один ген. Позднее было
показано, что многие белки имеют четвертичную структуру, в образовании
которой принимают участие разные пептидные цепи. Поэтому формула,
отражающая связь между геном и признаком, была несколько преобразована:
«Один ген - один полипептид».
Изучение химической организации Э. Чаргаффом наследственного
материала и процесса реализации генетической информации привело к
формированию представления о гене как о фрагменте молекулы ДНК,
транскрибирующемся
в
виде
молекулы
РНК,
которая
кодирует
аминокислотную последовательность пептида или имеет самостоятельное
значение (тРНК и рРНК). Также ценные сведения о структуре ДНК дали
результаты рентгеноструктурного анализа. Рентгеновские лучи, проходя
45
через кристалл ДНК, претерпевают дифракцию, т.е. отклоняются в
определенных направлениях. Степень и характер отклонения зависят от
структуры самой молекулы. Анализ дифракционных рентгенограмм привел к
заключению, что азотистые основания уложены на подобие стопки тарелок.
Рентгенограммы позволили выявить в ДНК 3 главных периода: 0,34, 2 и 3,4,
которые оказались размерами в модели ДНК, предложенной Дж.Уотсоном и
Ф.Криком. 0,34 нм - расстояние между последовательными нуклеотидами, 2
нм - толщина цепи, 3,4 нм - расстояние между последовательными витками
спирали. В конце двадцатых годов советские генетики А. С. Серебровский и
Н. П. Дубинин экспериментально показали, что ген не является единицей
мутации, что он имеет сложную структуру: состоит из нескольких
субъединиц, способных самостоятельно мутировать (ступенчатый аллелизм,
или центровая теория гена). Весь ген может состоять из отдельных центров,
трансгенов, каждый из которых несет сходную функцию. Мутация может
нарушать деятельность одного из трансгенов, не затрагивая других.
Несколько позже идея о сложном строении гена была подкреплена
экспериментами по внутригенному кроссинговеру на дрозофиле по локусам
lozenge, white и др. (работы Э. Льюиса, М. Грина и др.). Таким образом, к
1950 году ген представлялся как участок хромосомы, контролирующий
развитие определенного признака, имеющий определенную линейную
протяженность и способный мутировать в разных участках и быть
разделенным кроссинговером. Ген комплексен, так как его отдельные
участки могут различаться по функциям, и в их совместной деятельности
существует определенная субординация.
Структура
генов. Ген представляет собой последовательность
нуклеотидов ДНК размером от нескольких сотен до миллиона пар
нуклеотидов, в которых закодирована генетическая информация о первичной
структуре белка (число и последовательность аминокислот). Для регулярного
правильного считывания информации в гене должны присутствовать: кодон
46
инициации, множество смысловых кодонов и кодон терминации. Три подряд
расположенных
нуклеотида
представляют
собой
кодон,
который
и
определяет, какая аминокислота будет располагаться в данной позиции в
белке. Например, в молекуле ДНК последовательность оснований ТАС
является кодоном для аминокислоты метионина, а последовательность ТТТ
кодирует фенилаланин. В молекуле иРНК вместо тимина (Т) присутствует
основание урацил (У). Таблица генетического кода во всех руководствах
представлена именно символами иРНК. Из 64 возможных кодонов
смысловыми являются 61, а три триплета -- УАА, УАГ, УГА -- не кодируют
аминокислоты и поэтому были названы бессмысленными, однако на самом
деле они представляют собой знаки терминации трансляции.
Для прокариот характерна относительно простая структура генов. Так,
структурный ген бактерии, фага или вируса, как правило, контролирует одну
ферментативную реакцию. Специфичным для прокариот является оперонная
система организации нескольких генов. Гены одного оперона (участка
генетического материала, состоящего из 1, 2 и более сцепленных
структурных генов, которые кодируют белки (ферменты), осуществляющие
последовательные этапы биосинтеза какого-либо метаболита; в оперон
эукариот входит, как правило, 1 структурный ген; оперон содержит
регуляторные элементы) расположены в кольцевой хромосоме бактерии
рядом и контролируют ферменты, осуществляющие последовательные или
близкие реакции синтеза (лактозный, гистидиновый и др. опероны).
Структура генов у бактеориофагов и вирусов в основном схожа с
бактериями, но более усложнена и сопряжена с геномом хозяев. Например, у
фагов и вирусов обнаружено перекрывание генов, а полная зависимость
вирусов эукариот от метаболизма клетки-хозяина привела к появлению
экзон-интронной структуры генов.
Эукариотические
гены,
в
отличие
от
бактериальных,
имеют
прерывистое мозаичное строение. Кодирующие последовательности (экзоны)
47
перемежаются с некодирующими (интронами). Экзон - участок гена,
несущий информацию о первичной структуре белка. В гене экзоны
разделены некодирующими участками - интронами. Интрон - участок гена,
не несущий информацию о первичной структуре белка и расположенный
между кодирующими участками -- экзонами. В результате структурные гены
эукариот имеют более длинную нуклеотидную последовательность, чем
соответствующая зрелая иРНК, последовательность нуклеотидов в которой
соответствует экзонам. В процессе транскрипции информация о гене
списывается с ДНК на промежуточную иРНК, состоящую из экзонов и
интронов. Затем специфические ферменты - рестриктазы - разрезают эту проиРНК
по
границам
экзон-интрон,
после
чего
экзонные
участки
ферментативно соединяются вместе, образуя зрелую иРНК (так называемый
сплайсинг). Количество интронов может варьировать в разных генах от нуля
до многих десятков, а длина - от нескольких пар оснований до нескольких
тысяч.
Ген может кодировать различные РНК-продукты путем изменения
инициирующих и терминирующих кодонов, а также альтернативного
сплайсинга. Альтернативная экспрессия гена осуществляется и путем
использования различных сочетаний экзонов в зрелой иРНК, причем
полипептиды, синтезированные на таких иРНК, будут различаться как по
количеству аминокислотных остатков, так и по их составу.
Наряду со структурными и регуляторными генами обнаружены участки
повторяющихся нуклеотидных последовательностей, функции которых
изучены недостаточно, а также мигрирующие элементы (мобильные гены),
способные перемещаться по геному. Найдены также так называемые
псевдогены у эукариот, которые представляют собой копии известных генов,
расположенные в других частях генома и лишенные интронов или
инактивированные мутациями.
48
Классификация генов. Накопленные знания о структуре, функциях,
характере взаимодействия, экспрессии, мутабильности и других свойствах
генов породили несколько вариантов классификации генов. По месту
локализации генов в структурах клетки различают расположенные в
хромосомах ядра ядерные гены и цитоплазматические гены, локализация
которых связана с хлоропластами и митохондриями.
По
функциональному
характеризующиеся
значению
уникальными
различают
структурные
последовательностями
гены,
нуклеотидов,
кодирующих свои белковые продукты, которые можно идентифицировать с
помощью мутаций, нарушающих функцию белка, и регуляторные гены -последовательности нуклеотидов, не кодирующие специфические белки, а
осуществляющие регуляцию действия гена (ингибирование, повышение
активности и др.).
По влиянию на физиологические процессы в клетке различают
летальные, условно летальные, супервитальные гены, гены-мутаторы, геныантимутаторы и др. Следует отметить, что любые биохимические и
биологические процессы в организме находятся под генным контролем. Так,
деление клеток (митоз, мейоз) контролируется несколькими десятками генов;
группы
генов
осуществляют
контроль
восстановления
генетических
повреждений ДНК (репарация). Онкогены и гены-супрессоры опухолей
участвуют в процессах нормального деления клеток. Индивидуальное
развитие организма (онтогенез) контролируется многими сотнями генов.
Мутации в генах приводят к измененному синтезу белковых продуктов и
нарушению биохимических или физиологических процессов. Гомеозисные
мутации у дрозофилы позволили открыть существование генов, нормальной
функцией которых является выбор или поддержание определенного пути
эмбрионального развития, по которому следуют клетки. Каждый путь
развития характеризуется экспрессией определенного набора генов, действие
которых приводит к появлению конечного результата: глаза, голова грудь,
49
брюшко, крыло, ноги и т. д. Исследования генов комплекса bithorax
дрозофилы американским генетиком Льюисом показали, что это гигантский
кластер тесно сцепленных генов, функция которых необходима для
нормальной сегментации груди (thorax) и брюшка (abdomen). Подобные гены
получили название гомеобоксных. Гомеобоксные гены расположены в ДНК
группами и проявляют свое действие строго последовательно. Такие гены
обнаружены и у млекопитающих, и они имеют высокую гомологию
(сходство).
Функции генов. В процессе реализации наследственной информации,
заключенной в гене, проявляется целый ряд его свойств. Определяя
возможность развития отдельного качества, присущего данной клетке или
организму, ген характеризуется дискретностью действия (от лат. discretus -разделенный,
прерывистый),
прерывностью
Дискретность
наследственного
материала,
(интроны
предположение
и
экзоны).
о
которой
высказал еще Г. Мендель, подразумевает делимость его на части,
являющиеся элементарными единицами, - гены. В настоящее время ген
рассматривают как единицу генетической функции. Он представляет собой
минимальное количество наследственного материала, которое необходимо
для синтеза тРНК, рРНК или полипептида с определенными свойствами. Ген
несет ответственность за формирование и передачу по наследству отдельного
признака или свойства клеток, организмов данного вида. Кроме того,
изменение структуры гена, возникающее в разных его участках, в конечном
итоге приводит к изменению соответствующего элементарного признака.
Ввиду того что в гене заключается информация об аминокислотной
последовательности определенного полипептида, его действие является
специфичным. Однако в некоторых случаях одна и та же нуклеотидная
последовательность может детерминировать синтез не одного, а нескольких
полипептидов. Это наблюдается в случае альтернативного сплайсинга у
эукариот и при перекрывании генов у фагов и прокариот. Очевидно, такую
50
способность следует оценить как множественное, или плейотропное,
действие гена (хотя традиционно под плейотропным действием гена принято
понимать участие его продукта - полипептида - в разных биохимических
процессах, имеющих отношение к формированию различных сложных
признаков).
Лекция 4. Реализация генетической информации у живых
организмов.
Подавляющее большинство генов содержит в закодированном виде
информацию о синтезе белков. Белки — это биологические молекулы,
участвующие практически во всех процессах, протекающих в живых
системах. Они служат катализаторами разнообразных биохимических
реакции, осуществляют транспорт веществ внутри клеток и между клетками,
регулируют проницаемость клеточных мембран, из них строятся различные
структурные элементы. Белки участвуют в осуществлении двигательных
функций, обеспечивают защиту от инфекций и токсинов, регулируют синтез
остальных генных продуктов. Основной структурной единицей белков
являются аминокислоты. Все аминокислоты имеют сходное химическое
строение, К центральному атому углерода (α-углерод) присоединены атом
водорода (Н), аминогруппа (NH3+), карбоксильная группа (СОО—) и R-группа
(боковая цепь). Существует 20 разных боковых групп и соответственно 20
аминокислот. Например, в аминокислоте аланине R-группой является
метальная группа (СН3). Соединяясь друг с другом пептидными связями,
аминокислоты образуют полипептидную цепь. Пептидная связь образуется
между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой.
Первая аминокислота белковой молекулы имеет свободную аминогруппу (Nконец), а последняя — свободную карбоксильную группу (С-конец).
51
Длина белковых молекул варьирует от 40 до более 1000 аминокислотных
остатков, при этом в зависимости от их последовательности и от
аминокислотного состава молекулы белков принимают разную форму
(конфигурацию, конформацию). Многие функционально активные белки
состоят из двух и более полипептидных цепей (субъединиц), как
идентичных, так и несколько различающихся. Кроме того, многие белки,
выполняющие ключевые функции, представляют собой сложные белковые
комплексы, состоящие из множества разных субъединиц.
Важным «передаточным звеном» при переводе генетической информации
с языка нуклеотидов на язык аминокислот являются рибонуклеиновые
кислоты (РНК), которые синтезируются на определенных участках ДНК как
на матрицах в соответствии с их нуклеотидной последовательностью. РНК —
это линейная полинуклеотидная молекула, отличающаяся от ДНК в двух
отношениях. Во-первых, моносахаридом в РНК является рибоза, содержащая
не одну, а две гидроксильные группы; они связаны с 2'- и 3'-атомами
углерода. Во-вторых, одним из четырех оснований в РНК является урацил
(U),
занимающий
место
тимина.
Большинство
молекул
РНК
одноцепочечные, хотя часто в них имеются взаимнокомплементарные
участки, образующие двухцепочечные структуры — «шпильки». Спаривание
оснований происходит таким же образом, как и в ДНК, за исключением того,
что вместо пары А—Т образуются A—U.
Существуют
три
основных
типа
РНК:
информационная
(мРНК),
рибосомная (рРНК) и транспортная (тРНК). Все они играют важную роль в
процессе расшифровки генетической информации. Синтез РНК. на ДНКматрице называется транскрипцией. У большинства прокариот транскрипция
всех РНК осуществляется с помощью одной и той же РНК-полимеразы. У
эукариот
мРНК,
рРНК
и
тРНК
транскрибируются
полимеразами.
52
разными
РНК-
Транскрипция. Транскрипция во многом сходна с репликацией.
Матрицей при синтезе РНК служит определенный участок одной из цепей
ДНК. РНК-полимераза копирует этот участок, последовательно соединяя
друг с другом с помощью 3'—5'-фосфодиэфирных связей рибонуклеотиды в
соответствии с правилом комплементарности (рис. 3.9). В ходе транскрипции
новосинтезированная молекула РНК отсоединяется от ДНК, и двойная
спираль ДНК восстанавливается. Чтобы обеспечить транскрипцию только
отдельных сегментов ДНК, должны существовать некие сигнальные
последовательности,
указывающие,
где
начинается
(инициируется)
транскрипция и где она останавливается (терминируется). Сигнал инициации
обычно располагается перед кодирующей последовательностью, а сигнал
терминации
-
вслед
транскрибируемому
за
ней.
Участок
гену,
ДНК,
называется
предшествующий
5'-фланкирующей
последовательностью, а расположенный за ним — 3'-фланкирующей.
С молекулярной точки зрения ген представляет собой специфическую
нуклеотидную последовательность, транскрибируемую в РНК. Подавляющее
большинство транскрибируемых последовательностей ДНК составляют так
называемые структурные гены, на которых синтезируются мРНК. Конечным
продуктом структурного гена является белок, У прокариот структурный ген
представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК. Транскрипция
начинается со связывания РНК-полимеразы с промотором, и далее
последовательно копируется весь структурный ген (кодирующая область) от
первого нуклеотида до последнего с образованием функциональной мРНК. У
эукариот большинство структурных генов состоит из нескольких дискретных
кодирующих областей (экзонов), разделенных некодирующими областями
(интронами). По завершении транскрипции эукариотического структурного
гена интроны вырезаются из первичного продукта транскрипции с помощью
ферментов, а экзоны сшиваются друг с другом «торец в торец» (сплайсинг) с
образованием функциональной мРНК. Обычно длина экзонов составляет от
53
150 до 200 нуклеотидов, а длина интронов варьирует от 40 до 10 000
нуклеотидов. Очень немногие эукариотические структурные гены вообще не
имеют
нитронов.
Иногда
сплайсинг
мРНК
может
проходить
по
альтернативному варианту. Например, в одной ткани функциональная мРНК
может образовываться в результате соединения всех экзонов первичного
транскрипта, а в другой какой-то экзон будет вырезан вместе с
фланкирующими его интронами и образуется другая функциональная мРНК.
Благодаря
альтернативному
сплайсингу
в
разных
тканях
могут
образовываться разные продукты одного и того же структурного гена.
В активно функционирующей клетке примерно 3—5% суммарной РНК
приходится на долю мРНК, 90% - на долю рРНК и 4% — на долю тРНК.
мРНК может быть представлена десятками различных типов молекул, а
рРНК — всего двумя типами. Более крупная рРНК образует с белками
рибонуклеопротеидный
комплекс,
называемый
большой
рибосомной
субъединицей, а рРНК меньшего размера комплекс, называемый малой
рибосомной
субъединицей.
Во
время
синтеза
белков
субъединицы
объединяются с образованием рибосомы. У эукариот обе рибосомные
субъединицы крупнее, чем у прокариот.
Помимо тысяч рибосом, в клетке, активно синтезирующей белки,
содержатся до 60 различных видов тРНК. тРНК — это линейная
одноцепочечная молекула длиной от 75 до 93 нуклеотидов. В ней имеется
несколько взаимнокомплементарных участков, спаривающихся между собой
, а вся молекула укладывается в пространстве с образованием структуры,
напоминающей букву L. С помощью специфических ферментов (аминоацилтРНК—синтетаз)
к
3'-концу
тРНК
присоединяется
соответствующая
аминокислота. Так, фермент аргинил-тРНК—синтетаза присоединяет к
молекуле тРНКArg аминокислоту аргинин. Для каждой из двадцати
аминокислот, из которых состоят все белки, существует по крайней мере
одна специфическая тРНК. На другом конце молекулы тРНК расположена
54
последовательность из трех нуклеотидов, которая называется антикодоном.
Она распознает специфический кодон в мРНК и определяет, какая именно
аминокислота будет присоединена к растущей полипептидной цепи.
Трансляция. Трансляция осуществляется при участии мРНК, разных
тРНК, «нагруженных» соответствующими аминокислотами, рибосом и
множества белковых факторов, обеспечивающих инициацию, элонгацию и
терминацию синтеза полипептидной цепи. Трансляция в прокариотических
клетках инициируется формилметиониновой тРНК, которая так и называется
— инициаторная тРНК. При участии белковых факторов антикодон 3'-UAC5' инициаторной тΡΗКfMet (fMet - модифицированный метионин, аминогруппа
которого
формилирована)
связывается
с
кодоном
5'-AUG-3'
мРНК,
образующей комплекс с малой рибосомной субъединицей. Никакая другая
тРНК соединиться с этим комплексом не может. В свою очередь связывание
мРНК с малой рибосомной субъединицей осуществляется посредством
образования нуклеотидных пар между последовательностью примерно из
восьми нуклеотидов (последовательность Шайна—Дальгарно), которая
расположена вблизи 5'-конца мРНК, и комплементарной 3'-концевой
последовательностью рРНК, связанной с малой рибосомной субъединицей. К
комплексу fМеt-тРНКfМеt-мРНК-малая субъединица присоединяется большая
субъединица, и образуется инициаторный комплекс (комплекс инициации).
У эукариот трансляция инициируется связыванием специфической
«нагруженной» инициаторной тРНК (Met-TPHKMet) и факторов инициации с
малой рибосомной субъединицей. Затем мРНК присоединяется своим 5'концом к комплексу тРНК—малая рибосомная субъединица, и комплекс
продвигается по мРНК до старт-кодона (AUG). Далее антикодон UAC
инициаторной Met-TPHKMet спаривается с кодоном AUG мРНК. К комплексу
присоединяется
большая
рибосомная
инициаторный комплекс.
55
субъединица,
и
образуется
Этапы элонгации и терминации у про- и эукариот во многом сходны.
Процесс элонгации включает образование пептидных связей между
соседними
аминокислотами,
при
этом
очередность
присоединяемых
аминокислот определяется очередностью кодонов в мРНК. Рассмотрим
процесс более подробно. После образования инициаторного комплекса кодон
в
молекуле
мРНК,
следующий
за
кодоном
спаривается
AUG,
с
комплементарным ему антикодоном соответствующей тРНК, определяя
таким образом, какая из нагруженных тРН К присоединится к рибосоме
(ненагруженные тРНК не связываются с рибосомами). Если вторым
триплетом в мРНК оказывается CUG, то следующей к рибосомному
комплексу присоединяется несущая лейцин тРНК с антикодоном 3'-GAC-5'.
Когда эта тРНК оказывается на месте, между карбоксильной группой
метионина и аминогруппой лейцина с помощью ферментативной активности,
присущей большой субъединице, образуется пептидная связь, при этом
лейцин остается связанным со своей тРНК, а метионин отсоединяется от
инициаторной тРНК, и последняя отделяется от рибосомы. Комплекс
метионин—лейцин— тРНКLeu—мРНК «протягивается» через рибосому
(транслокация), так что следующий кодон мРНК может связаться с
нагруженной тРНК, несущей соответствующий антикодон. Если третьим
кодоном мРНК является UUU, то следующей аминокислотой в растущей
полипептидной цепи будет фенилаланин; его доставит к рибосоме тРНК с
антикодоном ААА. Когда эта тРНК окажется на месте, между карбоксильной
группой лейцина и аминогруппой фенилаланина образуется пептидная связь.
тРНКLeu отделится от рибосомы, произойдет транслокация пептидил-тРНКPhe
(тРНК с присоединенной к ней растущей полипептидной цепью), и
следующий кодон мРНК сможет связаться с антикодоном соответствующей
нагруженной тРН К. Эти события — связывание нагруженной тРНК с мРНК
благодаря
образование
комплементарному
пептидной
связи,
спариванию
кодона
отсоединение
56
с
антикодоном,
«разгруженной»
тРНК,
транслокация — продолжаются до тех пор, пока не соединятся друг с другом
все аминокислоты, закодированные в мРНК. Трансляция происходит в
направлении 5'—3' со скоростью примерно 15 аминокислот в секунду. Когда
5'-конец мРНК высвобождается из рибосомного комплекса, он может
связаться с другим таким же комплексом, так что одна молекула мРНК
может одновременно транслироваться множеством рибосом.
Элонгация продолжается до тех пор, пока рибосома не дойдет до кодона
UAA, UAG или UGA (стоп-кодон, терминирующий кодон). В норме в
клетках отсутствуют тРНК с антикодонами, комплементарными сигналам
терминации. Их узнают белковые факторы освобождения (терминации). При
связывании фактора освобождения с рибосомой происходит гидролиз связи
между последней тРНК и полипептидом, свободная тРНК, полипептидная
цепь и мРНК отсоединяются от рибосомы. Рибосома диссоциирует на
субъединицы, которые могут вновь участвовать в трансляции.
После
трансляции
многие
полипептиды
подвергаются
различным
модификациям. У большинства из них отщепляется N-концевой метионин,
так что N-концевым остатком становится вторая аминокислота. У эукариот
происходит
так
называемый
процессинг
некоторых
белков,
когда
полипептидная цепь расщепляется в определенных сайтах с образованием
более коротких белковых молекул со специфическими функциями. В
некоторых случаях, особенно в эукариотических клетках, к определенным
аминокислотам ферментативным путем присоединяются фосфатные группы,
липиды, углеводы или другие низкомолекулярные соединения. В результате
этих химических модификаций образуются белки, выполняющие в клетке
специфические функции.
Генетический словарь состоит из 64 кодонов. Три из них — это стопкодоны, а один (AUG) -старт-кодон, кодирующий еще и аминокислоту
метионин. Когда кодон AUG находится не на 5'-конце молекулы мРНК, а в ее
внутренней области, то он распознается другой тРНК (Met-TPHKMet), к
57
которой
присоединен
триптофан
кодируется
немодифицированный
всего
одним
метионин.
кодоном
Аминокислота
(UGG),
остальные
аминокислоты, из которых состоят белки, — по крайней мере двумя, чаще
четырьмя, а иногда и шестью кодонами. Например, для лейцина существует
шесть кодонов: (UUA, UUG, CUU, CUC, CUA и CUG. Синонимичные
кодоны используются различными организмами с разной частотой. Из
четырех кодонов для глицина GGA используется в структурных генах
человека в 26% случаев, а в Escherichia coli — в 9%. Такая же ситуация
наблюдается и для стоп-кодонов. Так, у человека частота использования
кодонов UAA, UAG и UGA составляет 0,22, 0,17 и 0,61 соответственно, а у E.
coli — 0,62,0,09 и 0,30. Несмотря на все эти различия, генетический код у
всех организмов, за редким исключением, одинаков.
Регуляция транскрипции у бактерий. Все процессы, протекающие в
бактериальной клетке, — образование аминокислот, нуклеотидов и других
важных метаболитов, репликация, транскрипция, трансляция, катаболизм,
высвобождение энергии, реакции на внешние воздействия — требуют
участия белков. Однако энергетических ресурсов клетки не хватает для
одновременного осуществления транскрипции и трансляции (экспрессии)
всех структурных генов. Поэтому постоянно экспрессируются только те
гены, которые кодируют белки, поддерживающие основные клеточные
функции, а транскрипция остальных структурных генов регулируется. Когда
у клетки возникает потребность в каком-то белке (белках), то инициируется
(включается) транскрипция соответствующего структурного гена (генов), а
когда такая потребность исчезает, транскрипция выключается.
Часто у бактерий белки одного метаболического пути кодируются
смежными структурными генами. Нуклеотидная последовательность, в
которой закодировано более одного белка, называется опероном. Обычно
оперон находится под контролем единственного промотора, и при его
транскрипции образуется одна длинная молекула мРНК, кодирующая
58
несколько белков. При трансляции такой мРНК, в которой стоп-кодон
последовательности, кодирующей один белок, соседствует со старт-кодоном
гена следующего белка, синтезируется набор дискретных белков.
В большинстве структурных генов Е. coli имеются два сайта связывания
для
РНК-полимеразы.
Один
из
них
обычно
представляет
собой
нуклеотидную последовательность
ТАТААТ
АТАТТА (ТАТА-бокс, или бокс Прибнова), а другой TTGAC
AACTG.
ТАТА-бокс и последовательность TTGAC расположены за 10 (область —
10) и 35 (область —35) нуклеотидов до сайта инициации транскрипции
соответственно (нуклеотид +1). Обычно от участка между ТАТА-боксом и
нуклеотидом +1 во многом зависит, будет ли происходить транскрипция
данного оперона. В зависимости от способа регуляции транскрипции оперона
этот участок называется оператором или активатором.
Для включения и выключения разных оперонов в ходе эволюции
сформировалось множество регуляторных систем. Например, с операторной
областью может быть связан регуляторный белок, называемый репрессором;
он мешает перемещению РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК, и
транскрипция блокируется (рис. 3.20). Однако если с репрессором свяжется
некое низкомолекулярное вещество (эффектор), то его конформация
изменится таким образом, что его связывание с операторной областью станет
невозможным, и транскрипция возобновится. Обычно эффектор разрушается
клеточными ферментами. Когда его концентрация снижается, репрессор
связывается с операторным участком, и транскрипция вновь прекращается.
Операторный участок специфичен для каждого оперона, а эффектор
взаимодействует только с определенным репрессором.
59
В качестве иллюстрации рассмотрим такой пример. Предположим, что
клетка способна метаболизировать определенный сахар. Тогда синтез
ферментов, расщепляющих этот сахар, будет бесполезной тратой клеточных
ресурсов, если он отсутствует в среде. С другой стороны, если этот сахар
имеется в достаточном количестве и является единственным источником
углерода, то ферменты, отвечающие за его утилизацию клеткой, становятся
совершенно необходимыми. В этом случае сахар действует как эффектор,
препятствуя связыванию репрессора с операторным участком и таким
образом обеспечивая транскрипцию оперона и синтез ферментов.
При истощении запасов сахара в среде репрессор связывается с
операторным участком, и транскрипция оперона прекращается.
Нормальным состоянием других оперонов может быть состояние, при
котором осуществляется их транскрипция, поскольку репрессорный белок
неактивен.
В
этом
случае
связываясь
с
неактивным
специфический
репрессором,
эффектор
вызывает
(корепрессор),
в
нем
такие
конформационные изменения, которые обеспечивают связывание комплекса
с операторным участком, и транскрипция оперона выключается (рис. 3.21).
Сам по себе репрессор не способен связываться с оператором, поэтому при
уменьшении
концентрации
Регуляция
транскрипции
корепрессора транскрипция возобновляется.
с
помощью
репрессора
называется
отрицательной. Если же система регуляции направлена на повышение
скорости транскрипции, то она называется положительной Рассмотрим
вкратце этот процесс. Белок-активатор связывается с участком между ТАТАбоксом и сайтом инициации транскрипции. При этом он не только не
блокирует перемещение РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК, а напротив,
ускоряет его, действуя как своего рода «смазка». Активаторы специфичны
для определенных сайтов активации. Иногда с работающим активатором
связывается эффектор, переводящий его в неактивную форму; тогда скорость
транскрипции уменьшается (рис. 3.22). В других случаях эффектор,
60
напротив, активирует неработающий активатор. Чтобы понять детали
регуляции транскрипции у бактерий, необходимо провести тщательный
анализ мутаций, которые влияют на данную регуляторную систему, и
исследовать in vitro различные сайты связывания белков и ДНК.
Регуляция
транскрипции
у
эукариот.
Некий
набор
основных
структурных генов, обеспечивающих жизнедеятельность клетки, — генов
«домашнего хозяйства» — транскрибируется в большинстве активно
функционирующих
эукариотических
клеток.
В
отличие
от
этого
специфические гены, которые отвечают за уникальность тех или иных тканей
или органов, транскрибируются и транслируются только в определенных
клетках. Так, гены, кодирующие
- и ß-субъединицы гемоглобина взрослого
человека, экспрессируются исключительно в клетках — предшественниках
эритроцитов. Число разных мРНК, специфичных для разных клеток,
варьирует
от
единиц
до
десятков.
Способность
клеток
включать
(активировать) или выключать (ингибировать) структурные гены крайне
важна
для
поддержания
клеточной
специфичности
и
экономного
расходования энергетических ресурсов.
Для включения и выключения транскрипции различных эукариотических
структурных
генов
используется
множество
разнообразных
высокоспецифичных процессов. Но так или иначе регуляция транскрипции у
эукариот осуществляется с помощью специфических белков -- факторов
транскрипции. Многие из них связываются непосредственно с нуклеотидной
последовательностью длиной менее 10 п.н., называемой по-разному: боксом,
модулем, элементом инициации, регуляторным элементом. В отличие от
прокариот у эукариот опероны в большинстве своем отсутствуют, т. е.
каждый эукариотический структурньй ген имеет свой собственный набор
регуляторных элементов. Существенную роль в регуляции транскрипции у
эукариот, помимо опосредованной взаимодействием между ДНК и белками,
играют также белок-белковые взаимодействия.
61
Несмотря на индивидуальность набора регуляторных элементов у
структурных генов эукариот, каждый из них имеет промоторный участок
(ТАТА-бокс, или бокс Хогнесса) из восьми нуклеотидов, включающий
последовательность ТАТА; последовательность ССААТ (САТ-бокс); участок
из повторяющихся динуклеотидов GC (GC-бокс). Эти элементы находятся на
расстоянии 25, 75 и 90 п.н. от сайта инициации соответственно.
Транскрипция структурного гена эукариот начинается со связывания с
ТАТА-боксом фактора транскрипции HD (TFIID), который представляет
собой комплекс по крайней мере из 14 белков. Затем с TFIID и участками
ДНК, примыкающими к ТАТА-бок-су, связываются другие факторы
транскрипции, и, наконец, со всем этим транскрипционным комплексом
связывается РНК-полимераза II. Затем при участии дополнительных
факторов происходит инициация транскрипции в точке + 1. Ясно, что если
последовательность ТАТА отсутствует или существенно изменена, то
транскрипция
структурного
Идентифицированы
также
гена
факторы
становится
транскрипции,
невозможной.
специфичные
для
регуляторных элементов ССААТ и GC, но пока неясно, как ДНК-белковые
взаимодействия могут влиять в этом случае на эффективность транскрипции,
если элементы расположены на расстоянии более 75 п.н. от сайта инициации.
Кроме того, на расстоянии сотен и даже тысяч пар оснований от сайта
инициации находится так называемая энхансерная последовательность,
которая многократно повышает скорость транскрипции структурных генов.
По-видимому,
сближение
удаленных
регуляторных
элементов
и
соответствующего структурного гена происходит при укладке хромосомной
ДНК. Кроме того, факторы транскрипции, которые связываются с
определенными
энхансерами
и
регуляторными
элементами,
могут
образовывать цепочку, соединяющую удаленные друг от друга сайты.
Некоторые репрессированные (неэкспрессирующиеся) гены активируются
каскадом
событий,
который
запускается
62
каким-либо
специфическим
внеклеточным сигналом, например повышением температуры или синтезом
гормона. Гормон, поступив в кровоток, связывается с рецепторами
специфических клеток, облегчающими его проникновение в клетку.
Оказавшись в клетке, гормон вступает во взаимодействие с одним из
клеточных белков и изменяет его конформацию. В таком измененном
состоянии белок проникает в ядро и связывается со специфическим
регуляторным
элементом,
который
инициирует
транскрипцию
соответствующего гена.
Итак, регуляция транскрипции у эукариот -это очень сложный процесс.
Структурный ген может иметь множество регуляторных элементов, которые
активируются специфическими сигналами в клетках разного типа в разное
время клеточного цикла. Однако некоторые структурные гены находятся под
контролем уникального фактора транскрипции. Специфические белки могут
взаимодействовать
с
определенными
регуляторными
элементами
и
блокировать транскрипцию или связываться со всем транскрипционным
комплексом еще до инициации транскрипции или во время элонгации.
МОДУЛЬ 3 «ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ»
Лекция 5. История и инструменты генной инженерии.
15 октября 1980 г. на Нью-Йоркской фондовой бирже произошло
знаменательное событие: уже через 20 минут после начала торгов стоимость
одной акции биотехнологической компании Genentech поднялась с 35 до 89
долларов. Это был рекордный для того времени скачок цен на акции
коммерческого предприятия. К моменту закрытия торгов в тот день цена
одной акции Genentech составляла 71,25 доллара, а стоимость всех 528 тысяч
акций была столь баснословно высока, что мелкие инвесторы, собиравшиеся
приобрести небольшой пакет акций, не имели никаких шансов.
63
По-видимому, это был первый случай в истории, когда о начале великой
технологической революции возвестил биржевой колокол. В 1980 г., когда
фирма Genentech впервые предложила обществу свои акции, это была
небольшая компания в Калифорнии, в течение четырех лет успешно
работавшая над проблемой получения рекомбинантных ДНК. За два года до
этого
ученым
компании
удалось
выделить
фрагменты
гена
(последовательности ДНК), кодирующие человеческий инсулин, и перенести
их
в
генетические
элементы
(клонирующие
векторы),
способные
реплицироваться в клетках обычной кишечной палочки (Escherichia coli).
Эти бактериальные клетки работали как биологические фабрики по
производству человеческого инсулина, который после соответствующей
очистки мог использоваться как лекарственный препарат для больных
диабетом, дающих аллергическую реакцию на свиной инсулин. Еще десять
лет назад такое развитие событий представлялось нереальным, но сегодня все
это стало вполне привычным.
Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в
разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих
лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже
предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году
Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной
информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное
изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и
Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято
считать годом рождения молекулярной биологии.
На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а
к
концу
60-х
годов
его
универсальность
была
подтверждена
экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики,
объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны
методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул
64
ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в
биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию
соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов,
катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии
методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.
Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на
три этапа.
Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности
получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются
получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана
возможность
создания
рекомбинантных
молекул
с
использованием
исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их
жизнеспособность, стабильность и функционирование.
Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных
молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными
плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.
Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК
(ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в
генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом,
животных. Формально датой рождения генетической инженерии следует
считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х.
Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую
фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.
Возможности
генной
инженерии.
Важной
составной
частью
биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х
годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии
преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для
масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально
анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве
65
лекарственных средств.
В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком
таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин
получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость
его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина
требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит
200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для
широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании
"Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном
штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей
А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными
связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что
он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает
побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности
от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен
синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной
транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного
проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы
экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров
культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что
эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной
железы свиньи или коровы.
Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом.
Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если
вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год
ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его
получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в
пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом,
доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон,
66
получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно
развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала
технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был
лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был
получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во
Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в
СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae
(дрожжи),
так
и
культуру
фибробластов
или
трансформированных
лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и
дешевые вакцины.
На
технологии
рекомбинантных
ДНК
основано
получение
высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию
генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены,
обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы).
ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный
подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком
подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка,
модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную
форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется,
несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок.
Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные
заболевания.
Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть
получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и
передающие его потомками. Генетическая трансформация животных
позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в
регуляции активности других генов, так и при различных патологических
процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных,
67
устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с
полезными для человека признаками.
Стратегия переноса функциональной единицы наследственности (гена) из
одного организма в другой была разработана американскими учеными
Стэнли Коэном и Гербертом Бойером в 1973 г. И Коэну, и Бойеру, и многим
другим было ясно, что технология рекомбинантных ДНК предоставляет
огромные возможности. Как в то время отмечал Коэн, «...есть надежда, что
удастся ввести в [бактериальную клетку] E. coli гены, ассоциированные с
метаболическими или синтетическими функциями, присущими другим
биологическим видам, например
гены
фотосинтеза или
продукции
антибиотиков».
Однако одним из первых откликов научного мира на создание новой
технологии был мораторий на некоторые биотехнологические эксперименты,
считавшиеся потенциально опасными. Запрет на собственные исследования
был провозглашен группой молекулярных биологов, включая Коэна и
Бойера. Они считали, что объединение генов, происходящих из двух разных
организмов, может случайно привести к созданию нового организма с
нежелательными и опасными свойствами. Прошло несколько лет, у ученых
накопился опыт работы с новой технологией, были согласованы инструкции
по обеспечению безопасности этих работ, и страсти постепенно улеглись.
Временное
прекращение
реализации
некоторых
научных
проектов,
связанных с рекомбинантными ДНК, не уменьшило энтузиазма генных
инженеров. Новая технология продолжает привлекать беспрецедентное
внимание как со стороны общественности, так и со стороны ученых.
Весть о клонировании генов, осуществленном Коэном и Бойером,
облетела весь мир. Многие исследователи немедленно оценили все
преимущества этой стратегии и создали огромное количество методик,
следуя которым, можно было с высокой эффективностью и относительно
просто идентифицировать, выделять, охарактеризовывать и использовать
68
гены. Эти технологические разработки внесли значительный вклад в
развитие практически всех биологических дисциплин, включая науку о
поведении
животных, биологию развития, молекулярную
эволюцию,
клеточную биологию и генетику человека, однако наиболее глубокие
изменения произошли в области биотехнологии.
Методы генной инженерии. Генетическая инженерия - получение новых
комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки
манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных
конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их
включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о
направленном,
по
заранее
молекулярных
генетических
заданной
систем
вне
программе
конструировании
организма
с
последующим
введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся
составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и
сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и
физиологические свойства.
Цель
прикладной
генетической
инженерии
заключается
в
конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при
внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства,
полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически
значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород
животных с определёнными ценными для человека признаками.
Методы
паспортизацию,
генной
инженерии
позволяют
диагностировать
провести
генетическую
генетические
заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных
заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
69
1.
специфическое
расщепление
ДНК
рестрицирующими
нуклеазами,
ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
2.
быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК,
что
позволяет
определить
границы
гена
и
аминокислотную
последовательность, кодируемую им;
3.
конструирование рекомбинантной ДНК;
4.
гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические
последовательности
РНК
или
ДНК
с
большей
точностью
чувствительностью,
основанную
на
их
способности
и
связывать
комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;
5.
клонирование
ДНК:
амплификация
in
vitro
с
помощью
цепной
полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную
клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент
в миллионах копий;
6.
введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК,
можно разделить на несколько групп:
- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
-ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК
(обратные транскриптазы);
- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов
фрагментов ДНК.
Рестриктазы.
Рестриктазы
(рестрицирующие
эндонуклеазы,
эндонуклеазы рестрикции) - это ферменты, узнающие и атакующие
определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты
рестрикции).
Еще в 1953 году было обнаружено, что ДНК определенного штамма E. coli,
введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В - в клетки
70
штамма С) не проявляет, как правило, генетической активности, так как
быстро расщепляется на мелкие фрагменты.
В 1966 году было показано, что это явление связано со специфической
модификацией хозяйской ДНК - она содержит несколько метилированных
оснований,
отсутствующих
в
немодифицированной
ДНК,
причем
метилирование (добавление к основанию метильной группы) происходит уже
после
завершения
репликации.
Бактерия
способна
отличить
свою
собственную ДНК от любой вторгающейся «чужеродной» именно по типу ее
модификации. За «метку» отвечают метилирующие ферменты модификации,
так
называемые
ДНК-метилазы.
Различие
в
модификации
делает
чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрицирующих ферментов,
которые узнают отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах.
Системы рестрикции и модификации широко распространены у бактерий;
их существование играет важную роль в защите резидентной ДНК от
загрязнения последовательностями чужеродного происхождения.
Рестриктаза, которая расщепляла неметилированную ДНК была выделена
в 1968 г. Мезельсоном и Юанем. Этот фермент был высокоспецифичен по
отношению к определенной последовательности ДНК, но расщеплял
молекулы неспецифически, в другом месте, на некотором удалении от
участка узнавания. Вскоре, в 1970 г. Смит и Вилькокс выделили из
Haemophilus influenzae первую рестриктазу, которая расщепляла строго
определенную последовательность ДНК (Hind III). Поскольку разные
бактерии по-разному метят свою ДНК, то и рестриктазы должны узнавать
разные последовательности. И действительно, с тех пор выделены
рестриктазы, узнающие более 150 сайтов рестрикции (мест расщепления
ДНК).
Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на
несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагменте! коротких
одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные
71
пары оснований с любым другим одноцепо- чечным участком, полученным с
помощью того же фермента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко
соединить два любы;, фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент
ДНК (любого происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазмиды
или бактериального вируса.
Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответствующего
участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную
карту,
отражающую
расположение
определенной
последовательности
нуклеотидов в данном участке. Сравнением таких карт можно оценить
степень гомологии межд\ отдельными генами (участками) без определения
их нуклеотидной последовательности. Рестрикционные карты важны для
клонирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических задач.
В качестве мишеней (мест узнавания) часто выступают палиндромы из 4-6
пар оснований - сайты рестрикции. Точки узнавания рестриктазами
симметричны относительно поворота на 180оС, то есть последовательность
нуклеотидов слева направо в одной нити такая же, как справа налево в
другой. Симметрия подразумевает, что те из них, которые должны быть
метилированы, встречаются на обеих цепях ДНК. В результате сайт-мишень
может
быть
полностью
метилирован
(обе
цепи
модифицированы),
полуметилирован (только одна цепь метилирована) или не метилирован.
Полностью метилированный сайт не подвержен ни рестрикции, ни
модификации.
Полуметилированный
сайт
не
узнается
ферментом
рестрикции, но может быть превращен с помощью метилазы в полностью
метилированный. У бактерий метилирование, как правило, связано с
сохранением имеющегося состояния модификации. Репликация полностью
метилированной ДНК ведет к образованию полуметилированной ДНК.
Вероятно узнавание полуметилированных сайтов представляет собой
обычный этап функционирования метилазы in vivo.
Неметилированный сайт-мишень представляет собой субстрат либо для
72
рестрикции, либо для модификации in vitro. В клетке немодифицированная
ДНК с большей вероятностью рестрицируется. Реакция разрезания
осуществляется в две ступени. Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затем
рядом разрезается другая. В областях, прилегающих с каждой стороны к
сайту разрезания, может иметь место экзонуклеотическая деградация.
Происходит эффективный гидролиз АТФ, роль которого еще не выяснена.
Каким образом фермент узнает один сайт, а разрезает другой, достаточно
удаленный? Важно отметить, что белок никогда не отделяется от молекулы
ДНК, с которой он первоначально связался. Если фермент инкубировать со
смесью
модифицированной
и
немодифицированной
ДНК,
он
предпочтительно разрезает немодифицированную ДНК. Следовательно,
узнавая сайт связывания, белок не отделяется от неметилированной ДНК для
того, чтобы найти сайт разрезания.
Существуют две альтернативные модели, объясняющие взаимосвязь
между сайтами узнавания и разрезания: в соответствии с одной из них
движется фермент, согласно другой модели, перемещается ДНК. Если
движется фермент, то его перемещение вдоль ДНК будет продолжаться до
тех пор, пока он не сделает выбор сайта разрезания. Если же движется ДНК,
то
фермент
остается
прикрепленным
в
сайте
узнавания,
а
ДНК
протаскивается через второй сайт связывания на ферменте, и это
продолжается до тех пор, пока фермент не достигает области разрезания
(пока не охарактеризованной). Получены электронно-микроскопические
данные, свидетельствующие, что фермент вызывает образование петли в
ДНК и остается, по-видимому, связанным с сайтом узнавания после
разрезания; эти данные подтверждают вторую модель.
Полимеразы. Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с
сотрудниками в 1958 году из E. coli. ДНК-полимераза I E. coli (Pol I) не
связывается с молекулами двухцепочечной кольцевой ДНК. Однако, если
такие молекулы денатурировать и получить одноцепочечные формы, то с
73
последними полимераза связывается в количествах, пропорциональных
длине этих участков — примерно одна молекула на 300 нуклеотидных
остатков. Pol l связывается с одноцепочечными участками двойной спирали
ДНК, в местах одноцепочечных разрывов с З'-гидроксилом и 5'-фосфатом, а
также с концами двухцепочечных молекул ДНК.
Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи с молекулярной
массой 103 кДа и имеет 3-х доменную структуру. Каждый домен обладает
своей ферментативной активностью: 5’ - 3’ полимеразной, 3’ - 5’
экзонуклезной, 5’ - 3’ экзонуклеазной.
1. 5'— 3' полимеразная активность. Для реакции необходимо наличие
одноцепочечной ДНК-матрицы и комплементарного участку этой цепи
фрагмента — праймера (затравки) с З'-ОН концом.
2. 3'- 5' экзонуклеазная активность. Гидролизует одноцепочечную или
двухцепочечную ДНК с З'-ОН конца. 3'—5' нуклеаза расщепляет диэфирную
связь только в неспаренных участках ДНК. Известно, что при полимеразной
реакции с определенной частотой возможно включение в растущую цепь
некомплементарного нуклеотида. Однако полимераза не может присоединять
нуклеотид к неправильно спаренному концу, образовавшемуся при ее
участии. На помощь приходит 3'—5' экзонуклеаза, убирающая ошибочный
нуклеотид, на место которого затем присоединяется правильный нуклеотидпредшественник. 3'—5' экзонуклеолитическая активность проявляется в
направлении, обратном синтезу ДНК (см. рис. 34). Таким образом, 3'—5'
экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы играет важную роль в точности
полимеризации,
направляемой
матрицей.
Эффективность,
или
число
оборотов, данной экзонуклеазы в оптимальных условиях составляет 2% от
числа оборотов субъединицы с полимеразной активностью.
3.
5'—
3'
экзонуклеазная
активность.
Деградирует
одну
цепь
двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5'-конца. В отличие от 3'—5'
экзонуклеазы 5'—3' экзонуклеаза расщепляет диэфирную связь только в
74
спаренных участках двухцепочечной молекулы ДНК. Более того, в то
время как 3'—5' нуклеаза отщепляет одномоментно только один нуклеотид,
5'—3' нуклеаза может вырезать с 5'- конца олигонуклеотиды длиной до
десяти остатков (около 20% продуктов гидролиза): Скорость нуклеазного
отщепления увеличивается на порядок при одновременно протекающей
реакции полимеризации. При этом увеличивается относительное количество
олигонуклеотидов в продуктах гидролиза ДНК.
Такое сочетание ферментативных активностей позволяет ДНК-полимеразе
I E. coli играть активную роль в репарации повреждений ДНК in vivo. N концевой домен соединен с соседним петлей из аминокислотных остатков и
легко отделяется с помощью протеолитических ферментов. Оставшаяся часть
бифункциональна, так как состоит из полимеразы и 3’ - 5’ экзонуклезы. Она
названа фрагментом Кленова (по фамилии одного из авторов, описавших ее).
Фрагмент
Кленова
(Pol
IK)
обычно
используют
для
достройки
одноцепочечных 5'-концов на двухцепочечной ДНК, часто генерируемых
рестриктазами, до тупых; для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК,
а также для гидролиза одноцепочечных З'-концов на двухцепочечных
молекулах ДНК.
Обратная транскриптаза. Обратная транскриптаза используется для
транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК. При изучении
ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК,
было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус
проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в
хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о
существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на
РНК-матрице комплементарную ДНК. Усилия, направленные на выделение
такого фермента, увенчались успехом, и в 1970 г. Темин с Мизутани, а также
независимо от них Балтимор открыли искомый фермент в препарате
75
внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНКполимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза.
Наиболее детально изучена ревертаза ретровирусов птиц. Каждый вирион
содержит около 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит
из двух субъединиц — a (65 кДа) и b (95 кДа), присутствующих в
эквимолярном количестве. Обратная транскриптаза обладает, по крайней
мере, тремя ферментативными активностями:
1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и
ДНК;
2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;
3) ДНК-эндонуклеазной активностью.
Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а
эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном
клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на
РНК-, так и на ДНК-матрицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим
полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер).
Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК,
которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с
новосинтезированной цепью ДНК.
Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции
матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной
транскрипции
проводят
в
специально
подобранных
условиях
с
использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом
удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В
качестве праймера при обратной транскрипции поли (А)-содержащих мРНК
используют олигo (dT), а для молекул РНК, не имеющих З'-поли (А) концов,
— химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу
изучаемой РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и
76
разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют
синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы
образовывать на 3'-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные
шпильки, которые могут выполнять функции праймера.
Матрицей
служит
первая
цепь
кДНК.
Данная
реакция
может
катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано,
что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных
двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи
кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей
праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой
S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых
кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для
повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до
тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli.
Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие
векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для
дальнейших исследований.
Лигазы. В 1961 г. Мезельсон и Вейгл на примере фага l показали, что
рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединение молекул
ДНК. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании
фрагментов ДНК. В 1967 году такой фермент был найден и получил название
ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х
цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.
Иными словами, ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды,
образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы
в процессах репарации ДНК, в процессах репликации - при удвоении цепи
ДНК.
В генной инженерии используются 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по
потребностям в кофакторах и способу действия. ДНК-лигаза E. coli в
77
качестве кофактора использует дифосфопиридиннуклеотид, а лигаза фага Т4
- АТФ в присутствии Mg2+. Лигаза фага Т4 более универсальна, так как
помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию
воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она
используется чаще.
Терминальная трансфераза, поли-А – полимераза. Терминальная
трансфераза (концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза) была обнаружена
Боллумом в 1962 году в тимусе теленка. Субстратом терминальной
трансферазы при использовании в качестве кофактора ионов Mg2+ является
одноцепочечная ДНК с З'-ОН концом или двухцепочечная ДНК с
выступающим одноцепочечным З'-ОН концом. Если в качестве кофактора
используются Co2+, этот фермент может катализировать присоединение
дезоксинуклеотидов к 3’-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами.
При введении в реакцию, направляемую терминальной трансферазой,
лишь одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие
гомополимерные 1-цепочечные 3'-концы. Таким же образом можно
достроить
другим
молекулам
ДНК
гомополимерные
3'-концы,
комплементарные первым. Смешение полученных препаратов ДНК при
определенных условиях может приводить к формированию гибридных
молекул
ДНК.
Именно
дезоксинуклеотидилтрансферазы
в
с
1972
помощью
г.
был
выполнен
концевой
первый
эксперимент по рекомбинации молекул ДНК in vitro.
Поли (А) - полимераза E. coli была открыта Сиппелом в 1973 году. Она
катализирует присоединение к 3’-ОН концу одноцепочечных молекул РНК
поли (А) последовательностей. Применяется при подготовке молекул РНК к
копированию с них комплементарной ДНК для введения радиоактивной
метки в 3’-конец РНК.
Лекция 6. Понятие вектора в генной инженерии.
78
Существует несколько типов векторов:
Бактериальные плазмиды. Основная масса клеточной ДНК бактерий
содержится в хромосоме (в хромосоме E. coli, например, 4 млн. пар
нуклеотидов). Однако кроме хромосом бактерии содержат большое
количество очень маленьких кольцевых молекул ДНК плазмид длиной
несколько тысяч пар оснований (молекулярная масса от 1,5 до 300
мегадальтон, 1 МД = 1500 п.о). Такие мини-хромосомы называют
плазмидами.
Как правило, плазмиды имеют в своем составе гены устойчивости к
антибиотикам, ионам тяжелых металлов (R-плазмиды), а также гены,
контролирующие
катаболизм
некоторых
органических
соединений
(плазмиды биодеградации, или D-плазмиды). Поскольку эти гены находятся
в плазмидах, они представлены гораздо большим числом копий. Высокая
копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества
ферментов, химически нейтрализующих антибиотики или ксенобиотики, что
и обеспечивает устойчивость к последним. Плазмиды, по-видимому,
вездесущи, так как их выделяют из разных штаммов и видов бактерий, но не
являются обязательными компонентами генома, а в некоторых природных
штаммах плазмиды не обнаружены вообще.
Поскольку плазмидная ДНК значительно меньше хромосомной, ее
довольно легко выделить в чистом виде. В присутствии ионов кальция
плазмиды легко поглощаются бактериями-рецепиентами, даже если те их
никогда не содержали, и в клетках бактериального потомства можно
обнаружить много копий поглощенной плазмиды. Однако бактериальная
клетка обычно может содержать в своем составе плазмиды одного типа. Это
явление несовместимости плазмид. Существуют группы несовместимости –
Inc-группы (от английского incompatibility – несовместимость). В такой
группе может быть несколько плазмид, совместимых между собой, но не
79
совместимых с другими плазмидами. У этих плазмид сходны многие
признаки и часто значительна гомология ДНК.
Число копий плазмиды в клетке может существенно варьировать. Это
зависит от генетических особенностей как клетки, так и плазмиды.
Плазмиды, находящиеся "под ослабленным контролем", могут размножаться
до тех пор, пока их количество не достигнет 10-200 копий на клетку. Если же
плазмида находится "под строгим контролем", она реплицируется с той же
скоростью, что и главная хромосома. Такие плазмиды содержатся в клетке в
одной или в нескольких копиях. Естественно, что для клонирования
рекомбинантных ДНК стараются использовать плазмиды первого типа. Но
это не обязательно, так как плазмиды в присутствии хлорамфеникола могут
умножаться независимо от деления хромосомы, и количество копий
плазмиды может многократно увеличиваться.
Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR
322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из
E. coli. Эта плазмида содержит гены устойчивости к двум антибиотикам:
ампициллину и тетрациклину, причем в генах устойчивости к этим
антибиотикам имеются сайты рестрикции. Если фрагмент чужеродной ДНК
встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется.
Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из
этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к
данному антибиотику. Но при этом сохраняется устойчивость к другому
антибиотику. Таким образом вектор дает возможность детектировать только
те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду.
Вирусы. Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются
в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее
неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую. К таким относятся
ДНК-вирусы SV-40 и вирус полиомы. Внедрение некоторых опухолевых
РНК-вирусов ведет к отпочковыванию вирусных частиц от клетки без ее
80
лизиса. К таким вирусам относятся, например, ретровирусы (вирус саркомы
Рауса и СПИДа). Для бактериальных клеток в качестве вектора часто
используют бактериофаги.
Вирусы являются одними из главных кандидатов на роль векторов для
введения чужеродной ДНК. При вирусной инфекции каждая клетка может
получить большое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать
так, чтобы она находилась под контролем сильных вирусных промоторов,
что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более
доступны для исследования.
В последние годы сконструированы многочисленные "челночные" векторы
и их рекомбинантные производные, способные к репликации в животной и
бактериальной клетке и эффективно экспрессирующие клонируемый ген в
животной клетке. Наиболее распространенные векторы состоят из плазмиды
рВR322 и интактного раннего района транскрипции ДНК SV40, а нужный
ген
встраивается
под
контроль
промотора
поздних
генов
или
дополнительного раннего промотора. Например, в ДНК SV40 был встроен
ген β-глобина кролика, который экспрессировался в линии клеток обезьяны,
зараженных рекомбинантным вирусом: в клетках синтезировались и мРНК
гена глобина, и сам белок.
Вирус должен быть жизнеспособным после рекомбинирования его ДНК.
Легче всего вирусы вводятся в бактерии. Недостатком вирусов как векторов
является их небольшая емкость. Кроме того, вирусы заражают небольшой
круг хозяев.
Существуют гибридные вектора, содержащие ДНК фага и плазмиды. К
ним относятся, например, космиды и фазмиды.
Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ,
обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую
частицу. Фаговые частицы обеспечивают хорошее проникновение гибридной
81
ДНК в клетку (путем инъекции), после чего происходит замыкание ДНК в
кольцо по липким концам и репликация ее по плазмидному типу.
Фазмиды также являются гибридами между фагом и плазмидой. После
встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в
других – как плазмиды.
Вироиды. Из всех известных в настоящее время инфекционных агентов
имеют ранг наиболее странных. Известно, что самые мелкие вирусы,
способные
к
независимой
репликации,
имеют
размеры
генома,
соответствующие молекулярной массе 1 М, то есть около 1500 тыс. пар
оснований.
Это
информации,
считали
минимальным
необходимой
для
количеством
кодирования
генетической
вирусоспецифических
продуктов и подавления метаболизма хозяйской клетки.
Однако в 1971 году были открыты инфекционные агенты, представляют
собой очень короткую цепь 1 нитевой ковалентно связанной кольцевой РНК,
состоящую из 270-300 нуклеотидов (на три порядка меньше самых
минимальных вирусов), не заключенную в белковую оболочку. Это
необычные патогены - самые простые и самые маленькие из всех известных.
Каким
образом
вироиды
продуцируют
симптомы
болезни
в
инфицированных растениях, не известно до сих пор. Установлено, что они
реплицируются
ферментами
клетки-хозяина,
не
транслируются
в
видоспецифичные полипептиды, интегрируются в геном клетки-хозяина.
Вироиды заражают персиситентно (не происходит выздоровления).
Вызывают системную инфекцию, т.е. мигрируют из сайта внедрения в другие
части растений, переносятся механически или через клеточный сок, через
семена, пыльцу. Вироиды также связаны с ядерными фракциями растений и
могут размножаться в ядрах.
При работе с вироидами получают 1-нитевую ДНК- копию РНК и
достраивают комплементарную нить для получения 2-нитевой ДНК вироида.
Такая 2-цепочечная ДНК вcтраивается в плазмиду и передается в клетки E.
82
coli для клонирования. Считывание гена начинается с промотора, который
узнается РНК-полимеразой, отвечающей за транскрипцию ДНК в матрицу
РНК. Обычно это фрагмент ДНК из 41-44 пар оснований. Ген считывается
слева направо, от 5’ к 3’ концу гена и заканчивается в терминальной области
гена. За промотором начинается стартовый сайт транскрипции, за которым
следует смысловая часть гена. Промоторная область гена содержит
определенные
короткие
сочетания
нуклеотидов,
характерные
для
бактериальных генов, или для генов высших организмов. Такие сочетания
служат
сигналами
для
РНК-полимеразы,
которая
присоединяется
к
промоторной части гена и начинает его считывать.
Однонитевые и двунитевые ДНК способны инициировать репликацию
вироида в механически инокулированных растениях табака. Энзиматически
in vitro синтезированы также РНК вироидов, высокоинфекционные для
растений. Векторные системы могут быть разработаны на основе самих РНК,
на
основе
вироидоспецифичных
ДНК,
а
также
в
комбинации
вироидоспецифичных ДНК с Ti-плазмидами. Вироиды инфицируют своих
хозяев в течение всего их жизненного цикла, поэтому в случае использования
вироидных векторных систем можно ожидать постоянной экспрессии
чужеродного гена в растении.
Плазмиды агробактерий. В качестве векторов могут использоваться
опухолеобразующие плазмиды бактерий. Виды Agrobacterium эволюционно
родственны клубеньковым бактериям, относящимся к роду Rhizobium, и
имеют много общих с ними черт. Однако характер взаимодействия
агробактерий с растением имеет своеобразные особенности.
Взаимодействие видов Agrobacterium с растениями представляет особый
интерес, так как при этом виде паразитизма один из партнеров специфически
видоизменяет свойства хозяина, встраивая свои гены в его геном. Кроме
того, это служит уникальным примером миграции ДНК прокариот в
эукариотическую клетку. ДНК митохондрий и хлоропластов Хлоропласты и
83
митохондрии содержат полноценную генетическую систему, то есть все
компоненты, необходимые для экспрессии генетической информации: ДНК,
ДНК-полимеразы,
РНК-полимеразы
и
белоксинтезирующий
аппарат
(рибосомы, т-РНК, аминоацил-тРНК-синтетазы).
Хлоропластная и митохондриальная ДНК также привлекают внимание
ученых в качестве возможных векторов для переноса генов в клетку.
Структурная
организация
этих
клеточных
субгеномов
существенно
различается.
Хлоропласты и другие пластиды обладают одинаковой генетической
информацией, так называемым пластомом. У высших растений он
представляет собой замкнутую молекулу ДНК длиной 150 т. н. п.,
достаточную для кодирования примерно 100 белков. Для синтеза пластид
необходимо значительно больше белков. Остальные белки кодируются
ядром, синтезируются в цитоплазме и поступают в хлоропласты. Некоторые
важнейшие белки хлоропластов состоят из нескольких субъединиц, часть из
них синтезируется на рибосомах цитоплазмы и транспортируется в
хлоропласт,
где
они
объединяются
с
другими
полипептидами,
закодированными в самом хлоропласте и там же синтезируемыми. Таким
образом, для биосинтеза функционально активного хлоропласта требуется
согласованная экспрессия генома и пластома.
Различные типы пластид содержат неодинаковые количества идентичных
копий пластома: от 10 – 20 копий в пластидах корней и зрелых хлоропластах
до сотен копий в молодых хлоропластах картофеля. Такой уровень
амплификации позволяет надеяться на надежную экспрессию чужеродной
ДНК при использовании их в качестве векторов в генноинженерных
экспериментах. Кроме того, гены рибосомальной РНК пластид и большой
субъединицы РБФК кодируются геномом хлоропластов. Возможно, введение
сильных промоторов в эти гены и дополнительная их модификация
84
существенно повлияют на фотосинтетическую активность растительной
ткани.
Гены растений также способны к экспрессии в клетках Е. coli. Это гены
большой
субъединцы
РБФК.
Преимущество
хлоропластных
генов
заключается в том, что их экспрессия к клетках кишечной палочки может
быть
достигнута
путем
простого
объединения
транскрибируемых
последовательностей, т.к. в ДНК хлоропластов и бактерий до начала
стартовых кодонов трансляции расположена одинаковая нуклеотидная
последовательность. Это дает возможность синтезировать растительные
экономически важные полипептиды с помощью клеток прокариот.
В
отличие
от
хлоропластной, ДНК
митохондрий характеризуются
исключительным разнообразием и их величина колеблется от 200 до 2400 т.
н. п.. Однако никакой корреляции между размером митохондриального
генома и числом белковых продуктов, синтезируемых изолированными
митохондриями, не наблюдается. Это явление, а также большие размеры
митохондриальной ДНК, по-видимому, можно объяснить присутствием ДНК,
бесполезной для функционирования митохондрий.
В
составе
митохондриальной
ДНК
имеются
структурные
гены,
кодирующие полипептиды, гены рибосомных и транспортных РНК. Однако
большая часть белков митохондрий, как и хлоропластов, кодируется
ядерными генами. Но если геном хлоропластов представлен гомогенной
популяцией крупных кольцевых молекул, то в митохондриях содержится
несколько классов кольцевых молекул, не все функции которых еще ясны.
Митохондриальный геном животных организмов намного меньше, 15 – 19
т. н. п., и более консервативен по структуре. Гены митохондрий кодируют 2
группы признаков – работу дыхательных систем и устойчивость к
антибиотикам и другим ядам. В митохондриальном геноме растений есть
также гены, отвечающие за признак мужской стерильности цитоплазмы.
85
Транспозоны. Транспозоны - сегменты ДНК, которые контролируют
собственную транспозицию (перемещение) из одного сайта ДНК в другой
путем вырезания из исходного сайта и внедрения в новый сайт хромосомы
или плазмиды. Впервые были открыты в 40-х годах американской ученой
Барбарой Мак-Клинток у кукурузы. Эти гены, индентифицированные по их
способности подавлять экспрессию других генов кукурузы, находящихся
рядом с ними, не имели фиксированного положения в хромосоме. Они как бы
передвигались по всему геному растения. Регуляторные элементы могли
встраиваться и выщепляться, причем после их выщепления зачастую
начинали функционировать ранее молчащие гены.
Оказалось, что гены, ассоциированные с регуляторными элементами,
становились нестабильными и часто мутировали из-за нестабильности самих
этих элементов. В течение многих лет кукуруза оставалась единственной
системой, в которой обнаруживались такие подвижные генетические
элементы. Сейчас - и у бактерий, дрозофил и других организмов.
Механизм перемещения фрагментов ДНК по геному до конца не выяснен.
ДНК
переносится
ферментом
транспозазой.
Фермент
кодируется
последовательность длиной около 20 нуклеотидов в середине транспозона.
Он
специфически
взаимодействует
с
концевыми
инвертированными
повторами мобильного элемента и может вырезать его из хромосомы.
Вырезание может происходить точно – с восстановлением исходной
структуры участка ДНК, и неточно, то есть с делециями и вставками от
одного до нескольких нуклеотидов. Это приводит к появлению стабильных
мутаций
и
является
одним
из
механизмов
создания
новых
последовательностей ДНК.
Как правило, мобильные генетические элементы многократно повторены в
геноме и образуют гетерогенные семейства, члены которых диспергированы
по хромосомам. Большая часть членов каждого семейства являются
дефектными копиями и не кодируют какой-либо функции, хотя сохраняют
86
способность к перемещению. Поведение транспозонов можно расценить как
паразитическое. Длина их от 2 до 10 тысяч нуклеотидных пар. У высших
эукариот на долю транспозонов приходится примерно 10% ДНК клетки.
Большинство их перемещается изредка, но, так как их в клетке довольно
много, транспозиция оказывает значительное влияние на разнообразие видов.
Биологический смысл перемещения отдельных сегментов ДНК:
- прерывание соответствующего гена, что ведет к эволюции;
- регуляция деятельности генов, так как транспозоны могут нести сигналы
для начала считывания генов. В новых областях усиливают или запрещают
работу гена.
Транспозоны также участвуют в горизонтальном переносе генов.
У бактерий были обнаружены 2 класса подвижных генов, различающихся
по длине и сложности организации.
1. Инсерционные последовательности, или 1S элементы, имеющие длину
около тысячи пар нуклеотидов и содержащие только ген, отвечающий за их
перемещение.
2. Транспозоны, длиной от 3 до 20 т. н. п., состоящие из ряда
дополнительных генов, отвечающих за устойчивость бактерий к различным
токсическим веществам.
Поскольку подвижные гены могут перемещаться в пределах генома с
одного места на другое, то они могут быть весьма эффективными векторами
для передачи рекомбинантной ДНК. Генетическая трансформация с
помощью векторов на основе транспозонов была впервые осуществлена на
дрозофиле. С помощью транспозируемого элемента Р дрозофиле был
передан ген, обуславливающий коричневую окраску глаз. Перенос генов при
помощи транспозонов имеет большие преимущества, так как он происходит с
высокой частотой и не влечет значительных перестроек интегрируемой ДНК.
87
Кроме того, этим методом можно переносить достаточно большие
фрагменты ДНК.
Лекция 7. Прямые методы переноса генов.
Прямое введение гена в клетку осуществляют несколькими способами:
Трансфекция
Микроинъекция
Электропорация
Метод «мини-клеток»
Упаковка в липосомы
Электронная пушка
При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция
(Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата.
Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.
Для повышения эффективности трансформации к специфической ДНК,
содержащей ген, по которому будет производится селекция, добавляется
неспецифическая ДНК-носитель. Обычно для этой цели берут ДНК из
тимуса теленка или спермы лосося. Часть ДНК связывается с мембраной и
не попадает в клетки. ДНК акцептируют от 15 до 90% клеток. Через
несколько суток после введения небольшая доля клеток способны
экспрессировать чужеродные гены, но затем уровень экспрессии падает и
более или менее стабильную трансформацию претерпевает 10-3 - 105
клеток.
Для
трансфекции
используется
и
ДЭАЭ-декстран,
полимер,
адсорбирующий ДНК. Эффект вхождения в клетки и время экспрессии
высоки,
но
частота
стабильной
трансформации
ниже,
чем
при
использовании преципитата кальция. Частоту трансфекции увеличивает
глицериновый шок (4 минуты в 15% растворе глицерина в НEPES-буфере).
88
В клетки можно вводить любой ген, если заранее лигировать его с
клонированным селективным маркером. Однако дальнейшие исследования
показали,
что
лигирование
вне
клетки
не
обязательно.
Клетки,
поглощающие селективный ген, вместе с ним поглощают и другую ДНК,
имеющуюся в кальциевом преципитате. Таким образом, пользуясь
методом котрансформации, практически любой клонированный сегмент
ДНК можно ввести в культивируемые клетки эукариот, если включить эту
ДНК вместе с селективным маркером в состав смеси для образования
кальциевого преципитата.
Для трансфекции можно использовать хромосомы или фрагменты
хромосом. Клетки-доноры блокируются на стадии митоза. Митотические
хромосомы высвобождаются под воздействием осмотического шока и
гомогенизации.
центрифугирования.
Их
очищают
Хромосомы
путем
осаждают
на
дифференциального
поверхности
клеток
хлористым кальцием, а через несколько часов обрабатывают реагентом,
способным перфорировать мембраны (например, глицерином).
Для обработки клеток-рецепиентов используются грубо очищенные
препараты хромосом, так как хромосомы при этом разрушаются меньше
всего. Количество хромосом для обработки 1 клетки ограничено. Лучше
использовать не более 20 хромосом на 1 клетку-рецепиент, так как при
высоких концентрациях хромосом в суспензии они агглютинируют.
Рецепиентная клетка содержит фрагменты донорных хромосом, которые
могут встраиваться в геном, могут реплицироваться самостоятельно. Во
введенных фрагментах часто наблюдаются делеции.
Не все клетки способны к трансформации геномной ДНК с высокой
частотой. Человеческие фибробласты эффективно включают плазмидную
ДНК и почти не включают геномную.
Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с
появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5
89
микрона и микроманипулятора (рис. 45). Так, плазмиды, содержащие
фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы (ТК) и плазмиду рВR322,
были инъецированы в ТК--клетки и было показано, что ТК-ген проник в
ядра и нормально в них реплицировался. Метод введения ДНК с помощью
микроинъекций был разработан в начале 70-х годов Андерсоном и
Диакумакосом. В принципе, при наличии хорошего оборудования можно за
1 час инъецировать 500-1000 клеток, причем в лучших экспериментах в 50%
клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных
генов. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что
он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в
клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.
Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения
обратимо
увеличивают
проницаемость
биомембран.
В
среду
для
электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо
ввести в клетки (рис. 46). Через среду пропускают высоковольтные
импульсы (напряжение 200 - 350 В, длительность импульса 54 мс),
приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической
мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы такие
макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в
результате
действия
осмотических
сил.
При
этом
объем
клетки
увеличивается.
Напряженность электрического поля и продолжительность его действия,
концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой
системы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы достичь
высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что
в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов
может достигать 80% выживших клеток.
Электропорация — физический, а не биохимический метод, и это, повидимому, обусловливает его широкое применение. Многочисленные
90
исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно
использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как
культивируемые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и
протопласты растений. Электропорирующий эффект высоковольтного
разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от
радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно
поглощают ДНК при значительно большей напряженности (10 кВ/см и
более), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно
поглощающие ДНК при напряженности поля 1—2 кВ/см.
Электропорация — наиболее простой, эффективный и воспроизводимый
метод введения молекул ДНК в клетки. Однако до недавнего времени этот
метод использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с
отсутствием серийных приборов — электропораторов. Появление и
совершенствование таких приборов в ближайшие годы приведет к
широкому применению данного подхода в генетической инженерии самых
разных типов клеток.
«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток митозе
колцемидом. При продолжительной обработке клеток колцемидом в них
вокруг
каждой
хромосомы
формируется
новая
ядерная
мембрана.
Обработка цитохалазином В и центрифугирование приводит к образованию
мини-клеток,
представляющих
микроядра,
инкапсулированные
в
цитоплазматическую мембрану.
Полученные
мини-клетки
очень
чувствительны
к
разного
рода
воздействиям, поэтому для слияния подбирают специальные мягкие
условия. Метод трудный, капризный, эффективность низкая – 10-6 – 10-7.
Упаковка
в
липосомы используется
для
защиты
экзогенного
генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.
Липосомы - сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов.
Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и
91
липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов.
Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее
пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Системы
переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.
Метод биологической баллистики (биолистики) является одним из
самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации
растений, особенно однодольных.
Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама,
диаметром
0,6—1,2
мкм,
напыляется
ДНК
вектора,
содержащего
необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые
частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и
помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток
наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под
биолистическую пушку на расстоянии 10—15 см. В пушке вакуумным
насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления
вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из
биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму
и ядро клеток.
Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают
из-за огромного количества и давления вольфрамовых частиц, в то время
как
в
зоне
0,6—1
см
от
центра
находятся
наиболее
удачно
протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на
среду для дальнейшего культивирования и регенерации.
С
помощью
биолистической
пушки
были
протрансформированы
однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом
были получены стабильные растения-трансформанты. Кроме успехов в
получении трансгенных однодольных, биолистическая трансформация
применяется для прямого переноса ДНК в эмбриогенную пыльцу и
дальнейшего быстрого получения трансгенных дигаплоидных растений,
92
которые являются важным этапом в селекционной работе. В настоящее
время этим методом была проведена трансформация растений табака и
после
регенерации
гаплоидных
растений
получены
стабильные
трансформанты.
Лекция 8. Непрямые методы переноса генов.
В настоящее время бактерия E. coli является самой изученной клеткой
из всех существующих. У большинства наиболее полно изученных фагов
клеткой - хозяином является также E. coli.
Протопласт E. coli одет в муреиновый мешок, прилегающий к внешней
мембране. E. coli относится к микроорганизмам, не обладающим
физиологической компетентностью к поглощению экзогенной ДНК.
Поэтому необходимо создать условия, позволяющие преодолеть барьер
клеточной стенки. Сначала получают сферопласты путем обработки клеток
лизоцимом в изотоническом растворе.
Липополисахаридный
бактерии
слой
стабилизирован
разрыхления
внешней
комплексообразователь
внешней
мембраны
двухвалентными
мембраны
грамотрицательной
катионами,
поэтому
E.
используется
coli
этилендиаминтетрауксусная
кислота
для
(EDTA),
которая связывает двухвалентные катионы. При обработке EDTA часть
липополисахаридов высвобождается из внешней мембраны клетки, и
лизоцим может достигнуть муреинового мешка и гидролизовать его. Это
ведет
к
повышению
проницаемости
клеточной
оболочки.
Усовершенствование методов получения сферопластов E. coli и их
трансфекции позволили достичь достаточно высокой эффективности
трансформации молекулами ДНК различных фагов.
Обнаружено, что на инфекционность существенное влияние оказывает
форма молекул фаговых ДНК, которую они принимают in vivo. Фаги с
93
кольцевой или линейной, но быстро замыкающейся ДНК (лямбоидные
фаги) характеризуются наибольшей эффективностью трансфекции.
Успешное проведение экспериментов на кишечной палочке стало стимулом
для проведения аналогичных исследований с другими прокариотическими
организмами. Наибольших успехов удалось достичь с клетками Bacillus
subtilis. B. subtilis - непатогенный почвенным микроорганизм, растущий в
строго аэробных условиях. Бациллы не образуют токсинов и непатогенны
ни для животных, ни для человека, тогда как клеточная стенка E. coli
содержит эндотоксин, который довольно трудно отделить от продуктов
генной инженерии. Кроме того, клеточная стенка бацилл имеет простую
структуру и бактерии могут секретировать многие белки в культуральную
жидкость. 20 различных видов бацил секретируют в культуральную
жидкость более 40 ферментов с внеклеточной локализацией. E. coli
секретирует в среду относительно мало белков, а выделение и очистка их
затруднены. В бациллах также обнаружены плазмиды и фаги, которые к
настоящему моменту уже хорошо изучены.
Чужеродные гены клонируют в так называемых челночных векторах. Эти
вектора с одинаковым успехом реплицируются в клетках нескольких хозяев,
в данном случае, в клетках E. coli и B.subtilis. Векторы были получены
комбинацией in vitro фрагментов этих плазмид.
Гены E. coli со своими регуляторными районами не функционируют в
B.subtilis, поэтому были использованы собственные гомологичные районы
B.subtilis.
Для конструирования рекомбинантной ДНК, содержащей в своем составе
ген, который должен экспрессироваться, придерживаются следующей
стратегии. Синтезируют кДНК или из клонотеки выделяют клетки, несущие
фрагмент генома с нужным геном, и клонируют их в соответствующем
векторе. Фрагменты геномной ДНК подвергают модификации - удаляют из
них некодирующие области и участки соседних генов. Часто для
94
проведения этой операции необходимо секвенирование данного фрагмента
ДНК. Затем конструируются промежуточные рекомбинантные ДНК, в
которых ген помещается под контроль бактериальных регуляторных
элементов (промотор, оператор, точка связывания с рибосомами). Эти
регуляторные
элементы
выделяют
из
гибридных
плазмид,
сконструированных специально как источники регуляторных элементов.
Полученная конструкция встраивается в подходящий вектор, например,
pBR 322, и ген экспрессируется в бактериальной клетке.
Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии,
который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную
экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную
клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например,
сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину,
входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген
инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst I, который расположен в
структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную
транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не
дойдет до сигнала терминации встроенного гена.
В качестве примера маркирования вектора могут служит первые
эксперименты с E. coli, а точнее с одной из ее плазмид рBR322,
проведенные Гилбертом для получения инсулина. Плазмида pBR322
содержит 2 гена, которые определяют устойчивость к ампициллину и
тетрациклину. Рестриктаза PstI расщепляет плазмиду в средней части гена,
кодирующего фермент устойчивости к апициллину. После расщепления
плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферазы надстраивали
последовательность из четырех нуклеотидов с остатками гуанина. Затем,
как обычно, с помощью лигаз "вшивали" ген проинсулина, получая
рекомбинантную ДНК. Встроенный в плазмиду фрагмент ДНК нарушал
синтез фермента, разрушающего ампициллин, но ген, обеспечивающий
95
устойчивость к тетрациклину, оставался активным. Трансформированные
таким образом клетки E. coli синтезировали гибридный белок, содержащий
последовательности пенициллазы и проинсулина, поэтому биологически
активный инсулин получали путем отщепления пенициллазы и средний
сегмент проинсулина.
С другой стороны, если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из
генов
устойчивости,
то
последний
инактивируется.
Следовательно,
успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов
легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному
антибиотику.
Плазмиды.
Плазмиды
-
это
внехромосомные
автономно
реплицирующиеся цвухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды
есть практически у всех бактерий. Одни из них содержат информацию,
обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (Fплазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды)
или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных
метаболитов (плазмиды деградации). Есть плазмиды, в которых не
обнаружены
гены,
выполняющие
какие-то
определенные
функции
(критические плазмиды; от англ, cryptic — скрытый, латентный). Размеры
плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит
сайт начала репликации (ori), без которого репликация плазмиды в клеткехозяине была бы невозможна.
Некоторые плазмиды представлены в клетке 10—100 копиями; они
называются высококопийными. Низкокопийные плазмиды присутствуют в
клетке в числе 1—4 копий. На долю плазмидной ДНК обычно приходится
0,1—5,0% суммарной клеточной ДНК. Если две или более плазмиды не
могут сосуществовать в одной и той же клетке, то говорят, что они
принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к
разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной
96
клетке, независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной
клетке было обнаружено до 8—10 разных плазмид, при этом каждая из них
выполняла свои функции, была представлена характерным для нее числом
копий и относилась к своей собственной группе несовместимости. Одни
плазмиды несут специфичный сайт инициации репликации и могут
реплицироваться только в клетках одного вида. У других плазмид этот сайт
менее специфичен, и они реплицируются в самых разных бактериальных
клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и с широким спектром
хозяев.
Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды
обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их
в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Но довольно часто
природные (немодифицированные, несконструированные) плазмиды бывают
лишены некоторых обязательных для «высококачественного" вектора
свойств. К таким важным свойствам относятся:
1) небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК
в Е. coli значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.;
2) наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть
осуществлена вставка;
3) наличие одного или более селективных генетических маркеров для
идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.
Поэтому плазмидные векторы приходится создавать с помощью генной
инженерии.
Плазмидный вектор pBR322. В 80-е годы плазмидный вектор pBR322
был одним из самых популярных универсальных векторов. Обычно
обозначение плазмидного вектора включает строчную букву p (от англ,
plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или
к истории его создания. Так, буквы BR в обозначении плазмиды pBR322
указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса, сконструировавших эту
97
плазмиду,
а
число
322
—
цифровое
обозначение,
взятое
из
их
исследовательских протоколов. Длина плазмиды pBR322 — 4361 п. н. Она
несет два гена устойчивости к антибиотикам, ампициллину (Ampr) и
тетрациклину (Tetr), a также уникальные сайты для BamHI, HindIII и SalI в
генеТеtr, один PstI-сайт в гене Аmрr, один сайт для EcoRI, находящийся за
пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации,
обеспечивающий
реплицируется
репликацию
с
исключительно
образованием
большого
в
числа
E.
coli.
копий,
Плазмида
в
другие
бактериальные клетки переносится с трудом.
Как работает клонирующий вектор pBR322? Если очищенную кольцевую
плазмиду
pBR322
обработать
рестриктазой,
расщепляющей
ее
в
единственном сайте, расположенном в одном из генов устойчивости к тому
или другому антибиотику, то образуется линейная молекула с липкими
концами. Такие молекулы смешивают с донорной ДНК, содержащей нужный
ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку
липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с
образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой
фага Т4 в присутствии АТР, в результате чего образуется множество разных
комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности
объединившиеся между собой фрагменты до-норной ДНК и исходные
плазмидные ДНК, Чтобы уменьшить количество последних, обрабатывают
рестрицированную плазмидную ДНК щелочной фосфатазой, отщепляющей
от линеаризованной молекулы 5'-фосфатные группы: ДНК-лигаза не может
сшить концы дефосфорилированной линейной плазмидной ДНК (рис. 4.8).
Что касается собственно рекомби-нантных молекул ДНК, то хотя в них и
имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе
двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с помощью ДНКлигазы между дефосфорилированной плазмидной ДНК и рестрицированной
донорной ДНК (рис. 4,8). После репликации в трансформированной клетке
98
одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клеткихозяина.
Трансформация и отбор. Теперь необходимо ввести рекомбинантную
ДНК в клетку-хозяина. Этот процесс называется трансформацией. Для его
осуществления используют специально разработанные приемы, например
подвергают клетки высокотемпературному воздействию и обрабатывают их
хлористым кальцием (СаС12), Однако эффективность трансформации все же
остается невысокой, обычно трансформируется не более одной клетки из
тысячи.
Таким
образом,
большинство
клеток
после
проведения
трансформации не содержат рекомбинантной ДНК. В некоторых из них
появляется воссоединившаяся кольцевая плазмидная ДНК, избежавшая
дефосфорилирования щелочной фосфатазой, в других — неплазмидная ДНК
и лишь в некоторых — плазмида со встроенным фрагментом чужеродной
ДНК (гибридная плазмида).
Как мы уже говорили, внехромосомная ДНК, не содержащая точки начала
репликации, не может реплицироваться в бактериальной клетке. Таким
образом, проникновение в клетку экзогенной ДНК, еще не означает, что она
будет
поддерживаться
в
хозяйской
клетке.
Далее, для
сохранения
рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине в первоначальном виде необходимо,
чтобы в клетке отсутствовали гены, кодирующие синтез рестриктаз, которые
могут привести к ее деградации, и чтобы клетка имела фенотип RecA– (такие
клетки неспособны к общей рекомбинации, так что экзогенная ДНК не будет
модифицироваться в результате гомологичной рекомбинации).
Затем
необходимо
идентифицировать
клетки,
содержащие
рекомбинантную ДНК. Способ идентификации должен быть как можно
более простым, поскольку приходится проверять огромное число клеток. В
системе pBR322, в которой чужеродная ДНК встраивается в сайт ВаmHI,
специфическая идентификация состоит из двух этапов. Сначала клетки после
трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин.
99
В таких условиях могут вырасти только те клетки, в которых присутствует
интактный ген Аmрr — или в составе интактной плазмиды pBR322, или в
составе гибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чувствительны
к ампициллину. Сайт BamHI расположен в гене Tetr плазмиды pBR322 (рис.
4.7); встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую
последовательность, и устойчивость к тетрациклину утрачивается. Таким
образом, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину,
но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную
плазмиду pBR322, несут ген Tetr и устойчивы как к ампициллину, так и к
тетрациклину.
На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки,
выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином
методом
перепечатки.
Клетки,
образующие
колонии
на
чашках
с
тетрациклином, содержат интактную плазмиду pBR322, поскольку, как мы
уже говорили, они устойчивы и к ампициллину, и к тетрациклину. Клетки, не
выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику,
значит, они содержат гибридную плазмиду pBR322.
Среди колоний, выросших на среде с ампициллином, выделяют те,
которые оказались чувствительны к тетрациклину, и из каждой колонии
получают индивидуальные клеточные клоны или (чаще делают именно так)
объединяют все колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к
тетрациклину,
и
культивируют
их
вместе.
Далее
можно
провести
дополнительный скрининг и идентифицировать те клетки, которые несут
гибридную плазмиду pBR322 со специфической вставкой. Присутствие
сайтов HindIII и SalI в гене Tetr и сайта PstI в гене Аmрr плазмиды pBR322
позволяет изменить локализацию клонированных фрагментов чужеродной
ДНК. Если для встраивания используется сайт PstI, то отбор проводится по
той же схеме, но в другом порядке, т. е. сначала высевают клетки на среду с
тетрациклином, а затем — с ампициллином.
100
Другие плазмидные векторы. Идея использовать pBR322 как вектор для
клонирования была вполне удачной, но эта плазмида содержит лишь
несколько сайтов рестрикции, а отбор трансформированных клеток занимает
много времени. Это привело к необходимости разработки альтернативных
систем клонирования. Например, плазмида pUC19 длиной 2686 п. н.
содержит: ген устойчивости к ампициллину; регулируемый сегмент гена βгалактозидазы (lacZ') лактозного оперона E. coli, ген lacI, кодирующий
репрессор, который контролирует экспрессию гена lacZ'; полилинкер —
короткую последовательность с множеством уникальных сайтов узнавания
для эндонуклеаз (EcoRI, SacI, КрпI, ХтаI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HinсII,
AccI, BspMI, PstI, SphI и HindIII); точку начала репликации плазмиды
pBR322.
При отборе трансформированных клеток руководствуются следующими
соображениями. Если клетки, содержащие немодифицированную плазмиду
pUC19, выращивать в присутствии изопропил-β-D-тиогалактопиранозида
(ИПТГ), который является индуктором lac-оперона, то продукт гена lad не
сможет связаться с промоторно-операторной областью гена lacZ', и как
следствие будут происходить транскрипция и трансляция плазмидного
фрагмента гена lacZ'. Продукт этого фрагмента свяжется с белком,
кодируемым хромосомной ДНК, и в результате образуется активная ßгалактозидаза. Последовательность с множеством сайтов рестрикции
(полилинкер) встроена в ген lacZ' так, что она не влияет на продукцию
функциональной β-галактозидазы, и если в среде присутствует ее субстрат 5бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид
(X-Gal),
то
он
будет
гидролизоваться под действием этого фермента с образованием продукта
синего
цвета,
окрашивающего
колонии
клеток,
содержащих
немодифицированную плазмиду pUC19.
Лекция 9. Векторы для трансформации растений и животных.
101
Введение генов в клетки млекопитающих.
Характеристика векторов для переноса генов в животные клетки
Манипуляции с клетками млекопитающих можно разделить на 2 большие
группы: эксперименты с соматическим клетками и эксперименты по
трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат –
получение трансгенных организмов.
Характеристика векторов для переноса генов в животные клетки
Одними из лучших носителей для введения чужеродной информации в
животную клетку являются вектора на основе ретровирусов, например, на
основе вируса лейкоза мышей. Они обеспечивают высокоэффективный
перенос генов и их стабильное встраивание в хромосому клеток-мишеней. В
основном трансформации животных клеток осуществляют либо с помощью
ретровирусов (около 40% от всех трансформаций), либо путем упаковки
ДНК в липосомы (25%), реже используют аденовирусы, так как они могут
вызывать сильный иммунный ответ, кроме того, невозможно их повторное
введение.
Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее
доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается
(главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные
белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то
другие характеристики существующих векторных систем - стабильность
интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность — все еще нуждаются в
серьезных доработках. Прежде всего это касается стабильности интеграции.
До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при
использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов.
Повысить
эффективность
стабильной
интеграции
можно
путем
совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных
систем, либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов
102
(то есть ДНК-структур, способных к длительной персистенции внутри
ядер).
В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе
искусственных хромосом млекопитающих (MAC - mammalian artificial
chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов
обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в
клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их
естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной
работы гена, в нужной ткани и в должное время. Такие искусственные
хромосомы уже созданы для дрожжей (YAK), так как геном дрожжей
полностью картирован.
Для идентификации модифицированных клеток, необходимы маркеры. Если
трансформируют соматические клетки, то применяют обычно селективные
маркеры. Аксель с коллегами из колледжа терапии и хирургии
Колумбийского университета исправили таким образом генетический
дефект клеток мыши. Они взяли фрагмент ДНК, содержащий ген
тимидинкиназы (ТК), который получен из вируса герпеса, смешали эту ДНК
с несколькими миллиграммами ДНК-носителя из спермы лосося и осадили
ДНК на культуру L-клеток мыши, в которых ген ТК отсутствовал (ТК-). С
частотой 1 на 100000 клетки приобретали ген ТК, поэтому на селективной
среде, которая не позволяла расти ТК- клеткам, росли и нормально
размножались ТК+ - клетки.
Другой селективный маркер - ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу
(ДГФР), можно использовать при трансформации немутантных линий
клетки. Благодаря экспрессии многих копий этого гена животная клетка
вместе с плазмидой приобретает устойчивость к высоким концентрациям
ингибитора фермента, и таким образом трансформантов можно отбирать
при высоких концентрациях ингибитора.
103
Разработано еще два универсальных вектора, содержащих генные маркеры,
работающие в нормальных клетках. Они построены по одному и тому же
принципу: прокариотические гены, определяющие фенотип трансгенных
клеток, соединены с эукариотическими регуляторными сигналами.
Один из векторов состоит из прокариотического гена устойчивости к
антибиотику неомицину, встроенного в раннюю область генома SV-40.
Эукариотические клетки чувствительны к аналогу неомицина G 418,
который
инактивируется
продуктом
гена.
Таким
образом
клетки,
прошедшие трасфекцию приобретают способность расти на среде,
содержащей G 418.
Векторы генной инженерии растений
Потенциальные векторы могут быть классифицированы на три категории.
1. Векторы, полученные на основе растительных патогенов (вирусов,
вироидов),
которые
введению
в
характеризуются
естественной
клетку
способностью
чужеродной
к
ДНК.
2. Векторы, полученные на основе мобильных генетических элементов. Их
еще
называют
подвижные
элементы,
транспозируемые
элементы,
транспозоны. Транспозоны способны менять свою локализацию в геномах.
7.
Векторы, полученные на основе природных растительных векторов.
Представители Тi- или Ri-плазмида.
Вирусы. Среди
растительных
вирусов
группа
каулимовирусов
–
изометрических вирусов мозаики цветной капусты CaMV (Caulimoflower
mosaic virus) рассматриваются наиболее часто как потенциальный вектор
для введения чужеродной ДНК в растение. Это связано с тем, что CaMV
являются вирусами растений, содержащими двунитевую ДНК, с которой
легче
всего
манипулировать
при
использовании
технологии
рекомбинантных ДНК для их потенциального применения в качестве
104
векторов. Геном CaMV имеет длину 8 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) и ДНК
обнаруживается в линейной, кольцевой, закрученной или завязанной в узел
форме. Она обладает уникальными (один раз встречающимися в данной
молекуле) сайтами для гидролиза эндонуклеазами SalGI и XhoI. Эти сайты
могут быть использованы для превращения ДНК CaMV в линейную
молекулу с последующим лигированием с подходящим плазмидным
ветктором E. Coli, в результате чего образуется гибридная плазмида, которая
может быть клонирована в E. сoli. Транскрипция генома CaMV
ассиметрична – только α-нить продуцирует стабильные РНК-транскрипты.
Перед С5' концом транскриптов найдены типичные эукариотические
промоторные сигналы. Очевидно, синтез вирусной РНК осуществляется
полимеразой хозяина. На интеграцию вирусной ДНК с геномом хозяина
данных нет. CaMV инфекция не передается через семена и нет оснований
думать,
что
происходит
интеграция
геномов
вируса
и
растения.
Данный вирус поражает главным образом крестоцветные растения.
Нуклеотидные последовательности CaMV указывают на то, что обширные
области генома кодирует белок. Чтобы встроить новую ДНК необходимо
идентифицировать области, куда можно было бы внедрить нужные гены так,
чтобы это не отражалось на интересующих исследователей областях. Есть
сообщение об успешном внедрении экзогенных ДНК, в частности γ-ДНК в
вирус и ее размножении в растениях. Принципиальный интерес к CaMV как
вектору основан на том, что его ДНК может быть введена непосредственно в
растение просто путем втирания в листья и вирус распространяется по всему
растению. Это дает основание рассматривать возможности введения
чужеродной
ДНК
в
растение,
а
не
в
клеточную
культуру.
Введение вирусной ДНК эффективно – нужно всего лишь 1-5 мкг
клонированной ДНК на растение и почти 100% растений становятся
инфицированными.
CaMV можно манипулировать in vitro как с бактериальной плазмидой и
105
затем вводить в растение. Особым преимуществом CaMV является то, что он
проникает во все клетки. К трудностям использования относится
ограниченность
В
настоящее
круга
время
привлекает
хозяев.
внимание
группа
геминовирусов,
содержащих однонитевую ДНК. Например, вирусы могут хорошо дополнять
CaMV
потому
что
имеют различный
круг
хозяев.
Геминовирусы
аккумулируются в ядрах растительных клеток и инфицируют многие
сельскохозяйственные культуры – кукурузу, бобы, томаты, пшеницу, табак и
многие тропические растения.
Вироиды. Около 40 лет назад считалось, что все инфекционные болезни
растений и животных вызваны или микроорганизмами (бактерии, грибы)
или вирусами. Было известно, что самые мелкие вирусы, способные к
независимой репликации, имеют геномы с молекулярной массой 1 млрд.
Поэтому резонно было предположить, что этот размер представляет собой
минимальное количество информации, необходимой для кодирования
вирусом своих продуктов и подавления метаболизма клетки-хозяина.
Действительно, хотя и известны меньшие вирусы, они для репликации
нуждаются в вирусах-помощниках, находящихся в той же клетке. Но в 1971
году было показано, что болезнь «веретенообразность клубней» картофеля
вызвана
небольшими
неинкапсулированными
молекулами
автономно
реплицирующейся РНК - вироидами. Оказалось, что вироиды вводят в
хозяйскую
клетку
еще
меньшую
информацию.
Вироиды реплицируются за счет фермента хозяина механизмом типа
катящихся колец с кольцевым вироидом в качестве матрицы.
Благодаря ряду особенностей вироиды рассматриваются в качестве
потенциальных
векторов:
1) вызывают инфекцию всего растения и могут сами мигрировать по
растению;
2) переносятся через клеточный сок;
106
3) некоторые вироиды передаются через семена (значит, они интегрируются
с геномом хозяина);
4) инфицируют широкий ряд растений.
Транспозоны.
Одним
из
перспективных
векторов
для
переноса
генетической информации в растение является вектор, сконструированный
на основе мобильных генетических элементов.
В 70-е годы прошедшего столетия в молекулярной генетике появилось новое
понятие – нестабильность генома. Этому важнейшему феномену посвящена
монография Р. Б. Хенсина «Непостоянство генома». Оказалось, что в геноме,
считавшимся многие годы незыблемым, определенные сегменты ДНК могут
менять свою локализацию, то есть мигрировать или, как еще принято
говорить у генетиков, транспозировать. Однако это понятие ни в коей мере
не отменяет основного постулата классической генетики о постоянстве
генома.
Первая группа транспозирующихся элементов (ТЭ) получила название
инсерционных
последовательностей
обозначаются
–
IS
это
простые
с
транспозоны,
номерами.
Каждый IS обладает короткими инвертированными концевыми повторами,
15-25 пар нуклеотидов. Эти повторы представляют собой два участка одной
и
той
же
двунитевой
ДНК,
имеющие
одинаковые
нуклеотидные
последовательности, но расположены в противоположной (обратной)
ориентации. ДНК IS фланкирована очень короткими прямыми повторами.
