Компьютерный и экспериментальный
анализ иммуногенных свойств вителлина
и катепсина F O. felineus
Носова Александра Андреевна, группа 7412, ФЕН НГУ
Кафедра информационной биологии
Руководители: д.б.н. Татьков С.И.,
к.б.н. Афонников Д.А.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной биологии ИЦиГ СО РАН
Распространенность семейства Opisthorchiidae
Clonorchis sinensis
Opisthorchis felineus
Metorchis bilis
Opisthorchis viverrini
Печеночные сосальщики индуцируют образование
холангиокарцином
Opisthorchis viverrini является канцерогеном
первой группы для человека (1994)
Clonorchis sinensis является канцерогеном
первой группы для человека (2009)
Широко используемые средства диагностики
• Паразитологические тесты: обнаружение в фекалиях и
дуоденальном содержимом яиц O.felineus
Недостатки: сложность распознавания яиц в полученных анализах,
яйца появляются только на 4 неделе после заражения,
субъективность определения заражения
Однократно полученный отрицательный результат не свидетельствует
об отсутствии описторхозной инвазии
• Иммунодиагностика: в имеющихся наборах используются
антигены, полученные из гомогената паразита
Недостаток: низкая чувствительность и специфичность анализа
Перспектива: использование рекомбинантных белков паразита
(высокоспецифичных антигенов)
Цель работы:
исследовать антигенные и функциональные свойства
мажорных белков катепсина F и вителлина O. felineus
Задачи:
• провести структурно-функциональную аннотацию и
предсказание антигенных свойств двух мажорных белков O.
felineus – катепсина F и вителлина - методами биоинформатики
• клонировать последовательности, кодирующие эти гены,
получить продуценты соответствующих белков в
прокариотической системе экспрессии E.coli, получить
препараты рекомбинантных белков
• исследовать взаимодействие рекомбинантных белков
катепсина F и вителлина с панелью сывороток пациентов,
страдающих описторхозом
Белки вителлин и катепсин F
Вителлин
•
• предшественники
желточных белков
синтезируются и
накапливаются в
•
желточниках паразита
• для F. hepatica вителлин В
•
является мажорным
антигеном и составляет 6-7%
от общего числа белков
взрослого паразита
• нет гомологов среди белков
•
человека
Катепсин F
катепсины составляют
значительную фракцию всех
активно транскрибируемых генов у
описторхид
являются истинно секретируемыми
белками (F. hepatica )
их основная биологическая
функция связана с гидролизом
различных белков хозяина для
питания паразита и для защиты от
иммунной системы хозяина
потенциально может принимать
участие в метастазировании при
развитии рака
Схема компьютерно-экспериментального подхода
для исследования антигенных свойств катепсина F
и вителлина
Анализ
литературных
данных
Поиск
информации в
базах данных
Изучение доменной
организации
Исследование
антигенных свойств
белок
Предсказание сайтов
посттрансляционной
модификации
3
Клонирование
последовательностей
гена
Построение
третичной структуры
по гомологии
Получение
экспрессии
белка
1 – анализ имеющихся данных
3 - экспериментальный анализ
Взаимодействие
с панелью
сывороток
2 – биоинформатический анализ
Определение доменной структуры
аминокислотных последовательностей белков
в базе данных CDD
Вителлин (доля предсказанной регулярной ВС < 5 %)
Катепсин F (доля предсказанной регулярной BC – 41,6 % )
Вителлин, вероятно, не является глобулярным белком, что делает
затруднительным качественное предсказание его третичной структуры.
Наличие консервативных доменов позволяет реконструировать модель
третичной структуры катепсина F с высокой точностью
Программы, использованные для проведения
структурно-функциональной аннотации и
предсказания антигенных свойств
• SignalP – Поиск сигнальных пептидов. Алгоритм: метод нейронной сети
• CDD – предсказание доменной организации. Алгоритм: множественное выравнивание
• SWISS-MODEL– построение третичной структуры белка по гомологии. Алгоритм:
•
•
•
•
•
реконструкция модели белка по шаблону
BepiPred - распознавание пептидов с высоким сродством к B-клеточным эпитопам.