Мишень содержит до внедрения только один такой повтор (5 или 9 пар
нуклеотидов). Наличие прямых и обратных повторов указывает на
присутствие транспозона. Рамка считывания несет информацию о белках.
Сложные транспозоны обозначаются Tn c номерами. Один класс
представлен сложными элементами, состоящими из центральной части,
несущей маркер, например лекарственной устойчивости, фланкированной с
107
каждой стороны родственными последовательностями – плечами –
длинными концевыми повторами. Плечи могут иметь либо одинаково
ориентированную, либо инвертированную последовательность. Иногда
плечи состоят из IS элементов. В случае Tn9 на каждом плече по IS1. В
других случаях плечи напоминают IS элементы.Все модули имеют концевые
инвертированные
повторы,
поэтому
сложный
транспозон
также
заканчивается короткими инвертированными повторами. Если же плечи
имеют инвертированную ориентацию друг относительно друга, короткие
повторы
на
концах
Tn
идентичны.
Природа транспозиционного события состоит в разрезании сайта мишени
рестриктазой, куда внедряется транспозон. Рестриктазы (рестрикционные
эндонуклеазы)
ферменты,
разрезающие
нуклеотидным
последовательностям,
ДНК
которые
по
они
определенным
«узнают».
Эти
последовательности называются сайтами рестрикции. Образование и
достройка ступенчатых концов делают понятными наличие прямых
повторов ДНК мишени в сайте внедрения.
Рекомбинация между любой парой прямых повторов будет приводить к
делеции, т.е. утрате ДНК между ними (Рис. 4). Промежуточная область
вырезается
в
виде
кольцевой
ДНК.
Хромосома
сохраняет
одну
копиюпрямого повтора. В случае Т9 (который заключен между двумя IS1)
рекомбинация
приведет
к
замене
Т9 на
IS1.
В чем же заключается смысл предусмотренного природой процесса
перемещения
отдельных
сегментов
ДНК.
транспозоны
прерывают
соответствующий
В
результате
ген
и
он
внедрения,
перестает
функционировать. Таким образом, транспозоны играют значительную роль в
эволюции. Кроме того, транспозоны несут в себе сигналы для начала
считывания информации. Внедряясь в новые области ДНК, они изменяют
процесс считывания информации. У бактерий ряд транспозонов несет гены
устойчивости к антибиотикам. Они могут передаваться из одной клетки к
108
другой. В результате, у данного вида возрастает число бактерий
выживающих при высоких концентрациях антибиотика. В индивидуальном
развитии
высших организмов на определенных
этапах происходит
включение или выключение определенных программ. В этом ключевую роль
также играют транспозоны. Можно считать экспериментально доказанным
участие
мигрирующих
элементов
в
образовании
опухолей.
Наибольшее применение в качестве векторов в настоящее время нашли
плазмиды – внехромосомные, автономно реплицирующиеся, кольцевые
молекулы ДНК бактерий. Почвенные бактерии или агробактерии содержат
плазмидную ДНК, способную генетически трансформировать растительную
клетку.
Агробактерии.
Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes представляют
собой
почвенные бактерии, которые в участках повреждения двудольных растений
вызывают заболевания, называемые соответственно «корончатым галлом» и
«косматым корнем». Среди однодольных растений только некоторые
представители
семейств Liliaceae и Amaryllidaceae оказались
в
слабой
степени восприимчивы к заболеванию корончатых галлов. Причины
подобного ограничения круга хозяев в настоящее время не раскрыты.
Однажды начавшись, опухолевый рост может продолжаться и в отсутствие
бактерий, а опухолевая ткань способна расти в асептичных условиях в
культуре на питательной среде, не содержащей экзогенных ауксинов и
цитокининов, которые в норме необходимы для стимляции роста
растительных
тканей
in
vitro.
Опухолевые ткани синтезируют новые производные аминокислот и сахаров,
известные как опины. Тип опина, синтезируемого в опухоли (например
нопалин, октопин, агроцинопин, маннопин и агропин), зависит от штамма
агробактерий, вызвавшего ее образование. Октопин и нопалин – опины –
образуются из аргинина; их легче всего обнаружить в ткани корончатых
109
галлов. В соответствии с этим многие широко распространенные
штаммы Agrobacterium tumefaciens классифицируют
как
штаммы
октопинового или нопалинового типа. В опухолях косматого корня,
вызываемых A. rhizogenes,как правило, обнаруживается агропин. Штаммы
агробактерий,
вызывающие
образование
избирательному
катаболизму
опинов
опухолей,
того
типа,
способны
синтез
к
которых
индуцируют, используя последние в качестве источников углерода и азота.
Как индукция опухолей, так и синтез опинов обусловлены бактериальными
плазмидами.
Ti-плазмиды. Ti-плазмиды (от англ. Tumour inducing – образующие
опухоль),
обнаруженные
штаммах A. tumefaclvns, имеют
(рис.
5.
А) во
всех
размеры
около
200—250
вируленных
тыс.
пар
нуклеотидов (т. п. н.) и стабильно сохраняются в агробактериях при
температуре ниже 30°С. Согласно данным ДНК-ДНК-гибридизации в Tiплазмидах различных штаммов агробактерий имеются четыре области
гомологии. Генетический анализ показал, что две области, Т-ДНК (от англ.
Transferred)
и vir-область
(от
англ.
virulence),
связаны
с
опухолеобразованием, тогда как две другие вовлечены в конъюгационный
перенос и репликацию плазмид в клетках агробактерий.
В процессе опухолеобразования определенная последовательность Tiплазмиды, Т-ДНК, переносится в клетки растения и встраивается в их
ядерный геном без заметных перестроек. Т-ДНК стабильна в растительном
геноме. В растительную ДНК может включаться одна или более копий ТДНК, и хотя множественные копии Т-ДНК могут образовывать тандемные
повторы, они могут быть разбросаны по геному - сцеплены с различными
районами растительной ДНК. Место встраивания Т-ДНК в растительную
ДНК, по-видимому, случайно. В различных Ti-плазмидах найдены области,
гомологичные
Т-ДНК. В
обычно
используемых
напалиновых
штаммах A. tumefaciens размер области Т-ДНК составляет около 24 т. п. н. В
110
некоторых корончатых галлах октопинового типа выявлены два несмежных
сегмента TL (Т-левая Т-ДНК) и ТR (Т-правая). Последовательность ТL (14
т.п.н.) обнаружена во всех линиях трансформированных клеток. TR (7 т. п.
н.), которая происходит из района Ti-плазмиды, локализующегося правее TlДНК, обнаружена в некоторых опухолевых линиях, причем число ее копий
может отличаться от такового для ТL . Последнее обстоятельство указывает
на
независимость
процессов
переноса TL и TR.
В опухолевых клетках Т-ДНК транскрибируется с образованием различных
полиаденилированных мРНК. количество накапливающихся в клетках
транскриптов Т-ДНК относительно невелико по сравнению с другими
растительными мРНК, а относительное их содержание может быть
различным.
Определение
нуклеотидной
последовательности
Т-ДНК
нопалинового типа позволило идентифицировать 13 протяженных открытых
рамок считывания, тогда как в октопиновых TL- и TR-ДНК обнаружено
соответственно 8 и 6 протяженных открытых рамок. Транскрипты правой
части нопалиновой т-днк функционально эквивалентны транскриптам tlднк. общая организация генов Т-ДНК и их фланкирующих областей
(последовательностей ДНК расположенных с обеих сторон генов) сходна с
таковой эукариотических генов, хотя они не содержат интронов. один из
генов
октопиновой
TL- области
(транскрипт
3)
кодирует
октопинсинтазу (ocs). В нопалиновых плазмидах гены опинсинтаз включают
и гены нопалинсинтазы и агроцинопинсинтазы (acs). В октопиновых Тiплазмидах TR-ДНК o6ласть кодирует два белка, ответственных за синтез
маннопина, и один — за превращение маннопина в агропин. Локус tmr
(транскрипт 4) кодирует фермент, участвующий в синтезе цитокинина;
мутации в этом локусе приводят у некоторых растений к пролиферации
корней из ткани корончатых галлов («rooty» или «корневые» мутанты).
Локус tms1 и tms2 (транскрипты 1 и 2) определяют нерегулируемый синтез
ауксинов, и мутации в любом из них у многих типов растений
111
обусловливают появление побегов из ткани корончатых галлов («snooty»
или «побеговые» мутанты). Таким образом, Т-ДНК содержит гены
(tms 1, tms2 и tmr), продукты которых препятствуют нормальной регуляции
метаболических процессов, вовлеченных в синтез фитогормонов, что и
приводит
к
онкогенному
фенотипу.
Следовательно,
эти
гены
(tms 1, tms2 и tmr) можно отнести к так называемым онкогенам, т.е генам,
индуцирующим образование опухоли. однако следует отметить, что
входящие в состав Т-ДНК гены не участвуют в переносе Т-ДНК в
растительные клетки и не влияют на её стабильность в геноме растения.
Индукция
Ri–плазмиды.
заболевания
бактериями A. rhizogenes аналогична
косматого
корня
трансформирующему
действию A. tumefaciens. Под контролем vir-области две отдельные области
Т-ДНК плазмиды переносятся в растительный геном TL- и TR.. TR-ДНК
содержит
гены,
кодирующие
опины
(маннопин
или
агропин),
и,
соответственно этому, штаммы характеризуют по их специфическим
опиновым генам. TR-ДНК, кроме того, содержит два гена, кодирующие
ауксин. Эти гены в значительной степени гомологичны ауксиновым
генам A. Tumefaciens. TL Т-ДНК A. rhizogenes полностью секвенирована; она
содержит по крайней мере 11 открытых рамок считывания, сходных с
эукариотическими,
промоторов
и
которые
сигналами
снабжены
необходимыми
полиаденилирования
элементами
(последние
должны
функционировать после переноса в растительный геном). Для поддержания
фенотипа косматого корня нет абсолютной необходимости в TL, однако
штаммы Agrobacterium, несущие как TL, так и ТR, более вирулентны и
заражают большее число видов растении, чем штаммы, несущие только одну
Т-ДНК.
МОДУЛЬ 4 «БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО»
112
Лекция 10. Структура и слагаемые биотехнологического процесса –
часть 1.
При ферментационной технологии можно использовать цельные живые
клетки (микробов, клетки животных и растений) или какие-нибудь клеточные
компоненты (например, ферменты) с целью физических или химических
преобразований органических веществ. Однако недостаточно получать
требуемые изменения веществ, метод должен иметь преимущества перед
другими, применяемыми в настоящее время, технологиями производства этих
же самых продуктов. Преимущества производства органических продуктов
биотехнологическими способами перед чисто химическими методами
достаточно многогранны:
• многие сложные органические молекулы, такие, как белки и антибиотики,
не могут практически быть синтезированы химическими способами;
•
биоконверсия обеспечивает значительно больший выход целевого
продукта;
• биологические системы функционируют при более низких температурах,
менее высоких значениях рН (близких к нейтральному) и т. п.;
• каталитические биологические реакции намного специфичнее, чем реакции
химического катализа;
• биологические процессы обеспечивают почти исключительно продукцию
чистых изомеров одного типа, а не их смесей, как это часто бывает в реакциях
химического синтеза.
Но вместе с тем биологические способы в сравнении с химическими
методами обладают рядом явных недостатков:
1. Биологические системы могут легко быть загрязнены посторонней
нежелательной микрофлорой.
2. Целевой продукт, синтезируемый биологическим способом, присутствует в
довольно сложной смеси, что обусловливает необходимость разделения его от
примеси ненужных веществ.
113
3. Биотехнологические производства требуют больших количеств воды,
которую в итоге необходимо удалять, сбрасывая в окружающую среду.
4. Биопроцессы обычно идут медленнее в сравнении со стандартными
химическими процессами.
Для каждого биотехнологического процесса должна быть разработана
подходящая схема, а сам процесс должен постоянно наблюдаться и
тщательно
контролироваться.
Для
большинства
практических
биотехнологических процессов такими системами являются ферменторы или
биореакторы, которые обеспечивают необходимые физические условия,
способствующие наилучшему взаимодействию катализатора со средой и
поставляемым материалом. Биореакторы варьируют от простых сосудов до
весьма сложных систем с различным уровнем компьютерного оснащения.
Биореакторы изготавливаются в двух вариантах или типах. Первый тип для
нестерильных систем, когда нет абсолютной необходимости оперировать с
чистыми
культурами
микроорганизмов
(например, ферментация при
пивоварении, производство пекарских дрожжей и т. п.).
Биореакторы второго типа предназначены для асептических процессов,
обычно используемых в производстве таких соединений как, антибиотики,
аминокислоты, полисахариды и одноклеточный бактериальный белок. В
реакторах такого типа все посторонние микроорганизмы должны быть
исключены, что, естественно, связано со значительными сложностями при их
конструировании и разработке самого биотехнологического процесса.
Основное требование к биореакторам любого типа сводится к обеспечению
оптимальных условий роста продуцента или накоплению синтезируемого им
продукта. Для достижения указанных целей необходимо разрабатывать
технологию, призванную оптимизировать процесс, а именно: использовать
подходящий источник
соответствовать
энергии, набор питательных веществ должен
питательным
потребностям
организма-продуцента,
ростовой среды должны быть удалены соединения,
114
ингибирующие
из
его
жизнедеятельность, должна быть подобрана соответствующая посевная доза
и, наконец, обеспечены все остальные
условия.
требуемые
физико-химические
Экономически рентабельные процессы в своей основе весьма
сходны, независимо от избранного продуцента, используемой среды и
образуемого продукта.
Главная задача – получение максимального количества клеток с одинаковыми
свойствами при их выращивании в определенных тщательно контролируемых
условиях. Фактически один и тот же биореактор (лишь с небольшими
изменениями) может быть использован для производства ферментов,
антибиотиков, органических кислот или одноклеточного белка.
Среды, предназначаемые для ферментационных процессов.
Превалирующим компонентом всех (или почти всех) биотехнологических
процессов является вода. В лабораторных условиях можно легко определить
специфические потребности любого конкретного организма и затем (с
известной долей приближения) экстраполировать на производственный
уровень.
Если процесс крупномасштабный, то важным моментом будет доступность
субстрата для культивирования (наличие его в требуемых количествах,
стабильность, восполняемость, легкость в обращении и сохранении).
Стоимость материалов является важным фактором, поскольку внедрение
любого биотехнологического процесса в значительной степени зависит от
его стоимости по сравнению с существующими
методами производства
этого же продукта. Неотъемлемым фактором является здоровье работников,
особенно при манипуляциях с порошковыми материалами.
Приготовление питательных сред для ферментационных процессов обычно
рассматривается как мало интересная часть общей задачи, но фактически оно
является краеугольным камнем, обеспечивающим успех всех последующих
этапов. Среды неподходящего состава обусловят низкий уровень ростовых
процессов и, следовательно, низкий уровень выхода целевого продукта.
115
Биореакторы.
Биотехнологические процессы принципиально отличаются от процессов
химического синтеза и могут быть двух типов: периодическими и
непрерывными. Специфика биотехнологических процессов состоит в том, что
в них участвуют живые клетки, субклеточные структуры или выделенные из
клеток ферменты и их комплексы. Это оказывает довольно существенное
влияние на процессы массопередачи (обмена веществ между различными
фазами – перенос кислорода из газообразной фазы в жидкую) и теплообмена
(перераспределение тепловой энергии между взаимодействующими фазами).
Поэтому
одним
из
важнейших компонентов
биореакторов
является
система перемешивания, обеспечивающая однородность условий в аппарате,
оптимальность массопередачи между фазами реактора, между культуральной
жидкостью и клетками и т.д.
Другим
существенным
различием
между
биотехнологическими
и
химическими процессами является необходимость создания аэробных или
анаэробных условий, требуемых для культивирования соответствующего
организма. Поэтому в определенных случаях необходимо подавать кислород
и удалять образующиеся газообразные продукты иного рода, в первую
очередь двуокись углерода (СО2).
Системы аэрации зачастую бывают очень сложной конструкции, поскольку
они должны обеспечить баланс между расходом О2 и его поступлением в
нужных количествах, учитывая тот факт, что потребность в кислороде не
одинакова на различных стадиях культивирования.
Крайне важным является обеспечение должного уровня теплообмена в
биореакторах, поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность
объектов зависит в значительной степени от колебаний температуры.
Поддержание температуры в определенном узком диапазоне диктуется: 1)
резким снижением активности ферментов по мере падения температуры и 2)
необратимой инактивацией (денатурацией) макромолекул (в первую очередь
116
белков) при ее повышении до критических значений. Температурный
оптимум у каждого организма лежит в определенных пределах. Большинство
биотехнологических процессов осуществляется в мезофильных условиях (30–
50 oС). С одной стороны, это имеет преимущество, потому что лишь в редких
случаях приходится обеспечивать повышенный подогрев реакторов. Однако,
с другой стороны, возникает проблема удаления избыточного тепла,
выделяющегося при интенсивном росте культивируемых клеток, поэтому
биореактор должен быть оснащен эффективной системой охлаждения.
Еще одной серьезной проблемой при культивировании в биореакторах
является
пенообразование,
связанное
с
необходимостью
аэрирования
содержимого, в котором постоянно присутствуют поверхностно-активные
вещества (ПАВ) продукты распада жиров (мыла) и белки (составные
компоненты субстрата например, белки соевой и кукурузной муки и т. п.).
Образующийся слой пены опять же, с одной стороны, способствует росту
аэробных микроорганизмов, а с другой – сокращает полезный объем реактора
и способствует заражению культуры посторонней микрофлорой. Это
заставляет интенсивно разрабатывать эффективные системы пеногашения.
Специфическим элементом биореактора является система, обеспечивающая
стерильность процесса. Стерилизация осуществляется на разных этапах
процесса, как до его начала, так и при осуществлении и после окончания.
Иными словами, в биотехнологическом производстве важное место отводится
принципу асептики, выдвинутому еще в 60-е годы XIX в. Луи Пастером.
В
последнее
время
в
биотехнологию
внедряется
принцип
дифференцирования режимов культивирования: разные этапы одного и того
же процесса осуществляются при различных условиях – температура, рН,
аэрация и т. п. Естественно, это создает новые (дополнительные) требования
при
конструировании
основными
реакторов.
принципами
Таким
реализации
образом,
в соответствии с
биотехнологических
процессов
современные биореакторы должны обладать следующими системами:
117
• эффективного перемешивания и гомогенизации среды выращивания;
• обеспечения свободной и быстрой диффузии газообразных компонентов
системы (аэрирование в первую очередь);
• теплообмена, обеспечивающего поддержание оптимальной температуры
внутри реактора и ее контролируемые изменения;
• пеногашения;
• стерилизации сред, воздуха и самой аппаратуры;
• контроля и регулировки процесса и его отдельных этапов.
Биотехнологически
ценные
продукты
синтезируются
как
в
экспоненциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так
называемые первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста
(антибиотики, пигменты и т. п. так называемые вторичные метаболиты).
Довольно
широко
в
биотехнологии
используется
периодическое
культивирование с подпиткой, при котором, помимо первичного внесения
питательного субстрата до засева культуры, в процессе культивирования в
аппарат через определенные интервалы добавляют питательные вещества
либо порциями, либо непрерывно "по каплям".
Существует также отъемно-доливочное культивирование, когда часть
содержимого биореактора периодически изымается и добавляется равное
количество питательной среды. Такой прием обеспечивает регулярное
"омолаживание" (обновление) культуры и задерживает (отдаляет) ее переход
в фазу отмирания. Этот прием иногда называется полунепрерывным
культивированием.
Модификацией периодического культивирования является культивирование
с диализом, при котором питательный субстрат постоянно поступает в
реактор
через
концентрации
специальную
продуктов
мембрану.
Диализ
жизнедеятельности
ведет
клеток,
к
снижению
неблагоприятно
влияющих на их жизнеспособность. Помимо этого, диализ удаляет из
118
культуры часть жидкости, что позволяет получать в конце процесса
концентрированную биомассу.
В
непрерывных
процессах
культивирования
клетки
постоянно
поддерживаются в экспоненциальной фазе роста. С этой целью в биореактор
непрерывно подается свежая питательная среда и обеспечивается отток из
него
культуральной
жидкости, содержащей
клетки
и
продукты
их
жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов (как уже
отмечалось выше) является точное соблюдение равновесия между приростом
биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления
содержимого свежей средой. Различают хемостатный и турбидостатный
режимы непрерывного культивирования.
При хемостатном режиме культивирования саморегулируемая система
возникает в силу следующих причин: если первоначальное поступление
свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость
деления
клеток,
то
в
результате
разбавления
культуры
снижается
концентрация веществ, ограничивающих ростовые процессы и скорость роста
культуры повышается; увеличивающаяся популяция начинает активнее
"выедать" субстрат, что в свою очередь приводит к торможению роста
культуры. Конечным итогом этих процессов является (после серии
затухающих колебаний) установление равновесия между скоростью роста
культуры и ее разбавлением.
Биореактор, работающий в хемостатном режиме культивирования, называют
хемостатом. Его конструкция предусматривает наличие: 1) приспособления
для подачи питательной среды; 2) устройства, обеспечивающего отток
культуральной жидкости вместе с клетками, и 3) системы, контролирующей
концентрацию элементов питательной среды и управляющей скоростью
подачи питательной среды.
Последнее является наиболее важным и наиболее сложно осуществимым
устройством.
119
Турбидостатный режим культивирования базируется на прямом контроле
концентрации
биомассы.
Наиболее
распространенным
методом
определения
является
измерение
светорассеивания
с
фотоэлементов.
Повышение
концентрации
клеток
и
ее
помощью
соответственно
оптической плотности автоматически ускоряет проток жидкости и наоборот.
По своей конструкции турбидостаты отличаются от хемостатов лишь
системами контроля скорости протока.
Хемостаты применяются в процессах, характеризующихся малым протоком,
когда концентрация клеток изменяется незначительно с изменением скорости
протока, что облегчает саморегулировку системы.
Область использования турбидостатов – высокие скорости разбавления,
обусловливающие быстрое и резкое изменение концентрации биомассы. С
технической точки зрения турбидостат может применяться только для
культивирования
одноклеточных
микроорганизмов.
При
длительном
культивировании в турбидостате возникает довольно серьезная проблема,
связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу. Однако имеются и
определенные преимущества. Так, например, если засевается смешанная
культура, то в турбидостате автоматически отбирается более быстро
растущий вид, что может использоваться для предохранения от массивного
заражения посторонней микрофлорой (если, конечно, она растет медленнее) и
селекции определенных форм.
Непрерывное
культивирование
в
одностадийным.
Многостадийное
последовательное
или
позволяющее
обеспечивать
одном
биореакторе
выращивание
называется
предусматривает
каскадное
расположение
биореакторов,
внедрение
принципа дифференцированных
режимов в непрерывные биотехнологические процессы, основанные на
создании системы биореакторов.
При разработке новых биотехиологических процессов сначала прибегают к
периодическому культивированию. На непрерывный режим пока
120
еще
переведено небольшое число процессов, однако перспективность его не
вызывает сомнений, несмотря на более сложные конструкции аппаратов и
систем контроля (иными словами, на более солидные капиталовложения).
Конечно, и периодическое культивирование еще не исчерпало своих
возможностей. Пока что выбор режима (периодическое или непрерывное
культивирование) подчиняется (да и будет подчиняться в дальнейшем)
соображениям экономической целесообразности.
Открытые и замкнутые ферментационные системы.
В практике современной индустриальной биотехнологии существует три
главных типа биореакторов и две формы биокатализаторов. Биореакторы
могут функционировать на основе разовой (однократной), восполняемой
(неполностью) и непрерывной (продолженной) загрузки. А в
самих
реакторах культуры могут быть статическими и перемешивающимися,
находиться в присутствии кислорода (аэробы) или без него (анаэробы), а
также в водной фазе или условиях низкого увлажнения.
Биокатализаторы (цельные клетки или ферменты) могут быть свободными
или иммобилизованными путем прикрепления к поверхности биореактора
или к специальным устройствам. Обычно реакции, протекающие в
ферменторах, осуществляются при умеренных значениях рН (около
нейтрального)
и
биотехнологических
температуры
процессах
(от
20
до
60
С).
При
многих
конечные продукты метаболизма
(так
называемые целевые продукты) накапливаются в низких концентрациях в
растворимой фазе (в водной среде) и требуют сепарации, прежде чем будут
направлены на реализацию.
Биореакторные системы для выращивания микрорганизмов могут быть
классифицированы как "замкнутые" и "открытые". Система рассматривается в
качестве замкнутой, когда многие компоненты данной системы не могут быть
из нее удалены или добавлены. Так, например, в традиционных однократных
(т. е. замкнутых) ферментационных системах все питательные компоненты
121
добавляются в начале ферментации и, как результат этого, скорость роста,
находящегося в таких условиях организма, в конечном счете будет снижена
до нуля вследствие уменьшения количества питательных веществ или
накопления
токсических
продуктов
отхода
метаболизма.
Системы,
функционирующие в таких условиях, называются как batch-системы
(замкнутые системы).
Большинство современных биотехнологических систем функционируют как
batch-процессы,
при
которых
однажды
оптимизированные
условия
обеспечивают максимальное накопление целевого (требуемого) продукта,
например, приготовление пива, производство антибиотиков и ферментов и т.
п.
Модификацией процесса с разовой загрузкой является возобновляемая
ферментация (feеd batch – от feеd-насыщающий), при которой количество
питательного вещества может быть добавлено в ходе ферментации с целью
восполнения частично израсходованного субстрата или для активации
процесса. Однако в своей принципиальной основе подобные системы
остаются замкнутыми, поскольку у них нет постоянного оттока содержимого.
В противоположность этому, ферментационная система, рассматривается
как открытая, если ее компоненты ( микроорганизмы и питательные
субстраты) могут постоянно добавляться и удаляться из биореактора. Такие
ферментеры оснащены приспособлениями, постоянно подающими свежую
питательную среду и удаляющими биомассу и другие продукты. В таких
системах скорость конверсии субстрата в биомассу или в целевой продукт
должна
быть
точно
сбалансирована
со
скоростью
поступления
вышеуказанных компонентов, что обеспечивает устойчивое состояние
метаболических процессов в реакторе.
Хотя непрерывные процессы приобрели широкое практическое применение в
лабораторных условиях (масштабах), лишь немногие из них используются в
промышленности.
Однако
непрерывные
122
процессы
довольно
широко
практикуются в производстве одноклеточного белка; например, продукция
ICI Prutin на метаноле и производство микопротеина компанией Rank Hovis
McDougall.
Процессы и аппараты периодического и непрерывного
культивирования.
Несколько
подробнее
об
особенностях
вышеуказанных
процессов.
Периодическое культивирование включает: а) стерилизацию сред и всего
оборудования; б) загрузку биореактора питательной средой; в) внесение
посевного материала (клеток или спор); г) выращивание культуры (это может
совпадать во времени с последующим этапом или предшествовать ему); д)
синтез целевого продукта; е) отделение и очистку готового продукта. Все
этапы представлены во временном аспекте; после окончания последнего этапа
производится мойка биореактора и подготовка его к новому циклу.
При этом типе культивирования рост клеточной популяции подразделяется на
несколько фаз: 1) лаг-фаза, или фаза задержанного роста, при которой клетки
растут медленно и адаптируются к новой среде обитания
в
объеме
ферментора; 2) экспоненциальная фаза, характеризующаяся интенсивным
делением клеток и сбалансированностью роста всей популяции; 3) фаза
замедленного роста, связанная с исчерпанием питательных субстратов и
накоплением токсических продуктов метаболизма; 4) стационарная фаза, при
которой прирост новых клеток количественно равняется числу погибающих;
5) фаза отмирания, характеризующаяся прогрессирующей гибелью клеток.
Конструкция биореакторов.
Все формы и виды ферментационных систем создаются, имея основной
целью обеспечение одинаковых условий для всех компонентов содержимого
реактора. В ферменторах биокатализаторы суспендированы в жидкой среде,
содержащей необходимые субстраты для обеспечения роста организмов и
образования нужного целевого продукта.
123
Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо точно
придерживаться следующей генеральной линии:
• Биореактор должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание
загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранения требуемой
микрофлоры.
• Объем культивирумой смеси должен оставаться постоянным, т. е. чтобы не
было утечки или испарения содержимого.
•
Уровень
растворенного
кислорода
должен
поддерживаться
выше
критических уровней аэрирования культуры аэробных организмов.
• Параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т. п., должны
постоянно контролироваться.
• Культура при выращивании должна быть хорошо перемешиваемая.
К материалам, используемым при конструировании сложных, прецизионно
работающих ферменторов, предъявляются определенные требования (порой
весьма строгие):
а) все материалы, вступающие в контакт с растворами, подающимися в
биореактор, соприкасающиеся с культурой микроорганизма, должны быть
устойчивыми к коррозии, чтобы предотвратить загрязнения металлами даже в
следовых количествах;
б) материалы должны быть нетоксичным и, чтобы даже при самой малой
растворимости они не могли бы ингибировать рост культуры;
в) компоненты и материалы биореактора должны выдерживать повторную
стерилизацию паром под давлением;
г) перемешивающая система биореактора и места поступления и выхода
материалов и продуктов должны быть легко доступными и достаточно
прочными, чтобы не деформироваться или ломаться при механических
воздействиях;
124
д) необходимо обеспечить визуальное наблюдение за средой и культурой, так
что материалы, используемые в процессе, по возможности должны быть
прозрачными.
Для оптимизации биотехнологических процессов требуется постоянный и
тщательный контроль за изменяющейся картиной ферментации,
обеспечивается
наличием
в
позволяющих
осуществлять
параметров
ферментационного
что
биореакторах соответствующих датчиков,
избирательный
анализ
процесса.
определенных
Неотъемлемой
частью
большинства ферментаций является та или иная степень компьютеризации.
За последние десятилетия форма биореакторов существенно изменилась.
Первые
(исходные)
ферментационные
системы
представляли
собой
неглубокие емкости, перемешивание в которых осуществлялось либо путем
их встряхивания, либо посредством перемешивания содержимого вручную.
На основе первичных систем в последующем были созданы аэрируемые
башенные конструкции, которые в настоящее время доминируют в
промышленном производстве.
Системы перемешивания являются важным классификационным принципом
биореакторов различного типа. Правда, поскольку биореакторы являются
многопараметровыми аппаратами, они могут классифицироваться и по
другим критериям: размерам, целевым назначениям (лабораторные, опытнопромышленные
или
пилотные,
промышленные),
(периодического и непрерывного действия),
режиму
условиям
работы
культивирования
(аэробные и анаэробные, мезофильные и термофильные, для поверхностного
и глубинного выращивания, для жидких и твердых питательных сред,
газофазные).
И все же система перемешивания имеет не последнее значение в
классификации. По способу перемешивания и аэрации биореакторы
подразделяются
на
аппараты
с
механическим,
циркуляционным перемешиванием.
125
пневматическим
и
Аппараты с механическим перемешиванием.
Эти реакторы имеют механическую мешалку с центральным валом и
лопастями (лопатками), число которых обычно равно 6, реже 8.
Лопасти могут быть прямыми или изогнутыми, часто их располагают в
несколько ярусов, что обеспечивает более эффективное перемешивание
больших объемов жидкости. В систему входят также отражательные
перегородки – узкие металлические пластинки, прикрепленные к внутренним
стенкам биореактора. Они предотвращают возникновение водоворотов и
обеспечивают вихревое движение жидкости, равномерно распределяемое но
всему объему реактора. Однако в ряде случаев они не могут быть применены
(культивирование
мицелиальных
микроорганизмами
(мицелием).
создается
в
биореакторах,
грибов),
Нежное
так
как
обрастают
и
медленное перемешивание
предназначаемых
для выращивания клеток
животных и (в меньшей степени) растений.
Аэрация (без явного, интенсивного перемешивания) может осуществляться
путем барботажа – подачи воздуха снизу через горизонтальную трубку с
отверстиями, иногда аэрирование достигается применением специальных
вибраторов, которые обеспечивают высокую степень асептики, малый расход
энергии и относительно слабо травмируют клетки.
126
В некоторых ферменторах используют полые мешалки, в которых воздух
поступает в среду культивирования через отверстия в нижнем конце их валов
и полые лопатки.
Аппараты с механическим перемешиванием – наиболее распространенные
конструкции в современной микробиологической промышленности.
Аппараты с пневматическим перемешиванием.
В такого типа аппаратах мешалка отсутствует и перемешивание жидкости
осуществляется
пузырьками
газа
(рис.3).
Естественно,
что
скорость
массообмена в них намного ниже, чем в ферменторах с механическим
перемешиванием (с мешалками).
Классическим аппаратом такого типа является эрлифтный реактор (air lift –
подъем
воздуха).
Биореакторы
с
пневматическим перемешиванием
характеризуются более мягким (плавным) перемешиванием содержимого и
получили распространение при выращивании клеток животных и растений.
Пневматические аппараты привлекают также простотой конструкции и
малыми энергозатратами.
Основной их недостаток – "тихоходность" Однако и это не всегда является
недостатком, поскольку, например, в условиях "тихоходных" установок
культуры
клеток
растений
характеризуются
биосинтетическими
способностями, присущими целому растению. Так, клетки Digitalis lanata в
эрлифтном ферменторе продуцируют ценный кардиологический препарат – р
-метилдигоксин.
127
Аппараты с циркуляционным перемешиванием.
Биореакторы циркуляционного или гидродинамичесиого типа оснащены
насосами и эжекторами, создающими направленный ток жидкости по
замкнутому контуру (кругу). Жидкость увлекает за собой пузырьки газа и тем
самым культуральная среда одновременно с перемешиванием может
насыщаться либо атмосферным кислородом, либо (с использованием
специальных устройств и эжекторов) газом иного типа. Эти аппараты
(биореакторы) отличаются простотой конструкции и надежностью в
эксплуатации.
Ферменторы циркуляционного типа часто заполняются твердыми частицами
(насадкой), которые способствуют лучшему перемешиванию содержимого
реактора,
препятствуют
обрастанию
стенок
при
длительном
культивировании, а также обеспечивают диспергирование воздуха в
жидкости. Некоторые микроорганизмы, прикрепляясь к таким насадкам (в
частности, грибы и актиномицеты), развиваются намного лучше. От
биореакторов
с
насадками
–
один
шаг
к
ферменторам
для
иммобилизованных клеток или к аппаратам для иммобилизованных
ферментов.
В последнее время разрабатываются новые способы аэрации. Например,
воздух может подаваться через специальные полипропиленовые мембраны.
128
Это позволяет избегать пенообразования и очень хорошо зарекомендовало
себя при выращивании клеток эукариотических организмов, в частности
при промышленном получении интерферона.
Система теплообмена.
Теплообмен осуществляется с помощью труб с охлаждающим или
нагревающим
агентом,
которые
оплетают
аппарат
и
образуют
так
называемую рубашку реактора. Иногда эта система труб располагается
непосредственно
в полости
ферментора. Нагревающими
агентами
в
промышленных биореакторах служат горячая вода или пар. Естественно, в
лабораторных ферменторах чаще используется электрический подогрев.
В качестве охлаждающих агентов применяют воду с низкой температурой
(артезианскую или пропущенную через холодильную установку); более
глубокое охлаждение достигается использованием этиленгликоля
фреонов.
Проблема
охлаждения
или
ферменторов становится очень
значительной в промышленных масштабах.
Система пеногашения.
Пеногашение
–
средство
борьбы
с
избыточным
ценообразованием.
Существуют химические, механические, акустические и другие виды
пеногашения. Наиболее часто применяют химические и механические
способы пеногашения. К химическим средствам относятся поверхностноактивные вещества, которые, внедряясь в стенки пузырей, становятся
центрами их неустойчивости. Эффективными пеногасителями служат
растительные (соевое, рапсовое, кокосовое, подсолнечное, горчичное) масла,
животные (сало, рыбий жир) и минеральные жиры. Недостатком этих
пеногасителей является то, что при их утилизации микробными клетками
сами по себе способствуют пенообразованию.
Механические пеногасители представляют собой различные устройства,
сбивающие пену: диски, лопасти, барабаны, располагающиеся в верхней
части реактора. Более сложными приспособлениями являются сепараторы
129
пены, которые одновременно служат для сбора биомассы, содержащейся в
пенном слое. Все эти устройства, конечно же, приводят к дополнительным
затратам и удорожают производство.
Система стерилизации.
Устройства и режим стерилизации определяется конструкцией биореактора,
вспомогательного оборудования, используемых питательных сред и т. п.
Наибольшее значение имеют термический метод стерилизации оборудования
и
сред
и
фильтрационный
способ,
применяемый
для
удаления
микроорганизмов из подаваемого в ферменторы воздуха или другого газа.
Режимы термальных способов стерилизации определяются химическим
составом питательных сред. При этом определяющим является состояние
компонентов среды после стерилизации; главное сохранность ее питательных
качеств.
Проблемы масштабирования ферментационных процессов.
Технология
производственного
лабораторных,
пилотных
процесса
отрабатывается
(опытно-промышленных)
и
поэтапно:
в
промышленных
установках. Чаще встречаются аппараты с объемами ферменторной камеры:
0,5–100 л (лабораторные), 100-5000 л (пилотные) и 5000–1000000 л и более
(промышленные). На каждом этапе увеличения масштаба ферментации
(процесса) – масштабном переходе (масштабировании биотехнологического
процесса)
–
решаются
конкретные
задачи
отработки
(налаживания)
производства и его оптимизации.
Лабораторные
ферменторы
по
устройству
и
форме
напоминают
промышленные и подразделяются на те же типы. Правда, в лабораторных
масштабах
наиболее
часто
применяются
аппараты
с
механическим
перемешиванием По принципу теплообмена и стерилизации они делятся на
две категории. К первой относятся лишенные собственных систем
теплообмена и стерилизации. Такие аппараты, по сути дела, представляют
собой камеры для культивирования, помещаемые в водяные бани и
130
стерилизуемые в автоклавах. Аппараты второй категории снабжены
системами
теплообмена
и
стерилизации,
принципиально
не
отличающимися от таковых промышленных установок.
С помощью лабораторных биореакторов решаются следующие задачи:
1) кинетические – определение скорости роста клеток, эффективность
утилизации субстратов и образования целевого продукта;
2) некоторые массообменные – расчет коэффициентов массопередачи,
скорость поступления в среду О 2 и других газов, скорость освобождения от
газообразных продуктов, образующихся при культивировании продуцентов
(в первую очередь СО 2 );
3) определение коэффициентов реакций, связывающих утилизируемые
субстраты и О 2 с получаемыми целевым и побочными продуктами.
Пилотные установки используют для поиска (отсюда и название) наиболее
целесообразных
технологий
и
в
общих
чертах
моделирование
промышленного процесса. Поэтому на данном этапе стараются применять тот
тип аппарата, который предполагается использовать в промышленном
масштабе. Иными словами, отрабатываются все аспекты производства, вплоть
до штатных вопросов. При масштабных переходах следует постоянно иметь в
виду, что при соблюдении одинаковых условий (среда, тип аппарата,
температура и рН, скорость перемешивания) уровень и скорость синтеза
целевого продукта могут существенно различаться ситуация, очень четко
прослеженная еще в 1940–1950 гг. при организации крупномасштабных
производств антибиотиков.
Вследствие сказанного при переходе от лабораторных к пилотным, а затем от
пилотных к промышленным установкам, приходится наряду с объемом
изменять и конструкцию, и режимы работы аппаратов.
Центральной проблемой при этом является подбор надежных критериев
масштабирования,
обеспечивающих
разработку
131
высокоэффективных
и
экономичных
технологий
промышленного
производства
целевого
продукта.
Лекция 11. Структура и слагаемые биотехнологического процесса –
часть 2.
Завершающие стадии биотехнологических процессов – выделение целевого
продукта – существенно различаются в зависимости от того, накапливается
продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же
продуктом является клеточная биомасса. Наиболее сложным является
выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо
отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем
целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток.
Выделение продукта существенно облегчается, если он экскретируется
продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому одной из насущных задач
биотехнологии
является
создание
микроорганизмов,
секретирующих
промышленных
возможно
большее
штаммов
число
ценных
продуктов в значительных количествах.
Технология выделения и очистки в значительной степени определяется
природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не
использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми
активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних
веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний
использовании.
Некоторые
при
его
традиционные биотехнологические процессы
вообще исключают этап отделения продукта.
Отделение биомассы. Первым этапом в процессе очистки целевого продукта
является разделение культуральной жидкости и клеточной биомассы
сепарация. В некоторых случаях сепарации предшествует специальная
обработка
реакционной
смеси,
способствующая
132
более
эффективному
отделению биомассы и стабилизации выделяемого продукта. Применяются
различные методы сепарации.
1. Флотация. Метод используется в том случае, если клетки продуцента в
силу
низкой
смачиваемости
накапливаются
в
поверхностных
слоях
содержимого биореактора. Особые устройства (флотаторы) различной
конструкции удаляют образующуюся при культивировании пену вместе с
прилипшими к пузырькам газа клетками. Повышение эффективности отбора
биомассы достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее
верхнего слоя механическим путем. Достоинствами метода является его
экономичность, высокая производительность и возможность использования в
непрерывных процессах.
2. Фильтрация. Различны применяемые в настоящее время фильтрующие
системы (барабанные, ленточные, тарельчатые фильтры, карусельные вакуумфильтры, фильтры-прессы, мембранные фильтры) основаны на одинаковом
принципе – задержке биомассы на пористой фильтрующей перегородке.
Недостатком способа является налипание клеток на фильтре, слой которых
снижает скорость протока жидкости в процессе фильтрования.
Для
фильтров
непрерывного
действия
предусматриваются
системы
автоматической очистки от биомассы, забивающей поры. Она может
сдуваться с поверхности фильтров сжатым воздухом или удаляться
специальными "ножами".
Существуют
также
фильтры
для
многократного
или
однократного
периодического использования. Например, мембранные (в частности,
тефлоновые) фильтры, позволяющие фильтровать очень разбавленные
клеточные взвеси. Однако проблемой их использования является быстрая
закупорка пор клетками, белками и другими коллоидными частицами.
Приемы механического удаления материала, забивающего фильтры, при
данном способе фильтрации не пригодны, так как повреждают мембраны.
Приемлемым путем преодоления затруднений такого рода является покрытие
133
мембранных фильтров гидрофильным слоем, препятствующим контакту
белков (коллоидов) с поверхностью фильтра, либо обработкой фильтров
гидролитическими ферментами.
3. Центрифугирование. Данный способ требует более дорогостоящего
оборудования, чем фильтрование, поэтому он применяется если:
а) суспензия фильтруется слишком медленно;
б) возникает необходимость максимального освобождения культуральной
жидкости от содержащихся в ней частиц;
в) требуется обеспечить непрерывный процесс сепарации, когда фильтры
рассчитаны на периодическое действие.
Центрифугирование
и
фильтрация
в
некоторых
биотехнологических
процессах осуществляется в комбинации, т.е. применяются фильтрационные
центрифуги, в которых разделение жидкой и твердой фазы основано на двух
процессах
фильтровании
и
центрифугировании.
Довольно
широко
используются приемы, где разделение обеспечивается лишь центробежной
силой. Наиболее перспективными в этом отношении являются центрифугисепараторы, в которых отделяемая биомасса оседает
па
стенках
вращающегося цилиндра или специальных тарельчатых вставках.
Методы разрушения клеток. Разрушение клеток проводится физическими,
химическими и ферментативными методами. Наибольшее промышленное
значение имеют физические способы дезинтеграции: 1) ультразвуком; 2)
лопаточными или вибрационными дезинтеграторами – метод, обычно
используемый в пилотных и промышленных установках; 3) встряхиванием
со стеклянными бусами; 4) продавливанием через узкие отверстия под
высоким давлением; 5) раздавливанием замороженной массы; 6) растиранием
в специальных ступках; 7) с помощью осмотического шока; 8) многократным
замораживанием и оттаиванием; 9) сжатием клеточной взвеси с последующим
резким снижением давления (декомпрессией).
134
Физические способы дезинтеграции отличаются большей экономичностью
в сравнении с другими методами, однако они характеризуются отсутствием
выраженной специфичности, вследствие чего обработка может отрицательно
влиять на качество получаемого целевого продукта.
Мягкое и избирательное разрушение клеточной стенки обеспечивается
применением химических и ферментативных методов. Так, бактериальные
клетки
разрушаются
(этилендиаминтетрауксусной
лизоцимом
кислоты),
в
а
присутствии
клеточные
стенки
ЭДТА
дрожжей
зимолиазой улитки или ферментами грибного либо актиномицетного
происхождения.
Клеточные
стенки
микроорганизмов
могут
быть
разрушены путем обработки толуолом или бутанолом. Элективный лизис
клеток
вызывается
воздействием
ряда
антибиотиков:
полимиксин,
новобиоцин, нистатин и др. Кроме того, к аналогичным результатам приводит
обработка клеток некоторыми поверхностно-активными веществами.
После дезинтеграции клеток необходимо избавляться от их «обломков», для
чего используют те же методы, что и при сепарации, т.е. центрифугирование
или фильтрацию. Однако в связи со структурой обрабатываемого материала в
данном случае приходится применять более скоростные центрифуги и
фильтры с меньшим диаметром пор (в большинстве случаев используются
мембранные фильтры). Обычно в большинстве
биотехнологических
процессов «обломки» клеток выбрасывают как отходы, но возможно и их
специальное получение в виде целевого продукта.
Отделение и очистка продуктов. Выделение целевого продукта из
культуральной жидкости или получаемого
дезинтеграции
в
результате
процессов
гомогената разрушенных клеток осуществляется путем
осаждения, экстракции или различных методов адсорбции. Приведенная на
рис.
4
схема
очистки
противоопухолевых
антибиотиков
хорошо
демонстрирует использование различных процедур для выделения продуктов
ферментации.
135
Осаждение растворенных веществ осуществляется физическими (нагревание,
разведение или концентрирование, охлаждение раствора) или химическими
воздействиями, переводящими растворенное вещество в малорастворимое
состояние. Естественно, что в зависимости от целей и свойств выделяемого
продукта подбирается тот или иной метод и то или иное воздействие, т. е.
подбирается реагент и т. п.
Экстракция подразделяется на твердо-жидкофазную (при которой продукт из
твердой
фазы
переходит
в
жидкую)
и
жидко-жидкофазную
(когда
обеспечивается перевод продукта из одной жидкой фазы в другую, также
жидкую фазу).
Твердо-жидкофазная экстракция сводится порой к простой обработке
твердого образца водой или органическим растворителем с целью извлечения
из него растворимых соединений. Достаточно широко применяются
различные
органические
растворители,
в
частности экстрагирование
ацетоном, который эффективно переводит в раствор ряд липидных и
белковых компонентов клеток.
При
жидко-жидкофазной
экстракции
используются
различные
органические растворители – алкилфенолы, эфиры, галогениды, гексан,
хлороформ и др. Эффективность экстракции может быть существенно
повышена:
1)
многократной
обработкой экстрагирующим агентом; 2)
подбором оптимального растворителя; 3) подогревом экстрагирующего
агента или экстрагируемой жидкости, содержащей продукт; 4) понижением
давления
в
аппарате
для
экстракции,
что
обеспечивает
довольно
эффективную экстракцию при относительно низкой температуре. Последнее
снижает затраты и уменьшает риск инактивации извлекаемого продукта.
Почти
полностью
избежать
экстрагирования
на
холоду,
криоэкстракции.
При
этом
инактивации
т.
е.
путем
уравниваются
позволяют
методы
использовании
методов
различия
между
твердым
субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое находится в
136
замороженном состоянии (в одной фазе). Криоэкстракция проводится с
применением растворителей, температура кипения которых низка и при
обычной комнатной температуре находящихся в газообразном состоянии.
Криоэкстракция может применяться в сочетании с криоконсервацией клеток.
Клеточная биомасса может длительное время сохранять свои свойства в
условиях глубокого замораживания, а затем из нее может быть экстрагирован
целевой продукт.
В некоторых случаях экстрагирующий агент может быть не в жидком, а в
газообразном состоянии (при жидко-газофазной или твердо-газофазной
экстракции).
Адсорбция является достаточно распространенным методом отделения
продукта и рассматривается в качестве частного случая экстракции, при
котором экстрагирующим агентом служит твердое тело. Механизм ее
сводится к связыванию выделяемого из жидкой или газообразной
вещества
поверхностью
твердого
фазы
тела. Традиционными адсорбентами
являются древесный уголь, пористые глины и т. п.
Более современные методы разделения веществ включают хроматографию,
электрофорез,
изотахофорез,
электрофокусировку, которые основаны на
принципах экстракции и адсорбции.