Алгоритм: метод нейронной сети
CTL-epitope-finder – распознавание пептидов с высоким сходством к
последовательностям известных CTL –эпитопов. Алгоритм: весовая матрица
Discotope - распознавание пептидов с высоким сродством к В-клеточным эпитопам в
пространственной структуре белка. Алгоритм: весовая матрица с учетом
аминокислотных свойств, пространственной структуры
Scratch Protein Predictor – предсказание общей антигенности на основе информации
о вторичной структуре, взаимодействиях между аминокислотами, предсказанных Bклеточных эпитопах. Алгоритм: весовая матрица, метод нейронной сети
NetNGlyc , NetPhos - предсказание сайтов N – гликозилирования АСН и
фосфорилирования (ТИР,ТРЕ,CEP). Алгоритм: метод нейронной сети
Пример предсказания последовательностей B клеточных эпитопов программой BepiPred
Вителлин (246 ак)
Катепсин F (326 ак)
B-клеточные
эпитопы
MKLVAILLVVLLPAVLGDGYYGP
RSRGHGRFYRGAYGDHTGRQTAA
SEYDLRGRLSQRGESSYSGDWDT
HAREDDKDFYEIGGRYAVYGKAA
DDTDYGLNAYLKAKGKFYGHGNE
EQGSKFEQFTKFRRGGGHDSYGK
KKHYNDYDTYGQMKKYGNRDVSS
KFEMYGKLKAKGKFDAYGKSDVA
SEFDKYGKYGQSGSSKDYADRDV
YGKLSGYGKYKSYGKLSGYGSQD
DYSKHGRHADYDELGY
MRLFVCCVАVTTIWSAFARTTRFEL
DNARALYEEFKVKYKKTYSNDDDEL
RFRIFKDNLLRAKRLQAMEQGTAQY
GVTQFSDLTSEEFKTRYLRMRFDGP
IVSEDLTPQEDVTVDDDKFDWRDHG
AVGPVLDQGDCGSCWAFSVIGNVEG
QWFRKTGKLLSLSEQRLIDCDHLDE
GCDGGYPPQTYGEIGKMGGLEARSD
YPXTGADGACYMEKAKAVAYVNGSX
QLPCNEEIQATKLKEIGPLSFALNA
DTLQLYKAGIMHPRSADPAGVNHAV
FAVGAGVEHGIPYWTVKNSWGEFFG
EQGYFRIARGDGTCGINRVVSTAII
K
Доля позиций,
формирующих
эпитопы
30,9 %
26%
Для последовательности вителлина доля последовательностей B-клеточных
эпитопов выше
Трехмерные структуры катепсина F
Модель 1
Модель 2
Структура
Покрытие
115-326
29-326
Уровень гомологии
46,26%
34,97%
Blast E-value
0,00e-1
0,00е-1
-1,44
-3,16
Z-вес структурной
модели
Название молекулы
Катепсин F человека
Прокатепсин L1
шаблона
Fasciola hepatica
Для дальнейшего анализа выбор был сделан в пользу модели 2 : абсолютное
значение Z-веса модели 2 превышает 3, покрытие последовательности
составляет 91,1 %, в качестве шаблона выступает прокатепсин L1 Fasciola
hepatica класса Trematodа
Результаты биоинформатического анализа
Вителлин
Катепсин F
нет
есть
Трехмерная модель
нет
есть
Количество доменов
1
2
Доля
позиций
Bклеточных эпитопов (%)
30,9
26
Доля
позиций
эпитопов (%)
35,8
30,1
-
20,2
0.765972
0.569235
нет
1 сайт
Название характеристики
Наличие
пептида
сигнального
CTL-
Доля
позиций
пространственных
Вклеточных эпитопов (%)
Показатель
антигенности
общей
Наличие
сайтов
гликозилирования
В результате анализа можно сделать вывод, что вителлин обладает более высокими
антигенными свойствами. Но отсутствие трехмерной модели и нерегулярная
вторичная структура затрудняют его более детальный анализ
Схема эксперимента по клонированию
последовательностей генов
bla
+
pHis-vitelline
bla
3557 bp
Hind III
pHis-vector
T7
vitelline
his6
Bgl II
bla
2831 bp
Hind III
Bgl II
his6
start codon
+
SD
T7
pHis-catF
Hind III
3797 bp
cathepsin F
T7
his6
Bgl II