Разделение веществ путем хроматографии основано на их неодинаковом
распределении
между
двумя
несмешивающимися
фазами.
Различают
хроматографию на бумаге, пластинках и колонках. При хроматографии на
бумаге или на пластинках одной из несмешивающихся фаз является
движущийся растворитель, а другой (неподвижной фазой) служат волокна
бумаги
или
частицы
покрывающего
пластинку какого-то
материала
(например, силикагеля). При колоночной хроматографии подвижной фазой
является протекающий через колонку растворитель, а неподвижную фазу
представляет
заполняющий
гранулированный
гель).
колонку
Колоночная
137
адсорбент
(чаще
хроматография
всего
это
допускает
масштабирование процесса, в результате чего она довольно широко
применяется
в
промышленных
условиях
и
включает
несколько
разновидностей:
• Ионообменная хроматография, колонка наполняется гранулами адсорбента,
которые несут заряженные катионные (NH4) или анионные (SO4) группы,
способные захватывать ионы противоположного заряда. Данный метод
используется для выделения ионизированных веществ из жидкости, а также
для очистки нейтральных соединений от примесей ионной природы.
• Метод "молекулярных сит", гель-хроматография, гель-фильтрация. Виды
хроматографии,
основанные
на
разделении
веществ
с
различной
молекулярной массой и диаметром частиц. Адсорбент захватывает и
удерживает, например, только низкомолекулярные соединения, пропуская
соединения с более высокой молекулярной массой.
• Афинная хроматография. Метод базируется на задерживании комплекса,
образующегося из компонента разделяемой смеси и лиганда, который
фиксирован на частицах носителя (наполнителя колонки). При данном методе
используются агенты, способные специфически связывать какое-нибудь одно
конкретное вещество. Например, фермент очищают на колонке, заполненной
его субстратом или специфическим ингибитором (таблица).
Весьма эффективный метод разделения и очистки белковых и небелковых
веществ основан на взаимодействии антигенов и антител. Разработанный на
основании таких взаимодействий способ получил название
имунно-
аффинной хроматографии, который существенно повысил разрешающую
способность при введении в практику использования моноклональных
антител. Блестящей иллюстрацией его эффективности
степень
одноэтапной
является
высокая
очистки человеческого интерферона (чистота
повышается примерно в 500 раз).
В аффинной хроматографии могут использоваться групповые лиганды,
связывающие, например, группу сходных по структуре ферментов. Такими
138
лигандами являются кофакторы ферментов или их аналоги. Могут
применяться и еще менее специфичные лиганды, связывающие довольно
обширные классы веществ; например, алкильные и арильные группы или
лиганды, представляющие собой текстильные красители.
Преимущество аффинной хроматографии состоит в том, что с ее помощью
можно в одну стадию осуществить полную очистку продукта из сложной
многокомпонентной смеси (культуральной жидкости, цельных клеточных
экстрактов и т. п.), тогда как другие способы требуют многоэтапной очистки
и сопряжены с большими затратами труда и времени. Однако метод имеет и
ряд недостатков, в частности высокая цена материалов, используемых в
аффинной хроматографии (например, веществ, применяемых в качестве
лигандов), а также быстрое забивание колонки пропускаемыми веществами.
Последнее заставляет использовать их в периодическом, а не в непрерывном
режиме. После каждого выделения продукта колонки промывают и частицы
заполняющего геля также подвергаются очистке.
Помимо аффинной хроматографии (которая иногда называется еще аффинной
адсорбцией в геле) в крупномасштабных биотехнологических процессах для
очистки продуктов все шире применяют аффинную преципитацию и
аффинное разделение.
При аффинной преципитации лиганд соединяется с растворимым носителем
и, после взаимодействия с соответствующим выделяемым соединением,
образующийся комплекс по мере его формирования выпадает в осадок.
Иногда ускорение выпадения преципитата достигается путем добавления
электролитов.
Аффинное разделение основано на использовании системы, состоящей из
двух водорастворимых полимеров, один из которых несет специфические
лиганды, а другой обладает сродством к примесным компонентам.
качестве
примера
можно
привести
139
В
разделение нуклеиновых кислот и
белков. Для полимера, соединяемого с лигандом, берется полиэтиленгликоль,
а другим компонентом является декстран.
Наряду с хроматографией перспективными методами разделения веществ при
биотехнологических процессах являются электрофорез и его модификации. В
этих методах разделяемая смесь помещается в мощное электрическое поле,
обеспечивающее движение ионизированных компонентов смеси. Различие в
электрофоретической подвижности позволяет пространственно разделить
входящие в ее состав компоненты. Современные варианты электрофореза
используют (как и хроматография) пластинки или колонки с образующими
гель наполнителями (агароза, полиакриламид, сефароза, оксиапатит и др.).
Модификацией
фокусировка
метода
или
электрофореза
электрофокусировка.
является
изоэлектрическая
В
методе
этом
раствор,
насыщающий гель, содержит соединение с кислотно-основными группами.
Под влиянием электрического поля кислотно-основные группы буферного
соединения меняют степень ионизации, создавая тем самым градиент рН в
направлении электрического поля. Электрически заряженные компоненты
разделяемой смеси, нанесенной на гель, мигрируют по направлению к
электроду
противоположного
знака.
Поскольку
эти
компоненты
передвигаются по градиенту рН, то они постепенно теряют свои заряды и в
зоне,
где
рН
соответствует
изоэлектрической
точке
(точке
электронейтральности), их движение прекращается. Каждый компонент
концентрируется (фокусируется) в определенной области геля.
Концентрирование продукта. За отделением продукта следует этап его
концентрирования с помощью основных методов – обратного осмоса,
ультрафильтрации
и
выпаривания.
При
методе
обратного
осмоса
концентрируемый раствор помещается в мешок из полупроницаемой
мембраны, снаружи
создается
осмотическое давление, превышающее
осмотическое давление раствора, в результате чего растворитель начинает
140
вытекать через мембрану против градиента концентрации растворенного
вещества, обусловливая дальнейшее концентрирование раствора.
Ультрафильтрация представляет собой способ разделения вещества (вернее
его концентрирование) с помощью мембранных фильтров. Технология
ультрафильтрации
экономичностью
и
привлекает
своей
щадящим
обращением
простотой,
с
относительной
продуктом,
поскольку
осуществляется при умеренно низком внешнем давлении. Кроме того, в
данном методе не требуется изменение рН, ионной силы раствора или
перевода продукта в другую фазу. Поэтому метод перспективен
при
концентрировании малостабильных продуктов (некоторые аминокислоты,
антибиотики и ферменты).
Метод
выпаривания
наиболее
древний
и
обладает
существенным
недостатком: для удаления растворителя концентрируемый раствор следует
нагревать, но тем не менее данный способ достаточно широко используется,
особенно в лабораториях. В производственных условиях чаще применяются
вакуумные
испарители,
обеспечивающие
более
щадящий
режим
концентрирования. Нагревающим агентом обычно служит водяной пар, хотя
используется также обогрев жидким теплоносителем или электрическими
нагревателями.
Выпаривающие аппараты бывают периодического и непрерывного действия с
однократной и многократной циркуляцией кипящего раствора. С целью
достижения равномерного обогрева разрабатываются различного рода
конструктивные
усовершенствования
систем
выпаривания.
Концентрирование методом выпаривания может ограничиваться стадией
получения сиропообразного раствора целевого продукта; такая процедура
называется упариванием и получаемый продукт относится к категории
жидких. Дальнейшее освобождение от влаги, остающейся в продуктах после
обратного осмоса, ультрафильтрации или выпаривания, достигается путем
особой стадии – сушки.
141
Обезвоживание
продукта
(сушка).
В
биотехнологии
различные методы сушки, выбор которых
применяются
определяется
физико-
химическими и биологическими свойствами обезвоживаемого продукта, в
частности от вязкости раствора или степени сохранности жизнеспособности,
если дело имеют с живыми объектами. Перспективным методом является
обезвоживание
в газообразных нагревающих агентах (пар, воздух,
углекислый газ, дымовые газы и т. д.), которые с высокой скоростью
подаются в сушильный аппарат снизу, а частицы обезвоживаемого продукта
парят в этом газовом потоке. Схема такого сушильного аппарата напоминает
газофазный
реактор.
Преимущество
данного
способа
состоит
в
возможности регулировать интенсивность массо-тепло-обмена за счет
изменения продолжительности пребывания препарата в воздушном потоке, а
также возможность организации непрерывного процесса. Недостатком метода
является прилипание продукта к стенкам сушильной камеры.
Для обезвоживания микробных взвесей применяются так называемые
барабанные сушилки, в которых подогреваемые барабаны вращаются в
сосудах с микробной взвесью. Соприкасаясь со стенками барабана, взвесь
обезвоживается и биомасса присыхает к поверхности барабана. Засохшую
биомассу
удаляют
специальными
ножами.
Особо лабильные материалы сушат в вакуумных сушильных шкафах при
пониженных давлениях и температурах. Довольно широкое распространение
в биотехнологических производствах получили распылительные сушильные
аппараты,
в
которых
обезвоживающиеся
растворы
или
суспензии
превращаются путем пропускания через форсунки (или вращающиеся диски)
в аэрозоль, который подается в сушильную камеру с нагретым газом (до
примерно 110–150 С). В таких сушилках выживаемость бактериальных
культур достигает лишь 20–30%, что явно не удовлетворяет требуемому
качеству препаратов.
142
Наиболее
широко
высушивания
используются
лабильных
лиофильные
белковых
сушки,
препаратов
особенно
или
для
препаратов
медицинского назначения. Препараты предварительно замораживаются, и
вода испаряется из замороженного состояния при высоком вакууме.
Модификация продуктов. Различного рода модификации необходимы в тех
случаях, когда в результате процесса получается лишь "заготовка" целевого
продукта.
Так,
например,
пенициллин
полусинтетических препаратов,
использования
модифицируется
поступающих
для
до
практического
как коммерческие препараты. В некоторых случаях при
биотехнологическом процессе продуцент образует какую-то определенную
структуру, к которой уже химическим путем добавляется необходимый
компонент. Иногда биологический объект участвует на каком-либо одном
этапе химических процессов, обеспечивающих синтез целевого продукта.
Модификация является необходимым этапом при получении многих
ферментов, гормонов и препаратов медицинского назначения. Соединения
животного или растительного, а также микробного происхождения зачастую
необходимо изменять таким образом, чтобы придать им требуемые для тех
или иных целей качества. Например, у бычьего инсулина удаляются
аминокислотные
остатки,
после
чего
он
становится
идентичным
человеческому гормону.
Стабилизация продукта. Для сохранения требуемых свойств получаемых
продуктов
в
процессе
их
хранения,
реализации
и
использования
потребителями применяют различного рода физико-химические воздействия
с целью повышения его стабильности. Показано, что определенная степень
обезвоживания
существенно
повышает
стабильность
активностей
ферментов, включая и устойчивость к нагреваниям. Стабилизация ферментов
также достигается добавлением к препаратам глицерина или углеводов,
которые формируют многочисленные водородные связи с аминокислотными
143
остатками, препятствуя тем самым их денатурированию при нагревании
или спонтанной инактивации.
В некоторых случаях стабилизация продукта представляет собой задачу
особого биотехнологического процесса, а не только простой физикохимической
модификации.
В
качестве
примера
можно
привести
стабилизацию пищевого продукта, получаемого из яичных желтков –
меланжа, свойства которого при хранении существенно изменяются, что
делает его непригодным к использованию. Однако порчу меланжа можно
предотвратить, если удалить из него углеводы посредством выращивания на
меланже пропионовокислых бактерий. Бактерии "выедают" углеводы,
повышают
питательную
ценность
продукта
за
счет
обогащения
органическими кислотами и витаминами В, а также значительно удлиняют
сроки хранения меланжа.
МОДУЛЬ 4 «БИОТЕХНОЛОГИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ»
Лекция 12. Традиционная микробиологическая биотехнология и
биотехнология рекомбинантных штаммов микроорганизмов.
Во второй половине XX столетия коренным образом изменилась структура
микробиологической промышленности, возникли принципиально новые
направления, видоизменились существовавшие производства. Изменения,
которые произошли в микробиологических производствах (в технологии,
аппаратурном оформлении, методах создания продуцентов и пр.), были
настолько существенны, что позволяют говорить о возникновении новой
отрасли - биотехнологии. Фундаментом для возникновения биотехнологии
послужило
внедрение
в
промышленную
микробиологию
крупных
достижений середины XX в. в биологических исследованиях (микробиология,
биохимия, генетика, энзимология и т.д.), в других естественных науках
144
(химия, физика), в прикладной математике и кибернетике, в ряде технических
наук (процессы и аппараты, химическая технология и т.д.).
В послевоенные годы биотехнология была не просто одной из новых
технологий (“неологий”). Большинство из возникших тогда новых технологий
было связано в первую очередь с военно-промышленным комплексом и
вызывало у людей в основном страх. Биотехнологию рассматривали как
идеальную альтернативу этим технологиям. Она только что дала новый тип
лекарств – антибиотики, казавшиеся тогда панацеей от всех инфекционных
болезней, и резко повысившие продолжительность жизни. От нее ждали
решения проблем нищеты, голода, истощения ресурсов и загрязнения
окружающей среды. Ее гуманистический потенциал был очень велик и на
работу в этой области переключились многие физики, сыгравшие важнейшую
роль в становлении отрасли. Например, инициатор и участник проекта по
созданию американской ядерной бомбы Лео Сцилард стал одним из
создателей молекулярной биологии, внес большой вклад в математическое
моделирование
биотехнологических
процессов
и
много
сделал
для
популяризации роли биотехнологии в построении более совершенного мира.
В нашей стране повышению роли физиков в развитии биологии в 50-х начале 60-х годов способствовало и то, что наиболее квалифицированные
биологи, особенно их передовой отряд - генетики все еще испытывали
гонения
со
стороны
поддерживаемых
властями
лысенковцев.
Часть
генетиков, как Н.К. Тимофеев-Ресовский, уцелела под крылом у физиковядерщиков. В.А. Энгельгардт, создавая в 1959 г. Институт радиоационой
физико-химической биологии (ныне институт молекулярной биологии РАН),
собрал людей, понятия не имевших ни о молекулярной биологии, ни вообще о
биологии, - чистых химиков, чистых физиков, сроднившихся в ходе
совместной работы с вирусологами, биологами, биохимиками и нашедших
общий язык в решении очень сложных проблем.
145
В 60-70 годах биотехнологию рассматривали и пропагандировали как способ
использования научного потенциала богатых стран для решения проблем
бедных. Основной областью ее применения считали в это время производство
пищи. Биотехнология представлялась ядром, вокруг которого будут
формироваться эффективные и гармонично вписанные в окружающую среду
производства будущего.
Примеры традиционных биотехнологических производств.
Наиболее крупная область применения традиционной биотехнологии по
масштабам
и
стоимости
-
по-прежнему
пищевая
промышленность
(производство кисломолочных продуктов, соевого соуса, сыроварение,
пивоварение,
Вторая
по
виноделие
экономической
микробиологическая
и
значимости
промышленность,
пр.)
область
годовая
-
собственно
продукция
которой
оценивается в 30 млрд. дол., в США она прирастает на 5-7% ежегодно.
Крупнотоннажной ферментацией в асептических условиях производят
антибиотики, аминокислоты, промышленные ферменты, полисахариды,
биопестиуиды, витамины, биополимеры и пр.
Одним из самых крупных по объему и по значению биотехнологических
производств стало производство антибиотиков. Они сейчас производятся на
10-12 млрд. дол. в год. В середине XX в. они занимали первое место среди
фармацевтический продукции развитых стран. Их социальное значение было
очень велико, целый ряд грозных болезней надолго перестал терроризировать
человечество,
понизилась
детская
продолжительность жизни, особенно
смертность
и
повысилась
в развивающихся
странах, что
способствовало демографическому взрыву в развивающихся странах и
старению
Увеличилось
населения
количество
в
открытых
антибиотиков
развитых.
природного
происхождения. К 1945 году было открыто лишь 32 антибиотика, к середине
70-х годов эта цифра достигла трех тысяч, а в 80-е годы - более шести тысяч.
146
Однако в медицинской практике используются лишь десятки антибиотиков.
Применительно к продуцентам антибиотиков впервые начали практически
применять индуцированный мутагенез. Были разработаны принципиально
новые технологические подходы для выделения и очистки антибиотиков. В
СССР технология ферментации разрабатывалась в ВНИИ пенициллина
(теперь
Большое
ВНИИ
значение
в
антибиотиков).
организации
промышленности
по
получению
антибиотиков имело изучение их строения, путей биосинтеза их молекул,
механизма их действия. Появилась возможность регулировать этот процесс за
счет введения предшественников. Крупная веха в развитии этой отрасли
связана с разработкой методов модификации естественных антибиотиков
путем некоторых изменений в их структуре, осуществляемых химическим
или биологическим путем. Большое практическое значение имело получение
полусинтетических
производных
пенициллинов
и
цефалоспаринов.
Расширились области применения антибиотиков: получают специальные
немедицинские
антибиотики
для
животноводства,
птицеводства,
пчеловодства, растениеводства, пищевой, консервной промышленности и т.д.
Широкое (и часто неправильное) применение антибиотиков приводит к тому,
что
вырабатываются
устойчивые
к
ним
штаммы
болезнетворных
микроорганизмов и существующие антибиотики теряют эффективность. В то
время, когда медики были уверены в скорой полной победе над
инфекционными болезнями, появились новые болезни (СПИД и др.), и новые
формы старых болезней (туберкулеза и пр.), против которых не удается найти
эффективных средств борьбы. Поэтому приходится создавать все новые и
новые
препараты.
Биотехнологическими способами производится ряд витаминов для медицины
и сельского хозяйства, хотя в ряде случаев химический синтез оказался
рентабельнее и вытеснил микробиологическое производство.
147
Одним из направлений биотехнологии, с становлением которого связано
создание в СССР крупнотоннажных производств, стало индустриальное
производство белка одноклеточных. Проблема снабжения человечества
белком имеет большое социальное значение, так как более половины
населения земного шара (в том числе, к сожалению, и население современной
России)
питается
достаточного
неудовлетворительно,
количества
белка.
не
Внимание
получая,
к
в
частности,
проблеме
привлекли
исследования биологов и медиков середины XXв., которые позволили
выяснить, сколько белка и какого аминокислотного состава должно быть в
пищевом и кормовом рационе, к каким тяжелым последствиям (серьезным
заболеваниям, повышению детской смертности) приводит недостаток этих
веществ в питании. В связи с ростом населения, сокращением посевных
площадей из-за урбанизации, индустриализации, загрязнением океана и
другими причинами, эта проблема будет обостряться, и поэтому, наряду с
интенсификацией сельского хозяйства, очень важно и изыскание новых
альтернативных
ресурсов
белковых
веществ.
Перспективным источником белка является биомасса микроорганизмов. Она
может содержать большое количество (40-80%) белка, полноценного по
аминокислотному составу, в то время, как традиционные источники - мясо,
творог, бобовые растения - содержат 16-20% белка. Продуктивность
биотехнологических производств может быть очень высока: известны
микроорганизмы, удваивающие свою массу за 5-30 минут, в то время, как
удвоение белковой массы животных исчисляется годами или месяцами,
растений - неделями. Кроме того, микробиологическим методом можно
получать белок, содержащий избыток некоторых незаменимых аминокислот
(например, лизина), и это делает возможным его использование для
сбалансирования растительных белков, неполноценных по аминокислотному
составу.
148
Традиционно для получения кормовых или пищевых дрожжей использовали
отходы сельского хозяйства, целлюлозно-бумажной, молочной, сахарной,
гидролизной и других отраслей промышленности. Пищевые дрожжи
применялись во время обеих мировых войн. В 50-х годах большие надежды
были связаны с куьтивированием зеленой водоросли хлореллы, были
разработаны производственные процессы, но они так и не вышли из
экспериментальной стадии.
В конце 50-х годов французский исследователь Л.Шампанья, работавший на
British Petroleum (BP), показал возможность получения в промышленных
условиях биомассы дрожжей рода Саndida за счет их выращивания на
углеводородах нефти (н.парафинах), в 1962 году фирма построила первую
пилотную
Идея
фабрику
по
широкомасштабного
выпуску
промышленного
продукта.
автоматизированного
производства белка, не зависящего от случайностей погоды, нашествий
вредителей и болезней, отвечала технократическому духу эпохи, и во многих
странах была воспринята с энтузиазмом. Она казалась быстрым решением
проблемы голода и нехватки белка, особенно в развивающихся странах - тем
самым использованием достиженитй богатых стран для нужд бедных, о
котором мечтали биотехнологи. Крупные нефтехимические компании
Великобритании,
США,
Франции,
ФРГ,
Японии
разрабатывали
промышленные процессы получения "белка одноклеточных" на чистых
парафинах, нефтяных дистиллятах, природном газе и метаноле. В 1967 и 1973
годах проводились интернациональные конференции, где было одобрено
получение "белка одноклеточных" на углеводородах. В гонку с лидером - BP включились другие европейские компании (Shell, Hoechst, ICI), были
запущены первые производства. Но санитарные органы Японии, Франции,
Италии и других стран наложили запрет на применение этого продукта из-за
возможного отрицательного воздействия на здоровье людей. В 1976 г. за
рубежом эти предприятия были законсервированы. В 1985 г. Комиссия ЕЭС
149
запретила использование продукта, полученного на н-парафинах из-за
недостаточности данных о возможной патогенности дрожжей родаСаndida, а
также о биологическом действии синтезированных этими дрожжами жирных
кислот с нечетным числом атомов углерода и наличия в полученном продукте
остаточных углеводородов с возможным канцерогенным действием. Кроме
того, существовало мнение о нецелесообразности использования ценного
невозобновляемого сырья - нефти для получения кормового продукта, в
условиях наступившего нефтяного кризиса эти соображения стали играть
большую роль, повышение цен на нефть сделало проект намного менее
привлекательным экономически.
Работы по созданию технологии получения дрожжей на парафинах начались
в СССР и странах членах СЭВ (ГДР, ЧССР и др.). Производство кормового
белка на парафинах показалось руководству СССР простым решением
проблем животноводства, вызванных в первую очередь неэффективной
организацией сельского хозяйства, был принят ряд постановлений партии и
правительства по этому поводу. На реализацию проекта были выделены
большие средства. В 1963 г. для организации в промышленных условиях
процесса выращивания микроорганизмов на углеводородном сырье был
создан Всесоюзный институт биосинтеза белковых веществ. Над этой
проблемой работали специалисты более 200 институтов страны - Институт
микробиологии
АН
СССР,
Институт
биохимии
и
физиологии
микроорганизмов АН СССР, нефтяные, сельскохозяйственные и пищевые
институты и т.д. С 1964 г. проводились медико-биологические исследования
безвредности и биологической ценности дрожжей рода Саndida, выращенных
на парафинах. В материалах съездов КПСС, Пленумов ЦК КПСС
неоднократно отмечалась необходимость увеличения выпуска кормовых
дрожжей на этом сырье. В 1968 г. в Уфе был пущен опытно-промышленный
завод мощностью 12 тыс. т в год. В 1970 г. было сделано заключение о
высокой кормовой ценности препаратов и безвредности его применения в
150
животноводстве и в СССР началось строительство заводов - гигантов
мощностью 70-300 тыс. т по выпуску белковых дрожжей на н.парафинах,
получивших название паприн. Коллектив ученых , руководивших этими
исследованиями в 1971 г. был удостоен Государственной премии СССР. К
1982 г. в СССР производство паприна превысило 1 млн. т.
В 1989 г. на Всесоюзном симпозиуме, в работе которого приняли участие
специалисты СССР, ГДР, КНР, НРБ, ФРГ, ЧССР, ВНР были подтверждены
полученные в нашей стране данные о безвредности и высокой кормовой и
биологической
ценности
использования
паприна
в
животноводстве.
Советский Союз стал единственной страной в мире, где кормовые дрожжи в
крупных масштабах получали на углеводородах нефти. В нашей стране на
этот продукт с 1969 по 1990 г. было введено четыре стандарта, в которых
постепенно ужесточались требования к продукту. В 1984 г. Минздрав СССР и
Министерство сельского хозяйства выдали разрешение на применение
паприна для всех видов сельскохозяйственных животных и рыб.
Однако и в нашей стране периодически появлялись данные о негативных
последствиях проекта. Проблема обострялась тем, что, как это часто бывает в
нашей стране, был выбран наиболее дешевый вариант - негерметизированное
оборудование. Технологический уровень производств, особенно систем
контроля и управления, был невысок. Недостаточно эффективным оказалось
также очистное оборудование, у многих специалистов вызывала сомнение
безопасность используемых культур микроорганизмов (эти дрожжи условные патогены). Все это в сочетании с крупными масштабами и низкой
культурой
производства
(свойственной
большинству
отечественных
гражданских технологий рассматриваемого периода) привело к тому, что
вокруг предприятий, производящих паприн, воздух и водоемы заражались
белковой пылью и клетками продуцента, нарушалось природное равновесие,
создавалась среда, мало пригодная для жизни человека, участилась
заболеваемость. Негативно сказывались и общие для всей советской
151
промышленности авралы в конце года или квартала, падение трудовой
морали в стране, и как следствие, - безответственное отношение к своим
обязанностям многих работников различных уровней. Важный фактор низкий уровень экологической грамотности и недооценка опасности
экологического загрязнения руководством и большинством населения.
Очистка готового продукта также была несовершенной, что делало
небезопасной для человека полученную с его применением продукцию
животноводства.
В 1987 г. была проведена реконструкция существовавших в России заводов,
предусматривающая
более
полную
очистку
выбросов,
рециркуляцию
отработанных потоков. Но тем не менее в 90-х годах дорогостоящие заводы гиганты, производящие белковую биомассу дрожжей рода Саndida на
парафинах, остановились, в основном по экономическим причинам, более
скромные по размерам гидролизные заводы выпускают кормовой белок на
отходах производства, так бесславно окончился один из самых крупных
проектов
по
традиционной
биотехнологии
в
нашей
стране.
В заключение хочется отметить, что, несмотря на неудачный опыт,
производство
белка
одноклеточных
в
индустриальных
условиях
-
перспективное направление в решении проблемы дефицита пищевых
веществ, которая очевидно не потеряет своей актуальности ни в России, ни в
мире и в XXI в. Многие биотехнологи в мире считают, что опасения были
значительно преувеличены: белок одноклеточных, полученный на парафинах
нефти, не более опасен, чем многие традиционные продукты, и стал жертвой
предубеждения против непривычного продукта, растущего недоверия к науке
и
лоббирования
интересов
сельскохозяйственных
производителей
и
рыболовства. Были опубликованы сотни работ, доказывающих безопасность
этого белка, однако противники не верили в их результаты, считая их
инспирированными
заинтересованными
производителями.
Значительно меньше возражений вызывают процессы, где в качестве
152
субстрата для получения белка одноклеточных используются возобновляемые
ресурсы (некачественное зерно, биомассу быстрорастущих растений), отходы
промышленности (в первую очередь - пищевой) и сельского хозяйства,
имеющие отрицательную себестоимость, или чистое сырье (метанол, этанол и
т.д.). В этом направлении у ученых в России имеется большой задел,
использование которого могло бы помочь стране выйти из зависимости от
импорта
продовольствия,
улучшить
структуру
питания
населения
и
обеспечить ее продовольственную безопасность.
Применение микробиологического синтеза для получения в индустриальных
масштабах аминокислот (составных компонентов белка) - это сравнительно
новая отрасль промышленности, также имеющая большое значение в
решении проблемы глобального дефицита белковых веществ. Ее продукция
оценивается в 2,5-3 млрд.дол. в год [Error: Reference source not found]. Для
полноценного питания людей и животных важны не только количество, но
аминокислотный состав белков в пище, недостаток некоторых незаменимых
аминокислот
может
вызвать
серьезные
проблемы.
Первое промышленное производство глутаминовой кислоты - ценной
пищевой добавки - было организована в Японии в 50-60-х годах после того
как С.Киносита с сотрудниками обнаружили способность микроорганизмов к
сверхсинтезу аминокислот и подобрали условия для синтеза этой кислоты в
значительных количествах. Это открытие привлекло внимание ученых,
появились тысячи патентов и публикаций, производство аминокислот было
организовано в ряде стран. Всего в мире получают около 500 тыс. тонн
аминокислот
в
год.
В
СССР
технологию
получения
аминокислот
разрабатывали В.Н.Букин, М.Е.Бекер, Ю.0.Якобсон и др. Аминокислоты
применяются как добавки к пище, в медицине, в животноводстве (в качестве
кормовых добавок), в растениеводстве (при синтезе средств защиты растений)
и в промышленности (при синтезе полимеров, в качестве добавок к
моторному топливу для улучшения эксплуатационных характеристик, для
153
электрохимического получения различных покрытий, сплавов, в фотографии
и
т.д.).
Лекция 13. Одноклеточный белок.
Главной проблемой, стоящей перед человечеством (и, в частности, перед
развивающимися странами), является взрывоподобный рост населения. В
1988 г. требовалось накормить 4 млрд "ртов", а в 2000 г. – 6 млрд.
Естественно, что традиционное сельское хозяйство не сможет удовлетворить
пищевые потребности растущей численности населения, особенно белковым
питанием. Уже в настоящее время Международная Организация питания и
сельского хозяйства (FAO) предсказывает резкое увеличение пропасти в
обеспечении белком между развитыми и развивающимися странами. По
меньшей мере 25% мирового населения в настоящее время страдает от голода
или недостатка питания и несоразмерно большая часть этого населения живет
в развивающихся странах, где засушливый климат и мало плодородные почвы
затрудняют ведение продуктивного сельского хозяйства.
И тем не менее продуктивность сельского хозяйства во всех его отраслях
постоянно повышается практически по всему миру. В этом процессе,
конечно, определенную помощь окажут и различные биотехнологические
новшества,
призванные
усовершенствовать
традиционные
сельскохозяйственные приемы. Даже сейчас во многих регионах Земли
постоянно появляются пищевые излишки, особенно велико их количество в
Северной Америке и Европе, где практически постоянна популяция людей.
Кроме того, ряд стран, ранее являвшихся чистыми импортерами большинства
пищевых продуктов (такие, как Индия и Индонезия), в настоящее время
сумели
наладить самообеспечение. И все же в мире имеет место
несбалансированность в снабжении населения хлебом и этот недостаток
постоянно усугубляется в связи с изменениями в неблагоприятную сторону
154
глобальной погоды (в частности,
национальными
разрушением
и
сильные
межнациональными
сельского
хозяйства
и
ливни,
засухи),
а
также
войнами,
сопровождаются
колоссальными
перебоями
в
распределении питания.
По данным ряда специалистов, мировой дефицит белка оценивается в 30–35
млн т. Причем степень дефицита варьирует в зависимости от страны и должна
рассматриваться в рамках каждой национальной экономики. Сдвиг от
злаковой к мясной диете в различных странах приобретает разительные
масштабы и ведет к увеличению расхода зерна в пересчете на человека,
поскольку требуется от 3 до 10 кг зерна, чтобы произвести 1 кг мяса путем
повышения эффективности животноводства и совершенствования кормовых
программ.
Поиски дополнительных источников белка предпринимаются постоянно и
повсеместно. Широко внедряются новые сельскохозяйственные приемы;
получаются
новые
сорта
злаков, характеризующиеся повышенным
содержанием белка; там, где это позволяют климатические и другие
природные условия, интенсивно внедряется выращивание сои и земляного
ореха; белки начинают экстрагироваться путем ультрафильтрации из
определенных
жидких
отходов;
и
наконец,
разрабатываются
новые
нетрадиционные способы производства белковых соединений.
Определенные успехи достигнуты в получении белка с помощью микробного
синтеза. Это направление получило название производства одоклеточного
белка (SСP), поскольку большинство микроорганизмов, используемых для
этих целей, растут в виде одноклеточных или мицелиальных (нитевидных)
особей, а не как сложные многоклеточные организмы (растения или
животные).
Понятие "съедобные микробы" звучит несколько странно, однако люди давно
распознали питательную и вкусовую ценность некоторых микроорганизмов, а
именно грибов. Но даже и в этом случае скептицизм и предвзятость
155
оказывают
существенное
влияние
на
отношение
людей
к
этому
великолепному пищевому продукту. И в то время как во многих странах
грибы достаточно широко употребляются в пищу, население других стран их
игнорирует и избегает использовать.
Хотя грибы в настоящее время во многих странах выращиваются в довольно
больших количествах и широко употребляются в пищу и рассматриваются
как весьма перспективный и удобный способ производства пищевых
продуктов, использование других микробов пока что менее приемлемо, так
как существуют многие проблемы, не являющиеся по своей природе
технологическими.
И все же на протяжении последних двух-трех десятилетий отмечается явный
растущий интерес к использованию различных микроорганизмов для
производства пищевых продуктов, в частности дня скармливания домашним
животным. Полагают, что применение одноклеточного белка, получаемого на
дешевых субстратах, для корма животных окажет большое влияние на
улучшение питания людей в результате снижения их конкуренции с
животными за растительную пищу, богатую белком.
Преимущества
микроорганизмов
как
продуцентов
белка
состоят
в
следующем: микроорганизмы обладают высокой скоростью накопления
биомассы, которая в 500–5000 раз выше, чем у растений и животных;
микробные клетки способны накапливать очень большие количества белка
(дрожжи – до 60%, бактерии – до 75% по массе); в микробиологическом
производстве
вследствие
высокой
отсутствует
многостадийность
специфичности
процесса;
а
сам
микроорганизмов
процесс
биосинтеза
осуществляется в мягких условиях при температурах 30–45° С, рН 3–6 и
давлении около 0,1 МПа. Помимо всего прочего, микробиологический путь
получения богатой белком биомассы менее трудоемкий по сравнению с
получением сельскохозяйственной продукции и органическим синтезом
белка.
156
Все эти преимущества и определили быстрое развитие технологии
производства микробного белка, которое в настоящее время является самой
крупнотоннажной
отраслью
биотехнологии
и
открывает возможность
промышленной продукции различных кормовых добавок для животноводства
и птицеводства с помощью микроорганизмов. Причем получаемые продукты
характеризуются высокой кормовой ценностью и в достаточных количествах.
Большое число компаний во всем мире участвует в этих процессах и уже
производится значительное количество достаточно ценных продуктов такого
рода.
Основной целью продукции одноклеточного белка является его содержание в
препарате. Однако следует иметь в виду, что помимо белка микроорганизмы
содержат также и другие вещества: углеводы, витамины, нуклеиновые
кислоты и различные минеральные соединения, часть из которых может
оказывать и неблагоприятное действие на организм, при использовании в
пищу человека или животных. Так, вследствие ограниченной способности
человека деградировать нуклеиновые кислоты, прежде чем использовать
одноклеточный протеин в качестве пищевого продукта, он должен
подвергаться специальной обработке.
Тем не менее высокое содержание белка, слабый запах и мягкий вкус
одноклеточного протеина в сочетании с легкостью хранения придают
существенную ценность этому продукту питания. Кроме того, он с успехом
может применяться в так называемых водных культурах: например на фермах
для разведения креветок, форели, семги и т. п. Преимущества микробного
белка
перед
животным
демонстрируются
(в
следующими
отношении
быстроты
получения)
цифрами: продукционная способность
коровы весом в 250 кг и 250 г дрожжей практически одинакова. В то время
как корова будет прибавлять в день по 200 г веса, микробы за этот же период
времени способны произвести (теоретически, в идеальных условиях
культивирования) до 25 т биомассы. Однако корова обладает уникальной
157
особенностью
превращать (конвертировать) траву в богатое белком и
другими ценными веществами молоко! Несмотря на многолетние попытки
разработки конкурентоспособного способа подобного типа конверсии, все
они остались пока безрезультатными. Поэтому коровы в настоящее время
рассматриваются
как
"живые,
самовоспроизводящиеся
и
съедобные
«ферменторы»! Поэтому вопрос о замене коров микроорганизмами в
пределах обозримого будущего остается открытым.
Помимо чисто технологических и экономических сложностей, существенное
влияние на развитие производства одноклеточного белка оказывают
географические,
факторы,
политические,
которые
порой
социологические
оказываются
в
и психологические
значительной
степени
определяющими. В частности, большое внимание уделяется проблемам
безопасности, питательной ценности и применимости данного продукта.
Природа сырьевого материала, используемого в производстве одноклеточного
белка,
представляет
известную
опасность:
например,
потенциальная
канцерогенность углеводородов нефти и н-парафинов, наличие тяжелых
металлов или других загрязняющих примесей в минеральных
солях,
присутствие остатков растворителей после экстракции продукта, а также
токсинов
(в
частности,
микотоксинов),
образуемых
некоторыми
микроорганизмами (например, определенными грибами), и т. д. Поскольку
организм-продуцент должен быть непатогенным и нетоксигенным, а его
продукты
метаболизма безвредными, строгий санитарный режим и
различные процедуры контроля качества должны постоянно осуществляться в
течение всего биотехнологического процесса в целях предотвращения порчи
продукта, а также
загрязнения
его
патогенными
или
токсигенными
микроорганизмами.
Применимость одноклеточного белка как пищевого продукта для человека
зависит не только от его безвредности и питательной ценности, но также и от
ряда других факторов. Помимо обычного нежелания людей потреблять
158
вещества, получаемые из микробов, процесс питания характеризуется
многими неуловимыми психологическими, социальными и религиозными
аспектами.
У
различных
культур
существует
достаточное
число
специфических ассоциаций с едой, общественным положением, а также
символической значимостью различных видов пищи. Должны также
учитываться более явные особенности, связанные с применимостью
продукта: запах, цвет, вкус, консистенция и внешний вид. Так, например,
одноклеточный белок может использоваться в качестве пищи для человека,
по-видимому,
лишь
при
относительно
малом
его количественном
содержании в обычных традиционных продуктах. Поэтому в настоящее время
он может служить преимущественно как источник питания для различных
видов домашних животных, птиц или рыб. И все же уже теперь некоторые
промышленные процессы направлены на изготовление микробных продуктов
для человека: например, грибной белок фирмы Ranks Hovis McDougall/ICI.
Какие же факторы, помимо технологических, оказывают влияние а
расширение производства одноклеточного белка? Главным образом это
политические и социальные аспекты использования для его получения
нефтепродуктов как субстратов для культивирования продуцентов, поскольку
последние
могут
быть
существенно
загрязнены канцерогенными
веществами. В силу этого обширные программы, связанные с производством
одноклеточного белка, в Японии, Италии и Британии в свое время были
приостановлены
и
усилия
биотехнологов были
направлены
на
его
производство из этанола или метанола либо на основе различных
органических отходов, являющихся потенциально менее опасными.
Одноклеточный белок на высокоэнергетических субстратах.
Представляющие существенное коммерческое значение как источники
энергии материалы (нефтегаз, метанол, этанол, метан и н-алканы) привлекают
внимание биотехнологов как субстраты ряда биотехнологических процессов,
главными участниками которых являются бактерии и дрожжи. Естественно,
159
что в разработке технологий использования
принимают
участие
обсуждалась
и
подобных
материалов
многие нефтяные компании, а сама проблема
изучается
различными
научно-исследовательскими
учреждениями. Наиболее подробно как сырье для получения одноклеточного
белка изучался метан, хотя в настоящее время в его использовании для
указанной цели имеется достаточно большое количество трудностей. В
противоположность этому, большое значение придается метанолу. Так,
компанией ICI в Великобритании разработана крупномасштабная (75 000 л)
ферментация растительного сырья для метанол утилизирующих бактерий.
Компании Hoechst (Германия) и Mitsubishi (Япония) также работают над
аналогичными технологиями, предназначенными для использования в
качестве продуцентов биомассы дрожжевых клеток вместо бактериальных.
Продукт, выпускавшийся компанией ICI (называемый прутин), использовался
исключительно для скармливания животным. Метанол как источник углерода
для получения одноклеточного белка обладает многими преимуществами по
сравнению с н-парафинами; в нем отсутствуют потенциальные токсичные
вещества, он легко растворим в водной фазе в любых концентрациях и при
культивировании на средах с метанолом в получаемой биомассе отсутствуют
какие-либо остатки углерода (хотя бы потому, что он легко испаряется).
Кроме того, имеют значение и другие важные моменты технического
порядка.
Завод компании ICI для производства прутина является единственным в
своем роде в западном мире и в настоящий момент вследствие цен на метанол
не работает с надлежащим экономическим эффектом, поскольку стоимость
метанола составляет примерно 50% от стоимости
стоимость
одноклеточного
продукта.
В
США
белка, полученного на метаноле в 2–5 раз
дороже, чем при его производстве из рыбной муки. На Среднем Востоке
низкая стоимость метанола и относительно высокие цены на рыбную муку
в
сочетании
с необходимостью производства большого количества
160
животных продуктов делают одноклеточный белок типа ICI-прутина весьма
привлекательным.
Относительно благоприятная ситуация для производства одноклеточного
белка на н-парафинах нефти сложилась в 70-е годы в бывшем Советском
Союзе, что было связано с низкими внутренними ценами на нефть. Были
построены три крупных завода по культивированию дрожжей рода Candida
(в том числе один в Новополоцке). В лучшие годы продукция дрожжевого
белка достигала 1 млн т сухой биомассы и обеспечивала потребности
сельского хозяйства (добавка в корм животных) и промышленности. Но в
середине 80-х все эти заводы остановились в связи с высокой себестоимостью
микробного белка (цена была в 2 раза выше, чем кормовой соевый белок).
Широкий спектр исследований, выполненных в 1960-е и 1970-е годы по
использованию метанола и сходных соединений в качестве субстратов для
получения
одноклеточного
белка,
дали
существенный
стимул
совершенствованию ферментационных технологий, направленных на его
производство в крупномасштабных количествах. Упоминавшееся выше
аэробное производство прутина является самым крупным из непрерывных
процессов и, по существу, представляет собой крупнейшую в мире
биотехнологичеокую
систему,
что
в
свою
очередь,
вследствие
необходимости строжайшей экономии, обусловило прогресс в разработках
биореакторов с восходящим воздушным потоком (эрлифтных ферменторов).
Весьма
подходящим
сырьем
для
получения
одноклеточного
белка,
предполагаемого к использованию в пищу человека, является этанол. В
скором времени перспективы производства одноклеточного белка на этаноле
будут определяться рядом локальных факторов: возможностями расщепления
этилена,
наличием
излишков
углеводов
сельскохозяйсвенного
происхождения, политическими ситуациями врегиональной экономической
самостоятельности, а также состоянием уровня мирового производства.
Одноклеточный белок на отходах.
161
Рециклизация
отходов
растений,
появляющихся
в
различного
рода
производствах (таких, как солома, выжимки, отходы цитрусовых, сыворотка
молока, меласса, навоз животных и бытовые сточные воды), представляет
существенную проблему биотехнологии. В отдельных местах количество
таких отходов достигает значительных величин, что является источником
серьезного загрязнения различных водных систем и вообще окружающей
среды. Поэтому использование указанных органических отходов может
способствовать достижению двух целей: снижению загрязнения и созданию
пищевого белкового препарата. Привлекательность растительных отходов,
содержащих углеводы, состоит в их низкой стоимости, в результате чего
удешевляется
биотехнологический
процесс,
а
также
в
том,
что
одноклеточный белок может быть получен при относительно небольшом
количестве операций.
Обоснованием для разработки технологии производства одноклеточного
белка на растительных отходах является их пригодность для микробной
конверсии, наличие в достаточных количествах и в течение длительного
периода,
а
также
уровень
уже
имеющихся
технологий.
Процессы,
использующие продукты отходов в производстве одноклеточного
базируются
на
основании
белка,
коммерческих соображений с применением
различных дрожжевых организмов в подходящих ферменторных системах.
Субстратами для организмов-продуцентов служат: меласса (Sacharomyces
cerevisiae), молочная сыворотка
в
производстве
сыра
(Kluyeromyces
fragilis), отходы крахмального производства с использованием двух видов
дрожжей (Endomycopsis fibuligera и Candida utilis). Питательная ценность
дрожжей,
получаемых
многочисленных
в
обширных
данном
процессе,
экспериментах
по
была
определена
скармливанию
в
этого
одноклеточного белка различным видам животных (свиньям, цыплятам и
телятам). В проведенных опытах регистрировался хороший рост животных и
отсутствие неблагоприятных последствий.
162
Заслуживает внимания новый продукт – Pekilo, представляющий собой
грибной белок, получаемый путем ферментации углеводов мелассы,
молочной сыворотки, отходов фруктов, гидролизатов древесины или
сельскохозяйственного
сырья.
Продукт
характеризуется
хорошим
аминокислотным составом и богат витаминами. Испытания на животных
показали, что Pekilo-протеин является хорошим источником белка в питании
свиней, телят, бройлеров, кур-несушек и производится при непрерывном
культивировании. Используемый для его производства организм является
мицелиальным грибом, а получаемый продукт обладает выраженной
фиброзной структурой, что делает готовый препарат удобным для
применения.
В Британии компания Ranks Hovis McDoudall совместно с корпорацией ICI
поставляет на рынок другой грибной белок (mycoprotein), получаемый при
выращивании гриба Fusarium на простых углеводах. Непохожий почти ни на
один из других типов, одноклеточный белок микопротеин производится для
употребления
в
пищу
людей.
Продукт
также
производится
путем
непрерывной ферментации. Разработка и внедрение данного микопротеина
(получаемого с помощью гриба Fusarium фирмой Ranks Hovis McDoudall)
оценивается по произведенным затратам более чем в 40 млн. фунтов
стерлингов, а осуществление проекта заняло свыше 20 лет. Первоначально
процесс осуществлялся посредством одноразовой ферментации, но затем
была разработана технология непрерывного культивирования. Кульминацией
проекта считается не только продукция грибной биомассы, но и получение
ценных для пищевого продукта характеристик.
Целлюлоза в сельскохозяйственных и лесных материалах, а также в
различных отходах должна составить в недалеком будущем основной
сырьевой компонент для многих биотехнологических процессов, включая и
одноклеточный белок. Целлюлоза в ее естественной ассоциации с лигнином
до сих пор является наиболее распространенным органическим веществом
163
для биологической конверсии. Различные исследовательские учреждения
настойчиво изыскивают пути предварительной обработки биологических
материалов подобного рода с
целью деструкции лигнинового барьера
(преимущественно физическими и химическими методами).
Удаление лигнина из лигноцеллюлозы делает последнюю потенциальным
источником энергии для жвачных животных, способных использовать ее в
качестве пищи. Таким путем лигноцеллюлозные материалы (солома,
выжимки и даже древесина) могут стать полезными кормовыми препаратами
для животных.
Многие виды грибов долгое время служили пищей для человека и
выращивались на лигноцеллюлозных материалах. Данные процессы являются
примерами
низкоэнергетических
технологических
систем.
Процессы
различаются по типу используемого субстрата или получаемого продукта, а
также по степени изощренности (изобретательности) методологии процесса.
В то время как большинство процессов получения одноклеточного белка
основано на жидкостных ферментациях, многие из современных способов
деградации
целлюлозы
базируются
на ферментации с пониженным
увлажнением, известной под термином «твердофазная ферментация».
Во
многих
странах
сельскохозяйственных
некоторая
часть
производствах,
соломы,
традиционно
получающейся
в
используется
для
компостирования с лошадиным навозом для получения субстрата, пригодного
при
выращивании
грибов
(Agaricus
lisporus
).
Ежегодно
"грибная"
промышленность Британии потребляет около 300 000 т соломы для
приготовления компоста, на котором выращивают грибы. Технологии,
основанные на использовании микроорганизмов и методов биохимической
инженерии в целях производства больших количеств биомассы, напоминают
сельскохозяйственное производство. Однако так называемый "грибной
процессинг", рассматриваемый в качестве примера общей биотехнологии,
считается
какой-то
пренебрежительной
164
областью
"новых"
биотехнологических разработок, хотя большое число съедобных грибов в
настоящее время выращивается искусственным путем в различных странах
мира. Новинки в эту область стали проникать сравнительно недавно, однако
"вознаграждение" в скором будущем окажется, по оценкам специалистов,
огромным. Биотехнология, как ни странно, не всегда должна быть высоко
технологичной. В развивающихся странах, где дорогостоящие системы могут
оказаться неприемлемы в виду стоимости процессов и отсутствия грамотных
операторов,
различного
рода
новые
биотехнологические
разработки
целесообразно использовать для совершенствования (улучшения) уже
существующих традиционных микробиологических процессов.
Основными примерами твердофазной ферментации являются многие типы
обработки ряда пищевых продуктов, применяющиеся в странах Востока. В
этих процессах некоторые мягкие материалы (горох, бобы, отруби и т. п.)
служат объектами микробной переработки (гидролиз крахмала и белков) с
целью получения продуктов улучшенного качества (например, улучшение
аромата продукта, обогащение его белком и аминокислотами). Примерами
традиционной пищи на Востоке являются мисо, соевый соус и др., обычно
изготавливаемые в "домашних" масштабах. Однако многие из этих блюд
составляют основу крупных промышленных
существенного
биотехнологического
производств,
оснащения.
Подобные
требующих
блюда
и
ароматизированные соусы медленно, но верно, распространяются на Запад и
несомненно станут в недалеком будущем составной частью нашего
ежедневного меню.
Одноклеточный белок из сельскохозяйственного сырья.
Выше было показано, каким образом микроорганизмы могут использоваться
для получения одноклеточного белка из органических отходов типа сахаров,
крахмала и целлюлозы. Почему же в таком случае не выращиваются растения
специально для применения в качестве субстрата, на котором можно было бы
получать одноклеточный белок микробиологическим способом? Концепция
165
производства
растительной
биомассы
в
качестве
материала
для
биотехнологических процессов крайне актуальна и важна. В настоящее время
такого рода программы используются в большей степени для производства
этанола, но вполне обоснованно полагать, что маниока, сахарный тростник и
некоторые виды пальм могут явиться перспективным сырьем, которое
подвержено быстрым ферментативным обработкам с достаточно высоким
экономическим эффектом. Если лигноцеллюлоза окажется способной легко и
экономически выгодно утилизироваться какими-нибудь микрорганизмами,
то большинство районов мира получат готовые питательные субстраты,
пригодные для различных биотехнологических процессов.
Одноклеточный белок из водорослей.
Одно время существовал повышенный интерес к проблеме использования
водорослей в качестве одноклеточного белка, поскольку они хорошо растут в
открытых прудах и нуждаются только в СО2 как источнике углерода, а также
в солнечном свете как источнике энергии для фотосинтеза. Такие водоросли,
как Chlorella и Scenedesmus, долгое время использовались в пищу в Японии, a
Spirulina широко применялась в Африке и Мексике. В некоторых странах
мира водоросли выращивают в прудах или лагунах для удаления с их
помощью ряда органических загрязнений, а образующуюся массу собирают,
высушивают и добавляют в порошкообразном виде в корм животным.
МОДУЛЬ 4 «БИОТЕХНОЛОГИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ»
Лекция 14. Культивирование клеток растений и животных в условиях
in vitro.
Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить
из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro,
датируется первым десятилетием XX века. После того как стало известно,
что подобные процессы реальны, наступил второй этап работ, начало
166
которому положила демонстрация возможности выращивания и репродукции
в таких клетках фильтрующихся инфекционных агентов—вирусов. Третий
этап истории начинается со времени, когда была показана практическая
возможность получения в клетках животных больших количеств вирусного
материала для применения в вакцинных препаратах, и простирается до
времени, когда: 1) стало возможным вставить в клетки специфические
экзогенно полученные гены и получить их экспрессию и 2) подтверждена
возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой
популяции. Когда такие популяции получали из клетки, выделявшей в
окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной
жидкости были одинаковыми. Причины и следствия этих двух феноменов в
настоящее время интенсивно исследуются и они знаменуют собой начало
четвертого этапа работ в данной области.
Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре,
потребовалось овладеть рядом подходов и методик. Особенности их
приведены ниже.
1. Методики получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и
грибов.
2. Методики разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или
изолированных клеток не подавляется.
3. Методики наблюдения за клетками в динамике их развития.
4. Методики непрерывного культивирования культур клеток животных in
vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.
Научную основу для разработки этих методик составляет представление о
клетке как основном структурном элементе живых организмов животного и
растительного происхождения. Идея о том, что клетки тканей животных
можно выделить из организма и затем создать условия для роста и
воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей
Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны
167
сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в
окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться
поддерживать свои внутренние условия. Если различия между внутренними
и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста
и деления клетки. Такое понимание явления приводит к необходимости
разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне
организма.
Чуть позже, в 1885 году, У. Ру (W. Roux) показал возможность сохранения
вне организма живых тканей на практике. Он сохранял в жизнеспособном
состоянии оболочку куриного эмбриона в теплом физиологическом растворе.
Впоследствии он стал автором, активно публиковавшимся по проблемам
эмбриологии in vitro. Позднее, в 1897 г., Лёб (Loeb) поддерживал в
жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в
пробирках с сывороткой и плазмой крови. Льюнгрен (1898) показал
возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном
состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации.
Дополнительные
эксперименты
были
проведены
Джолли
(1903),
наблюдавшим деление клетки в висячей капле, содержащей лейкоциты
саламандры, а Биб и Эвинг (1906) подтвердили это при пересадке
лимфосаркомной ткани собаки.
Продолжая работы Ру, Росс Харрисон усовершенствовал методику «висячей
капли». Он использовал небольшие кусочки ткани, отторгнутые от
медуллярного сосуда лягушки к внедренные в ее лимфатический тромб, и
выдерживал их в виде капли на нижней стороне покровного стекла,
расположенного поверх углубления в предметном стекле. В 1907 г. ему
удалось наблюдать с помощью такой «камеры» рост нервных клеток в
течение нескольких недель; он установил, что скорость роста этих клеток
составляет 20 мкм за 25 мин. В то время как эксперименты Харрисона были
направлены на то, чтобы получить ответы на вопросы, относящиеся к
168
физиологии нервных клеток лягушки, методика, которой он пользовался,
была применена Барроузом для других клеток тканей теплокровных
животных. Этот исследователь в 1910 г. вместо лимфатического тромба
использовал тромб плазмы курицы.
В 1913 г. Алексис Каррель применил плазму крови, обогащенную экстрактом
эмбриона. Добавка такого экстракта ускоряла рост тканей. Примененная
методика обеспечивала значительно большую вероятность успеха, чем та,
которую использовали Левис (1911) и Рид (1908 г.). Рид готовила культуры
клеток из костного мозга морской свинки и пыталась выращивать
эксплантаты на среде определенного химического состава. Работа Карреля
привлекла большое внимание, так как она была опубликована под
интригующим названием — культивирование «бессмертных» клеток.
Инкубация клеток сердца куриною эмбриона была начала 17 января 1912 г.
Пересев клеток продолжил Эблинг, как он сам заявлял, работая с ними 34
года. Поскольку Каррель был хирургом и весьма сведущим в вопросах
асептики, он смог внести существенный вклад в культивирование клеток
животных in vitro. В то же время организация и технические условия
проводимых экспериментов были очень громоздкими. Ассистенты Карреля
были одеты в длиннополые резиновые халаты темного цвета с капюшонами
для
полного
прикрытия
головы.
Процедуры
были
длительными
и
отягощенными многими деталями. В результате тех требований, которые
выдвигались автором в отношении сложных мер предосторожности для
предотвращения
контаминации,
вокруг
данного
предмета
создалась
атмосфера таинственности и исключительности, что скорее тормозило
прогресс, чем способствовало ему. Тем не менее им было достигнуто многое.
В частности, даже при отсутствии антибиотиков он добился успеха в
пересадке клеток, используя хирургическую технику для отторжения
отдельных колоний и переноса их в новые условия роста. Каррель также
169
продемонстрировал своим коллегам научное значение тех наблюдений,
которые могут быть сделаны в процессе пересадки клеток.
В ходе проделанных работ был внесен ряд поправок в рецептуру среды
культивирования. В частности, Тирод модифицировал раствор Рингера и в
дополнение к куриной сыворотке и эмбриональному экстракту стал
использовать коагулят фибрина. Для наблюдения за делящимися клетками
животных Канти в 1928 г. разработал метод кинофотомикрографии. В этот
же период был разработан дополнительный и очень существенный подход в
технике работы с клетками. Имеется в виду применение трипсина для
высвобождения клеток из тканевой матрицы, в которой они находятся.
Однако эта методика не находила признания до тех пор, пока в 1937 г. Симмс
и Стидлман использовали ее для пассирования клеток между культурами
плазмы. Эта методика дает возможность успешно применять в культурах
индивидуальные клетки, а не ткани.
Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены
Эрлом с сотрудниками в 1948 году. Игл (1955) систематически исследовал
пищевые потребности клеток в условиях. До тех пор пока в 1961 г. Хейфлик
и Мурхед не выделили линию диплоидных клеток человека (НДС) WI-38,
считалось,
что
один
раз
установившаяся
клеточная
линия
имеет
неограниченное время жизни. Относительно линии WI-38 было показано, что
период ее существования в культуре ограничивается приблизительно 50
удваиваниями популяции. Перед отмиранием популяции для клеток этой
линии характерен феномен старения. Однако при отмирании эти клетки
оставались диплоидными и не имели признаков злокачественных изменений.
Клетки, выделенные из раковых опухолей или трансформированные в ходе
культивирования, характеризуются «бессмертностью» и коррелируют с
гетероплоидностью. Первые суспензионные культуры клеток животных, как
правило, основывались на клетках злокачественных тканей. Это — клетки
HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека. Перевиваемая
170
линия карциномы шейки матки была выделена еще в 1952 году Джеем с
сотрудниками, она используется и в настоящее время во многих
лабораториях мира.
Последующий этап в истории культивирования диплоидных клеток человека
связан с установлением факта, что они являются генетически стабильными и
свободными от всех известных латентных и онкогенных вирусов. Поэтому
линии диплоидных клеток человека разрешено применять для получения
продуктов, предназначаемых для людей. Эта догма остается действующей и в
настоящее время, хотя новейшие открытия отчетливо показали присутствие в
клетках, выделенных из нормальных тканей, потенциальных онкогенов,
идентичных тем, которые найдены в таких известных онкогенных вирусах,
как вирус саркомы Рауса и вирус саркомы Молони. Раус еще в 1910 году
индуцировал опухоль, использовав профильтрованный экстракт куриной
опухоли. Эта опухоль была индуцирована РНК-вирусом (вирус саркомы
Рауса). Позднее было установлено, что ряд вирусов способен индуцировать
возникновение опухолей, такие вирусы были названы онкогенными.
Животные
ткани.
Животные
клетки
выращивают
in
vitro
либо
прикрепленными к подходящей подложке, либо суспендированными в
жидких питательных средах. Для масштабного выращивания клеток
используют
реакторы
для
промышленного
культивирования
микроорганизмов. Различают 3 типа культуры клеток: первичные культуры,
получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого
пересева; диплоидные культуры (см. диплоид), чаще получаемые из
эмбриональных тканей и сохраняющие до 50 пересевов диплоидный набор
хромосом, которые затем трансформируются в постоянные (перевиваемые)
гетероплоидные культуры, существующие вне организма десятки лет. В
отличие от культуры клеток, задачей культуры органов, осуществляемой с
применением жидких или твердых сред в стеклянных капиллярах, на
171
покровных стеклах и нитроцеллюлозных фильтрах, на агаре и т. п., является
сохранение нормальной структуры тканей и нормального их развития.
Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и
дифференцировки клеток, гистогенеза, межтканевых и межклеточных
взаимодействий, обмена веществ и т. п. Культуры животных клеток являются
важными
продуцентами
многих
клеточных
продуктов,
например,
противовирусного агента интерферона. На них выращивают вирусы для их
идентификации и получения вакцин. Клеточные культуры часто применяют
при тестировании и изучении механизма действия лекарственных и
косметических средств, пестицидов, консервантов и т. п. Методы культуры
клеток нашли широкое применение для реконструкции различных тканей и
органов. Так, культура клеток кожи используется для заместительной
терапии при ожогах, культура клеток эндотелия - для реконструкции стенок
сосудов. Способность клеток к росту в культуре привела к развитию методов
клонирования (см. клон), хранения и слияния клеток (см. клеточная
инженерия), что, в свою очередь, вызвало становление новой области науки генетики соматических клеток (см. сома). Органные культуры используются
при изучении закономерностей развития органов, для изучения способов
сохранения жизнеспособности изолированных органов, предназначенных для
трансплантации.
Растительные ткани. Идея о возможности культивирования растительных
клеток была высказана еще в конце 19 - начале 20 вв. немецкими учеными Х.
Фехтингом (1892), С. Рехингером (1893) и Г. Габерландтом (1902). Однако
лишь в 1922 американскому исследователю В. Роббинсу удалось в течение
нескольких недель культивировать корневые меристемы томатов. Начало же
успешному развитию метода культуры клеток и тканей растений положили
работы Р. Готре (Франция) и Ф. Уайта (США), показавших в 30-е годы
способность каллюсных культур (см. каллюс) к неограниченному росту.
Американский ученый Ф. Стюард, работая с культурой изолированной
172
флоэмы моркови, получил из нее в 1958 целые растения. Значительный вклад
в развитие культуры клеток и тканей растений в нашей стране внесли
исследования Р. Г. Бутенко и ее сотрудников, использовавших эти методы
для изучения физиологии растительных клеток и морфогенеза растений.
В целом термин «культура клеток, органов, тканей» применяется
к асептически выращиваемым частям растений:
1. каллусным тканям на агарированной среде;
2. суспензионной культуре клеток и небольших агрегатов в
жидкой среде;
3. культуре протопластов;
4. изолированным зародышам;
5. изолированным органам (кончиков корней, меристемам
побегов).
Тотипотентность растительной клетки. Методы культивирования
изолированных фрагментов растений основаны на сследовании важного
свойства растительной клетки – тотипотентности. Тотипотентность (лат.
Totus – весь, potentia - сила) – это свойство клетки реализовать генетическую
информацию, обеспечивающую её дифференцировку и развитие до целого
организма.
Тотипотентностью
обладают
оплодотворенные
яйцеклетка
растений и яйцо животных организмов. Что касается дифференцированных
клеток, то у животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам
кишечнополостных. Так, соматические клетки гидры дают начало новому
организму. У высших животных с ранних этапов эмбриогенеза, с началом
специализации клеток, тотипотентность не реализуется. Однако клетки,
изолированные из эм брионов млекопитающих, в условиях культивирования
способны сохранять плюрипотентность – способность дифференцироваться
во все типы клеток как собственно зародыша, так и экстраэмбриональных
тканей. Такие клетки получили название эмбриональных стволовых клеток, с
ними связывают решение проблемы пересадки тканей.
173
У растений в природных условиях тотипотентность могут проявлять и
специализированные клетки. Пример тому – вегетативное размножение, в
том числе наблюдения в результате развития растений из клеток листьев
бегонии, каланхое и др. Тотипотентность у растений реализуется при
заживлении
ран;
на
раневой
поверхности
растений
в
результате
неорганизованной пролиферации клеток происходит развитие каллуса
(лат.Callus – мозоль, толстая кожа). Каллус способствует заживлению ран.
Однако многие однодомные растений утратили способности к образованию
каллуса и вегетативному размножению.
В экспериментальных условиях in vitro при выращивании фрагментов тканей,
органов (эксплантов) или клеток на искусственных питательных средах
возможна
реализация
супрессированной
(подавленной)
in
vivo
тотипотентности. Это осуществляется под действием регуляторов роста и
развития
фитогормонов.
Реализация
супрессированной
in
vivo
тотипотентность легче всего осуществляется как при культивировании
меристематических клеток, изолированных из кончиков корней и почек и
использования сложных по составу культуральных сред, так и при
культивировании каллуса. Эти подходы были удачно реализованы в 30-е
годы в работах американского исследователя Филиппа Уайта и французского
исследователя Роже Готре, которых принято считать родоначальниками
современных методов культивирования изолированных органов и тканей
растений.
Культивирование растительных клеток и тканей in vitro проводят на
агаризованных либо жидких питательных средах, содержащих в качестве
одного из основных компонентов фитогормоны. Разработаны способы
выращивания отдельных клеток. Изменяя условия культивирования, прежде
всего концентрацию и соотношение различных гормонов, можно либо
длительно поддерживать неорганизованный рост каллюсной ткани, либо
индуцировать в ней образование различных органов. Клетка из практически
174
любой ткани растения, в отличие от животной клетки, способна в условиях in
vitro к делению и дифференцировке с последующим формированием целого
растения (см. тотипотентность). Важным этапом в развитии методов
культуры клеток растений явилась разработка в 1960 профессором
Ноттингемского университета Э. Коккингом (Великобритания) метода
ферментативного
изолирования
протопластов,
которые
оказались
способными в асептической культуре к регенерации в целое растение.
Изолированные протопласты, по выражению американского исследователя
А. Галстона, вывели растительную клетку из <деревянной тюрьмы> и
открыли перспективы различных манипуляций с ней - клеточной инженерии.
Культура клеток, тканей и органов растений используется для выращивания
клеточной биомассы растений, прежде всего лекарственных, с целью
получения из нее ценных соединений, в генетико-селекционной работе, а
также для изучения фундаментальных проблем физиологии и генетики
растений, фитопатологии, онтогенеза растений и др. Для сохранения
генофонда растений созданы банки меристемных тканей, хранящихся в
условиях криоконсервации.
Лекция 15. Трансгенные растения и животные.
Трансгенные растения.
Способность к вегетативному размножению
отличает организм растений от организма высших животных, что заметно
облегчает осуществление трансгеноза. Многие клетки растений, например,
клетки зародыша на ранних стадиях его развития, покоящиеся клетки
меристем кончиков побегов и корней, а также сосудистых тканей камбия,
находятся в недетерминированном состоянии и, попадая под влияние
внешних воздействий, могут дифференцироваться с образованием клеток
любых типов, а также давать начало новым растениям.
175
Перенос в питательную среду таких недетерминированных клеток может
приводить к их полной дедифференцировке и формированию в культуре
недифференцированной
стабилизироваться
в
ткани
жидких
каллуса.
Такие
суспензионных
клетки
культурах
могут
и
расти
неограниченно долго. Из недифференцированных тканей многих видов
растений можно легко регенерировать целые растения.
Процесс получения трансгенных растений начинается с введения требуемых
генов в недифференцированные клетки
таким образом, чтобы они
интегрировались в хромосомы. Введение чужеродных генов в клетки
растений облегчается, если их клеточные стенки удаляют с помощью
гидролитических ферментов - пектиназы и(или) целлюлазы, что приводит к
образованию
протопластов.
Чужеродные
гены,
находящиеся
в
составе векторных плазмид , вводят в протопласты одним из стандартных
способов
с
использованием
эндоцитоза,
стимулированного
полиэтиленгликолем, электропорации , микроинъекций или бомбардировки
микрочастицами, нагруженными векторной ДНК. После этого протопласты в
течение
нескольких
дней
культивируют
на
питательной
среде
для
восстановления клеточных стенок и образующиеся клетки-трансфектанты
используют для регенерации целых растений.
Основным
направлением
применения
трансгеноза
для
генетической
модификации культурных растений является повышение их устойчивости к
неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и
гербицидам.
Метод защиты растений от вирусов с помощью трансгенов предложен В.
Шибальским в 1988 г. Сущность метода заключается во введении в геном
растений транс-действующих доминантных летальных генов или, по
терминологии Шибальского, "анти-генов", которые кодируют измененные
мутациями белки вирусов, существенные для их воспроизводства, и путем
конкурентного замещения соответствующих белков вируса дикого типа
176
прерывают его размножение. С использованием такого подхода удалось
получить очень высокую устойчивость растений к вирусу Х картофеля
(PVX) . В этом случае в ген репликазы PVX с помощьюнаправленного
мутагенеза вводили мутации, сопровождающиеся заменой аминокислот в
консервативном участке полипептидной цепи репликазы, ассоциированном с
ее каталитическим сайтом. Для экспрессии мутантного трансгена в растениях
табака были характерны внутриклеточное накопление инактивированной
репликазы и появление высокой устойчивости растений к заражению вирусом
PVX.
Еще один подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусам,
основан на введении в них трансгенов, экспрессирующих в клетках
моноклональные антитела, направленные против вирусных белков. С
использованием такого метода создали эффективную систему защиты
растений от вируса морщинистой мозаики артишока (AMCV) . Для этого
сначала получили панель моноклональных антител к вирусу AMCV и
отобрали гибридомы, продуцирующие антитела, которые взаимодействуют с
консервативными участками белка оболочки вируса. Клетки гибридомы
использовали для конструирования библиотеки кДНК, из которой выделили
последовательности нуклеотидов, кодирующие полноразмерные тяжелые и
легкие
цепи
иммуноглобулинов
G
класса
2b.
С
помощью ПЦР и
универсальных праймеров амплифицировали вариабельные участки этих
последовательностей
(VH
и
VL),
которые
далее
клонировали
в
экспрессирующем векторе E. coli, что сопровождалось образованием
полипептидов VH и VL, соединенных линкерным пептидом (антитела scFV).
После отбора клонов, продуцирующих высокоаффинные антитела к
вирусному антигену (scFV), объединенные таким образом гены VH-VL
помещали в экспрессирующий вектор и использовали для получения
трансгенных растений табака Nicotiana bentamiana. Трансгенные растения
содержали в своих клетках до 0.1% антител от суммарного белка и оказались
177
устойчивыми к AMCV-инфекции , но не к вирусу мозаики цветной капусты
(CMV) , что указывало на специфический характер их резистентности.
Трансгенные
растения
сорго,
устойчивые
к
гербицидам,
получали
бомбардировкой незрелых эмбрионов на стадии зиготы микрочастицами
золота (диаметр частиц - 1,5-3,0 мкм). В таком случае микрочастицы
погружали
в
раствор
экспрессирующего
вектора,
высушивали
и
"выстреливали" в клетки-мишени, добиваясь при этом высоких результатов
трансфекции.
Растения-биореакторы. Одним из перспективных направлений ДНКтехнологий растений является создание растений-биореакторов, способных
продуцировать белки, необходимые в медицине, фармакологии и др. К
достоинствам растений-биореакторов относится отсутствие необходимости в
кормлении и содержании, относительная простота создания и размножения,
высокая продуктивность. Кроме того, чужеродные белки не вызывают
иммунных реакций у растений, чего трудно добиться у животных.
Существует потребность в получении целого набора биологически активных
белков, которые, из-за очень низкого уровня синтеза в специфических тканях
или продуктах, недоступны для изучения по механизму действия, широкого
использования или определения областей дополнительного применения. К
таким белкам относится, например, лактоферрин, который находится в
небольшом количестве в молоке млекопитающих, лейкоцитах крови.
Лактоферрин человека (hLF) перспективно использовать в качестве пищевой
добавки и лечебного препарата для профилактики и лечения инфекционных
заболеваний
желудочно-кишечного
тракта
детей
раннего
возраста,
повышения иммунного ответа организма при злокачественных и ряде
вирусных (СПИД) заболеваний. Получение лактоферрина из молока крупного
рогатого скота, вследствие его низкого содержания, приводит к высокой
стоимости препарата. При введении кДНК гена лактоферрина в клетки табака
получен ряд каллусных тканей, синтезирующих укороченный лактоферрин,
178
антибактериальные
свойства
которого
были
значительно
сильнее
антибактериальных свойств нативного лактоферрина. Концентрация этого
укороченного лактоферрина в клетках табака составляла 0,6-2,5%.
В геном растений встраиваются гены, продукты которых индуцируют у
человека и животных иммунный ответ, например, на оболочечные белки
возбудителей различных заболеваний, в частности, холеры, гепатита, диареи,
а также на антигены плазматических мембран некоторых опухолей.
Создаются трансгенные растения, несущие гены, продуцирующие некоторые
гормоны, необходимые для гормонотерапии людей и так далее.
Примером использования растений для создания вакцин являются работы,
выполненные в Стенфордском университете. В работе были получены
антитела к одной из форм рака с помощью модернизированного вируса
табачной мозаики, в который был встроен гипервариабельный участок
иммуноглобулина лимфомы. Растения, зараженные модернизированным
вирусом, продуцировали антитела правильной конформации в достаточном
для клинического применения количестве. 80% мышей, получавших
антитела, пережили лимфому, в то время как все мыши, не получавшие
вакцины, погибли. Предложенный метод позволяет быстро получать
специфичные для пациента антитела в достаточном для клинического
применения количестве.
Велики перспективы использования растений для производства антител.
Кевин Узил с сотрудниками показал, что антитела, продуцируемые соей,
эффективно защищали мышей от инфекции вирусом герпеса. В сравнении с
антителами, продуцируемыми в культурах клеток млекопитающих, антитела,
продуцируемые растениями, имели сходные физические свойства, оставались
стабильными в человеческих клетках и не имели отличий в способности
связывать и нейтрализовать вирус. Клинические испытания показали, что
использование антител, продуцируемых табаком, эффективно препятствовало
размножению мутантных стрептококков, вызывающих кариес.
179
Было проведено создание вакцины, продуцируемой картофелем, против
инсулинозависимого диабета. В клубнях картофеля накапливался химерный
белок, состоящий из субъединицы В токсина холеры и проинсулина. Наличие
субъединицы В облегчает потребление данного продукта клетками, что
делает вакцину в 100 раз более эффективной. Скармливание клубней с
микрограммовыми количествами инсулина мышам, больным диабетом,
позволяло затормозить прогрессирование болезни.
Риск и возможная опасность ГМО и их научная проверка. В
определенном смысле любой сорт выступает в качестве важнейшего для
человечества рентообразующего фактора, как бы «озвучивающего» в цене
величину и качество урожая благодаря лучшему использованию преимуществ
местных почвенно-климатических и погодных условий, соответствию
требованиям, а нередко и «прихотям» рынка, отзывчивости на применение
техногенных факторов, применению новейших достижений науки и пр. В то
же время при рыночной системе ценообразования и существующих
методиках сортоиспытания далеко не всегда «улавливаются» преимущества
нового сорта или гибрида, связанные с обеспечением экологической
безопасности, т.е. их пригодностью к природоохранным, в том числе
беспестицидным,
технологиям
возделывания,
способностью
усваивать
труднодоступные элементы питания, противостоять кислотности и засолению
почвы, обогащать ее биологическим азотом, улучшать физико-химическое и
фитосанитарное состояние и тд. То обстоятельство, что в условиях рыночной
экономики цены на сельскохозяйственную продукцию практически не
учитывают
средоохранные,
ресурсосберегающие,
почвоулучшающие
и
многие другие важные в экологическом плане признаки и свойства новых
сортов, следует рассматривать в качестве хотя и временного, но весьма
негативного явления.
Далеко не всегда в цене «озвучивается» и содержание в урожае биологически
ценных, в том числе незаменимых, веществ. Между тем проблемы здоровья,
180
питания и ресурсов всегда взаимосвязаны, а качество пищи и лекарства
справедливо считаются двумя сторонами одной и той же медали под
названием здоровье. С учетом решающего значения сорта в определении
показателей «качества пищи», а следовательно, и «качества жизни» людей
рентообразующим свойствам сорта, связанным с содержанием биологически
и технологически ценных веществ (углеводов, аминокислот, жиров,
витаминов, минеральных солей и др.), вкусом, эстетичностью, безопасностью
для здоровья (отсутствие нитритов и нитрозаминов, тяжелых металлов,
радионуклидов, микотоксинов и пр.), в процессе селекции и возделывания
растений необходимо уделять особое внимание. Так, энергетическая и
протеиновая ценность кормовых культур и соответствующих сортов должна
формироваться в строгом соответствии с технологиями их возделывания,
транспортировки, хранения и переработки, а также условиями содержания
животных, более того, даже с учетом особенностей производства той или
иной животноводческой продукции.
Например, важную роль приобретает создание сортов клевера с высокой
растворимостью протеина (разброс данного показателя по сортам — от 20 до
70%), что позволило бы приблизить эту культуру по питательной ценности к
люцерне. Поэтому в селекционном процессе, так же как и при нормировании
кормов, важно учитывать не только валовое содержание, но и все большее
число составляющих их биологически ценных веществ, определяющих в
конечном счете питательную ценность кормов по обменной энергии и
перевариваемому протеину. В этой связи должны быть разработаны
соответствующие коэффициенты биоконверсии не только для каждой
кормовой культуры и сорта, вида животного и технологии его содержания, но
и для определенного типа фитоценоза (лугового или полевого) и т.д.
Как уже отмечалось выше, одной из возможностей уменьшения загрязнения
генотоксическими агентами окружающей среды в связи с химизацией
сельского хозяйства является широкое использование ГМ растений. Но оно
181
требует
объективного
анализа
рисков
распространения
ГМО.
При
рассмотрении проблемы возможного влияния трансгенных растений на
окружающую среду в основном обсуждаются 3 аспекта:
1.
Сконструированные
гены
могут
быть
переданы
с
пыльцой
близкородственным диким видам, и их гибридное потомство приобретет
новые привнесенные свойства или способность конкурировать с другими
растениями.
2. Трансгенные сельскохозяйственные растения могут стать сорняками для
сельского хозяйства и вытеснить произрастающие рядом другие растения.
3. Трансгенные растения могут стать прямой угрозой для человека, домашних
и диких животных (например, из-за их токсичности или аллергенноcти).
К настоящему времени выполнены экспериментальные исследования этих
возможностей и получены следующие данные.
Проведена оценка трансгенного рапса по способности к инвазии с целью
определения: станут ли гербицидустойчивые растения более склонными к
распространению в естественных условиях. При изучении демографических
параметров трансгенного и обычного рапса, выращивавшихся в различных
местах и различных климатических условиях, получены данные прямого
сравнения
3
различных
генетических
линий —
контроль,
канамицинустойчивая линия и гербицидустойчивая линия — Баста.
Несмотря на значительные колебания по выживанию семян (при их хранении
в земле), росту растений и семенной продуктивности, не обнаружены данные,
указывающие,
что
генетическая
инженерия
по
канамицин-
и
гербицидустойчивости усилила инвазивные свойства рапса. В случаях, когда
наблюдали значительные различия, например, по выживанию семян,
трансгенные растения оказались менее стойкими по сравнению с обычными.
При изучении частоты переноса гена bar (устойчивости к гербициду Баста)
трансгенным рапсом были засеяны окружности диаметром 9 м среди гектара
обычных растений. Для улучшения перекрестного опыления в поле стояли
182
ульи с пчелами. Семена собирали на расстоянии 1,3, 12 и 47 м от этих
окружностей и в потомстве определяли наличие гибридных растений.
Частота перекрестного опыления составила на расстоянии 1м — 1,4%, 3 м —
0,4%, 12 м — 0,02% и 47 м — 0,00034% (3 гибрида на миллион растений).
Определение
частоты
перекрестного
опыления
между
трансгенным
картофелем S.nigrum и S.dulcamara показало, что когда трансгенные и
контрольные растения выращивали в соседних рядах, то частота скрещивания
между ними составляла 24%. При увеличении расстояния до 10 м она
составляла 0,017%, а при 20 м гибридных растений не обнаружено.
Еще одним аспектом влияния трансгенных растений на окружающую среду
является
получение
трансгенных
растений
с
лучшей
способностью
использовать минеральные соединения, что, кроме усиления роста, будет
также препятствовать смыву химикатов в фунтовые воды и попаданию в
источники водопотребления.
Ген CHL1 арабидопсиса контролирует транспорт нитратов и влияет на их
поглощение из почвы. Изолирован гомологичный ему ген OsNTI. У
трансгенных растений арабидопсиса с геном CHL1 поглощение азота
усиливалось. ДНК CHL1 и OsNTI была слита с промоторами Act1 и Ubi1, и
эти конструкции были интродуцированы в растения риса. Среди трансгенных
растений, подвергнутых анализу, растение со множественными инсерциями
Ubi1-CHL1 характеризовалось типичным для растений с повышенным
поглощением нитратов соотношением корневой массы к надземной.
Ген глюкуронидазы (GUS), изолированный из Escherichia coli, — один из
наиболее широко используемых репортерных генов у трансгенных растений.
Этот ген чаще всего используется для изучения экспрессии генов при его
подстановке под промоторы соответствующих генов. Выпуск на рынок
трансгенных сортов сельскохозяйственных растений, имеющих GUS ген в
качестве репортерного, требует оценки биобезопасности этого гена.
183
GUS-активность
обнаружена
у
многих
видов
бактерий
и
поэтому
представлена в организмах беспозвоночных и позвоночных. В организмах
позвоночных GUS-активность обязана попаданию энтеробактерии Escherichia
coli, обитающей в кишечном тракте, в почве и фунтовых водах, поэтому
дополнительная активность GUS, добавленная в экосистему за счет
трансгенных растений, не изменит существующую ситуацию вовсе или
изменит незначительно.
Нет оснований полагать, что трансгенные культуры, экспрессирующие GUS
ген, будут иметь какие-либо преимущества перед другими культурами и
будут сорняками или такими преимуществами станут обладать сорняки,
получившие этот ген за счет скрещивания с родственными видами
сельскохозяйственных растений.
Так как глюкуронидаза встречается естественно в кишечном тракте человека
и других позвоночных, ее наличие в пище или в кормах, полученных из
трансгенных растений, не причинит им вреда. Поэтому наличие GUS гена в
трансгенных растениях считается безопасным для человека, животных и
окружающей среды.
Среди естественных компонентов биосферы значительное место занимают
микроорганизмы. В силу высокой скорости эволюции микроорганизмы
наиболее эффективно реагируют на изменение окружающей среды, так что
исследование
природных
оперативно
оценить
микробных
влияние
сообществ
изменений
позволяет
окружающей
наиболее
среды
на
биоразнообразие. Такие исследования приобретают в последние годы
большое значение в связи с широким распространением генетически
модифицированных микроорганизмов и возможным попаданием их в
естественные микробные сообщества. Все эти воздействия могут создать
проблемы,
связанные
с
распространением
чужеродных
генетических
конструкций в природных сообществах — так называемым горизонтальным
переносом генов, что неминуемо приведет к существенному ускорению
184
эволюции микробных сообществ, появлению новых форм с новыми
генетическими
признаками.
Оценка
устойчивости
таких
форм
и
содержащихся в них конструкций, а также последствий их появления в
природе чрезвычайно важна для разработки стратегий последующего
развития общества.
Для оценки возможного влияния генетически модифицированных растений
на экосистемы почвы листья контрольных и трансгенных растений табака с
геном ингибитора протеазы 1,7, обладающих инсектицидной активностью,
помещали в почву. Содержание ингибитора протеазы через 5-7 дней
составляло 0,05% от исходного количества и через 2 недели уже не
детектировалось. Количество нематод в почве около остатков трансгенных
растений было выше, чем около контрольных растений. Популяция
Collembola, наоборот, была менее плотной возле остатков трансгенных
растений, что указывает на наличие влияния остатков трансгенных растений
на популяции нематод и Collembola.
Иногда высказываются опасения о возможном горизонтальном переносе
генов от трансгенных растений в почвенные микроорганизмы. Определена
частота возможной трансформации почвенной бактерии Acinetobacter
calcoaceticus BD413 ДНК трансгенных растений при двух источниках ДНК
растений, различных форм плазмидной ДНК с геном nptll. Трансформанты
при использовании ДНК трансгенных растений не обнаружены, что
предполагает частоту трансформации ниже 10-13 транс формантов на
реципиент в оптимальных условиях. Однако в условиях почвы, при снижении
концентрации ДНК, доступной бактериям, эта частота должна снизиться до
10-16. Учитывая ранее полученные данные об ограниченном времени
сохранения хромосомной ДНК и невозможности определения детектируемой
компетентности клеток A.calcoaceticus в почвенных условиях, полученные
результаты приводят к выводу о неопределяемой частоте возможного
185
поглощения растительной ДНК этим почвенным микроорганизмом в
естественных условиях.
Изучена стабильность ДНК в листовом опаде трансгенных растений сахарной
свеклы, устойчивых к ризомании, и возможность горизонтального переноса
ДНК от растений к бактериям. Трансгенные растения несли NPTII и bar гены.
Показана длительная сохранность растительной ДНК в почве.
Не обнаружен перенос специфичных конструкций трансгенной ДНК к
микроорганизмам, изолированным из почвы.
Исследования показывают, что экологический риск при выращивании
трансгенных растений можно сравнить с риском испытания новых
селекционных сортов, полученных без применения биотехнологических
методов. Все соединения, которые появляются в трансгенных растениях, уже
существуют в природе. Все дело в скорости появления этих признаков у
растений. То, что в природе произошло бы за тысячелетия, в экспериментах
ученых происходит за годы.
Следует ли опасаться появления трансгенных растений, скажем, того же
масличного рапса, устойчивого к гербицидам, потому, что он может
скреститься с сурепкой и та станет устойчивой к этому гербициду?
Определенный риск, конечно, существует, однако о появлении сорняков,
устойчивых к гербицидам, известно уже давно и это не вызывало ранее
никаких опасений. Просто подбирали другой гербицид, к которому данный
сорняк был нестойким. Так же и в случае появления сорняков, устойчивых к
какому-либо
гербициду
за
счет
скрещивания
с
трансгенными
гербицидустойчивыми растениями, будут применены другие гербициды,
которые и уничтожат эти сорняки, но оставят трансгенные растения,
устойчивые к этому гербициду.
Одной из заманчивых возможностей ДНК-технологии является создание
генетически модифицированных культурных растений, устойчивых к классу
гербицидов сплошного действия. В таком случае, при применении
186
гербицидов сплошного действия, на площади будут уничтожены все растения
за исключением культуры, которая обладает генетически обусловленной
устойчивостью к данному гербициду. Это было бы идеальным вариантом
контроля вредоносности сорняков.
Существует ли опасность изменения трансгенных растений таким образом,
что они станут токсичными для человека и животных? Даже теоретически
трудно себе представить, что введение одного или несколько генов в высший
эукариотический организм, геном которого состоит из десятков тысяч генов,
так изменит его метаболизм, что это растение станет синтезировать какиелибо токсические соединения, не связанные с экспрессией введенного гена.
Конечно, в каждом случае внесения нового гена получаемые трансгенные
растения должны проходить тщательные испытания. При этом исследуют
продукты метаболизма, кодируемые вносимым геном, и только после этого
такие трансгенные растения изучают в полевых условиях.
И хотя обмен генов между сконструированными трансгенными растениями и
родственными им культурными и дикими видами, по мнению большинства
биотехнологов,
не
представляет
угрозы
для
окружающей
среды,
предпринимаются попытки разработки системы, полностью препятствующей
такому переносу генов. Одним из подходов к решению этой проблемы
является создание стерильных мужских растений. Однако, несмотря на свою
эффективность, в настоящее время он ограничен небольшим количеством
видов сельскохозяйственных растений.
Другим подходом является внесение желаемых генов в хлоропластный геном.
Для подавляющего большинства видов культурных растений хлоропласты
наследуются строго по материнскому типу и, таким образом, трансгены не
будут передаваться с пыльцой. Первые исследования в этом направлении
были по материнской линии проведены в лаборатории П. Малиги и показали
возможность внесения в хлоропластный геном маркерных генов.
187
Таким образом, можно суммировать имеющуюся информацию об опасностях,
которые надо учитывать, в следующих пунктах.
1.
Принцип
создания
горизонтальной
вовлекаются
векторов — имитация
естественного
процесса
передачи
наследственной
информации,
при
эволюционно
естественные
пути
генетического
обмена
которой
материала; не исключен запуск событий, которые могут привести к
изменениям межвидовых барьеров переноса генетического материала
патогенов.
2. Интеграция нового материала в геном не может к настоящему времени
рассматриваться как полностью прогнозируемый процесс — возможен запуск
событий «инсерционного» мутагенеза.
3. У генетически модифицированных растений: а) модификации, связанные с
увеличением устойчивости к гербицидам и паразитам, не учитывают
традиционные проблемы коэволюции хозяина и паразита, возможность
передачи генетического материала устойчивости сорнякам; б) модификации с
целью
получения
фармакологических
препаратов
не
учитывают
неисследованные последствия для иммунной системы человека и животных
изменений антигенного состава пищевых продуктов; в) не учитывается тот
факт, что широкое использование генетически модифицированных растений
неизбежно приводит к изменениям биоразнообразия в глобальном масштабе.
4. У генетически модифицированных животных: а) при их получении в целях
увеличения
продуктивности
использования
человеком
недостаточно
продукции
исследованы
генетически
последствия
модифицированных
животных для эндокринной и иммунной систем человека, а также
потенциальных
источников
генетических
элементов;
тиражирования
геномов
б)
распространения
при
использовании
высокопродуктивных
дестабилизирующих
ГМ
особей
животных
не
для
исключено
распространение скрытых генетических дефектов, а также изменение
биоразнообразия внутри сельскохозяйственных пород; в) в терапевтических
188
целях —
недостаточно
изучены
последствия
преодоления
трансплантационного межвидового барьера, не исключены влияния на
иммунную систему хозяина, а также возможно облегчение преодоления
межвидового барьера патогенами.
В проблеме трансгеноза есть ряд нерешенных и теоретических проблем,
например, одна из них — сайленсинг, «замолкание» встроенных генов. Это
явление известно довольно давно, но конкретные механизмы, приводящие к
выключению встроенных генов, пока не вполне ясны. Созданы специальные
модели для изучения влияния числа копий генов. За контроль взята встройка
одной копии гена глюкуронидазы в связке с геном-репортером по
канамицинустойчивости, двух копий генов в прямой последовательности и
тех же двух копий, но уже инвертированных друг к другу. Введение
повторенных нуклеотидных последовательностей в виде прямых и особенно
инвертированных
повторов
канамицинустойчивости.
резко
Влияние
снижает
числа
уровень
копий
или
экспрессии
места
гена
встройки
переносимых генов на их экспрессию, уровень активности или полное
выключение — лишь один из механизмов явления сайленсинга, активно
изучаемого в ряде лабораторий.
Другая важная проблема в процессе трансгеноза — возникновение мутаций
как следствие встройки чужеродной ДНК (Т-ДНК инсерций). Собрана целая
коллекция Т-ДНК индуцированных мутаций, характеризующихся, например,
измененным строением цветка и мужской стерильностью. Мутантные
фенотипы появляются с частотой до 5%. Установлено, что у большей части
проанализированных растений мутантный фенотип наследуется сцепленно с
признаком устойчивости к антибиотику канамицину, что свидетельствует об
инсерционной природе мутационных событий в результате интеграции
чужеродной ДНК в геном растений.
Очевидно, что для предупреждения вышеперечисленных событий, прежде
всего, необходимо:
189
1. Наличие в генных конструкциях специальных последовательностей,
позволяющих легко уничтожать клетки — их носители.
2.
Использование
традиционных
приемов
проверки
на
мутагенную
активность всей продукции, связанной с ДНК-технологиями, с обязательным
использованием тестов in vivo — лабораторных линий мышей и клеточных
культур человека с учетом возможных кумулятивных эффектов со
стрессирующими агентами.
3. Контроль изменения генофондов популяций трансгенных растений и
животных, их репродуктивной изоляции от полученных традиционным
путем.
4. Контроль изменения биотической компоненты агросистем, в которых
разводятся трансгенные растения (микрофлора почвы, сорняки, насекомые и
т.д.).
К сложностям использования генетически модифицированных растений,
устойчивых к насекомым, относят следующие:
1. Возможность приобретения насекомыми толерантности к токсинам. Так,
обнаружено,
что
у
сельскохозяйственного
вредителя —
кукурузного
мотылька (Ostrinia nubilalis) есть формы, устойчивые к Bt-токсину.
Устойчивость
контролируется
аутосомным
геном
с
неполным
доминированием. Это может в скором будущем сделать использование Btмодифицированных растений бессмысленным.
2. Противоречивость данных о токсичности для теплокровных животных и
людей.
Исходя из этого, дальнейшее развитие использования ДНК-технологий в
защите растений от насекомых будет осуществляться в направлении создания
генетически модифицированных растений, несущих гены более эффективных
и безопасных инсектицидов. Так, например, в последнее время развернуты
работы по замене в генных конструкциях при получении трансгенных
растений, устойчивых к насекомым, бактериального гена Bt-токсина на ген
190
яичного белка авидина курицы. Принцип его действия основан на том, что
авидин, накапливающийся в растениях, приводит к дефициту витамина
биотина в тканях насекомых, что блокирует их онтогенез и приводит к их
гибели. В то же время продукт гена авидина входит в пищу человека; его
концентрации
в
трансгенных
растениях,
токсичные
для
насекомых,
нетоксичны для человека, и даже при избыточном потреблении таких
растений
человеком
возможные
негативные
эффекты
могут
быть
скомпенсированы введением в пищу биотина.
В настоящее время в дискуссиях по проблемам генетической инженерии
основной упор делается на критериях, показателях и методах оценки пищевой
безопасности генетически модифицированных организмов и получаемых из
них продуктов. Между тем главное внимание, на наш взгляд. должно быть
уделено эволюционной, биологической и экологической безопасности ГМО.
Вся история развития сельского хозяйства (да и цивилизации в целом)
многократно доказывала пагубность подмены широкого научного базиса
узким сиюминутным прагматизмом и всякого рода целесообразностью
(экономической,
политической,
конъюнктурной
и
пр.).
Санитарно-
гигиеническая и медико-биологическая экспертизы играют хотя и важную, но
только вспомогательную роль, когда речь идет об эволюции организмов,
действительно управляемой волей человека. Кроме того, следует соотносить
угрозу голода (которая вполне реальна) с действительными возможностями
биоинженерии вообще и генетической инженерии в частности в обеспечении
продовольственной безопасности населения в предстоящий период.
Трансгенные животные. Генетическая модификация животных при помощи
технологии рекомбинантных ДНК (трансгеноза) основана на введении
клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало
клеткам
зародышевой
линии.
Скрещивая
трансгенных
потомков,
появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные
191
линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области
проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в
оплодотворенную
яйцеклетку
мыши
с
помощью
микроинъекции,
имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие
введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную
яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный
подход заключается в выделении мышиных эмбриональных
стволовых клеток и трансфекции их клонированным геном. При этом
вводимая конструкция должна интегрироваться в геном стволовых клеток.
Клетки, несущие ген-мишень в определенном хромосомном сайте, отбирают
и культивируют, а затем вводят их в мышиные эмбрионы на ранних стадиях
развития. Мышиные эмбриональные стволовые клетки плюрипотентны
(тотипотентны), т. е. могут дать начало клеткам любого типа, в том числе и
клеткам
зародышевой
линии.
Для
трансгеноза
используют
также
искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), несущие множество генов.
Таким образом были получены мыши, синтезирующие только человеческие
антитела. Их использовали в качестве модельных систем для изучения
генетических болезней человека (например, болезни Альцгеймера).
С помощью аналогичных экспериментальных подходов были получены
трансгенные коровы, овцы, свиньи, птицы и рыбы. Есть надежда, что
трансгеноз позволит улучшать генотип существующих пород домашнего
скота и выводить породы животных с новыми признаками. Кроме того,
возможно, таких домашних животных, как коровы, овцы и козы, удастся
использовать в качестве своеобразных «биологических фабрик» для
получения продуктов клонированных генов, секретируемых в молоко.
Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более
высокой удойностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой
яйценоскостью и т. д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора,
каждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими
192
характеристиками. В результате со временем можно получать более или
менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия
скрещивания и отбора, требующая больших временных и материальных
затрат, оказалась тем не менее исключительно успешной, и сегодня почти все
аспекты биологических основ выведения новых пород домашнего скота могут
быть к ней сведены. Однако после того как эффективная генетическая линия
получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора становится
все труднее. Так, линия с новым «ценным" геном может нести также и
«вредные»
гены,
вследствие
чего
потомки
могут
оказаться
менее
продуктивными. Чтобы быть уверенными в том, что новая, улучшенная линия
сохранит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо
разработать абсолютно новую стратегию.
Получение трансгенных
животных. Если вводить ДНК в клетки
многоклеточного организма, то результатом трансформации будет изменение
свойств лишь небольшого числа клеток, которые приобрели новый ген или
гены. Следовательно, для изменения свойств всего организма следует
изменять геном половых клеток, которые перенесут новые свойства
потомкам. У растений и животных целесообразно изменять такие свойства,
как
скорость
роста,
устойчивость
к
заболеваниям,
способность
адаптироваться к новым внешним условиям. В качестве маркеров в этом
случае
можно
использовать
полиморфизм
длины
рестрикционных
фрагментов (AFLP), анализ мини-сателлитов, анализ микросателлитной ДНК
(SSR), гибридизацию и т.д.
Разработаны
способы
введения
генов
в
эмбриональные
клетки
млекопитающих, мух и некоторых растений. От работы с довольно крупными
яйцами амфибий перешли к изучению яйцеклеток и эмбрионов мыши,
которая представляет наиболее изученное в генетическом отношении
млекопитающее.
193
Микроинъекцию клонированных генов производят в один или оба
пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. Чаще выбирают
мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры
больше. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод
приемной матери, или дают возможность развиваться в культуре до стадии
бластоцисты, после чего имплантируют в матку.
Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение.
Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека,
ген β-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК
вируса лейкемии мышей. Число молекул, вводимое за одну инъекцию,
колеблется от 100 до 300 000, а их размер - от 5 до 50 кб. Выживает обычно 10
- 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных
яйцеклеток варьирует от нескольких до 40%. Таким образом, реальная
эффективность составляет около 10%.
Интеграция чужеродных генов неспецифична по отношению к хромосомам, а
число копий чужеродного гена может различаться от нескольких штук до 100
и более. Эти гены образуют группу тандемных повторов, объединенных по
типу "голова к хвосту". Чужеродная ДНК после инъекции была обнаружена
как в соматических, так и в половых клетках. Это означает, что интеграция
проходит на самых ранних стадиях развития зиготы.
В нескольких случаях гетерологичная ДНК наследовалась в трех поколениях
мышей, что свидетельствует о стабильной интеграции. Интегрировавшая в
половые клетки ДНК передается как менделевский ген. Установлено, что
уровень экспрессии чужеродного гена зависит от места интеграции ДНК с
хромосомами и от степени ее метилирования, а также от дифференцировки
тканей. В некоторых случаях удалось получить тканеспецифическую
экспрессию. Важно отметить что специфические чужеродные гены можно
встраивать в геном клетки таким образом, что они подчиняются нормальным
регуляторным сигналам.
194
В 1981 году Константини и Лэси (Оксфорд) провели инъекцию в яйцеклетки
мыши фрагменты хромосомной ДНК кролика длиной 19 килобаз. Эти
фрагменты содержали ген β-глобина кролика. Яйцеклетки культивировали до
стадии бластоцисты и имплантировали в матку. У 24 мышей, родившихся в
результате развития имплантированных яйцеклеток, проведены частичная
гепатоэктомия. Анализ ДНК из клеток печени показал, что у 9 мышей
встречается от 1 до 20 копий на клетку гена β-глобина. После спаривания 4
трансформированных самцов с нормальными самками получили потомство из
18 животных. 6 из них также имели ген β-глобина. Установлено, что
интеграция гена в клетки млекопитающих происходит случайным образом и
не связана с конкретными областями хромосомы. Ген нестабилен, может быть
утрачен или стать неактивным. Вместе с геном необходимо вводить
регуляторные последовательности.
Метод введения генов в эмбриональные клетки имеет ограничения. Не всегда
удается встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы.
Разработанные методические примы пока не позволяют заменить имеющийся
в геноме ген, вытесняя его, не всегда удается подчинить новый ген системе
регуляции организма.
При трансгенозе могут возникать неожиданные проблемы. Например, одни из
первых работ по генетической транформации животных проводились путем
встраивания генов гормона роста. Перенос гена гормона роста крысы мышам
увеличивал рост мышей в 2 раза. Эксперименты по трансгенозу генов
гормона роста быка кроликам также увенчались успехом. А вот аналогичные
эксперименты по модификации крупного рогатого скота привели к
увеличению прироста всего на 10-20%. Очевидно, это связанно с тем, что у
мышей сохраняется широкая норма реакции, и встраивание генов,
увеличивающих количество гормона, заставляет генотип реализоваться
максимально полно. У домашнего скота в результате направленной селекции
195
организмы работают на верхнем пределе нормы реакции, отсюда ожидаемый
эффект не проявился.
В нашей стране получены свиньи, несущие ген соматотропина. Они не
отличались по темпам роста от нормальных животных, но изменение обмена
веществ сказалось на содержании жира. У таких животных ингибировались
процессы липогенеза и активировался синтез белка. К изменению обмена
веществ приводило и встраивание генов инсулиноподобного фактора. Такие
трансгенные свиньи были созданы для изучения цепочки биохимических
превращений гормона, а побочным эффектом явилось укрепление иммунной
системы.
Самая мощная белоксинтезирующая система находится в клетках молочной
железы. Если поставить гены чужих белков под контроль казеинового
промотора, то экспрессия этих генов будет мощной и стабильной, а белок
будет накапливаться в молоке (животное-ферментер). Уже получены
трансгенные коровы, в молоке которых содержится человеческий белок
лактоферрин.
Этот
белок
гастроэнтерологических
планируют
заболеваний
применять
у
для
людей
профилактики
с
низкой
иммунорезистентностью. Это больные СПИДом, недоношенные младенцы,
больные раком, прошедшие радиотерапию. Ведутся клинические испытания
такого молока. Уже сейчас корпорация Genzyme Transgenics планирует
исследования с целью создания трансгенного крупного рогатого скота,
содержащего в молоке человеческий альбумин. Был куплен патент на
получение эмбрионов, содержащих геном клеток соединительной ткани
(фибробластов), включающий ген, ответственный за синтез человеческого
белка. Подобная технология позволяет увеличить эффективность создания
трансгенных молочных животных, так как при обычном впрыскивании генов
в
оплодотворенную
яйцеклетку
рождается
от
только
5
-
10%
трансформированных животных, из них - несколько самцов, не дающих
молока.
196
Использование
новой
технологии
клонирования
позволяет
получать
животных только женского пола, дающих трансгенный протеин. Альбумин
используется в терапии для поддержания осмотического давления в крови.
Ежегодно в мире требуется около 440 тысяч литров плазмы крови для
выделения этого белка (стоимость около 1,5 млрд. $). Каждая молочная
корова может произвести 80 кг рекомбинантного человеческого альбумина
ежегодно. Genzyme Transgenics занимается разработкой аналогичных методов
получения человеческого гормона роста и β-интерферона.
В Англии созданы трансгенные овцы, молоко которых содержит фактор
свертывания крови.
В нашей стране были попытки создать овец, продуцирующих химозин
(фермент для сыроварения). Было получено 2 овцы, у одной – ген не
экспрессировался, у второй содержание химозина достигало 300 мг/л. Однако
потомство этой овцы давало низкие удои – порядка 50 кг за период лактации.
Причина заключалась в том, что химозин вырабатывается в виде
предшественника – прохимозина, который превращается в активный фермент
при рН=5. Было запланировано получать именно прохимозин, но в каких-то
участках вымени происходило снижение рН, что приводило к активации
химозина непосредственно в организме. Активный химозин свертывал
молоко, а оно закупоривало протоки вымени. Сейчас пытаются решить эту
проблему.
В Подмосковье получены кролики, выделяющие γ-интерферон, эритропоэтин,
но
кролики
не
являются
традиционными
продуцентами
молока.
Эксперименты же по трансформации сельскохозяйственных животных очень
дорогостоящи – одно трансгенное животное стоит десятки и сотни тысяч
долларов.
Трансгенных животных получают и для целей ксенотрансплантации. Одним
из излюбленных доноров органов являются свиньи, так как имеется
анатомическое сходство органов и сходство иммунологических свойств.
197
Реакции отторжения при трансплантации имеют сложный механизм. Одним
из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки,
локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней
эти белки заменены на человеческие.
Еще одно направление трансгеноза – получение устойчивых к болезням
животных. Животноводство держится на вакцинах, так как селекция ведется
преимущественно на хозяйственно ценные признаки – шерстистость,
молочность и т. д. Повышение устойчивости – дело генных инженеров. К
защитным белкам относятся интерфероны, поэтому ген интерферона
встраивали
различным
животным.
Трансгенные
мыши
получили
устойчивость, они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта
не обнаружено.
Другое направление – введение генов, кодирующих антисмысловую РНК.
Для животноводства острой проблемой являются лейкозы, вызываемые РНКвирусами. Трансгенные кролики, несущие гены, отвечающие за присутствие в
клетке антисмысловой РНК, были устойчивы к лейкозам.
Трансгенных животных можно использовать для изучения наследственных
заболеваний мозга и нервной системы. Гены болезни Альцгеймера
(отложение белка β-амилоида приводит к образованию характерных бляшек)
и гены, отвечающие за развитие эпилепсии, болезней мозга вводятся в геном
нормальных животных; при этом получают трансгенных животных-моделей,
на которых можно испытывать различные терапевтические приемы.
Трансгенных
животных
стали
использовать
для
исследования
воспалительных и иммунологических заболеваний человека, например,
ревматоидного артрита. Моделируются болезни, связанные с липидным
обменом.
Трансгенный крупный рогатый скот
Если
предполагается
использовать
молочную
железу
в
качестве
«биореактора», то наиболее предпочтительным животным для трансгеноза
198
является крупный рогатый скот, который ежегодно дает до 10 000 л молока,
содержащего примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться
такое количество рекомбинантно-го белка и эффективность его очистки
составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать примерно
100 кг такого белка в год. По случайному совпадению, именно столько белка
С, использующегося для предотвращения тромбообразования, требуется
ежегодно. С другой стороны, одной трансгенной коровы будет более чем
достаточно для получения требуемого ежегодно количества фактора IX
(фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови, который
вводят больным гемофилией для повышения свертываемости крови. Одна из
целей трансгеноза крупного рогатого скота — изменение содержания в
молоке различных компонентов. Так, количество сыра, получаемого из
молока, прямо пропорционально содержанию в нем к-казеина, поэтому
весьма
перспективным
представляется
увеличение
количества
синтезируемого к-казеина с помощью гиперэкспрессии трансгена этого белка.
Далее, если обеспечить экспрессию гена лактазы в клетках молочной железы,
то можно будет получать молоко, не содержащее лактозы. Такое молоко
незаменимо для многих людей, не переносящих лактозу; после приема молока
или
молочных
расстройство.
продуктов
Трансгеноз
у
них
возникает
серьезное
желудочное
крупного
рогатого
скота
это
—
весьма
перспективный подход, но создание большого числа трансгенных животных
потребует времени, ведь для того чтобы вырастить половозрелое животное из
оплодотворенной яйцеклетки, нужно примерно 2 года.
Весьма
актуально
создание
домашних
животных
с
наследственной
устойчивостью к бактериальным и вирусным инфекциям и паразитарным
инвазиям. Известно о существовании пород с наследственной устойчивостью
к бактериальным инфекционным заболеваниям — маститу (коровы),
дизентерии (новорожденные поросята), холере (домашняя птица). Если в
основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно
199
попытаться создать несущих его трансгенных животных. В настоящее время
для
борьбы
с
инфекционными
заболеваниями
домашних
животных
используют прививки и лекарственные препараты. Заболевших животных
изолируют, за здоровыми ведут тщательное наблюдение. Стоимость всех этих
мероприятий может достигать 20% обшей стоимости конечной продукции.
Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций,
можно использовать другой подход, заключающийся в создании путем
трансгеноза наследуемых иммунологических механизмов. С этой точки
зрения рассматривают самые разные гены, ответственные за работу
иммунной системы: гены основного комплекса гистосовместимости, Тклеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадеживающими на
настоящее время являются предварительные результаты, полученные при
введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L-цепи
какого-либо моно-клонального антитела. Идея этого подхода заключается в
том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом
защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с помощью прививок.
Трансгенные овцы, козы и свиньи. Опыты по трансгенозу в случае овец и
коз в основном были направлены на превращение молочных желез этих
животных в своеобразные биореакторы для получения белковых продуктов,
использующихся в медицине. Несмотря на то что надои у овец и коз меньше,
чем у коров, за год они дают сотни литров молока. С помощью метода,
аналогичного
используемому
для
создания
трансгенных
мышеи
и
трансгенных конструкций, содержащих гены человека под контролем
промоторов, специфичных для молочных желез (табл. 19.2), были созданы
трансгенные овца и коза, в молоко которых секретировались белки человека.
Они были гликозилированы и обладали активностью, близкой к таковой
соответствующих белков, получаемых от человека. Однако, для того чтобы
убедиться в полной эквивалентности этих белков, нужны дополнительные
исследования. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не
200
оказывала никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на
вскармливаемое потомство. В отличие от этого при введении свиньям
трансгена бычьего гормона роста под контролем промотора металлотионеина
неблагоприятные эффекты наблюдались. Количество гормона у разных
особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта
группа быстрее прибавляла в весе. К сожалению, этот положительный
результат частично обесценивался различными патологиями: у животных
отмечались язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление
перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к
пневмонии. Причины этих симптомов неизвестны. Возможно, они связаны с
долговременным присутствием в организме избытка гормона роста. В этих
экспериментах трансген синтезировался более или менее непрерывно. Были
созданы также трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Для
этого кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста 1 была помещена под
контроль мышиного промотора гена кератина с высоким содержанием серы,
что обеспечивало гиперэкспрессию кДНК, При этом у трансгенных овец в
отличие от свиней никаких нежелательных побочных эффектов не
наблюдалось.
В последнее время большое внимание уделяется вопросу об использовании
органов животных для трансплантации человеку. Основная проблема
межвидовой трансплантации — это гиперострое отторжение. Гиперострое
отторжение влечет за собой связывание антител организма-хозяина с
углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного
органа. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию
(активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель несущих
антитела клеток и быстрая потеря пересаженного органа.
В естественных условиях воспалительная реакция блокируется особыми
белками на поверхности клеток, выстилающих стенки кровеносных сосудов.
Эти белки ингибиторы комплемента видоспецифичны. Было высказано
201
предположение, что если бы животное-донор несло один или несколько генов
человеческого белка, ингибирующего комплемент, то пересаженный орган
был бы защищен от первичной воспалительной реакции. С этой целью были
получены трансгенные свиньи, несущие различные человеческие гены
ингибитора комплемента. Клетки одного из этих животных оказались
совершенно
нечувствительными
комплемента.
Предварительные
к
компонентам
эксперименты
по
системы
каскада
пересадке
органов
трансгенных свиней приматам показали, что ткани пересаженного органа
повреждаются слабее, а сам орган не отторгается немного дольше. Возможно,
трансгенные свиньи, несущие человеческий ген ингибитора комплемента и
лишенные основного поверхностного белка клеток свиней, который вызывает
острейшее
отторжение,
будут
служить
источником
органов
для
трансплантации человеку.
Трансгенные птицы. Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйцеклетки
птиц с целью получения трансгенных линий — непростая процедура. Это
связано с некоторыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так,
при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько
сперматозоидов, а не один, как это обычно бывает у млекопитающих, и
идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским,
становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не
подходит, поскольку в этом случае ДНК не интегрируется в геном
оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить
микроинъекцию
ДНК
в
ядро,
дальнейшие
операции
будет
трудно
осуществить, поскольку у птиц яйцеклетка после оплодотворения достаточно
быстро обволакивается прочной мембраной, покрывается слоем альбумина и
внутренней и наружной известковыми оболочками.
Трансгенных цыплят можно использовать для улучшения генотипа уже
существующих пород — для придания им (in vivo) устойчивости к вирусным
инфекциям
и
заболеваниям,
вызываемым
202
кокцидиями,
повышения
эффективности усвоения пищи, снижения уровня жира и холе-стерола в
яйцах, повышения качества мяса. Было предложено также использовать яйцо
с его высоким содержанием белка в качестве источника белковых продуктов,
использующихся
в
фармацевтической
промышленности.
Экспрессия
трансгена в клетках репродуктивного пути курицы, где обычно секретируется
большое количество овальбумина, может способствовать накоплению
соответствующего белкового продукта в яйце, откуда его можно затем
выделить.
МОДУЛЬ 4 «КОММЕРЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ
БИОТЕХНОЛОГИИ»
Лекция 16. Инженерная энзимология.
Ферменты
являются
присутствующими
в
сложными
живых
органическими
клетках,
где
они
соединениями,
функционируют
как
катализаторы различных биохимических реакций превращений разных
химических соединений. Хотя ферменты образуются только в живых клетках,
многие из них могут быть выделены из клеток без потери активности и
способны работать в условиях in vitro.
Ферментная
использование
технология
в
включает
растворенной
продукцию,
форме
и,
выделение,
наконец,
очистку,
применение
в
иммобилизованном виде ферментов в широком круге реакторных систем.
Ферментная технология, вне всякого сомнения, обеспечит в будущем
разрешение наиболее насущных проблем, стоящих перед обществом;
например, обеспечением пищей, источниками энергии (ее сохранением и
использованием с максимальной эффективностью), а также улучшением
окружающей среды.
203
Эта новая технология происходит из биохимии, но в значительной степени из
микробиологии, химии и инженерных отраслей. В будущем, надо полагать,
ферментная технология в сочетании с генетической инженерией обеспечит
существенный прогресс во многих областях биотехнологии.
С давних пор в таких процессах, как пивоварение, изготовление хлеба и
производство сыра, использовалась (хотя и не понимаемая) деятельность
ферментов.
В
результате
эмпирических
совершенствований
эти
традиционные технологии получили широкое распространение задолго до
того момента, когда сформировались научные знания о механизмах этих
процессов.
На Западе понимание промышленного значения ферментов складывалось в
процессе использования дрожжей и солода с тех времен, когда традиционное
пивоварение и выпечка хлеба занимало существенную долю производства.
На
Востоке
аналогичными
процессами
были
производство
саке
и
разнообразные пищевые ферментации, использующие нитевидные грибы в
качестве источника ферментативной активности.
1896 г. считается достоверным началом современной микробной ферментной
технологии с получением первого коммерческого продуктановой отрасли –
такадиастазы,
представляющей
собой
грубую (неочищенную) смесь
гидролитического фермента, приготавливаемую путем выращивания гриба
Aspergillus oryzae на отрубях ячменя.
Быстрое развитие ферментной технологии началось с середины 50-х годов на
основе использования грибных (микробных) ферментов. Причиной этого
главным образом явилось следующее:
1)
Интенсивное
развитие
практики
глубинного
культивирования
микроорганизмов, связанных с производством антибиотиков, что, в свою
очередь, потребовало новых знаний и привело к быстрому внедрению
появляющихся разработок в производство.
204
2)
Быстрое
развитие
основных
знаний
о
свойствах
ферментов,
обусловливающее реализацию их потенциала для целей промышленного
катализа.
Свободные от клеток ферменты имеют в настоящее время широкое
применение во многих химических процессах, в которых участвует большое
количество последовательных реакций. Однако ферментные процессы, в
которых используются в качестве катализаторов микробные клетки,
характеризуются довольно большим числом ограничений:
1. Большая часть субстрата в обычных условиях превращается в микробную
биомассу.
2. Наличие (или возможное появление) побочных реакций, приводящих к
накоплению значительных количеств отходов.
3. Условия для роста микроорганизма могут быть иными, нежели для
образования и накопления необходимого продукта.
4. Выделение и очистка необходимого продукта из культуральной жидкости
могут быть сопряжены со значительными трудностями.
Многие (если не все) из этих перечисленных недостатков могут быть
существенно уменьшены путем использования чистых ферментов и, повидимому, при дальнейших совершенствованиях методов применения
ферментов они будут
практически
решены. В будущем многие
традиционные ферментные процессы могут быть заменены использованием
многоферментных
реакторов,
которые
способны
обеспечить
высокоэффективную утилизацию субстратов, обусловить более высокий
выход и намного лучшую однородность получаемых продуктов. Большинство
ферментов, используемых в промышленности, являются внеклеточными
ферментами, т.е. ферментами, секретируемыми микроорганизмами во
внешнюю среду. Таким образом, если микроорганизм продуцирует ферменты
для расщепления больших молекул до ассимилируемых (низкомолекулярных)
форм, то ферменты обычно экскретируются в окружающую (культуральную)
205
среду. В таких случаях культуральная (ферментационная) жидкость,
получаемая при выращивании микроорганизмов (например, дрожжей или
мицелиальных грибов, бактерий), является основным источником протеаз,
амилаз и в несколько меньшей степени целлюлаз, липаз и других
гидролитических ферментов. Многие промышленные ферменты, являясь
гидролазами,
могут
функционировать
без
дополнительных
сложных
кофакторов; они легко выделяются (сепарируются от биомассы) без
разрушения клеточных стенок продуцентов и хорошо растворимы в воде. Но
поскольку большинство ферментов микроорганизмов по своей природе
являются внутриклеточными, то наибольший прогресс в биотехнологии
может ожидаться именно при их использовании для промышленных
целей.Однако
в
этом
случае
возникает
необходимость
разработки
эффективных способов их выделения и очистки.
Индустриальный рынок ферментов до 1965 г. был сравнительно небольшим,
когда ферменты начали широко использоваться для изготовления различного
рода
детергентов.
В
последующие
несколько
лет
промышленное
производство ферментов резко возросло. Естественно, увеличивается и
мощность производств, выпускающих ферменты и для других целей,
например
гидролиза
крахмала, изомеризации
глюкозы
во
фруктозу,
изготовления молочных продуктов (в том числе сыров). Многие ферменты,
такие, как протеазы, амилазы, глюкозоизомеразы, производятся десятками
тонн, на сумму около 1 млрд. долларов. Новые технологии, такие, как
технология рекомбинантных ДНК, а также улучшение методов ферментации
и последующей обработки целевых продуктов ("процессинга"), несомненно
значительно снизят затраты производства (и в первую очередь стоимость
ферментных препаратов), сделав их более конкурентоспособными в
сравнении с химическими препаратами.
Среди многих новых областей и возможностей ферментной технологии
существенное место отводится утилизации лигноцеллюлозы (или просто
206
древесных материалов). Это "обильное" (с избытком имеющееся в природе)
сырье должно использоваться человеком, и многие исследовательские
разработки направлены на создание эффективных способов деструкции
данного сложного органического соединения. Если это удастся осуществить,
то биотехнологию ожидает блестящее будущее.
Технология производства ферментов.
Несмотря на то что многие весьма полезные и ценные ферменты
продуцируются клетками животных и растений, все же предполагается, что
большая часть промышленных разработок в области ферментной технологии
будет основываться на ферментах, получаемых из микроорганизмов. Даже
в солодовом процессе при пивоварении, где спользуется амилаза, получаемая
из проростков ячменя, относительно недорогая, и на основании которой
строится повсеместное приготовление пива, по-видимому, не выдержит
конкуренции
с
все
увеличивающимся
внедрением
в
эти
процессы
бактериальных ферментов аналогичного действия.
Использование микроорганизмов в качестве источников производства
ферментов стимулируется следующими основными факторами:
• высокой степенью специфической активности в пересчете на единицу
сухого веса продукта;
• сезонными колебаниями количества и качества сырьевых материалов и
возможностью их длительного сохранения в зависимости от климатических
изменений;
• возможностью выбора нужного фермента из широкого спектра микробных
катализаторов,
характеризующихся
различной степенью устойчивости к
повышенным температурам рН среды;
• возможностями
промышленной
генетики
оптимизировать количества
выхода ферментов и способов селекции штаммов-продуцентов
мутагенеза,
изменения
путем
условий культивирования, а также (в последнее
207
время) применения практически неограниченных возможностей методов
генетической инженерии.
Приемы селекции различных микроорганизмов довольно сложны и включают
многие факторы, такие, как стоимость культивирования, способность
секретировать фермент во внешнюю среду или накапливать его внутри
клетки, а также способность противостоять неблагоприятным воздействиям
внешней среды, повреждающим ферменты, и т. п. В зависимости от
происхождения ферменты существенно различаются между собой по
термостабильности и по отношению к экстремальным значениям рН. Так,
например, протеазы Bac. subtilis относительно стабильны при нагреваниях и
активны в щелочной среде, в силу чего считаются более подходящими для
использования в качестве добавок в стиральные порошки и моющие средства.
В противоположность этому, грибные амилазы, вследствие их высокой
чувствительности к нагреванию, пригодны в хлебопечении и т. д.
При
селекции
продуцентов
ферментов
генетики
промышленных
микроорганизмов стремятся улучшить желаемые их свойства: высокий выход
фермента, стабильность фермента, независимость синтеза фермента от
индуктора, легкое его извлечение из среды и т. п., тогда как нежелательные
качества стараются устранить или ингибировать. К числу последних
относятся наличие вредных побочных метаболитов, неприятный запах,
нежелательный цвет препарата и т. п. Сложная генетическая техника, однако,
еще не нашла широкого применения и большинство производств использует
главным образом приемы мутагенеза в сочетании с хорошо отработанными
селекционными
методами.
Общим
промышленных
микроорганизмов
недостатком
является
их
малая
большинства
генетическая
изученность, что, естественно, снижает возможности улучшения полезных
свойств продуцентов ферментов за относительно короткий период времени.
Однако технология переноса генов вместе с белковой инженерией способны
208
изменить эту ситуацию и обусловить развитие новых направлений в области
ферментной технологии.
Поскольку микробные ферменты являются малообъемными препаратами
относительно
невысокой
стоимости,
методы,
применяемые
для
их
производства, обычно осуществляются с использованием биореакторов
(ферментеров), аналогичных по конструкции и функциях таковым, которые
применяются при производстве антибиотиков. Выбор культуральной среды
является весьма важным моментом в процессе производства, так как она
обеспечивает
растущий
микроорганизм
энергией,
а
также
является
источником необходимых элементов (углерода, азота и т. д.). Стоимость
сырьевого материала непосредственно связана с ценой конечного продукта.
В большинстве случаев ферменты получаются при ферментации с
одноразовой загрузкой, длящейся от 30 до 150 часов; процессы, основанные
на непрерывном (проточном) культивировании, нашли пока еще малое
применение в промышленном производстве ферментов.
В процессе выращивания продуцентов ферментов, последние могут
накапливаться внутри клеток или же секретироваться во внешнюю среду.
Коммерческие препараты ферментов могут выпускаться в продажу либо в
жидкой, либо в кристаллической форме; очищенными или же в виде "грубых"
препаратов. Например, в препаратах, используемых для гидролиза крахмала,
целлюлозы, основным критерием является высокая активность основного
фермента в препарате, а наличие других активностей зачастую не принимают
во внимание. В то же время в препаратах ферментов, используемых в
молекулярной
биологии, медицине,
основным
критерием
качества
является отсутствие дополнительных ферментативных активностей и просто
белковых загрязнений.
Концентрирование и очистка ферментов зачастую представляет собой весьма
сложные процессы. И естественно, что стоимость препаратов ферментов
зависит от всех перечисленных выше моментов.
209
Ферментные препараты, предназначенные для использования в пищевой
промышленности или в медицинской практике, подлежат строгому контролю
на токсичность для животных, мутагенную активность, тератогенность и
канцерогенность, а также проверяются в различных фармакологических
тестах.
Ответственность за безопасность выпускаемых ферментных препаратов
ложится на фирму, их производящую. Практически, безопасный ферментный
препарат должен обладать низкими аллергическими свойствами и быть
свободным от токсических веществ, а также вредоносных микроорганизмов.
Иммобилизованные ферменты.
В последние 15–20 лет на стыке ряда химических и биологических дисциплин
сложилось новое "инженерное" направление – химическая энзимология,
стремительное
развитие
которой
было
обусловлено созданием
биологических катализаторов нового типа – иммобилизованных ферментов.
А разработка метода иммобилизованных ферментов определялась, в свою
очередь, рядом существенных факторов, затрудняющих
использование
чистых ферментов во многих промышленных производствах.
Во-первых, чистые препараты ферментов неустойчивы при лительном
хранении, а также при разного рода воздействиях, особенно тепловых.
Во-вторых, в виду сложности отделения ферментов от различных реагентов
смеси
многократное
принципиально
энзимологией
новые
их
использование
перспективы
с разработкой
весьма
затруднено.
открылись
перед
Однако
прикладной
принципов создания иммобилизованных
ферментов. Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом
существенных
преимуществ
при
использовании
в
прикладных
(промышленных целях) производствах по сравнению с чистыми препаратами.
Гетерогенный
(иммобилизованный)
катализатор
легко
реакционной среды, что обусловливает:
• возможность остановки реакции в любой нужный момент;
210
отделить
от
• повторное использование катализатора;
• получение конечного продукта, не загрязненного ферментом.
Последний момент весьма важен при производстве пищевых и медицинских
продуктов.
Применение
иммобилизованного
катализатора
позволяет
проводить ферментный процесс непрерывно и регулировать скорость
реакции, а также изменять количество получаемого продукта в соответствии с
изменениями скорости протока реакционной смеси.
Иммобилизация или некоторая модификация фермента может обусловить
изменения и некоторых его свойств (специфичность взаимодействия с
субстратом; зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и
других параметров среды, а также его стабильность по отношению
различного
рода
денатурирующим
к
воздействиям). Иммобилизация
ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность
за счет изменения свойств носителя.
Для иммобилизации ферментов используются также различные типы
неорганических носителей, таких, как создаваемые на основе силикагеля,
глины, керамик, природных минералов, металлов и их оксидов. Основными
качествами, определяющими широкое внедрение неорганических носителей
в производственные процессы, является легкость
их
регенерации
и
возможность придания им любой конфигурации. Они могут применяться
как в виде порошков, шариков, так и монолитов; они могут быть как
пористыми, так и сплошными (непористыми).
Определенное преимущество для различного рода работ имеют носители,
приготавливаемые
на
основе
микропористых
кремнеземов.
К
их
достоинствам следует отнести механическую прочность, химическую
инертность по отношению ко многим растворителям, наличие жесткого
скелета
с
заданным
размером
пор,
а
также
устойчивость
к
микроорганизмам. Недостатками кремнеземов является их использование в
ограниченном диапазоне рН, а также явление неспецифической сорбции на их
211
поверхности,
хотя
модифицирующими
последнее
может
воздействиями.
быть
Правда,
устранено
стоимость
различными
кремнеземных
носителей относительно высока, и модификация еще больше повышает цену,
поэтому внедрение их в промышленность существенно ограничено.
Более пригодными для промышленного использования могут оказаться
природные алюмосиликаты – глины, а также пористая керамика, в состав
которой, помимо алюмосиликатов, входят окислы титана, циркония или
другие добавки. Следует также упомянуть такие широко распространенные
носители, как уголь и графитированная сажа. Весьма перспективными
носителями являются приготавливаемые на основе металлов и их оксидов,
которые характеризуются высокой механической прочностью, относительной
дешевизной, стабильностью и хорошими гидродинамическими свойствами.
Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в
которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего
объема. На практике для иммобилизации ферментов используют рутинные
физические и химические методы. Все существующие методы физической
иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединяется с
носителем ковалентными связями) могут быть подразделены на четыре
основные группы:
• адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (или как иногда говорят
матрикса);
• включение в поры геля;
• пространственное разделение фермента от остальной части реакционной
смеси с помощью полупроницаемой мембраны;
• введение фермента а двухфазную реакционную среду, в которой он
растворим, но может находиться только в одной из фаз.
Как и всякая другая классификация, приведенная ниже, является в
значительной степени условной, так как не всегда существует возможность
проведения четкой границы между различными способами иммобилизации.
212
Адсорбционная
иммобилизация
является
наиболее
старым
из
всех
существующих в настоящее время способов иммобилизации ферментов.
Носителями
при
данном
способе
иммобилизации
могут
быть
как
органические, так и неорганические вещества, которые применяются а виде
порошка, мелких гранул или шариков. Иммобилизация ферментов путем
адсорбции
на
нерастворимых
носителях
отличается исключительной
простотой и достигается путем обеспечения контакта водного раствора
фермента с избранным для конкретной цели носителем. После отмывки
неадсорбированного фермента препарат готов к применению.
На
процесс
адсорбции
и
прочность
связывания
фермента
с
носителемоказывают определенное влияние различные факторы внешней
среды, основными из которых являются: удельная поверхность и пористость
носителя, значения рН среды, ионная сила раствора фермента, его
концентрация, а также температура проведения адсорбции. Иными словами,
эффективность
иммобилизации
ферментов
определяется
сбалансированностью ряда факторов и нарушение этого баланса может
привести к резкому ослаблению взаимодействия фермента с носителем. Для
исключения
подобной
методических
приемов,
ситуации,
на
практике
способствующих
используется
повышению
набор
эффективности
процесса и, следовательно, получению более качественных препаратов.
Иммобилизация путем включения в гели состоит в том, что молекулы
фермента
включаются
в
трехмерную
сетку,
образованную
тесно
переплетающимися нитями (цепями), формирующими гель. Пространство
между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой
приходится
обычно
значительная
часть
общего
объема
геля.
Для
иммобилизации фермента в геле существует два основных способа:
• при одном из них фермент вводится в водный раствор мономера, а затем уже
проводят полимеризацию, в результате которой формируется гель с
включенными в него молекулами фермента,
213
• второй способ состоит в том, что фермент вносится в раствор уже готового
полимера, который затем каким-либо образом переводят в требуемое
состояние, гелеобразное состояние.
Иммобилизация путем включения в полупроницаемые мембраны – состоит в
том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата
полупроницаемой мембраной, способной легко пропускать
небольшие
молекулы
фермента.
субстрата,
задерживая
крупные молекулы
Существующие модификации этого метода различаются лишь способами
получения полупроницаемых мембран и их природой.
К этим модификациям относятся: микрокапсулирование в замкнутых
сферических
пузырьках,
имеющих
тонкую
полимерную
стенку
(мембрану).
Метод двойного эмульгирования, в соответствии с которым приготовленная
заранее эмульсия водного раствора фермента в органическом растворе
полимера вновь диспергируется в воде. После затвердевания органического
раствора
образуются
полимерные
сферические
частицы
с
иммобилизованными в них молекулами фермента.
Способ включения в волокна отличается от метода микрокапсулирования
главным
образом
формой
получаемых
препаратов.
Если
при
микрокапсулировании образуются сферические микрокапсулы, то при этом
способе
формируются
нити.
Для
иммобилизации
ферментов
можно
использовать также выпускаемые промышленностью полимерные полые
волокна, изготавливаемые из природных или синтетических материалов. Для
проведения ферментативной реакции волокна, по которым циркулирует
раствор
фермента,
погружаются
в
сосуд
с
раствором
субстрата,
диффундирующим через мембрану внутрь волокна.
В медицинских целях и некоторых фундаментальных исследованиях
достаточно широко используется метод иммобилизации ферментов путем их
включения в липосомы, поскольку такие системы близки природным
214
мембранам и могут дать весьма ценную информацию о ферментативных
процессах, протекающих в клетках. Существует несколько модификаций
данного способа, самой последней из которых является иммобилизация путем
включения в полимерные липосомы. Полимерные липосомы характеризуются
более высокой стабильностью по сравнению с обычными.
Основным недостатком всех мембранных систем, применяемых для
иммобилизации
ферментов,
является
невозможность
ферментативного
превращения высокомолекулярных субстратов, для которых мембраны
представляют собой непреодолимые барьеры.
Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа
сводится к тому, что ограничение свободы перемещения фермента в системе
достигается не вследствие его фиксирования на жестком носителе, а в
результате его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной
системы.
Химические методы иммобилизации ферментов.
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации
является то, что вследствие химических взаимодействий в молекуле фермента
возникают новые ковалентные связи, в частности между ним и носителем.
Препараты иммобилизованных ферментов, получаемые с использованием
химических методов, обладают, по крайней мере, двумя существенными
достоинствами. Во-первых, формирующаяся ковалентная связь между
ферментом и носителем обеспечивает высокую прочность образующих
конъюгатов. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна
приводить
к
существенным
изменениям
их
свойств
(субстратной
специфичности, каталитической активности и стабильности).
Существует большое число химических реакций, используемых для
ковалентного связывания ферментов с неорганическими носителями (такими,
как керамика, стекло, железо, цирконий и титан) или природными
полимерами (такими, как сефароза и целлюлоза), а также синтетическими
215
полимерными веществами (нейлон, полиакриламид и другие виниловые
полимеры или сополимеры, обладающие реакционно-способными группами).
Во многих из этих процедур ковалентное связывание ферментов с носителем
является не специфичным, т. е. ассоциирование фермента с носителем
осуществляется за счет химически активных группировок фермента,
распределенных по его молекуле случайным образом. Основным является
создание техники конъюгирования, при которой ферменты связывались бы с
носителем достаточно эффективно, но без снижения их каталитической
активности. Короче говоря, химическая иммобилизация ферментов в целом
является
своеобразным
искусством,
уровень
которого
определяется
качествами экспериментатора.
Для
получения
иммобилизованных
ферментов
используют
большое
количество различных как органических, так и неорганических носителей.
Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут служить
для иммобилизации ферментов, следующие:
• высокая химическая и биологическая стойкость;
• высокая механическая прочность;
• достаточная проницаемость для фермента и субстратов, большая удельная
поверхность, высокая пористость;
• возможность получения трубок, листов и т.п.;
• легкая активация (переведение в реакционноспособную форму);
• высокая гидрофильность, позволяющая проводить реакции связывания с
ферментом в водной среде;
• невысокая стоимость.
Отсутствие в природе универсальных носителей, обладающих сразу всеми
перечисленными свойствами, обусловливает широкий набор применяемых
для иммобилизации ферментов материалов.
Органические полимерные носители.
216
Используемые в настоящее время органические носители можно разделить на
два класса: 1 – природные полимеры, 2 – синтетические полимерные
носители. Первые, в свою очередь, подразделяются на группы
соответствии
с
их
биохимической
в
классификацией: полисахаридные,
белковые и липидные носители. Синтетические полимеры также могут
быть подразделены на несколько групп: полиметиленовые, полиамидные и
полиэфирные носители.
Помимо вышеупоминавшихся требований, к рассматриваемым носителям
предъявляются дополнительные, обусловленные методом иммобилизации,
свойствами иммобилизуемого фермента, а также способом дальнейшего
использования получаемого препарата:
• при ковалентном иммобилизации носитель должен связываться только с
теми функциональными группами на молекуле фермента, которые не
являются ответственными за катализ;
• носители не должны оказывать ингибирующего действия на фермент.
Применение природных полимеров в качестве носителей аргументируется
их доступностью и наличием свободных функциональных групп, легко
вступающих в разнообразные химические реакции, а также их высокой
гидрофильностью. К недостаткам следует отнести неустойчивость к
воздействию
некоторых
микроорганизмов
и
относительно
высокую
стоимость многих из них.
Полисахариды.
Наиболее часто для иммобилизации ферментов используют целлюлозу,
декстран, агарозу и их производные. Целлюлоза отличается высокой
степенью гидрофильности и наличием большого числа гидроксильных групп,
что обусловливает ее легкое модифицирование путем введения различных
заместителей.
Для
увеличения
механической
прочности
целлюлозу
гранулируют, что делает ее относительно дешевым и удобным для
иммобилизации
различных
ферментов
217
носителем.
Гранулированная
целлюлоза легко превращается в различные ионообменные производные.
Однако она неустойчива к действию сильных кислот, щелочей и некоторых
окислителей, что ограничивает области ее применения.
Хитин – природный аминополисахарид, напоминающий некоторым образом
целлюлозу и является компонентом наружного скелета ракообразных,
насекомых, а также входит в состав оболочек некоторых грибов. Являясь
отходом промышленной переработки креветок и крабов, данное соединение
имеется в достаточно больших количествах при относительно низкой
стоимости. Хитин обладает пористой структурой, не растворяется в воде,
разбавленных кислотах и щелочах, а также в органических растворителях.
Путем обработки щелочами хитин превращается в хитозан, который в
качестве носителя дает хорошие результаты,
иммобилизованных
поскольку
препараты
ферментов, приготовленные с помощью хитозана,
обладают высокой каталитической активностью и устойчивы к микробному
воздействию.
Декстран – разветвленный полисахарид бактериального происхождения,
содержащий остатки глюкозы. Приготовленные на его основе гели
выпускаются различными зарубежными фирмами и широко используются в
различного рода работах, Некоторые из них известны под названием
"сефадекс" (Швеция) и "молселект" (Венгрия).
Гели, приготовленные на основе декстрана, отличаются высокой стойкостью
по отношению к различным химическим веществам, что делает их весьма
широко
используемыми
в
различного
рода исследованиях и на
производстве. К группе декстранов может быть отнесен и крахмал,
представляющий собой смесь полисахаридов, основным компонентом
которой является амилоза и амилопектин. Посредством определенных
химических обработок из крахмала получен новый
крахмал,
обладающий
повышенной
гидролизующим полисахариды.
218
носитель – губчатый
устойчивостью
к
ферментам,
Агароза – широко используется в качестве носителя для иммобилизации
ферментов,
однако
стоимость
ее
довольно
высока,
что
заставляет
разрабатывать различные ее модификации с целью получения легко
регенерируемых форм, которые в результате этого могли бы использоваться
повторно. Гели, приготавливаемые на основе агарозы, выпускаются
различными зарубежными фирмами и некоторые широко известны и у нас в
стране, например "сефароза".
Агар – природный полисахарид, выделяемый из клеточных стенок некоторых
морских водорослей. Точный состав его не известен, но установлено, что он
содержит, по крайней мере, два полисахарида: агарозу и агаропектин.
Преимуществом агара является его низкая стоимость и нетоксичность.
Некоторые
производные
агара
отличаются
высокой
механической
прочностью и устойчивостью в щелочной среде, что явилось основанием
рассматривать данный носитель почти идеальным.
Другими полисахаридами, получаемыми из морских водорослей, являются
альгиновые кислоты и их соли, которые после некоторой модификации
применяются для иммобилизации ферментов, клеток и клеточных органелл.
Гепарин – кислый полисахарид, успешно применяемый для получения
водорастворимых препаратов иммобилизованных ферментов, используемых в
медицине.
Синтетические полимерные носители.
Огромное разнообразие синтетических полимеров обеспечивает их широкое
использование в качестве носителей для иммобилизации ферментов.
Синтетические полимеры используются для иммобилизации ферментов
различными способами, а также для получения гелей и микрокапсул.
Полимеры на основе стирола.
Полимеры этого типа являются основой для изготовления инообменных
материалов, а также для изготовления микропористых и макропористых
материалов, используемых в сорбционной иммобилизации.
219
Полимеры на основе производных акриловой кислоты.
Одним из производных акриловой кислоты, широко применяемым в качестве
носителя,
является
иммобилизации
акриламид.
ферментов
Весьма
широко
применяется
метод
клеток
путем
включения
их
и
в
полиакриламидный гель (ПААГ). При этом процентное содержание полимера
определяет пористость и жесткость геля. Некоторыми фирмами выпускаются
носители смешанного типа, изготавливаемые па основе ПААГ и агарозы.
Полиамидные носители.
Это группа различных полимеров с повторяющейся амидной группировкой.
Главным достоинством носителей этого типа является то, что они могут быть
созданы в различной физической форме: в виде гранул, порошков, волокон,
мембран, трубок и т. п. Широкое применение таких носителей, особенно для
медицинских
целей,
обусловлено
и
биологической
инертностью,
и
стойкостью к воздействию биологических факторов.
В Европе для приготовления полусинтетического пенициллина используется
на одном из этапов 6-амино-пенициллиновая кислота, получаемая с помощью
иммобилизованного фермента пенициллин-ацилазы. В год производится
примерно 3500 т этой кислоты, а для этого требуется произвести около 30 т
указанного фермента.
Иммобилизованная глюкозоизомераза используется в США, Японии и
Европе
для
промышленного
производства
концентрированного
фруктозного сиропа путем частичной изомеризации глюкозы, получаемой из
крахмала. Миллионы тонн такого сиропа ежегодно выпускаются с помощью
этого фермента, который в настоящее время является наиболее широко
применяемым из всех иммобилизованных ферментов.
Промышленные и коммерческие успехи этого процесса определяются
следующими факторами: глюкоза, получаемая из крахмала, относительно
дешевая; фруктоза – более сладкая, чем глюкоза; концентрированный
220
фруктозный сироп содержит примерно одинаковые количества глюкозы и
фруктозы, а по сладости подобен сахарозе.
Другой
важной
областью применения
иммобилизованных
ферментов
является производство аминокислот с помощью аминоацилазы. Колонки с
амино-ацилазой используются в Японии для производства сотен килограммов
L-метионина, L-фенилаланина, L-триптофана и L-валина. Ферментнополимерные
коньюгаты
широко
используются
в аналитической и
клинической химии. Иммобилизованные на колонках ферменты могут
использоваться повторно в качестве специфических катализаторов при
определении различных субстратов. Например, разработаны
ферментные
электроды для потенциометрических и амперометрических определений
таких веществ, как мочевина, аминокислоты, глюкоза, спирт и молочная
кислота.
Электрод представляет собой электрохимический сенсор, находящийся в
тесном контакте с тонкой проницаемой ферментной мембраной, способной
специфически
реагировать
с
какими-либо конкретными
субстратами.
Включенные в мембрану ферменты продуцируют кислород, ионы водорода,
ионы аммония, двуокись углерода или другие небольшие молекулы (в
зависимости
от осуществляемой
реакции),
которые
затем
легко
детектируются специфическим сенсором. Выраженность ответа указывает
на концентрацию определяемого вещества.
Применение ферментной технологии в существующих в настоящее время
процессах
(таких,
как
пивоварение,
обработка
пищевых
продуктов,
фармакология, химическая промышленность и т. п.) имеет огромные
перспективы, однако до полной реализации ее еще весьма далеко.
Наконец, несколько слов о так называемых иммобилизованных микробных
клетках, которые получают все большее распространение и характеризуются
снижением расхода времени и дорогих этапов очистки. Иммобилизация
клеток достигается аналогичными методами, что и свободных ферментов.
221
Огромным преимуществом иммобилизованных клеточных систем является
замена ими сложных ферментационных процессов, таких, как получение
вторичных продуктов микробного метаболизма (производство синтетических
антибиотиков), в постоянно контролируемых химических процессах с
использованием ферментных электродов, водных анализах и обработках
отходов,
непрерывных
солодовых
процессах,
азотфиксации,
синтезе
стероидов и других медицинских продуктов.
Лекция 17. Иммунобиотехнология.
Вакцины.
Вакцинация
способствует
формированию
у
реципиента
иммунитета к патогенным микроорганизмам и тем самым защищает его от
инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в
организме хозяина вырабатываются антитела к патогенному микроорганизму,
которые при последующей инфекции приводят к его инактивации
(нейтрализации или гибели), блокируют его пролиферацию и не позволяют
развиться заболеванию.
Эффект вакцинации открыл более 200 лет назад — в 1796 г. — врач Эдвард
Дженнер. Он доказал экспериментально, что человек, перенесший коровью
оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится
невосприимчивым
к
оспе
натуральной.
Натуральная
оспа
—
высококонтагиозное заболевание с высокой смертностью; даже если больной
не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические
расстройства и слепота. Дженнер публично провел прививку коровьей оспы
8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из
пустулы больной коровьей оспой, а затем через определенное время дважды
инфицировал ребенка гноем из пустулы больного натуральной оспой. Все
проявления заболевания ограничились покраснением в месте прививки,
исчезнувшим через несколько дней.
222
Ранее такие инфекционные болезни, как туберкулез, оспа, холера, брюшной
тиф, бубонная чума и полиомиелит, были настоящим бичом для человечества.
С появлением вакцин, антибиотиков и внедрением мер профилактики эти
эпидемические болезни удалось взять под контроль. Однако защитные меры
со временем становились неэффективными, и возникали новые вспышки
заболеваний. В 1991 г. эпидемия холеры поразила Перу; в течение трех
следующих лет было выявлено примерно 1 млн. заболевших, несколько тысяч
из них умерли. К сожалению, против многих болезней человека и животных
вакцин не существует. Сегодня во всем мире более 2 млрд, людей страдают
заболеваниями, которые можно было бы предотвратить с помощью
вакцинации. Вакцины могут оказаться полезными и для профилактики
постоянно появляющихся «новых» болезней (например, СПИДа).
Как
правило,
современные
(инактивированных)
вакцины
патогенных
создают
микроорганизмов
на
основе
либо
убитых
живых,
но
невирулентных (аттенуированных) штаммов. Для этого штамм дикого типа
выращивают в культуре, очищают, а затем инактивируют или модифицируют
таким образом, чтобы он вызывал иммунный ответ, достаточно эффективный
в отношении вирулентного штамма. Несмотря на значительные успехи в
создании вакцин против таких заболеваний, как краснуха, дифтерия, коклюш,
столбняк,
оспа
и
полиомиелит,
производство
современных
вакцин
сталкивается с целым рядом ограничений.
• Не все патогенные микроорганизмы удается культивировать, поэтому для
многих заболеваний вакцины не созданы.
• Для получения вирусов животных и человека необходима дорогостоящая
культура животных клеток.
• Титр вирусов животных и человека в культуре н скорость их размножения
часто бывают очень низкими, что удорожает производство вакцин.
•
Необходимо строго соблюдать меры предосторожности, чтобы не
допустить инфицирования персонала.
223
• При нарушении производственного процесса в некоторые партии вакцины
могут
попасть
живые
или
недостаточно
ослабленные
вирулентные
микроорганизмы, что может привести к неумышленному распространению
инфекции.
•
Аттенуированные штаммы могут ревертировать к исходному штамму,
поэтому необходимо постоянно контролировать вирулентность.
•
Некоторые заболевания (например, СПИД) нельзя предупреждать с
помошью традиционных вакцин.
• Большинство современных вакцин имеют ограниченный срок годности и
сохраняют
активность
температуре,
что
только
затрудняет
их
при
пониженной
использование
в развивающихся
странах.