ПЦР-скрининг колоний на наличие вставки
последовательности гена
1 - маркер «СибЭнзим»
2-6, 8-10 – положительные
клоны для последующего
анализа
7 – отрицательный контроль
1 - маркер «СибЭнзим»
2-9 – положительные клоны
для последующего анализа
10 – отрицательный контроль
Анализ индукции целевых белков
М – набор белковых маркеров «СибЭнзим»
1 – индукция катепсина F (37 KD)
2,4 – культуры, выращенные без индукции
3 – индукция вителлина (28 KD)
Анализ растворимости белков
Анализ растворимости
вителлина
M –набор белковых маркеров «СибЭнзим»
1 - отрицательный контроль индукции белка
2 – суммарный лизат клеток белка после
индукции
3 – растворимая форма белка вителлин
4 – нерастворимая форма белка вителлин
Анализ растворимости
катепсина F
M - набор белковых маркеров
«СибЭнзим»
1 – растворимая форма белка
катепсин F
2 – нерастворимая форма белка
катепсин F
Определение взаимодействия рекомбинантных
белков катепсина F и вителлина O. felineus с панелью
сывороток пациентов больных описторхозом
Антиген
производства
ЗАО
"ВекторБест"
Рекомбинантный
белок катепсин
F(тв), разведение
1:16000
Рекомбинантный
белок вителлин
(с/н), разведение
1:16000
Рекомбинантный
белок вителлин
(с/н), разведение
1:32000
Среднее
значение для
сывороток
больных(+)
1,14
0,87
1,7
0,96
Среднее
значение для
контрольных
сывороток (-)
0,0425
0,46
0,891
0,48
Отношение
средних
значений (+/-)
26,8
1,9
1,9
2
Выводы
• На основании анализа литературы, касающейся протеома трематод
семейства Opisthorchiidae, для компьютерного и экспериментального
исследования были выбраны белки катепсин F и вителлин O. felineus
• Проведена структурно-функциональная аннотация и предсказаны
антигенные свойства белков O.felineus катепсина F и вителлина
методами биоинформатики
• Согласно биоинформатическому анализу белок вителлин обладает
более высокими антигенными свойствами по отношению к катепсину
F, но отсутствие трехмерной модели и нерегулярная вторичная
структура затрудняют более детальный анализ его структуры
• Проведено молекулярное клонирование целевых генов в составе
экспрессирующего вектора pHis6, получены штаммы-продуценты
рекомбинантых белков вителлина и катепсина F и определена
растворимость этих белков
• Проведены
предварительные
исследования
взаимодействия
рекомбинантных антигенов с панелью сывороток пациентов,
страдающих описторхозом. Полученные данные указывают на
необходимость дальнейших исследований по тестированию
антигенных свойств вителлина и катепсина F
Благодарности сотрудникам лаборатории
молекулярной и клеточной биологии ИЦиГ СО РАН:
к.б.н., с. н. с. П. А. Белавин,
м.н.с. М. Н. Львова,
д.б.н., в. н. с. И. А. Разумов,
д.б.н., зав. лабораторией В. А. Мордвинов
Предсказание антигенной активности
Вителлин (246 ак)
Катепсин F (326 ак)
CTL-эпитопы
Программа: CTLepitope-Finder
распознавание в
аминокислотной
последовательности
пептидов, которые
имеют высокое
сходство с
последовательностям
и известных CTL –
эпитопов.
Алгоритм:
построение весовой
матрицы.
Пороговое значение:
0.0.