В последнее десятилетие, с развитием технологии рекомбинантных ДНК,
появилась возможность создать новое поколение вакцин, не обладающих
недостатками традиционных вакцин. Для их разработки применяют методы
генной инженерии.
•
Патогенный
микроорганизм
модифицируют,
делегируя
гены,
ответственные за вирулентность. Способность вызывать иммунный ответ при
этом сохраняется. Такой микроорганизм можно безбоязненно использовать в
качестве
чистой
живой
культуре
вакцины,
исключает
поскольку
выращивание
в
возможность спонтанного восстановления
целого гена,
• Создают живые непатогенные системы переноса отдельных антигенных
детерминант неродственного патогенного организма. Такая система переноса
способствует развитию выраженного иммунного ответа на патогенный
микроорганизм.
•
Если патогенные микроорганизмы не растут в культуре, можно
изолировать, клонировать и экспрессироватъ в альтернативном хозяине
224
(например, в E, coli или линии клеток млекопитающих) гены тех белков,
которые содержат основные антигенные детерминанты, и
использовать эти белки как «субъединичные", вакцины (см, следующий
раздел). • Некоторые патогенные микроорганизмы действуют опосредованно,
вызывая развитие аутоиммунной реакции на инфицированные клетки
организма-хозяина.
специфического
Для
таких
уничтожения
заболеваний
можно
клеток-мишеней,
создать
систему
сконструировав
ген,
кодирующий химерный белок, одна часть которого будет связываться с
инфицированной клеткой, а другая — уничтожать ее. Эта система не является
истинной вакциной, хотя она и действует только на инфицированные клетки,
устраняя саму причину развития аутоиммунной реакции.
К вакцинам для животных предъявляются менее жесткие требования, поэтому
первыми вакцинами, полученными с помощью технологии рекомбинантных
ДНК, были вакцины против ящура, бешенства, дизентерии и диареи поросят.
Создаются и другие вакцины для животных, а в скором времени появятся и
рекомбинантные вакцины, предназначенные для человека.
Субъединичные вакцины. Как правило, вакцины содержат неповрежденные
патогенные микроорганизмы, но при этом неживые или аттенуированные.
Антитела, вырабатываемые в ответ на их введение, связываются с
поверхностными белками патогенного организма и запускают иммунный
ответ. Б связи с этим возникает вопрос: должна ли вакцина содержать целые
клетки или лишь какие-то специфические поверхностные компоненты? Что
касается вирусов, то, как было показано, для выработки в организме-хозяине
антител
в
ответ
на
вирусную
инфекцию
достаточно
очищенных
поверхностных белков вируса (белков капсида или внешней оболочки).
Вакцины,
содержащие
лишь
отдельные
компоненты
патогенного
микроорганизма, называют «субъединичными»; для их разработки с успехом
используется технология рекомбинантных ДНК.
225
Генная иммунизация. Новый подход, позволяющий индуцировать у
организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в
клетки животного-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых
экспериментах такого рода E. coli-плазмиду, содержащую клонированный ген
белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора
вируса
животных,
конъюгировали
с
микрочастицами
золота
и
бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что
клонированную
кДНК
можно
вводить
в
клетки
и
с
помощью
внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды,
несущей соответствующую ДНК, Для этого необходимо в 103-104 раз больше
ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов
более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный
белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать
очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования
для создания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того,
получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются
правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые
организмами-хозяевами.
Этот
метод,
получивший
название
генной
иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных.
Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из
серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей
вводили раствор с Е. соli-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса
гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора
вируса саркомы Рауса или цитомегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена
нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2
нед после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к нему.
Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем
мышей из контрольной группы. Более того, они были нечувствительны и к
другому
штамму
вируса
гриппа.
226
Такая
перекрестная
защита
не
вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин,
полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая
вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того,
традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор,
пока остаются неизмененными поверхностные антигены, К сожалению, для
генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что
приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса.
Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и
активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные
антигены.
ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых
антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на
кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же
вектор можно использовать для доставки разных белков или для
многократного введения одного и того же гена.
Моноклональные антитела (МКАТ). Эффективность препаратов антител,
полученных при иммунизации животных, меняется от одной партии к другой,
поскольку
в
одних
случаях
антитилопродукувальные
во
клетки
время
сильнее
проведения
иммунизации
стимулируются
одними
детерминантами определенного антигена, а в других иммунная система
активно отвечает на другие эпитопы того же антигена. Это может влиять на
способность различных препаратов антител сочетаться с антигенами,
поскольку
отдельные
эпитопы
имеют
разную
эффективность
(стимулирующее способность). Поэтому в одной партии поликлональных
антител может содержаться мало молекул, направленных против основного
эпитопов, и в результате она будет менее эффективной, чем другая. Чтобы
повысить специфичность антител, для диагностики часто используют
моноклональные
антитела.
В-лимфоциты
(В-клетки),
синтезирующие
антитела, не могут длительное время культивироваться в культуре in vitro.
227
Решение этой проблемы исследователи видели в создании гибридной клетки.
Получив
генетическую
составляющую
от
В-клетки,
она
могла
бы
вырабатывать антитела, а получив способность к делению от клеток
совместного типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда
перерождаются и становятся раковыми (миеломная) клетками, приобретая
способность к росту в культуре и сохраняя вместе с тем многие свойства Вклеток. Так клетки миеломы, прежде всего те, что не производят антител,
стали кандидатами на слияние с антитилопродукувальнимы В-клетками.
Структура и функции антител. Молекула антитела (иммуноглобулин)
состоит из двух «легких» (L) и двух «тяжелых» (Н) белковых цепей, которые
соединены водородными связями и расположенными в строго определенных
местах дисульфидными мостиками. N-концевые участки L- и Η-цепей
образуют антигенсвязывающий сайт. Отдельные домены
(области) молекулы антитела выполняют разные функции, что облегчает
манипуляции с генами антител. Антигенсвязывающие сайты состоят из трех
участков, определяющих комплементарность антител к антигену (CDR, от
англ, complementarity-determining regions), и образующих вариабельные (VH и
Vl) области на N-концах Н- и L-цепей. Для CDR характерна очень высокая
изменчивость последовательности аминокислот, поэтому их еще называют
гипервариабельными. Помимо вариабельных (VH и Vl), каждая L-цепь
содержит одну константную область, или домен (CL), a каждая Η-цепь -три
константных области, или домена (СH1, СН2 и СH3). При обработке антитела
протеолитическим ферментом папаином образуются три фрагмента: два
идентичных (Fab), каждый из которых содержит интактную L-цепь,
связанную дисульфидным мостиком с vh- и СH1-доменами Н-цепи, и один Fc,
состоящий из двух соединенных дисульфидной связью СН2- и Сн3-доменов Нцепи, Fab-фрагмент, точнее его N-концевая часть, называемая Fv-фрагментом,
обладает антигенсвязывающей активностью, присущей интактной молекуле
228
антитела (рис. 10.5). При этом его аминокислотная последовательность у
разных молекул существенно различается.
После связывания антигена с интактным антителом запускаются следующие
реакции иммунного ответа.
• Активируется система комплемента. Компоненты этой системы разрушают
клеточные мембраны, активируют фагоциты и генерируют сигналы,
мобилизующие другие компоненты системы иммунного ответа.
•
В
результате
связывания
антитела
Fc-участка
с
Fc-рецептором
эффекторной клетки запускается реакция опосредованной антителами
клеточной
цитотоксичности.
высвобождает
которой
•
связан
вещества,
Fab-участок
Активированная
лизирующие
эффекторная
чужеродную
клетка
клетку,
с
молекулы антитела.
После связывания Fab-участка с растворимым антигеном Fc-участок
антитела может присоединяться к Fc-рецепторам фагоцитов, которые
захватывают и разрушают комплекс антиген—антитело.
Получение МКАТ. Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной
линии, которая производит антитела одной специфичности, заключается во
введении мышам антигена - иммунизации. После цикла иммунизации,
проведенного в течение нескольких недель, проверяют, произошло развитие у
животных иммунного ответа. Если ответ развилась, то у животных берут
селезенку,
промывают
высвобождения
ее,
единичных
измельчают
клеток,
и
среди
слегка
встряхивают
которых
находятся
для
и
антитилопродукувальни В-клетки. Клетки селезенки смешивают с суспензией
специальных миеломных клеток, дефектных (мутантных) за ферментом
гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ). Такое суспензию в
течение нескольких минут инкубируют в 35% растворе полиэтиленгликоля, а
затем переносят в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин
(среда ГАО). Обработка полиэтиленгликолем способствует слиянию клеток,
однако оно происходит редко и в большинстве своем случайным событием. В
229
смеси содержатся клетки миеломы, селезенки, а также гибридные (те,
слившиеся) клетки миеломы-селезенки. Однако в среде ГАО растут только
гибридные клетки миеломы-селезенки, все другие типы клеток погибают.
Клетки селезенки, слившихся вообще не растут в культуре in vitro, а
дефектные (мутантные) миеломные клетки ГГФРТ не могут использовать
гипоксантин как предшественник в процессе биосинтеза пуриновых
оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых
кислот. Однако у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - с
участием дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит
аминоптерин, что ингибирует активность этого фермента. Итак, миеломные
клетки ГГФРТ не могут синтезировать пурины в среде ГАО и погибают.
Клетки селезенки-миеломы, слившихся растут в среде ГАО, поскольку
клетки
селезенки
предоставляющий
поставляют
гибридомы
функциональный
способности
фермент
утилизировать
ГГФРТ,
экзогенный
гипоксантин среды, несмотря на блокирование синтеза пуринов с участием
дигидрофолатредуктазы Аминоптерин, и за счет способности клеток
миеломы к активному делению. Тимидин нужен для устранения блокировки в
синтезе
пиримидинов,
обусловленного
ингибированием
дигидрофолатредуктазы. На 10-14-е сутки после слияния клеток в среде ГАО
остаются и растут только слиты гибридомы селезенки-миеломы. Их потом
вносят в углубление пластиковых микротитровального планшетов и
выращивают на полном культуральной среде без ГАО. После проведения
слияния и получения гибридомы нужно осуществить идентификацию
(скрининг) гибридных клеточных линий, секретирующих специфические
антитела к антигену, который использовали для иммунизации. Для этого
обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих антитела,
которые секретируются, например, иммуноферментным анализом. Чтобы
получить линии, которые происходят от одной клетки (клоны), клеточную
суспензию из таких углублений разбавляют культуральным средой и
230
высевают в другие углубления. После культивирования полученных клонов
среды снова тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом)
продуцирует моноклональные антитела (МКАТ), распознающие антигенмишень. В том случае, когда получают более одну специфическую гибрида,
проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены
антитела, которые вырабатываются различными клонами, против одной и той
же
антигенной
детерминанты.
Каждый
клон,
продуцирующий
моноклональные антитела, можно поддерживать в культуре практически
бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и
использовать их в дальнейшем как источник клеток. Иногда используют
культивирования гибридом в организме мышей. Для этого гибрида вводят в
брюшную
полость
мышей
совместной
генетической
линии
после
предварительного подавления их иммунной системы, например, введением
минерального масла. Гибридомы (собственно злокачественная опухоль)
приживается в брюшной полости мыши, начинает размножаться и
синтезировать значительное количество антител, которые можно выделить из
асцитической жидкости. Полученные гибридомной технологии МКАТ имеют
абсолютно одинаковую специфичность, принадлежащих к одному классу,
подклассу иммуноглобулинов и практически стандартными препаратами,
характеристики которых не зависят от условий содержания животных,
индивидуальных особенностей и т.д.. В связи с этим сейчас МКАТ нашли
широкое
применение
для
выделения
высокоочищенных
препаратов
некоторых веществ, как компоненты диагностических препаратов, новые
типы вакцин, иммунотерапевтические средства.
Лекция 18. Рекомбинантные белки и полипептиды.
Выделение кДНК интерферонов. Для выделения генов или кДНК
белков человека используют разные подходы. В ряде случаев выделяют
231
нужный
белок
и
определяют
аминокислотную
последовательность
соответствующего участка молекулы. Исходя из этого находят кодирующую
его
нуклеотидную
последовательность,
синтезируют соответствующий
олигонуклеотид и используют его в качестве гибридиза-ционного зонда для
выделения нужного гена или кДНК из геномных или кДНК-библиотек.
Другой подход состоит в выработке антител к очищенному белку и
использовании их для скрининга библиотек, в которых происходит
экспрессия определенных генов. Для белков человека, синтезируемых
преимущественно в какой-то одной ткани, кДНК-библиотека, полученная на
основе
мРНК,
выделенной
последовательностью
из
ДНК-мишени.
этой
ткани,
Например,
будет
обогащена
основным
белком,
синтезируемым клетками островков Лангерганса поджелудочной железы,
является инсулин, и 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют
именно его. Однако принцип обогащения кДНК неприменим для тех белков
человека, количество которых очень мало или место синтеза которых
неизвестно. В этом случае могут понадобиться другие экспериментальные
подходы. Интерфероны (ИФ) человека, включающие α-, β- и γ-интерфероны
(ИФα, ΗΦβ, ИФγ), — это природные белки, каждый из которых может найти
свое терапевтическое применение. При выделении их кДНК пришлось
разработать новый подход, позволяющий преодолеть трудности, связанные с
недостаточным содержанием соответствующих мРН К и белков. Процедура
выделения кДНК интерферонов состояла в следующем.
1. Из лейкоцитов человека выделили мРНК и фракционировали ее по
размерам; провели обратную транскрипцию и встроили в сайт PstI плазмиды
pBR322.
2.
Полученным продуктом трансформировали
Escherichia
coli.
Образовавшиеся 6000 клонов подразделили на 12 групп; по 512 клонов в
каждой. Тестирования проводили на группе клонов, что позволило ускорить
процесс их идентификации.
232
3. Каждую группу клонов гибридизовали с неочищенным препаратом
ИФ-мРНК,
4. Из образовавшихся гибридов, содержащих клонированную ДНК и
мРНК, выделили мРНК и провели ее трансляцию в бесклеточной системе
синтеза белка.
5. Определили интерферонную противовирусную активность каждой
смеси,
полученной
в
результате
трансляции.
Группы,
проявившие
интерферонную активность, содержали клон с кДНК, гибридизовшейся с ИФмРНК.
6.
Позитивные группы разбили на 8 подгрупп, содержащих по 64
клона, и вновь провели тестирование. Разбиение на подгруппы повторяли до
тех пор, пока не идентифицировали клон, содержащий полноразмерную ИФкДНК человека.
Если нужно получить большие количества ИФ, соответствующую
кДНК можно субклонировать в экспрессирующем Е. соli-векторе, который
позволяет достичь высокого уровня экспрессии.
Гормон роста человека, полученный методом генной инженерии.
Стратегию конструирования новых белков путем замены функциональных
доменов или с помощью направленного мутагенеза можно использовать для
усиления или ослабления биологического действия белка. Например,
нативный гормон роста человека (ГРЧ) связывается в разных типах клеток
как с рецептором гормона роста, так и с пролактиновым рецептором.
Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе
лечения, нужно исключить присоединение ГРЧ к пролактиновому рецептору.
Поскольку участок молекулы гормона роста, связывающийся с этим
рецептором, по своей аминокислотной последовательности лишь частично
совпадает с участком молекулы, который взаимодействует с пролактиновым
рецептором, удалось избирательно снизить связывание гормона с последним.
Для этого использовали сайт-специфический мутагенез, в результате
233
которого произошли определенные изменения в боковых группах некоторых
аминокислот (His-18, His-21 и Glu-174) — лигандов для ионов Zn2+,
необходимых для высокоаффинного связывания ГРЧ с пролакгиновым
рецептором (рис. 10.2). Модифицированный гормон роста связывается
только со «своим» рецептором. Полученные результаты представляют
несомненный интерес, но смогут ли модифицированные ГРЧ найти
применение в клинике, пока неясно.
Лекарственные средства против ВИЧ. Ученым пока не удалось
получить вакцину, достаточно эффективную против вируса иммунодефицита
человека (ВИЧ), который вызывает развитие синдрома приобретенного
иммунодефицита (СПИД). Параллельно с созданием такой вакцины идет
поиск других средств, позволяющих замедлить патологический процесс.
ВИЧ поражает один из видов лимфоцитов, а именно Т-хелперы (Тнклетки). В норме в процессе развития иммунного ответа Тн-клетки связывают
продукты деградации специфических антигенов и высвобождают факторы,
стимулирующие другие клетки иммунной системы к участию в иммунном
ответе. Тн-клетки играют в этом процессе ключевую роль, а при ВИЧинфекции они перестают функционировать. Как только вирус внедряется в
Тн-клетку, он становится защищенным от иммунной системы организма и
начинает оказывать свое разрушающее действие на Тн-клетки.
•
В результате размножения вируса в инфицированной клетке
происходит ее лизис.
•
по
Пораженная
производству
клетка
действует
как
фабрика
ВИЧ-гликопротеина (gpl20), который вызывает
разрушение Тн-клеток и других Т-лимфоцитов.
•
Пораженная клетка сливается с другими Тн-клетками, формируя
синцитий, который
не способен выполнять функции, свойственные
индивидуальным Тн-клеткам.
234
Основным следствием ВИЧ инфекции явля ется неспособность
иммунной системы организма обеспечивать его защиту от обычных
бактериальных и вирусных инфекций, которые в конце концов приводят к
гибели больного, несмотря на лечение антибиотиками и другими средствами.
На первом этапе ВИЧ-инфекции происходит взаимодействие между
гликопротеином оболочки вируса мол. массой 120 кДа (gpl20) и рецептором
на поверхности Тн-клеток — CD4. In vitro поражение th-клеток блокируется
антителами к СЕМ; процесс замедляется также при избытке свободного
белка CD4. Однако ни один из этих способов не приводит к уничтожению
вируса. Один из подходов, обеспечивающих как защиту Тн-клеток, так и
инактивацию вируса, заключается в создании химерного белка, состоящего
из фрагмента молекулы CD4 и Fc-фрагмента иммуноглобулина. Свойства
этого белка, называемого СВ4-иммуноад-гезином, определяются составными
частями его молекулы: СD4-компонент связывает gp120 и блокирует ВИЧ, а
иммуноглобулиновый обеспечивает замедление разрушения молекулы в
плазме и ее связывание с клетками, несущими рецептор к антителу. После
присоединения СD4-иммуноадгезина к свободной вирусной частице или к
инфицированной клетке запускается реакция опосредованной антителами
клеточной цитотоксичности, которая обеспечивает уничтожение вируса или
пораженной им клетки.
Другой
подход,
позволяющий
контролировать
развитие
ВИЧ-
инфекции, заключается в создании системы мечения ВИЧ-пораженных
клеток для их специфического уничтожения. Например, если сшить два
фрагмента ДНК, один из которых кодирует рецептор CD4, а другой —
внутриклеточный токсин Pseitdomonas (экзотоксин А), то мы получим ген,
кодирующий химерный белок с комбинированными свойствами. Экзотоксин
A Pseudomonas -это белок с мол. массой 66 кДа, состоящий из трех доменов:
домен I отвечает за связывание с клеткой, II — за проникновение белка в
клетку, III — за присоединение ADP-рибозы к эукарио-тическому фактору
235
элонгации (EF-2), что приводит к его инактивации. Химерный белок CD4—
экзотоксин A Pseudomonas вместо домена I содержит большую часть
последовательности CD4, в результате чего обладает и цитотоксической
активностью экзотоксина Pseudomonas, и gp120-связывающей активностью
CD4.
На
поверхности
всех
ВИЧ-поражен-ных
клеток
находится
гликопротеин gp120, поэтому СD4-домен химерного белка соединяется
исключительно с этими клетками. Присоединившись к инфицированной
клетке, химерный белок проникает внутрь нее при участии домена II
экзотоксина A Pseudomonas. Затем экзотоксиновая часть химерного белка
инактивирует фактор элонгации EF-2, участвующий в синтезе белка. Это
препятствует дальнейшему синтезу белка, что в конце концов приводит к
гибели клетки. Таким образом, CD4-домен «помечает» ВИЧ-пораженные
клетки, а экзотоксин выступает в роли «наемного убийцы».
Синтезируясь в Е. coli, химерный белок образует нерастворимые
цитоплазматические включения. Их растворяют в гуанидингидрохлориде и
выделяют
с
помощью
быстрого
разведения
и
анион-обменной
хроматографии. Полученный таким образом белок с успехом выдержал
проверку в контрольной культуре клеток. Однако в организме человека на
Рsеиdотопаs-компонент химерного белка может возникнуть иммунная
реакция, и не исключено, что его придется вводить вместе с каким-либо
иммуносупрессантом, например циклоспорином. Нужно иметь в виду, что
описанный выше способ борьбы с ВИЧ-инфекцией находится на начальной
стадии разработки, хотя в будущем и может оказаться весьма эффективным.
Подобные
иммунопрепараты
обладают
достаточно
высокой
эффективностью, что позволяет применять их в низких дозах и свести к
минимуму побочное действие на иммунную систему. Кроме того, они могут
оказаться полезными для лечения различных новообразований, а иногда и
заменять химиотерапию. На пораженные клетки можно «нацелить" и другие
цитотоксичные белки, например дифтерийный токсин или растительный
236
токсин рицин. Впрочем, даже при оптимальном развитии событий пройдет
еще
несколько
лет,
прежде
чем
терапевтическое
применение
рекомбинантных экзотоксинов станет рутинным.
Ферменты.
ДНКаза I. Наиболее частым летальным наследственным заболеванием
среди европеоидов является муковисцидоз. В США выявлено 30 000 случаев
этого заболевания, в Канаде и странах Европы - 23 000. Пациенты с
муковисцидозом
часто
страдают
инфекционными
заболеваниями,
поражающими легкие. Лечение рецидивирующих инфекций антибиотиками в
конце концов приводит к появлению резистентных штаммов патогенных
бактерий. Бактерии и продукты их лизиса вызывают накопление в легких
вязкой слизи, затрудняющей дыхание. Одним из компонентов слизи является
высокомолекулярная ДНК, которая высвобождается из бактериальных
клеток при лизисе. Ученые из биотехнологической компании Genentech
(США) выделили и экспрессировали ген ДНКазы — фермента, который
расщепляет высокомолекулярную ДНК на более короткие фрагменты.
Очищенный фермент вводят в составе аэрозоля в легкие больных
муковисцидозом, он расщепляет ДНК, вязкость слизи снижается, что
облегчает дыхание. Хотя эти меры и не излечивают муковисцидоз, они
облегчают состояние больного. Применение данного фермента было недавно
одобрено Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов,
медикаментов и косметических средств (США), и объем его продаж составил
в 2000 г. примерно 100 млн. долларов.
Альгинат-лиаза. Альгинат - это полисахарид, синтезируемый целым
рядом морских водорослей, а также почвенными и морскими бактериями.
Его мономерными единицами являются два сахарида – ß-D-маннуронат и aL-гулуронат, относительное содержание и распределение которых и
определяют свойства конкретного альгината. Так, остатки a-L-гулуроната
образуют межцепочечные и внутрицепочечные сшивки путем связывания
237
ионов кальция; остатки ß-D-маннуроната связывают ионы других металлов,
Альгинат, содержащий такие сшивки, образует эластичный гель, вязкость
которого прямо пропорциональна размеру полисахаридных молекул.
Выделение альгината слизистыми штаммами Pseudomonas aemginosa
существенно повышает вязкость слизи у больных муковисцидозом. Чтобы
очистить дыхательные пути и облегчить состояние больных, в дополнение к
обработке ДНКазой I следует провести деполимеризацию альгината с
помощью альгинат-лиазы.
Ген
альгинат-лиазы
был
выделен
из
Flavobacterium
sp.,
грамотрицательной почвенной бактерии, ативно вырабатывающей этот
фермент. На основе E. coli был создан банк клонов Flavobacterium и проведен
скрининг тех из них, которые синтезируют альгинат-лиазу, путем высевания
всех клонов на твердую среду, содержащую альгинат, с добавлением ионов
кальция. В таких условиях весь альгинат, находящийся в среде, за
исключением того, который окружает продуцирующие альгинат-лиазу
колонии, образует сшивки и становится мутным. Гидролизованный альгинат
теряет способность к формированию сшивок, поэтому среда вокруг
синтезирующих
альгинатлиазу
клонированного
фрагмента
колоний
ДНК,
остается
прозрачной-Анализ
присутствующего
в
одной
из
положительных колоний, показал наличие открытой рамки считывания,
кодирующей полипептид мол. массой около 69 000. Более детальные
биохимические и генетические исследования показали, что этот полипептид,
по-видимому,
является
предшественником
трех
альгинат-лиаз,
вырабатываемых Flavobacterium sp. Сначала какой-то протеолитический
фермент отрезает от него N-концевой пептид массой около 6000. Оставшийся
белок
мол.
массой
63
000
способен
деполимеризовать
альгинат,
вырабатываемый как бактериями, так и морскими водорослями. При его
последующем разрезании образуется продукт мол. массой 23 000,
деполимеризующий альгинат морских водорослей, и фермент мол. массой 40
238
000, разрушающий альгинат бактерий. Для получения больших количеств
фермента мол. массой 40 000 кодирующую его ДНК амплифицировали
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), а затем встраивали в
выделенный из В. subtilis плазмидный вектор, несущий ген, кодируюший
сигнальный пептид α-амилазы В. sitbtüis. Транскрипцию контролировали при
помощи системы экспрессии гена пенициллиназы. При трансформации
клеток В. subtilis полученной плазмидой и высевании их на содержащую
альгинат твердую среду с добавлением ионов кальция образовались колонии
с большим ореолом. Когда такие колонии выращивали в жидкой среде, рекомбинантная
альгинат-лиаза
выделялась
в
культуральную
среду.
Последующие тесты показали, что этот фермент способен эффективно
разжижать альгинаты, синтезируемые слизистыми штаммами P. aeruginosa,
которые были выделены из легких больных муковисцидозом. Для того чтобы
определить,
целесообразно
ли
проводить
клиническое
тестирование
рекомбинантной альгинат-лиазы, нужны дополнительные исследования.
Профилактика отторжения трансплантированных органов. В 1970х гг. были пересмотрены взгляды на пассивную иммунизацию: ее стали
считать
профилактическим
трансплантированных
средством
органов.
борьбы
Предлагалось
с
отторжением
вводить
пациентам
специфические антитела, которые будут связываться с лимфоцитами
определенного типа, уменьшая иммунный ответ, направленный против
пересаженного органа.
Первыми веществами, рекомендованными Департаментом по контролю
за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств
(США) для использования в качестве иммуносупрессоров при пересадке
органов у человека, были моноклональные антитела мыши ОКТЗ. За
отторжение органов отвечают так называемые Т-клетки — лимфоциты,
дифференцирующиеся
в
тимусе.
ОКТЗ
связываются
с
рецептором,
находящимся на поверхности любой Т-клетки, который называется CD3. Это
239
предупреждает
развитие
трансплантированного
полного
органа.
иммунного
Подобная
ответа
и
отторжение
иммуносупрессия
весьма
эффективна, хотя и оказывает некоторые побочные действия, например
вызывает лихорадку и приводит к появлению сыпи.
240
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
МАТЕРИАЛЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ЗАНЯТИЙ
по дисциплине
«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Специальность — 020209.65 «Микробиология»
Форма подготовки очная
г. Владивосток
2012
241
СОДЕРЖАНИЕ ПРАКТИЧЕСКОЙ ЧАСТИ КУРСА.
Лабораторные работы к курсу «Молекулярная биотехнология»
Лабораторная работа №1 Биотехнология как динамически развивающаяся
наука.
1.
Основные понятия и термины биотехнологии.
2.
Предмет и задачи биотехнологии.
3.
Теоретические основы биотехнологии.
4.
Связь биотехнологии с фундаментальными науками второй половины
XX века.
5.
Биотехнологизация различных направлений деятельности человека.
Теоретический
Модуль I «Молекулярная биотехнология:
модуль/раздел/тема,
которому
по
история и направления развития»
выполняется
лабораторная работа
Цель практического занятия
Знакомство
студентов
достижениями
с
современной
биотехнологии,
формирование целостного представления о
возможностях
применения
полученных
знаний и навыков для решения конкретных
задач.
Приобретаемые
навыки и умения
практические Овладение
практическими
необходимыми
в
умениями,
дальнейшей
профессиональной деятельности
242
Необходимое оборудование и
-
(или) программное обеспечение
Продолжительность
6 часов
практического занятия
Форма выдачи результата
Отчет в рабочем журнале в виде записей и
рисунков
Лабораторная работа №2 Возможности и задачи биотехнологии. Устройство
биотехнологической лаборатории.
1.
Устройство биотехнологической лаборатории. Правила работы в
лаборатории.
2.
Способы
стерилизации
помещения,
лабораторной
посуды,
инструментов, рабочего места, питательных сред.
3.
Основные методы культивирования клеток и тканей.
4.
Знакомство с устройством автоклава.
Теоретический
Модуль I «Молекулярная биотехнология:
модуль/раздел/тема,
которому
по история и направления развития»
выполняется
лабораторная работа
Цель лабораторной работы
Обучить студентов правилам работы в
биотехнологической
лаборатории,
подготовке
места
рабочего
и
инструментария для исследований
Приобретаемые
практические Студенты приобретают навыки в умении
навыки и умения
соблюдать правила стерильности и работы с
243
живыми
клеточными
культурами,
необходимые в исследованиях.
Необходимое оборудование и Автоклав,
стерильный
(или) программное обеспечение
плитка электрическая.
Продолжительность
6 часов
бокс,
пинцеты,
лабораторной работы
Форма выдачи результата
Отчет в рабочем журнале в виде записей и
рисунков
Лабораторная
работа
№3
ОБЪЕКТЫ
МОЛЕКУЛЯРНОЙ
БИОТЕХНОЛОГИИ. МЕТОДЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ БИООБЪЕКТОВ
1.
Основные критерии выбора биообъекта
2.
Классификация биообъектов
3.
Индуцированный мутагенез
4.
Селекция
5.
Клеточная инженерия и технология рекомбинантных ДНК
6.
Культура тканей и клеток растений как источник для получения
лекарственных средств
Теоретический
Модуль I «Молекулярная биотехнология:
модуль/раздел/тема,
которому
по история и направления развития»
выполняется Объекты молекулярной биотехнологии
лабораторная работа
Цель лабораторной работы
Показать
разнообразие
назначению,
составу,
биообъектов
по
происхождению.
Обучить основам генной инженерии и
244
мутагенеза.
Приобретаемые
практические Освоение основных приемов манипуляции с
навыки и умения
растительным и животным геномами. Отбор
наиболее ценных мутантов.
Необходимое оборудование
Мультимедийная техника
Продолжительность
6 часов
лабораторной работы
Форма выдачи результата
Отчет в рабочем журнале в виде записей и
рисунков.
Лабораторная
работа
№4
РЕАЛИЗАЦИЯ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ИНФОРМАЦИИ У ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ
1.
Устойство генетического аппарата про- и эукариот
2.
Особенности организации регуляторных элементов у про- и эукариот
3.
Основные этапы транскрипции
4.
Методы регуляции экспрессии
5.
Постановка ПЦР-реакции
Теоретический
Модуль
модуль/раздел/тема,
которому
II
«Фундаментальные
основы
по молекулярной биотехнологии»
выполняется Реализация генетической информации у
лабораторная работа
живых организмов.
Цель лабораторной работы
Изучить устройство генетического аппарата
про-
и
эукариот.
Освоить
технику
амплификации и детекции нуклеиновых
кислот на примере полимеразной цепной
реакции и электрофореза, соответственно.
245
Получить
кДНК
гена
«домашнего
хозяйства» актина.
Приобретаемые
практические Умение правильно владеть инструментами:
навыки и умения
пипеткой, ПЦР-амплификатором, шейкером
и
центрифугой
в
соответствии
с
их
назначением.
Необходимое оборудование
Мультимедийная техника
Продолжительность
6 часов
лабораторной работы
Форма выдачи результата
Отчет в рабочем журнале в виде записей и
рисунков.
Демонстрация
агарозных
гелей
с
полученных
продуктами
ПЦР-
реакции.
Лабораторная
работа
№5 ИНСТРУМЕНТЫ И МЕТОДЫ ГЕННОЙ
ИНЖЕНЕРИИ
1.
Инструменты и методы генной инженерии.
2.
Классификация нуклеаз.
3.
Использование рестрицирующих эндонуклеаз, лигаз и полимераз в
процессе создания рекомбинантных молекул
4.
Трансферазы, киназы и фосфатазы в генной инженерии.
5.
Устройство и типы векторов. Основные компоненты
Теоретический
Модуль III «Генная инженерия»
модуль/раздел/тема,
которому
по Инструменты и методы генной инженерии.
выполняется
лабораторная работа
246
Цель лабораторной работы
Изучить инструменты и методы генной
инженерии при создании рекомбинантных
молекул.
Приобретаемые
практические Умение осуществлять подбор генетических
навыки и умения
конструкций и инструментов для работы с
наследственным материалом
Необходимое оборудование
Мультимедийная техника
Продолжительность
6 часов
лабораторной работы
Форма выдачи результата
Отчет в рабочем журнале в виде записей и
рисунков.
Лабораторная работа №6 Трансформация клеток растений и животных
1. Прямые методы переноса генов: электропорация, микроинъекция,
бомбардировка и др.
2. Непрямые методы переноса генов с помощью агробактерий: механизм и
преимущества.
3.
Перенос генов с помощью вирусов.
Теоретический
Модуль III «Генная инженерия»
модуль/раздел/тема,
которому
по
выполняется
«Транформация
клеток
растений
и
животных»
лабораторная работа
Цель лабораторной работы
Показать методы переноса генетического
материала на примере электропорации и
агробактериальной трансформации.
247
Приобретаемые
практические Освоить перенос генетического материала в
навыки и умения
клетки
растительных
и
животных
организмов
Необходимое оборудование
Мультимедийная техника
Продолжительность
6 часов
лабораторной работы
Форма выдачи результата
Отчет в рабочем журнале в виде записей и
рисунков.
Демонстрация
результатов
электропорации E. coli и агробактериальной
трансформации растительных клеток.
Лабораторная
работа
№7
ПРОМЫШЛЕННАЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ.
ПРОЦЕССЫ И АППАРАТЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ.
1. Общая схема процессов в биотехнологии.
2. Основные типы биотехнологических производств.
3. Методы разделения культуральных сред и клеточной массы.
4. Первичные и вторичные метаболиты.
5. Управляемые, неуправляемые, совместные, последовательные и
ступенчатые биотехнологические процессы. Требование асептики в
биотехнологии.
6. Ферментаторы периодического и постоянного действия.
7. Отходы биотехнологических производств. Обезвреживание и
248
утилизация отходов биотехнологических производств.
Теоретический
Модуль
модуль/раздел/тема,
которому
«Биотехнологическое
IV
по производство»
выполняется Структура
и
слагаемые
лабораторная работа
биотехнологического процесса
Цель лабораторной работы
Обучить
принципам
биотехнологического
получения
продукта
в
промышленных масштабах
Приобретаемые
практические Освоить методы получения первичных и
навыки и умения
вторичных
метаболитов,
принцип
функционирования ферментатора
Необходимое оборудование
Мультимедийная техника
Продолжительность
6 часов
лабораторной работы
Форма выдачи результата
Отчет в рабочем журнале в виде записей и
рисунков.
Лабораторная
работа
№8
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ПРОМЫШЛЕННАЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ.
ПРОИЗВОДСТВО
ЛЕКАРСТВЕННЫХ
СРЕДСТВ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ.
249
1. Лекарственные препараты. Интерфероны. Гормон роста человека,
полученный
генно-инженерными
методами.
Моноклональные
антитела как лекарственные средства.
2. Профилактика
отторжения
трансплантированных
органов.
Лекарственные вещества, связанные с моноклональными антителами
(структура
иммунотерапевтического
тромболитического
агента,
производство антител с помощью E. coli).
3. Биотехнологическое производство молочных продуктов, сахаров,
спиртов и полиолов.
Теоретический
Модуль
модуль/раздел/тема,
которому
«Биотехнология
V
по микробиологических систем»
выполняется Традиционная
лабораторная работа
микробиологическая
биотехнология
и
биотехнология
рекомбинантных
штаммов
микроорганизмов
Цель лабораторной работы
Изучение
основных
источников
промышленного получения лекартсвенных
и
других
средств,
знакомство
с
биотехнологическим производством
Приобретаемые
практические Ознакомление
навыки и умения
с
основными
микробиологическими
объектами,
используемыми
источников
в
качестве
биотехнологических продуктов, а также –
методиками.
Необходимое оборудование
Мультимедийная техника
Продолжительность
6 часов
250
лабораторной работы
Форма выдачи результата
Отчет в рабочем журнале в виде записей и
рисунков.
Лабораторная работа №9 МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА
1.
Методы иммунодиагностики.
2.
Ферментный-иммуносорбентный анализ (ELISA)
3.
Методы ДНК-диагностики.
4.
Геномная дактилоскопия или метод ДНК-типирования.
5.
Блотинг ДНК для саузерн-гибридизации. Использование саузернгибридизации для судебной экспертизы.
6.
Молекулярная диагностика генетических заболеваний
Теоретический
Модуль VII
модуль/раздел/тема,
которому
по
выполняется
«Коммерческие продукты
молекулярной биотехнологии»
Иммунобиотехнология,
лабораторная работа
энзимология.
Цель лабораторной работы
Наглядно
Инженерная
продемонстрировать
основные
методы иммуодиагностики
Приобретаемые
практические Умение
навыки и умения
поставить
ферментативную
реакцию (на примере ELISA) и
полученный результат.
Необходимое оборудование
Мультимедийная техника
Продолжительность
3 часа
лабораторной работы
251
оценить
Форма выдачи результата
Отчет в рабочем журнале в виде записей и
рисунков.
Демонстрация
результатов
реакции в плашках.
Темы рефератов
1. Методы переноса генов в растительные клетки.
2. Методы генетической модификации животных.
3. Генноинженерные методы повышения устойчивости растений к
фитопатогенам и гербицидам.
4. Генноинженерные методы повышения устойчивости растений к вирусам и
бактериям.
5. Генноинженерные методы получения растений, противостоящих
неблагоприятному воздействию и старению.
6. Растения как биореакторы.
7. Практическое применение трансгенных животных. Трансгенные мыши.
8. Трансгенный крупный рогатый скот. Цели трансгеноза.
9. Трансгенные овцы, козы, свиньи. Цели трансгеноза.
10. Трансгенные животные как продуценты ценных биологически активных
белков.
11. Промышленный синтез белков с помощью рекомбинантных
микроорганизмов.
12. Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения
биополимеров.
13. Получение инсулина на основе методов генной инженерии.
14. Трансгенные растения. Проблемы биобезопасности.
15. Пищевая продукция из генетически модифицированных источников.
16. Проблема оценки риска трансгенных растений.
252
17. Методы молекулярной диагностики в медицине.
18. Подготовить лекцию по биотехнологии для школьного факультатива по
углубленному изучению биологии, включая наглядные схемы и рисунки.
19. Биотехнологические и фармацевтические предприятия и компании СанктПетербурга и Ленинградской области.
20. Применение диагностических методов (ДНК-диагностика,
иммунодиагностика) в медико-диагностических лабораториях.
Литература для подготовки к практическим занятиям
1. В.М. Воробьева, В.Ф. Турецкова. Биотехнология лекарственных
средств
и
диагностических
препаратов.
Часть
1.
Общая
биотехнология/ Учебное пособие. – Барнаул: АГМУ, 2003. – 2186с.;
2005. – 156 с.
2.
С.Н.
Орехов.
Фармацевтическая
биотехнология.
Руководство к практическим занятиям / Учебное пособие // С.Н.
Орехов; под ред. В.А. Быкова и А.В. Катлинского / М.: Изд.группа
«ГЕОТАР-Медиа», 2009. – 384 с.
3.
Ю.О.
Сазыкин
Биотехнология:
учеб.
пособие
для
студентов высших учебных заведений // Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов,
И.И. Чикалева; под ред. А.В. Катлинского/ М.: Изд.центр
«Академия», 2006. – 256 с.
4.
Фармацевтическая технология. Технология лекарственных
форм. / Под ред. И.И. Краснюка и Г.В. Михайловой.- 2-е изд. – М.:
Издательский центр «Академия», 2006.- 592 с.
5.
Микробиология и иммунология. 2-е изд., перераб. Под ред.
Воробьева А.А. Изд-во МЕДИЦИНА. 2005. 496 с. ISBN 5225042716
253
254
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ОРГАНИЗАЦИИ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ
РАБОТЫ СТУДЕНТОВ
по дисциплине «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Специальность – 020209.65 «Микробиология»
г. Владивосток
2012
255
Учебно-методическое
обеспечение
самостоятельной
работы
студентов. Оценочные средства для текущего контроля успеваемости,
промежуточной аттестации по итогам освоения дисциплины.
При
освоении
дисциплины
«Молекулярная
биотехнология»
предусматривается широкое использование активных и интерактивных форм
приобретения
новых знаний. В обязательном порядке должен быть
обеспечен доступ студентов в Интернет. Тестовые формы контроля знаний
студентов предполагают использование компьютерного класса. Студенты
могут самостоятельно при помощи лаборанта отрабатывать лабораторные
занятия, использовать компьютеры для подготовки к семинарским занятиям.
Для текущего контроля усвоения теоретического материала, изложенного на
лекциях, подготовлен список вопросов, включающий все темы. Этот
перечень служит основой для самоконтроля и проверки знаний. Ключевые и
трудноусвояемые моменты обсуждаются на семинарах, также проводится
устный опрос студентов. В теоретической части курса для осуществления
текущего
контроля
предусмотрено
выполнение
домашних
заданий
(контрольных работ) по основным направлениям дисциплины. Для текущего
контроля используются также сведения учета посещаемости и успеваемости
по всем разделам дисциплины, размещенные на сайте ДВФУ
Самостоятельная работа
студентов включает библиотечную или
домашнюю работу с учебной литературой и конспектом лекций, подготовку
к семинарским занятиям, контрольным работам, к оформлению реферата.
1.
Знакомство с работами
2.
Знакомство
с
периодической
литературой,
посвященной
исследованиям в области микробиологии:
Основные
журналы:
эпидемиологии
и
«Микробиология»,
иммунологии»,
«Биотехнология»
256
«Журнал
микробиологии,
«Молекулярная
биотехнология»,
3. Работа с рекомендованной учебной литературой.
Объем и порядок выполнения самостоятельной работы учащиеся
определяют сами.
Контроль результатов самостоятельной работы осуществляется в ходе
проведения ксеминаров, контрольных работ и путем тестирования.
Контрольные вопросы и задания для проведения текущего контроля и
промежуточной аттестации по итогам освоения дисциплины (собеседования
и
зачета)
вытекают
из
тематического
«Молекулярная биотехнология»
257
содержания
дисциплины
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
КОНТРОЛЬНО-ИЗМЕРИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
по дисциплине
«МОЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Специальность — 020209.65 «Микробиология»
Форма подготовки очная
г. Владивосток
2012
258
Вопросы к зачету
1. Центральная догма молекулярной биологии: транскрипция, трансляция и
экспрессия генов.
2. Первичная структура ДНК. История открытия.
3. Репликация ДНК.
4. Первичная структура РНК. 5. РНК: функция, типы, структурные отличия
от ДНК.
5. Ген, структура и функция (общее).
6. Генетический код, основные свойства. Универсальность. Избыточность.
Однозначность.
7. Структура и функции эукариотического гена.
8. Структура и функции прокариотического гена.
9. Основные отличия структуры генов прокариот и эукариот.
10. Промоторы – регуляторные элементы генов прокариот и эукариот.
11. Регуляция экспрессии структурных генов эукариот.
12 Регуляция экспрессии структурных генов прокариот.
13. Транскрипция, особенности транскрипции эукариот.
14. Транскрипция, особенности транскрипции прокариот.
15. Процессинг РНК. Структура матричной РНК эукариот.
16. Трансляция, основные элементы и этапы.
17. Структура и функция рибосом.
18. Структура и функция транспортных РНК.
19. Особенности трансляции у эукариот.
20. Особенности трансляции у прокариот.
21. Процессинг беков.
22. Белки, определение белков, структура.
23. Общие функции белков. Каталитическая, транспортная, рецепторная,
структурная, защитная, двигательная функции белков, примеры.
259
24. Белки токсины и антибиотики.
25. Определение биотехнологии, история развития.
26. Основные направления биотехнологического производства.
27.Связь биотехнологии с фундаментальными науками второй половины XX
века. Биотехнология микроорганизмов.
28. Биотехнология при решении проблем экологии.
29. Эукариотические организмы в биотехнологии.
30. Биотехнология прокариотов.
31.
Биотехнология
растительной
клетки,
получение
и
поддержание
клеточных культур растений, микроклонирование.
32. Методы культуры клеток растений. Питательные среды, условия
культивирования .
33. Использование и значение в биотехнологии растений факторов роста
растений.
34. Практическая биотехнология растений. Производство БАВ в культуре
клеток растений.
35. Суспензионные клеточные культуры как продуценты важных первичных
и вторичных метаболитов.
36. Методы получения штаммов-суперпродуцентов. Примеры рентабельных
клеточных производств.
37. Культуры клеток редких, эндемичных и исчезающих видов растений,
преимущества и перспективы использования.
38. Методы культуры клеток животных. Питательные среды, условия
культивирования.
39. Особенности культивирования клеток животных, отличия от культур
клеток растений.
40. Структура и слагаемые биотехнологического производства. Особенности
подготовки конечного продукта при биотехнологическом производстве.
260
41.
Ферментеры.
Устройство
ферментера.
Основные
классификации
ферментеров.
42. Особенности подготовки конечного продукта при биотехнологическом
производстве.
43. Традиционная микробиологическая биотехнология и биотехнология
рекомбинантных штаммов микроорганизмов.
44. Биосинтез биологически активных пептидов человека: инсулин,
интерферон, интерлейкин в бактериях.
45. Инженерная энзимология. Иммобилизованные клетки и ферменты.
46. Иммунобиотехнология. Рекомбинантные вакцины.
47. Трансгенные растения и животные. Производство ценных веществ в
трансгенных растениях и животных. Преимущества подхода.
48. Понятие ГМО. Отличия ГМО от обычных организмов. Возможные риски.
49. Понятие рекомбинантной ДНК.
50. Генетическая инженерия. Краткая история развития генной инженерии.
51.Прямые методы переноса генов: трансформация протопластов векторной
ДНК, трансфекция с ПЭГ, электропорация.
52. Прямые методы переноса генов: микроинъекция, бомбардировка,
липосомальная трансформация.
53. Непрямые методы переноса генов. Природный механизм переноса генов
от агробактерий к растениям и его использование в биотехнологии.
54. Понятие плазмиды, природные функции бактериальных плазмид.
55. Понятие вектора в генетической инженерии, использование плазмид в
качестве векторов для переноса трансгенов.
56. Понятие о Т-ДНК агробактерий.
57. Молекулярный механизм переноса генов при агробактериальной
трансформации растений: Ti- и Ri- плазмиды, vir-гены.
58. Основные этапы активации vir-генов, функции соответствующих белков.
261
59. Основные инструменты генетической инженерии, этапы клонирования
гена.
60. Принцип ПЦР. Применение метода ПЦР в генетической инженерии.
61.
Эндонуклеазы
рестрикции,
принцип
действия,
использование
в
генетической инженерии.
62. Понятие процессов рестрикции и лигирование, понятие липких и тупых
концов ДНК.
63. Вектора для клонирования, касcетный, бинарный, коинтегративный.
Элементы векторов.
64. Регуляторные элементы вектора: промоторы и терминаторы для
прокариот, растений и животных.
65. Селективные маркеры векторов, особенности селективных маркеров для
прокариот, растений и животных, использование антибиотиков для селекции
трансгенных клеток.
66. Трансформация бактерий E. coli и A. tumefaciens. Этапы трансформации
агробактериями растений.
67. Метаболическая инженерия растений.
68. Создание новых биообъектов методами клеточной и генетической
инженерии.
69. Рекомбинантные ферменты, белки и пептиды, получение, примеры.
70. Получение съедобных вакцин. Растения и животные как биореакторы.
71. Моноклональные антитела как лекарственные средства.
72. Профилактика отторжения трансплантированных органов.
Тестовые задания.
262
ТЕМА: Молекулярная биотехнология: история и направления
развития.
1. Определение “Биотехнология – означает любой вид технологии, связанный
с использованием биологических систем, живых организмов или их
производных для изготовления или изменения продуктов или процессов с
целью их конкретного использования”:
А - верно,
Б - не верно,
В - требует уточнения.
2. Геномика изучает:
А - отдельные гены,
Б - совокупность структурных компонентов ДНК,
В – совокупность всех генов организма,
Г – механизмы генетических изменений.
3. В биотехнологии понятию “биообъект” соответствуют следующие
определения:
А – организм, на котором испытывают новые БАВ,
Б – организмы, вызывающие микробную контаминацию технологического
оборудования,
В – фермент, используемый для генно-инженерных процессов,
Г – организм, продуцирующий БАВ,
Д – фермент, используемый в лечебных целях.
4. Отличительные особенности эукариотической клетки:
А – больший размер,
Б – наличие ядра,
263
В – ригидная клеточная стенка,
Г – отсутствие субклеточных органелл,
Д – хромосомная ДНК в цитоплазме.
5. Отличительные особенности прокариотической клетки:
А – малый размер,
Б – отсутствие ядра,
В – наличие субклеточных органелл,
Г – многослойная клеточная стенка,
Д – хромосомная ДНК в ядре.
6. Оптимальный температурный режим развития микроорганизмовмезофилов составляет:
А – 45-90 оС,
Б – от -5 до 35 оС,
В – свыше 90 оС,
Г – 10-45 оС.
7. Типичные направления использования микроорганизмов-психрофилов:
А – источники генов, кодирующих термолабильные белки,
Б – источники генов, кодирующих термостабильные белки,
В – утилизация токсических отходов,
Г – производство этилового спирта,
Д – производство биогаза.
8. Источником генов термостабильных ферментов служат микроорганизмы-:
А – мезофиллы,
Б – термофилы,
В – психрофилы.
264
9. К биологическим системам в биотехнологии относят:
А – системы очистки воздуха от микроорганизмов,
Б – культуры клеток растений,
В – микрофлора кишечника человека,
Г – культуры микроорганизмов,
Д – культуры клеток животных.
10. В биотехнологии нашли применение такие компоненты клеток:
А – ДНК и РНК,
Б - рибосомы,
В – митохондрии,
Г – ферменты.
ТЕМА: Фундаментальные основы молекулярной биотехнологии
1. Утверждение “ДНК является хранилищем генетической информации,
потому что ее молекулы в отличие от РНК более стабильны”:
А - верно,
Б - не верно,
В - требует уточнения.
2. Отличие молекулы РНК от ДНК:
А – моносахаридом является дезоксирибоза,
Б – моносахаридом является рибоза,
В – азотистое основание - тимин,
Г – азотистое основание – урацил,
Д - азотистое основание - гуанин.
265
3. Синтез молекулы ДНК осуществляется:
А – ДНК-лигазой,
Б – ДНК-полимеразой,
В – из L-формы нуклеотидов,
Г – из D-формы нуклеотидов,
Д – из смеси D- и L-форм нуклеотидов.
4. Сплайсинг:
А – вырезание из предшественника мРНК экзонов и ковалентное соединение
интронов с образованием зрелых молекул мРНК,
Б – вырезание из предшественника мРНК интронов и ковалентное
соединение экзонов с образованием зрелых молекул мРНК,
В – последовательное ковалентное соединение экзонов и интронов с
образованием зрелых молекул мРНК,
Г – вырезание из предшественника мРНК интронов и их ковалентное
соединение с образованием зрелых молекул мРНК.
5. Кодон:
А – три соседних нуклеотида мРНК, кодирующих определенную
аминокислоту,
Б – три соседних нуклеотида тРНК, комплиментарных нуклеотидам
специфического кодона в молекуле мРНК,
В – три соседних нуклеотида тРНК, кодирующих определенную
аминокислоту,
Г – три соседних нуклеотида тРНК, кодирующих определенную
последовательность аминокислот.
6. Процессы транскрипции идут:
266
А – постоянно с одинаковой скоростью,
Б – под контролем регуляторных систем,
В – периодически по мере накопления энергии,
Г – сопряжено с процессами формирования молекул ДНК,
Д – со скоростью, пропорциональной формированию структурных генов.
7. Оперон:
А – участок ДНК, содержащий несколько структурных генов,
Б – участок ДНК, содержащий один структурный ген,
В – нуклеотидная последовательность, кодирующая один белок,
Г – нуклеотидная последовательность, кодирующая более одного белка,
Д – длинная молекула мРНК, кодирующая несколько белков.
8. – Плазмида представляет собой:
А – определенный штамм кишечной палочки, используемый для
биотехнологических целей,
Б – кольцеобразную молекулу ДНК,
В – внехромосомный элемент генетической информации
Г – вирус, размножающийся в цитоплазме клеток
Д – хромосому, используемую в качестве вектора для введения ДНК в клетки
бактерий.
9. Отбор трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
проводят:
А – тестированием на резистентность к различной температуре,
Б – тестированием на резистентность к определенным антибиотикам,
В – по способности окрашиваться гемотоксилином,
Г – по морфологическим признакам,
Д – по скорости роста и размножения.
267
10. Требования к векторам ДНК:
А – малый размер,
Б – большой размер,
В – видоспецифичность,
Г – наличие селективных генетических маркеров для идентификации
реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК,
Д – наличие сайта рестрикции, в который осуществлена вставка.
ТЕМА: Генная инженерия
1. Фермент, который узнает специфическую последовательность внутри
молекулы ДНК и расщепляет ее в этом месте:
а) лигаза;
б) полимераза;
в) рестриктаза;
г) пептидаза
д) нуклеаза.
2. Какая из последовательностей не может являться сайтом рестрикции:
а) AATATT;
б) GCGATCGC;
в) GACCAG;
г) GATC.
3. Лигаза обладает способностью:
a) гидролизовать фосфодиэфирные связи в молекуле ДНК;
б) образовывать фосфодиэфирные связи в молекуле ДНК;
в) гидролизовать водородные связи в молекуле ДНК;
268
г) образовывать водородные связи в молекуле ДНК.
4. Для получения матриц ДНК на основе РНК используют:
а) Taq-полимеразу;
б) M-MLV-ревертазу;
в) Фрагмент Кленова;
г) лигазу;
д) РНКазу.
5. Для образования липкого конца -АААААА на тупых концах ДНК,
необходимо использовать:
a) dT и ревертазу;
б) dA и полимеразы;
в) рестриктазу;
г) dA и терминальную дезоксинуклеотидил трансферазу.
6. Для образования из липкого конца 5'-GTCAT тупого конца 5'-GTCAT,
необходимы:
3'-CA
3'-CAGTA
a) dG, dT, dA, dC и ревертаза;
б) dT, dA, dC и полимераза;
в) dT, dA, dC и Фрагмент Кленова;
г) dT, dA, dG и Фрагмент Кленова.
7. В полимеразной цепной реакции используется фермент:
а) Taq-полимераза;
б) M-MLV-ревертаза;
в) Фрагмент Кленова;
269
г) лигаза;
д) РНКаза.
8. Смысловой праймер присоединяется по принципу комплементарности:
a) в начале амплифицируемого участка на смысловую цепь ДНК;
б) в конце амплифицируемого участка на смысловую цепь ДНК;
в) в начале амплифицируемого участка на антисмысловую цепь ДНК;
г) в конце амплифицируемого участка на антисмысловую цепь ДНК.
9. Осуществление полимеразной цепной реакции стало возможным
благодаря:
а) установлению структуры и функции ДНК;
б) универсальности генетического кода;
в) изучению ДНК-зависимых ДНК-полимераз человека;
г) выявлению термостабильных ДНК-зависимых ДНК-полимераз;
д) открытию РНК-зависимых ДНК-полимераз.
10. Для осуществления полимеразной цепной реакции в смеси необходимо
присутствие ионов:
а) кальция;
б) магния;
в) марганца;
г) калия.
ТЕМА: Генная инженерия
1. В прямых методах переноса ДНК в организмы:
А – используется природный посредник переноса ДНК,
270
Б – перенос осуществляется при помощи химических и физических
воздействий на клетки с целью изменения их проницаемости,
В – клетки организма-реципиента поглощают ДНК из раствора
самопроизвольно.
2. К непрямым методам трансформации относятся:
А – липофекция,
Б – электропорация,
В – агробактериальная трансформация,
Г – бомбардировка,
Д – вирусная трансформация.
3. Agrobacterium tumefaciens вызывают:
А – неопластический опухолевый рост – корончатый галл,
Б – неопластический опухолевый рост – “волосатый” корень,
В – неопластическая пролиферация дифференцированной ткани –
корончатый галл,
Г – неопластическая пролиферация дифференцированной ткани “волосатый” корень.
4. Agrobacterium rhizogenes вызывают:
А – неопластический опухолевый рост – корончатый галл,
Б – неопластический опухолевый рост – “волосатый” корень,
В – неопластическая пролиферация дифференцированной ткани –
корончатый галл,
Г – неопластическая пролиферация дифференцированной ткани “волосатый” корень.
5. Общие элементы плазмид Ti и Ri:
271
А – гены tms, tmr,
Б – гены rol,
В – участок vir,
Г – участок Т-ДНК.
6. Т-ДНК:
А – участок плазмиды, содержащий гены vir,
Б – участок плазмиды, содержащий гены катаболизма опинов,
В – участок плазмиды, ограниченный 25 буквенными повторами - бордерами,
Г – участок плазмиды, переносимый в геном растения.
7. За восприятие и передачу сигнала от раненой клетки к области vir
осуществляют:
А – virD и virC,
Б – virA и virG,
В – vriA и virB,
Г – virC и virG,
Д – virB и virG.
8. Т-ДНК при расщеплении наследуется как:
А – рецессивный Менделеевский признак,
Б – доминантный Менделеевский признак,
В – рецессивный не Менделеевский признак,
Г – доминантный не Менделеевский признак.
9. Обязательные элементы векторов, разработанных на основе мегаплазмид
агробактерий:
А - Т-ДНК,
Б – гены tms и tmr,
272
В – vir-область,
Г – гены rol,
Д – гены, отвечающие за катаболизм опинов
Е – маркер селекции для растений.
10. – Коинтегративный вектор:
А – состоит из двух плазмид, бинарной и клонирующей, объединяемых в
одну плазмиду для трансформации,
Б – состоит из двух плазмид, бинарной и клонирующей, объединяемых в
одну агробактерию для трансформации,
В – состоит из одной плазмиды, содержащей T-ДНК и области,
Г – состоит из одной плазмиды, содержащей или область Т-ДНК, или virобласть.
11. – Бинарный вектор:
А – состоит из двух плазмид, бинарной и клонирующей, объединяемых в
одну плазмиду для трансформации,
Б – состоит из двух плазмид, бинарной и клонирующей, объединяемых в
одну агробактерию для трансформации,
В – состоит из одной плазмиды, содержащей T-ДНК и области,
Г – состоит из одной плазмиды, содержащей или область Т-ДНК, или virобласть.
ТЕМА: Биотехнологическое производство
1. Назначение питательных сред:
А – защита клеток от воздействия факторов внешней среды,
Б – поддержание оптимальных для роста клеток физико-химических условий,
В – обеспечение клеток питательными веществами для синтеза биомассы,
273
Г – обеспечение клеток питательными веществами для синтеза необходимых
продуктов жизнедеятельности,
Д – все вышеперечисленное верно.
2. Обеспечение и сохранение стерильности питательных сред обеспечивают:
А – стерилизация исходных компонентов среды,
Б – термическая стерилизация среды,
В – стерилизующей фильтрацией,
Г – добавлением антибиотиков,
Д – все вышеперечисленное верно.
3. Режим хранения культур-продуцентов предполагает:
А – замораживание при температуре ниже -20 оС,
Б – замораживание при температуре ниже -2… -5 оС,
В – лиофильное высушивание,
Г – консервирование,
Д – термостатирование при 37 оС.
4. Признаки поверхностного способа культивирования:
А – твердая питательная среда,
Б – монослой суспензии клеток,
В – фиксирование клеток на поверхности реактора,
Г – использование микроскопических гранул-носителей,
Д – все вышеперечисленное верно.
5. Тип культивирования при котором в биореактор свежая порция субстрата
подается непрерывно “по каплям”:
А. Периодическое,
Б – Периодическое, с добавлением субстрата,
274
В – Непрерывное.
6. Время добавления дополнительных доз субстрата при периодическом
культивировании определяется по:
А – pH,
Б – количеству синтезированных продуктов,
В – объему реактора,
Г – скорости перемешивания питательной среды,
Д – плотности питательной среды.
6. Отличительные признаки эрлифтного биореактора:
А – механическое перемешивание питательной среды,
Б – перемешивание среды барботированием,
В – циркуляция среды за счет потока воздуха,
Г – циркуляция среды за счет электромагнитных волн,
Д - циркуляция среды за счет тепловой конвекции.
7. Стерилизация промышленного биореактора осуществляется:
А – дезинфицирующими растворами,
Б – ультрафиолетовым излучением,
В – влажным паром под давлением,
Г – сухим воздухом под давлением,
Д – стерильным раствором питательной среды.
8. Процесс ферментации контролируют по:
А – концентрации минеральных веществ,
Б – концентрации растворенного кислорода,
В – pH,
Г – температуре,
275
Д – интенсивности перемешивания биомассы.
9. Контроль биомассы осуществляют по :
А – числу клеток и их линейных размеров,
Б – числу жизнеспособных клеток,
В – интенсивности дыхания (накопления CO2),
Г – содержанию белка.
10. Для выделения клеток из культуральной жидкости используют:
А – флотацию,
Б – седиментацию,
В – сепарацию,
Г – центрифугирование,
Д - фильтрование.
ТЕМА: Биотехнология микробиологических и эвукариотических систем
1. Какой из перечисленных параметров является критическим при
культивировании клеток в биореакторе:
a) солевой состав;
b) форма биореактора;
c) перемешивание;
d) влажность.
2. Тип культивирование клеток растений в жидкой среде называют:
a) поверхностным;
b) промежуточным;
c) глубинным;
3. Какая из культур клеток животных является постоянной:
276
a) культура клеток фибробластов;
b) культура клеток HеLa;
c) культура клеток лимфоцитов.
4. Ферментные процессы, в которых используются в качестве катализаторов
микробные клетки, характеризуются ограничениями (выбрать неправильный
ответ):
a) большая часть субстрата в обычных условиях превращается в
микробную биомассу;
b) наличие (или возможное появление) побочных реакций,
приводящих к накоплению значительных количеств отходов;
c) условия для роста микроорганизма могут быть иными, нежели для
образования и накопления необходимого продукта;
d) выделение и очистка необходимого продукта из культуральной
жидкости не сопряжены с трудностями.
5. Для получения съедобных вакцин используют растения:
a) богатые белком;
b) готовые к употреблению без термической обработки;
c) требующие термической обработки;
d) обладающие высокой урожайностью.
6. ГМО отличается от обычного организма:
a) наличием чужеродной ДНК и белков;
b) вкусовыми свойствами;
c) мутациями в ДНК организма;
d) способностью размножаться.
277
7. Как называется тип культивирования в биореакторе с постоянным
добавлением свежей среды:
а) периодическим;
c) непрерывным;
d) с подпиткой.
8. Перемешивание в биореакторе механического типа осуществляется:
а) пузырьками воздуха;
b) лопастями мешалки;
c) подачей сжатого воздуха;
d) встряхиванием биореактора.
9. В чем заключается принципиальное отличие состава питательной среды
для культивирования клеток животных от растений:
a) наличие гормонов роста;
b) наличие сыворотки;
c) наличие витаминов;
d) наличие глюкозы.
10. Назначение питательных сред:
a) защита клеток от воздействия факторов внешней среды,
b) поддержание оптимальных для роста клеток физико-химических условий,
c) обеспечение клеток питательными веществами для синтеза биомассы,
d) обеспечение клеток питательными веществами для синтеза необходимых
продуктов жизнедеятельности,
e) все вышеперечисленное верно.
ТЕМА: Коммерческие продукты молекулярной биотехнологии
278
1. Современные вакцины создают на основе:
А - инактивированеных и диких штаммов паттогенов,
Б - аттенуированных и диких штаммов патогенов,
В - инактивированных и аттенуированных штаммов патогенов,
Г - диких штаммов.
Д – все вышеперечисленное верно.
2. Найдите НЕверные утверждения:
А - все патогенные микроорганизмы удается культивировать,
Б - для получения вирусов животных и человека необходима дорогостоящая
культура животных клеток,
В - титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их размножения
достаточна для производства доступных вакцин,
Г - необходимо строго соблюдать меры предосторожности, чтобы не
допустить инфицирования персонала,
Д - аттенуированные штаммы не могут ревертировать к исходному штамму,
поэтому необходимо постоянно контролировать вирулентность,
Е - некоторые заболевания (например, СПИД) нельзя предупреждать с
помощью традиционных вакцин,
Ж - большинство современных вакцин имеют неограниченный срок
годности.
3. Субъединичные вакцины содержат:
А – ДНК патогенных штаммов,
Д - ген, кодирующий белок-антиген,
В – клеточные органеллы патогена,
Г – выделенный и очищенный белок-антиген,
Д – все вышеперечисленное верно.
279
4. Достоинства субъединичных вакцин:
А – очищенный иммуногенный белок стабилен и безопасен,
Б – отсутствие нежелательных компонентов, способных вызвать побочные
эффекты,
В – доступность субъединичных вакцин,
Г – конформация выделенного белка не отличается от нативной,
Д – все вышеперечисленное верно.
5. Пептидные вакцины это:
А – вакцины на основе белка капсида,
Б – вакцины на основе внутренних доменов белков-антигенов,
В – короткие пептиды, имитирующие эпитопы белка-антигена,
Г – короткие пептиды, имитирующие эпитопы белка-антигена, сшитые с
белком переносчиком.
6. Что такое генная иммунизация:
А – включение в клетки животного-мишени гена, кодирующего антигены,
Б – включение в клетки животного-мишени гена, кодирующего антитела.
7. Аттенуированные вакцины, созданные методами генетической инженерии:
А - не содержат гены токсичных белков патогена,
Б – не содержат гены белков-антигенов,
В – не содержат генов, отвечающих за независимые жизненные функции,
Г – не содержат модифицированные гены белков вирулентности.
8. К природным органическим носителям относятся:
А – полисахариды,
Б – полиакриламиды,
280
В – белки,
Г – полиэфиры,
Д – липиды.
9. К синтетическим органическим носителям:
А – полисахариды,
Б – полиакриламиды,
В – белки,
Г – полиэфиры,
Д – липиды.
10. Химическая иммобилизация ферментов осуществляется за счет:
А – образования водородных связей,
Б – прикрепления фермента к носителю биологическим клеем,
В – образования ковалентных связей,
Г – фиксации фермента в порах носителя,
Д – фиксации фермента между волокон полимерезующегося носителя.
281
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
по дисциплине
«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Специальность — 020209.65 «Микробиология»
Форма подготовки очная
г. Владивосток
2012
282
Основная
1. Воробьева В.М., Турецкова В.Ф.. Биотехнология лекарственных средств
и диагностических препаратов. Часть 1. Общая биотехнология/ Учебное
пособие. – Барнаул: АГМУ, 2003. – 2186с.; 2005. – 156 с.
2. Орехов
С.Н..
Фармацевтическая
биотехнология.
Руководство
к
практическим занятиям / Учебное пособие // С.Н. Орехов; под ред. В.А. Быкова
и А.В. Катлинского / М.: Изд.группа «ГЕОТАР-Медиа», 2009. – 384 с.
3. Сазыкин Ю.О. Биотехнология: учеб. пособие для студентов высших
учебных заведений // Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чикалева; под ред. А.В.
Катлинского/ М.: Изд.центр «Академия», 2006. – 256 с.
4. Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм. / Под
ред. И.И. Краснюка и Г.В. Михайловой.- 2-е изд. – М.: Издательский центр
«Академия», 2006.- 592 с.
5. Микробиология и иммунология. 2-е изд., перераб. Под ред. Воробьева
А.А. Изд-во МЕДИЦИНА. 2005. 496 с. ISBN
6. Егорова
Т.
А.,
Клунова
С.
5225042716
М.,
Живухин
Е.
А. Основы
биотехнологии. — М., 2003.
Дополнительная
1.
Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки.
Т. 1 - 3. М.: Мир, 1994.
2.
Анализ генома. Методы / Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. 246 с.
3.
Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦиГСО
РАН, 1993. – 241 с.
4.
Барановов В. С. Генная терапия – медицина XXI века // Соросовский
образовательный журнал. № 3. 1999. С. 3 – 68.
283
5.
Бекер М. Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.:
Агропромиздат, 1990. 334 с.
6.
Валиханова Г. Ж. Биотехнология растений. Алматы: Конжык, 1996. 272
с.
7.
Глеба Ю. Ю. Биотехнология растений // Соросовский образовательный
журнал. № 6. 1998. С. 3 – 8.
8.
Глебов О. К. Генетическая трансформация соматических клеток //
Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988.
9.
Егоров Н. С., Самуилов В. Д. Современные методы создания
промышленных штаммов микроорганизмов // Биотехнология. Кн. 2.
М.: Высшая школа, 1988. 208 с.
10.
Зверева С. Д., Романов Г. А. Репортерные гены для генетической
инженерии растений: характеристика и методы тестирования //
Физиология растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 479-488.
11.
Лещинская
И.
Б.
Генетическая
инженерия
//
Соросовский
образовательный журнал. 1996. №1. С. 33 - 39.
12.
Ли А., Тинланд Б. Интеграция т-ДНК в геном растений: прототип и
реальность // Физиология растений. 2000, том 47, № 3. С. 354-359
13.
Лутова Л. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н. и др. Генетика развития
растений. СПб.: Наука, 2000. 539 с.
14.
Пирузян Э. С. Генетическая инженерия растений. М.: Знание, 1988. 64
с.
15.
Пирузян Э. С. Проблемы экспрессии чужеродных генов в растениях //
Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Биотехнология. 1990. Т. 23. 176
с.
16.
Попов Л. С., Языков А. А. Трансгенные животные как модели для
изучения репродукции эмбрионального развития и заболеваний
человека // Успехи современной биологии.1999. Т 119, № 1. С. 30-41.
284
17.
Романов Г. А. Генетическая инженерия растении и пути решения
проблемы биобезопасности / Физиология растений, 2000. Том 47, № 3.
С. 343-353.
18.
Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. Ч. 1. Новосибирск: Изд-во
Новосибирского ун-та, 1994. 304 с.
19.
Томилин Н. В., Глебов О. К. Генетическая трансформация клеток
млекопитающих // Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии.
Л.: Наука, 1986. С. 62 - 82.
Томилин Н. В., Глебов О. К. Генетическая трансформация клеток
млекопитающих // Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии.
Л.: Наука, 1986. С. 62 - 82.
Дрейпер Дж. и др. (ред.). Генная инженерия растений. Лабораторное
руководство. — М.: Мир, 1991.
20.
Сингер М., Берг П. Гены и геномы. — М.: Мир, 1998.
21.
Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.
22.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и
применение. — М.: Мир, 2002.
23.
Патрушев Л. И. Экспрессия генов. — М.: Наука, 2000.
интернет ресурсы
1. Щелкунов С.Н.,Учебно-справочное пособие:Генная инженерия,
2004http://www.booksmed.com/biologiya/1302-geneticheskayainzheneriya-shhelkunov.html
2. Глик Б., Пастернак Дж., Молекулярная биотехнология, 2002
http://www.booksmed.com/mikrobiologiya/898-molekulyarnayabiotexnologiya-glik-pasternak.html
3. Кузьмина Наталья Александровна, Учебное пособие по биотехнологии
www.biotichnolog.ru
285
4. Громова Н.Ю., Косивцов Ю.Ю., Сульман Э.М. Технология синтеза и
биосинтеза биологически активных веществ: Учебное пособие. - Тверь:
ТГТУ, 2006. - 84 с. http://window.edu.ru/resource/627/58627/files/tstutver33.pdf
286
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Дальневосточный федеральный университет»
(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
ГЛОССАРИЙ
по дисциплине «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Специальность — 020209.65 микробиология
г. Владивосток
2012
287
Аденозинтрифосфат (АТР). Рибонуклеозид-5-трифосфат, участвующий в
энергетическом цикле клетки в качестве донора фосфатной группы.
att-сайты. Участки фаговой и бактериальной хромосом, рекомбинация
между которыми приводит к интеграции или исключению фага.
Активация аминокислоты. АТР-зависимое ферментативное образование
эфирной связи между карбоксильной группой аминокислоты и З'гидроксильной группой соответствующей ей тРНК.
Аминоацил-тРНК
–синтетаза.Фермент,
катализирующий
образование
аминоацил-тРНК за счет энергии АТР.
Аминоацил-тРНК. Эфир аминокислоты и тРНК.
Антибиотики.
Специфические
микроорганизмами,
способные
в
хим.
вещества,
малых
количествах
образуемые
оказывать
избирательное токсическое действие на другие микроорганизмы и на клетки
злокачественных опухолей. К А. в широком смысле относят также
антимикробные вещества тканей высших растений (фитонциды) и животных.
Синтез
А.
является
выражением
активного
антагонизма
микробов–
антагонистов. Первый А. (пенициллин) был открыт А. Флемингом в 1929 г.,
термин предложил в 1942 г. 3. Баксман. В наст. время описано более 4 тыс.
А., но в качестве лекарственных средств применяется не более 100.
Антикодон. Специфическая последовательность из трех нуклеотидов в
тРНК, комплементарная кодону для аминокислоты в мРНК.
АР-эндонуклеазы. Ферменты, разрезающие ДНК в апуриновых или
апиримидиновых участках с образованием 5'-концов.
Аттенуатор. Терминаторная последовательность, на которой происходит
аттенуация.
Аттенуация.
Регуляция
транскрипции
на
уровне
терминации,
осуществляемая при экспрессии некоторых бактериальных оперонов.
Бактериофаги (фаги). Вирусы, инфицирующие бактерии.
288
Белок-репрессор. Регуляторный белок, связывающийся с оператором на
ДНК или с РНК, предотвращающий, соответственно, транскрипцию или
трансляцию.
Бессмысленная мутация. Изменение в ДНК, приводящее к замене
смыслового
кодона,
соответствующего
какой-либо
аминокислоте,
на
бессмысленный (терминирующий).
Бессмысленный кодон. Один из трех триплетов: UAG, UAA, UGA,
вызывающих терминацию синтеза белка (UAG известен, как amber-кодон,
UAA - как ochre-кодон, UGA – как opal-кодон).
Биотехнология - в широком смысле - пограничная между биологией и
техникой научная дисциплина и сфера практики, изучающая пути и методы
изменения окружающей человека природной среды в соответствии с его
потребностями.
Биотехнология - в узком смысле - совокупность методов и приемов
получения полезных для человека продуктов и явлений с помощью
биологических агентов. В состав биотехнологии входят генная, клеточная и
экологическая инженерии.
Биогаз - горючий газ, получаемый:
- из твердых и жидких отходов животноводческих комплексов, городских
сточных вод и т.п.; и
- при сбраживании специально выращиваемых водорослей и других
организмов с быстрорастущей биомассой.
В основном биогаз содержит метан.
Биосинтез - промышленное получение с помощью (микро-) организмов
антибиотиков, гормонов, витаминов, аминокислот и других необходимых
людям веществ.
289
Биофабрика - индустриальное предприятие, изготавливающее вакцины,
сыворотки
и
другие
биологические
препараты
для
диагностики,
профилактики болезней и лечения больных животных и людей.
Биоэнергетика - способы промышленного получения энергии из биомассы
специально выращиваемых водорослей, быстрорастущих деревьев, навоза и
других отходов животноводства.
Библиотека генов. Неупорядоченный набор фрагментов ДНК, содержащий
всю генетическую информацию данного вида.
Блок Прибнова. Каноническая последовательность ТАТААТ, находящаяся
на расстоянии около 10 пар нуклеотидов перед стартовой точкой
бактериальных генов. Представляет собой часть промотора, отвечающую за
инициацию транскрипции со стартовой точки под действием РНКполимеразы.
Ведущая цепь. Цепь ДНК, синтезирующаяся непрерывно в 5'→3'направлении.
Вектор. Автономно реплицирующаяся в клетке-хозяине молекула ДНК, к
которой можно присоединить фрагмент ДНК, чтобы обеспечить его
репликацию; например, плазмида или ДНК умеренного фага.
Вирус.
Самореплицирующийся
инфекционный
комплекс
нуклеиновой
кислоты и белка, содержащий ДНК- или РНК-хромосому и требующий для
своей репликации интактную клетку-хозяина.
Водородная связь. Сравнительно слабое электростатическое притяжение
между электроотрицательным атомом и атомом водорода, ковалентно
связанным с другим электроотрицательным атомом.
Вставочная мутация. Мутация, вызванная вставкой дополнительного
основания между двумя последовательно расположенными основаниями
ДНК.
Вырожденный код. Код, в котором один элемент на каком-то одном языке
кодируется несколькими элементами на другом языке.
290
Ген.
Участок
хромосомы,
который
кодирует
одну
или
несколько
полипептидных цепей или молекулу РНК.
Генетическая информация. Наследственная информация, содержащаяся в
нуклеотидной последовательности хромосомной ДНК или РНК.
Генетический код. Набор кодовых слов (триплетов) в ДНК кодирующих
аминокислоты белков.
Генотип. Совокупность генов организма.
Гетерохроматин. Генетически неактивные участки хромосом; постоянно
находятся в конденсированном состоянии.
Генная инженерия - практика целенаправленного изменения генетических
программ половых клеток с целью придания исходным формам организмов
новых свойств или создания принципиально новых форм организмов.
Основной метод генной инженерии состоит в извлечении из клеток
организма гена или группы генов, соединение их с определенными
молекулами нуклеиновых кислот и внедрение полученных гибридных
молекул в клетки другого организма.
Генно-модифицированный
организмов,
любое
организм
неклеточное,
организм
-
одноклеточное
или
несколько
или
многоклеточное
передаче
наследственного
образование:
-
способные
к
воспроизводству
или
к
генетического материала;
- отличные от природных организмов;
- полученные с применением методов генной инженерии; и
- содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты
или комбинации генов.
291
Гибридизация. Процесс взаимодействия комплементарных цепей РНК и
ДНК, образующих двухцепочечный гибрид РНК -ДНК.
Гираза. Топоизомераза типа II из Е. coli. Фермент способен вносить
отрицательные супервитки в ДНК.
Гистоны. Эволюционно консервативные белки эукариот, связывающие
ДНК; участвуют в формировании нуклеосомы, основной структурной
единицы хроматина.
Горячая точка. Участок ДНК, в котором частота возникновения мутаций
(или рекомбинаций) очень велика.
D-петля. Область внутри митохондриальной ДНК, в которой небольшой
участок РНК-праймера взаимодействует с одной из цепей ДНК, вытесняя
исходную комплементарную цепь. Этот же термин используется при
описании события, катализируемого RecA-белком, которое заключается в
замене одной цепи в дуплексной ДНК другой одноцепочечной ДНК,
захваченной извне.
Двойная спираль. Спираль, образованная двумя комплементарными
антипараллельными цепями ДНК или РНК.
Двунаправленная
репликация.
Репликация,
при
которой
две
репликационные вилки движутся в противоположных направлениях от
общего старта - oriC.
Дезоксирибонуклеотиды. Нуклеотиды, содержащие в качестве пентозного
компонента 2'-дезокси-D-рибозу.
Делеционная мутация. Мутация, возникшая в результате утраты одного или
большего числа нуклеотидов из гена.
ДНК-лигаза. Фермент, катализирующий образование фосфодиэфирной
связи между З'-концом одного фрагмента ДНК и 5'- концом другого в
условиях, когда оба фрагмента комплементарно спарены с цепью-матрицей.
ДНК-полимераза.
Фермент,
который
катализирует
протекающую
в
присутствии матрицы реакцию синтеза ДНК из предшественников дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов.
292
ДНК-репликазная
система.
Полный
набор
ферментов
и
специализированных белков, необходимых для репликации ДНК.
Закрытая
рамка
считывания. Содержит кодоны преждевременной
терминации, не позволяющие иРНК транслироваться в белок.
Инвертированные повторы. Две копии одной и той же последовательности
в составе одной молекулы ДНК, находящиеся в противоположной
ориентации. Прилежащие друг к другу инвертированные повторы образуют
палиндром.
Индуктор. Небольшая молекула, включающая транскрипцию гена за счет
связывания с регуляторным белком.
Индукция. Свойство клеток (бактериальных или дрожжевых) синтезировать
определенные ферменты только при наличии соответствующих субстратов;
применительно
к
экспрессии
генов
термин
означает
включение
транскрипции в результате взаимодействия индуктора с регуляторным
белком.
Инициирующий кодон. Триплет AUG, кодирующий первую аминокислоту
в полипептидной цепи, которой у прокариот является N-формилметионин, а
у эукариот - метионин.
Интеграция. Внедрение вирусной или иной последовательности ДНК в
геном клетки-хозяина, приводящее к ковалентному соединению с хозяйской
последовательностью.
Интрон. Вставочная последовательность в гене; она транскрибируется, но
вырезается до процесса трансляции.
Катаболическая репрессия. Ослабление экспрессии многих бактериальных
оперонов, происходящее при добавлении глюкозы; вызывается уменьшением
уровня циклического AMP в клетке и инактивацией вследствие этого
регуляторного САР-белка.
Катящееся кольцо. Способ репликации, при котором репликационная вилка
совершает множество оборотов на циркулярной матрице; синтезирующаяся в
каждом цикле цепь ДНК вытесняет цепь, синтезированную в предыдущем
293
цикле, образуя хвост, состоящий из линейного набора последовательностей,
комплементарных одноцепочечному матричному кольцу.
кДНК (комплементарная ДНК). ДНКсинтезируемая обычно с помощью
обратной транскриптазы и комплементарная данной мРНК; используется для
клонирования ДНК.
Кодирующая цепь. Цепь ДНК, последовательность которой идентична
иРНК.
Клеточная инженерия - конструирование специальными методами клеток
нового типа. Клеточная инженерия используется для решения теоретических
проблем в биотехнологии, для создания новых форм растений и т.п.
Комплементарная цепь. Одна из цепей ДНК, используемая в качестве
матрицы для синтеза РНК и комплементарная ей.
Координированная регуляция. Означает общий контроль экспрессии
группы генов.
Корепрессор. Малая молекула, которая включает механизм репрессии
транскрипции, связываясь с регуляторным белком.
Кроссинговер. Обмен материалом между гомологичными хромосомами,
происходящий в процессе мейоза, и лежащий в основе генетической
рекомбинации.
Ксенобиотики. Чужеродные для живых организмов хим. вещества,
естественно не входящие в круговорот биогенов и, как правило, прямо или
косвенно порожденные деятельностью человека. К. являются некоторые
пестициды, минеральные удобрения, моющие средства, препараты бытовой
химии, хим. лекарственные средства и др. Попадая в воду, почву, могут
нарушать естественный ход природных процессов.
Кэп. Структура на 5'-конце эукариотических иРНК; образуется после
транскрипции за счет присоединения 5'-конца гуанинового нуклеотида к 5'концевому основанию иРНК. Эта структура может быть метилирована, по
294
крайней мере, по той молекуле гуанина, которая присоединилась. «Кэп»
имеет следующее строение -7МеG5′ppp5′Np...
Лидер. Нетранслируемая последовательность, находящаяся на 5'-конце
иРНК и предшествующая инициирующему кодону.
Линкер.
Синтетический,
короткий
двухцепочечный
олигонуклеотид,
содержащий сайты узнавания для ряда рестрикционных эндонуклеаз; может
быть присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью какойлибо другой рестриктирующей эндонуклеазы, в процессе реконструирования
рекомбинантной ДНК.
Линкерная ДНК. ДНК нуклеосомы, выходящая за пределы кор-частицы
длиной 146 пар нуклеотидов (т.е. за пределы минимальной нуклеосомы).
«Липкие» концы. Самокомплементарные одноцепочечные участки ДНК,
выступающие на противоположных концах двуцепочечной молекулы;
возникают в результате ступенчатых разрезов в двухцепочечных молекулах
ДНК.
Матрица. Макромолекулярный шаблон для синтеза информационной
макромолекулы. Матричная РНК (мРНК или иРНК). Класс молекул РНК,
каждая из которых комплементарна одной цепи клеточной ДНК и служит для
переноса генетической информации от хромосомы к рибосомам.
Мутация. Наследуемое изменение в хромосомe.
мяРНК (малая ядерная РНК). Одна из многих маленьких РНК,
содержащихся в ядре; принимает участие в сплайсинге.
Нуклеиновые
кислоты.
нуклеотидные
остатки
Природные
соединены
полинуклеотиды,
между
собой
в
в
которых
определенной
последовательности фосфодиэфирными связями.
Нуклеозид. Соединение, состоящее из пуринового или пиримидинового
основания, ковалентно связанного с пентозой.
Нуклеоид. Ядерная зона в прокариотической клетке; она содержит
хромосому, но не окружена мембраной.
295
Нуклеосома. Основная структурная единица хроматина, состоящая из ~200
нуклеотидных пар ДНК и октамера гистоновых белков.
Обратная транскриптаза. Синтезируемая ретровирусами РНК- зависимая
ДНК-полимераза, способная катализировать синтез ДНК, комплементарной
РНК.
Обратная транскрипция. Синтез ДНК на матрице РНК; осуществляется
ферментом обратной транскриптазой.
Однонаправленная репликация. Единственная репликационная вилка
движется от определенной точки, называемой местом начала репликации.
Оператор. Область ДНК, которая взаимодействует с белком-репрессором,
благодаря чему регулируется экспрессия гена или группы генов.
Оперон. Единица генетической экспрессии, состоящая из одного или
нескольких связанных между собой генов, а также из промотора и оператора,
которые регулируют их транскрипцию.
Отстающая цепь. Должна удлиняться в 3'→5'-направлении, поэтому
синтезируется прерывисто в виде коротких фрагментов (5′→3'), которые
затем ковалентно соединяются.
Охра-кодон. Триплет UAA, один из трех бессмысленных кодонов,
вызывающих терминацию синтеза белка.
Палиндром. Последовательность ДНК, которая остается неизменной, если
на одной из цепей ДНК ее читать слева направо, а на другой справа налево;
состоит из прилежащих друг к другу инвертированных поворотов.
Первичный
транскрипт.
Первоначально
синтезированная
немодифицированная молекула РНК, соответствующая транскрипционной
единице.
Перемещающийся элемент (транспозон). Фрагмент ДНК, который может
менять свое положение в геноме.
Плавление ДНК. Денатурация ДНК.
Плазмида. Внехромосомная независимо реплицирующаяся небольшая
кольцевая молекула ДНК.
296
Полиаденилирование. Присоединение последовательности полиадениловой
кислоты к 3'-концу эукариотической РНК после завершения ее синтеза.
Полуконсервативная репликация. Осуществляется за счет разделения
цепей исходной двухцепочечной молекулы и последующего использования
каждой из них в качестве матрицы для синтеза комплементарных цепей.
Последовательность
Шайна-Дальгарно.
Вся
или
только
часть
полипуриновой последовательности AGGAGG, находящейся на 5'-конце
иРНК
непосредственно
перед
инициирующим
AUG-кодоном,
комплементарная последовательности на 3'- конце 16S-pPHK; принимает
участие в связывании рибосомы с иРНК.
Праймер. Короткая последовательность (часто это РНК), комплементарно
взаимодействующая с одной из цепей ДНК; образует свободный 3'-ОНконец,
используя
который
ДНК-полимераза
начинает
синтез
дезоксирибонуклеотидной цепи.
Праймосома. Комплекс белков, принимающих участие в инициировании
синтеза фрагментов Оказаки в процессе прерывистой репликации ДНК;
праймосома может перемещаться вдоль ДНК, участвуя в последующих актах
инициации.
Промотор. Участок ДНК, с которым может связываться РНК-полимераза,
инициируя тем самым транскрипцию.
Профаг. Фаговый геном, интегрированный в бактериальную хромосому.
Полусинтетические
соединения.
Соединение,
полученное
хим.
модификацией биол. продукта (напр., 6–аминопенициллановой кислоты при
производстве
различных
пенициллинов).
Нередко
говорят
о
полусинтетическом методе получения соединения, когда его хим. синтез
сопровождается стадиями превращения промежуточных продуктов путем
биотрансформаций.
Рамка считывания. Один из трех возможных способов считывания
нуклеотидной последовательности в виде последовательного ряда триплетов.
297
Реверсия мутации. Замена в ДНК, которая или исправляет первоначальное
повреждение (истинная реверсия) или компенсирует его (в результате
вторичной мутации в данном гене).
Регуляторный ген. Ген, продукт которого принимает участие в регуляции
экспрессии другого гена, например ген, кодирующий белок-репрессор.
Рекомбинантная ДНК. ДНК, образованная в результате соединения генов в
новой комбинации.
Ренатурация. Реассоциация денатурированных комплементарных цепей
ДНК с образованием двухцепочечной молекулы.
Рентгеноструктурный анализ (РСА). Использование метода дифракции
рентгеновских
лучей
на
кристаллах
исследуемого
соединения
для
определения его трехмерной структуры.
Репликационная
вилка.
Точка,
в
которой
цепи
родительской
двухцепочечной ДНК расходятся для того, чтобы могла произойти
репликация.
Репликация. Синтез дочерней молекулы двухцепочечной ДНК, идентичной
родительской двухцепочечной ДНК.
Репликон. Единица генома, способная к автономной репликации ДНК;
содержит точку инициации репликации.
Репрессибельный фермент. Фермент, синтез которого ингибируется в том
случае,
если
продукт
катализируемой
им
реакции
легко
доступен
бактериальной клетке.
Репрессия. Ингибирование транскрипции
(или
трансляции) за счет
связывания белка-репрессора со специфическим сайтом на ДНК(или иРНК).
Репрессор.
Белок,
который
связывается
с
регуляторной
последовательностью (оператором) гена и блокирует его транскрипцию.
Рестриктирующне эндонуклеазы. Эндодезоксирибонуклеазы, узнающие
специфическую
нуклеотидную
расщепление
цепей
обеих
последовательность
ДНК
в
сайтах,
и
вызывающие
которые
определяются
нуклеотидными последовательностями, обладающими симметрией второго
298
порядка
относительно
центра.
Эти
ферменты
являются
важным
инструментом генетической инженерии.
Ретровирус. РНК-содержащий вирус, в состав которого входит обратная
транскриптаза, т.е. РНК-зависимая ДНК-полимераза.
Сайт-специфическая
рекомбинация.
Происходит
между
двумя
определенными (не обязательно гомологичными) последовательностями,
например, наблюдается при интеграции и исключении фага или при
разрешении коинтегратных структур в процессе транспозиции.
Сателлитная ДНК. Высокоповторяющиеся нетранслируемые участки ДНК
в эукариотических клетках.
Сдвиг рамки. Мутация, которая обусловлена вставкой или потерей одной
или нескольких пар нуклеотидов; приводит к смещению рамки считывания
кодонов при биосинтезе белка, в результате чего образующийся белок,
начиная
с
кодона,
подвергшегося
изменению,
имеет
искаженную
аминокислотную последовательность.
Сплайсинг. Процесс удаления интронов и объединения экзонов в иРНК.
Стартовая точка (инициирующий сайт). Обозначает участок ДНК,
соответствующий первому основанию, включающемуся в РНК.
Структурный ген. Ген, кодирующий белки и РНК.
Селекция - наука о желательном преобразовании пород животных, сортов
растений, рас микроорганизмов, бактерий и вирусов.
В задачи селекции входит выведение новых и улучшение существующих
сортов растений, пород животных и штаммов микроорганизмов путем
искусственного мутагенеза и отбора, гибридизации, генной и клеточной
инженерии.
Техническая микробиология - раздел микробиологии, разрабатывающий
способы
культивации
полезных
микроорганизмов
масштабах.
299
в
промышленных
ТАТА-последователъностъ (блок Хогнесса). А-Т-богатая семичленная
последовательность, находящаяся на расстоянии около 25 пар нуклеотидов
перед
стартовой
точкой
каждой
транскрипционной
единицы,
транскрибируемой РНК-полимеразой II; вероятно, необходима для такого
расположения фермента, при котором он может осуществлять правильную
инициацию.
Терминирующая последовательность. Последовательность ДНК, которая
находится на конце транскрипционной единицы и служит сигналом
окончания транскрипции.
Терминирующие кодоны. Три кодона UAA, UAG и UGA, которые служат
сигналами окончания синтеза полипептидной цепи.
Топоизомеразы. Ферменты, способные осуществлять положительное или
отрицательное сверхскручивание колец двухце почечной ДНК.
Точка начала репликации (ori). Последовательность ДНК, в которой
происходит инициация репликации.
Токсины – ядовитые вещества, образуемые живыми организмами, в том
числе и микроорганизмами. По хим. природе – полипептиды. Исключение
составляют афлатоксины, являющиеся производными кумаринов. Обладают
антигенными свойствами. Среди микробных Т. различают экзотоксины
(простые белки), которые образуются грамположительными патогенными
бактериями и выделяются в среду в процессе их роста; эндотоксины
(сложные белки – комплексы липополисахаридов с белками), которые
освобождаются при распаде (лизисе) микроорганизмов. Гены, кодирующие
экзотоксины, локализованы большей частью в плазмидах или профагах, а не
в
бактериальной
специфичностью,
хромосоме.
т.
е.
экзотоксинов–тетаноспазмин
Все
поражают
и
экзотоксины
обладают
высокой
определенные
ткани.
Примеры
возбудителя
столбняка,
тетанолизин
дифтерийный Т. и др. Эндотоксины находятся в наружных слоях клеточных
стенок всех патогенных грамотрицательных бактерий. Действие их на
300
организм
относительно
неспецифично.
Примеры
эндотоксинов–Т.
возбудителей брюшного тифа, дизентерии и др.
Трансверсия.
Мутация,
в
результате
которой
пурин
замещается
пиримидином, или же наоборот.
Трансдукция. Перенос генетического материала из одной клетки в другую с
помощью вирусного вектора.
Транскрипционный контроль. Регуляция белкового синтеза при помощи
регуляции образования мРНК.
Транскрипция. Ферментативный процесс, при котором генетическая
информация, содержащаяся в одной цепи ДНК, используется для синтеза
комплементарной нуклеотидной последовательности в цепи мРНК.
Транслоказа. Фермент, вызывающий какое-либо движение, например
перемещение рибосомы вдоль мРНК.
Трансляционный контроль. Регуляция синтеза белка за счет изменения
скорости его трансляции в рибосоме.
Трансляция.
Процесс,
при
котором
генетическая
информация,
содержащаяся в молекуле мРНК, направляет синтез соответствующей
аминокислотной последовательности в белке.
Транспозаза. Фермент, участвующий в интеграции транспозона в новый
сайт.
Транспозиция. Перемещение гена или группы генов из одного места генома
в другое.
Транспозон. Последовательность ДНК, способная реплицироваться и
внедрять одну из копий в новое место генома.
Транспортная РНК (тРНК). Класс молекул РНК (мол. Масса 25000-30000),
каждая из которых на первом этапе белкового синтеза ковалентно
соединяется со специфической аминокислотой.
Факторы элонгации (EF). Белки, циклично ассоциирующие с рибосомой в
соответствии с включением каждой новой аминокислоты в полипептидную
цепь.
301
Фрагменты Оказаки. Короткие фрагменты ДНК длиной 1000- 2000
оснований; образуются в результате прерывистой репликации; впоследствии
ковалентно соединяются в непрерывную цепь.
Химерная ДНК. Рекомбинантная ДНК, содержащая гены из двух разных
видов организмов.
Шпилька. Представляет собой двухцепочечную область, образующуюся за
счет
спаривания
оснований
между
соседними
(инвертированными)
комплементарными последовательностями в одноцепочечной РНК или ДНК.
Экзон. Участок эукариотического гена, транскрипт которого оказывается в
зрелой мРНК; он кодирует определенный участок полипептидной цепи
белка.
Экзонуклеаза.
Фермент,
гидролизующий
только
концевую
гидролизовать
внутренние
фосфодиэфирную связь нуклеиновой кислоты.
Эндонуклеаза.
Фермент,
способный
фосфодиэфирные связи в нуклеиновых кислотах.
Эндоплазматический ретикулум. Обширная система двойных мембран в
цитоплазме эукариотических клеток; она окружает секреторные каналы и
часто усеяна рибосомами.
Эукариоты. Организмы, клетки которых содержат окруженное мембраной
ядро с множественными хромосомами и внутриклеточные органеллы.
Экологическая
инженерия
целенаправленные
-
хозяйственные
мероприятия, основанные на экологических подходах и методах.
Эмбриогенетическая инженерия - активная перестройка генома животных
путем вмешательства в их развитие на самых ранних стадиях онтогенеза.
Ядро. Органелла эукариотической клетки, окруженная мембраной и
содержащая хромосомы
302