MKLVAILLVVLLPAVLGDGYYG
PRSRGHGRFYRGAYGDHTGRQT
AASEYDLRGRLSQRGESSYSGD
WDTHAREDDKDFYEIGGRYAVY
GKAADDTDYGLNAYLKAKGKFY
GHGNEEQGSKFEQFTKFRRGGG
HDSYGKKKHYNDYDTYGQMKKY
GNRDVSSKFEMYGKLKAKGKFD
AYGKSDVASEFDKYGKYGQSGS
SKDYADRDVYGKLSGYGKYKSY
GKLSGYGSQDDYSKHGRHADYD
ELGY
MRLFVCCVAVTTIWSAFARTTR
FELDNARALYEEFKVKYKKTYS
NDDDELRFRIFKDNLLRAKRLQ
AMEQGTAQYGVTQFSDLTSEEF
KTRYLRMRFDGPIVSEDLTPQE
DVTVDDDKFDWRDHGAVGPVLD
QGDCGSCWAFSVIGNVEGQWFR
KTGKLLSLSEQRLIDCDHLDEG
CDGGYPPQTYGEIGKMGGLEXR
SDYPXTGXDGXCYMEKXKXVAY
VNGSXQLPCNEEIQATKLKEIG
PLSFALNADTLQLYKXGIMHPR
SXDPXGVNHAVFXVGXGVEHGI
PYWTVKNSWGEFFGEQGYFRIX
RGDGTCGINRVVSTAIIK
Доля
последовательностей
эпитопов в белке
35,8 %
30,1%
Для последовательности вителлина доля последовательностей CTL-эпитопов выше
Предсказание антигенной активности
Вителлин (246 ак)
MRLFVCCVAVTTIWSAFARTTRFELD
NARALYEEFKVKYKKTYSNDDDELRF
RIFKDNLLRAKRLQAMEQGTAQYGVT
QFSDLTSEEFKTRYLRMRFDGPIVSE
DLTPQEDVTVDDDKFDWRDHGAVGPV
LDQGDCGSCWAFSVIGNVEGQWFRKT
GKLLSLSEQRLIDCDHLDEGCDGGYP
PQTYGEIGKMGGLEXRSDYPXTGXDG
XCYMEKXKXVAYVNGSXQLPCNEEIQ
ATKLKEIGPLSFALNADTLQLYKXGI
MHPRSXDPXGVNHAVFXVGXGVEHGI
PYWTVKNSWGEFFGEQGYFRIXRGDG
TCGINRVVSTAIIK
В-клеточные эпитопы в
пространственной
структуре белка
Программа: Discotope –
распознавание пептидов,
обладающих высоким
сродством к В-клеточным
эпитопам в пространственной
структуре белка
Алгоритм: построение весовой
матрицы с учетом
аминокислотных свойств,
пространственной структуры
Пороговое значение: -7,7
Доля последовательностей
эпитопов в белке
Общая антигенность
Программа: Scratch Protein
Predictor
Алгоритм: реконструкция
структуры, использование
нейронной сети
Катепсин F (326 ак)
-
20,2%
0.765972
0.569235
Биоинформатический анализ антигенных свойств двух белков показывает, что
предсказанная антигенная активность вителлина выше, чем катепсина.
Поиск сайтов посттрансляционной модификации
Предсказание сайтов
фосфорилирования и
гликозилирования
Программа: NetPhosпредсказание сайтов
фосфорилирования серина,
тирозина и треонина
Алгоритм: предсказание сайта
по последовательности
методом нейронной сети
Порог: 0.5
Программа: NetNGlycпредсказание сайтов N –
гликозилирования аспарагина
Алгоритм: предсказание сайта
поиском последовательности
Asn-Xaa-Ser/Thr методом
нейронной сети
Порог: 0.5
Вителлин (246 ак)
Катепсин F (326 ак)
MKLVAILLVVLLPAVLGDGYY
GPRSRGHGRFYRGAYGDHTGRQ
TAASEYDLRGRLSQRGESSYSG
DWDTHAREDDKDFYEIGGRYAV
YGKAADDTDYGLNAYLKAKGKF
YGHGNEEQGSKFEQFTKFRRGG
GHDSYGKKKHYNDYDTYGQMKK
YGNRDVSSKFEMYGKLKAKGKF
DAYGKSDVASEFDKYGKYGQSG
SSKDYADRDVYGKLSGYGKYKS
YGKLSGYGSQDDYSKHGRHADY
DELGY
MRLFVCCVAVTTIWSAFARTT
RFELDNARALYEEFKVKYKKT
YSNDDDELRFRIFKDNLLRAK
RLQAMEQGTAQYGVTQFSDLT
SEEFKTRYLRMRFDGPIVSED
LTPQEDVTVDDDKFDWRDHGA
VGPVLDQGDCGSCWAFSVIGN
VEGQWFRKTGKLLSLSEQRLI
DCDHLDEGCDGGYPPQTYGEI
GKMGGLEARSDYPATGADGAC
YMEKXKAVAYVNGSAQLPCNE
EIQATKLKEIGPLSFALNADT
LQLYKXGIMHPRSADPAGVNH
AVFAVGAGVEHGIPYWTVKNS
WGEFFGEQGYFRIARGDGTCG
INRVVSTAIIK
Для последовательности вителлина количество предсказанных сайтов
фосфорилирования больше, однако катепсин содержит сайт N-гликозилирования
вблизи одного из эпитопов, который может влиять на его свойства.
